Summary
Her presenteres en protokoll for å isolere og transfektere primær iris og retinal pigment epitelceller fra ulike pattedyr (mus, rotte, kanin, gris og storfe). Metoden er ideelt egnet til å studere okulære genterapitilnærminger i ulike oppsett for ex vivo-analyser og in vivo-studier som kan overføres til mennesker.
Abstract
Aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er den hyppigste årsaken til blindhet hos pasienter >60 år, og påvirker ~ 30 millioner mennesker over hele verden. AMD er en multifaktoriell sykdom påvirket av miljømessige og genetiske faktorer, noe som fører til funksjonsnedsettelse av netthinnen på grunn av retinal pigment epitel (RPE) celle degenerasjon etterfulgt av fotoreseptor nedbrytning. En ideell behandling vil omfatte transplantasjon av sunne RPE-celler som utskiller nevrobeskyttende faktorer for å forhindre RPE-celledød og fotoreseptordegenerering. På grunn av funksjonelle og genetiske likheter og muligheten for en mindre invasiv biopsi, ble transplantasjonen av irispigment epitelceller (IPE) foreslått som en erstatning for degenererte RPE. Sekresjon av nevrobeskyttende faktorer med et lavt antall subretinally-transplanterte celler kan oppnås ved Sleeping Beauty (SB100X) transposonmediert transfeksjon med genkoding for pigment epitel-avledet faktor (PEDF) og / eller granulocytt makrofag-koloni stimulerende faktor (GM-CSF). Vi etablerte isolasjon, kultur og SB100X-mediert transfeksjon av RPE- og IPE-celler fra ulike arter, inkludert gnagere, griser og storfe. Globuser er utplantet og hornhinnen og linsen fjernes for å få tilgang til iris og netthinnen. Ved hjelp av en skreddersydd spatel fjernes IPE-celler fra den isolerte irisen. For å høste RPE-celler kan det være nødvendig med en trypsininkubasjon, avhengig av arten. Deretter, ved hjelp av RPE-tilpasset spatel, blir celler suspendert i medium. Etter sådd overvåkes celler to ganger i uken, og etter å ha nådd samløp, transfektert av elektroporasjon. Genintegrasjon, uttrykk, proteinsekresjon og funksjon ble bekreftet av qPCR, WB, ELISA, immunfluorescens og funksjonelle analyser. Avhengig av arten kan 30.000-5 millioner (RPE) og 10.000-1,5 millioner (IPE) celler isoleres per øye. Genmodifiserte celler viser betydelig PEDF/GM-CSF-overtrykk med kapasitet til å redusere oksidativt stress og tilbyr et fleksibelt system for ex vivo-analyser og in vivo-studier som kan overføres til mennesker for å utvikle okulære genterapitilnærminger.
Introduction
Vår gruppe fokuserer på utvikling av regenerative tilnærminger for å behandle nevroretinal degenerasjon, det vil si AMD, av RPE- og IPE-basert ikke-viral genterapi. Den prekliniske etableringen av slike terapier nødvendiggjør in vitro-modeller som kan overføres til mennesker. Dermed er målet med studien som presenteres her å levere protokoller for isolasjon, kultur og genteknologi av primære RPE- og IPE-celler. Begrunnelsen for å etablere isolering av PE-celler fra flere arter er å robust bekrefte sikkerheten og effektiviteten av tilnærmingen og øke reproduserbarheten og overførbarheten. Den tilgjengelige menneskelige RPE-cellelinjen ARPE-19 er forskjellig fra primærceller (f.eks. de er mindre pigmenterte) og er derfor bare av begrenset verdi for prekliniske analyser1. I tillegg kan ikke-menneskelige pattedyrceller kjøpes for mindre kostnader og i større mengder; humant donorvev kan fås fra ulike eye banks, men tilgjengeligheten er begrenset og dyr. Endelig må nye avanserte terapipreparater (ATMP, dvs. celle, vev eller genterapipreparat) brukes i minst to forskjellige arter før de testes hos pasienter, og disse in vivo-studiene ber om fremstilling av allogene celletransplantasjoner.
Retinal nevrodegenerative sykdommer er den ledende årsaken til blindhet i industrialiserte land, bestående av vanlige sykdommer som AMD, samt sjeldne sykdommer som retinitis pigmentosa, der retinal celledød til slutt fører til blindhet. RPE-celler, fotoreseptor og retinal ganglion celler (RGC) skade kan i noen tilfeller bli redusert, men det er for tiden ingen kurative terapier tilgjengelig. ATMPer tilbyr potensial til å korrigere genfeil, integrere terapeutiske gener eller erstatte degenererte celler, og dermed muliggjøre utvikling av regenerative og kurative terapier for sykdommer som AMD; 13 genterapier har allerede fått markedsføringsgodkjenning, inkludert en terapi for å behandle RPE65 mutasjonsrelatert retinal degenerasjon2,3. Blant eldre voksne (>60 år) påvirkes ~ 30 millioner mennesker over hele verden av enten neovascular (nvAMD) eller avascular (aAMD) AMD4. Begge formene er indusert av aldersrelaterte utløsere, inkludert oksidativ skade, funksjonshemming og tap av RPE-celler etterfulgt av fotoreseptorforringelse, blant annet (f.eks. genetiske risikohaller, røyking, hypertensjon)5,6. I nvAMD forverres patogenese av en ubalanse av angiogene og anti-angiogene faktorer til fordel for den angiogene vaskulære endoteliale vekstfaktoren (VEGF) som induserer koroidal neovascularization (CNV). Til dags dato kan bare nvAMD behandles ved månedlige intravitreale injeksjoner av inhibitorer av VEGF-proteinet for å undertrykke CNV; ingen effektiv behandling er ennå tilgjengelig for aAMD6,7.
Flere studier evaluerte cellebaserte terapier for å erstatte anti-VEGF-terapien: studier laget av Binder et al., der nyhøstede autologe RPE-celler ble transplantert til pasienter med nAMD8,9,10, viste moderat visuell forbedring, men bare en liten gruppe pasienter nådde en endelig synsskarphet høy nok til å muliggjøre lesing. Nylig brukte en klinisk fase I-studie en embryonal stamcelle-avledet RPE-patch for å behandle AMD med lovende resultater; det vil si effekt, stabilitet og sikkerhet av RPE-patchen i opptil 12 måneder hos 2 av de 10 pasientene som ble behandlet11. I tillegg har flere grupper publisert studier der autologE RPE-Bruchs membran-choroid flekker ble høstet fra perifer netthinnen og transplantert til makula12,13,14; og indusert pluripotent stamcelle (iPSC)-avledede RPE-flekker ble generert fortransplantasjon 15. For aAMD har antistoffer rettet mot komplementveien blitt testet i kliniske studier6,16 og en fase I-studie ved hjelp av en enkelt intravitreal injeksjon av en adeno-assosiert viral (AAV) vektorkoding av genet for faktor CD59 (AAVCAGsCD59) hos pasienter med geografisk atrofi (GA) ble fullført17; fase II-studien startet nylig og tar sikte på å rekruttere 132 pasienter med avansert aAMD og å evaluere utfallet ved 2 år etter intervensjon18. Til slutt har FocuS-studiegruppen startet en klinisk fase I/II multisenterstudie som evaluerer sikkerhet, doserespons og effekt av en rekombinant ikke-replikerende AAV-vektor som koder en menneskelig komplementfaktor19.
Primært er målet med en regenerativ AMD-terapi transplantasjon av funksjonelle RPE-celler, som ble skadet eller mistet. Imidlertid deler IPE- og RPE-celler mange funksjonelle og genetiske likheter (f.eks. fagocytose og retinolmetabolisme), og fordi IPE-celler er mer gjennomhøstet, har de blitt foreslått som en RPE-erstatning20. Selv om det tidligere har vist seg at IPE-celletransplantasjon forsinker fotoreseptordegenerering i dyremodeller21,22 og stabiliserer visuell funksjon hos pasienter med sluttfase nvAMD, ble det ikke observert noen signifikant forbedring hos disse pasientene23. Mangelen på effekt kan skyldes det lave antallet transplanterte celler, og/eller ubalansen av nevrobeskyttende netthinnefaktorer. En alternativ tilnærming ville være å transplantere transfekterte pigmentepiteleceller som overekspresserer nevrobeskyttende faktorer for å gjenopprette retinal homeostase, opprettholde gjenværende RPE-celler og beskytte fotoreseptorer og RGCer mot degenerasjon. Følgelig foreslår vi en ny terapi som består av transplantasjon av funksjonelle RPE- eller IPE-celler som har gjennomgått genteknologi for å utskille nevrobeskyttende og anti-angiogene proteiner, som PEDF, GM-CSF eller insulinlignende vekstfaktorer (IGFer). Fordelen med å utvikle og analysere denne tilnærmingen i flere arter i stedet for å bruke en cellelinje, bare en art eller menneskelig vev er: 1) økt reproduserbarhet og overførbarhet av resultatene som vist av mange studier realisert i uavhengige laboratorier og forskjellige arter1,24,25; 2) gris eller storfe celler er feasibly disponibel uten offer av flere dyr; 3) tilgjengeligheten av spesielt gris og storfe celler tillater store testserier å produsere robuste resultater; 4) kunnskapen om å isolere, kultur og genetisk modifisere celler fra de mest brukte modellene muliggjør in vivo analyser i flere arter24,25,26 og dermed tilbyr et forbedret risiko-nytte forhold for de første behandlede pasientene; 5) fleksibiliteten til protokollen som presenteres tillater bruk i ulike modeller og eksperimentelle oppsett og for alle okulære cellebaserte terapier med og uten genteknologi. I motsetning til dette er alternative teknikker som cellelinjer eller humant vev bare av begrenset overførbarhet og/eller begrenset disponerbarhet. Cellelinjer som ARPE-19 er ideelle for foreløpige eksperimenter. Lav pigmentering og høy spredning varierer imidlertid betydelig fra primærcellene1. RPE- og IPE-celler, som er isolert fra humant donorvev, tilbyr en dyrebar kilde for overførbare in vitro-eksperimenter; Vi får imidlertid menneskelig vev fra en amerikansk-amerikansk øyebank, noe som betyr at vevet er minst to dager gammelt (etter enucleation) og krever en lang og dyr transport, men lokalt donorvev er ikke tilgjengelig i tilstrekkelige mengder for en produktiv forskning. Fordelen med bruk av primærceller bekreftes av flere studier fra andre gruppe27,28.
For utvikling av en cellebasert ikke-viral genterapi ved hjelp av SB100X transposonsystem for transfektering av primære RPE- og IPE-celler med genkoding for PEDF og/eller GM-CSF for å behandle henholdsvis NVAMD og aAMD, henholdsvis29,30,31,32, etablerte vi først transfeksjonen av ARPE-19 celler19 celler 1 . Deretter ble isolasjons- og transfeksjonsprotokollene etablert i lett tilgjengelige bovine og porcin primærceller. Nå er isolasjon og transfeksjon av primære RPE- og IPE-celler fra fem forskjellige arter etablert, fra små (som mus) til store pattedyr (som storfe). Det ble bekreftet i primære RPE- og IPE-celler avledet fra humane donorøyne30. Good Manufacturing Practices (GMP)-kompatibel produksjon av ATMP ble validert ved hjelp av humant donorvev samt33. Til slutt ble både sikkerhet og effektivitet av tilnærmingen vurdert in vivo i tre forskjellige arter som protokollen er tilpasset: mus, rotte og kanin. I det kliniske oppsettet vil en irisbiopsi bli høstet fra pasienten, og IPE-celler vil bli isolert og transfektert i det rene rommet, før cellene blir transplantert subretinalt tilbake til samme pasient. Hele prosessen vil finne sted under en enkelt kirurgisk økt som varer ca. 60 minutter. Utviklingen av behandlingstilnærmingen og evalueringen av effektiviteten ba om gode in vitro- og ex vivo-modeller for å implementere robuste og effektive genleveringsmetoder, for å analysere effektiviteten av genlevering, terapeutisk proteinproduksjon og nevrobeskyttende effekter, og å produsere celletransplantasjoner for å teste tilnærmingen i vivo1,24,25,29,30 . Det er verdt å nevne at terapien har den etiske godkjenningen for en klinisk fase Ib / IIa-studie fra den etiske kommisjonen for forskning av Kantonen Genève (nr. 2019-00250) og for tiden samles siste prekliniske data forespurt om autorisasjon av sveitsiske reguleringsmyndigheter ved hjelp av den presenterte protokollen. I denne forbindelse viste pre-kliniske in vivo-data en betydelig reduksjon i CNV og utmerket sikkerhet24,25,31.
Her beskrives isolasjonen og kulturen til RPE/IPE-celler fra storfe, gris, kanin, rotte og mus, og bruken av det integrative SB100X transposonsystemet kombinert med elektroporasjon som en effektiv genleveringsmetode. Spesielt ble primære PE-celler transfektert til overekspress PEDF og GM-CSF. Innsamlingen av disse protokollene gjør det mulig å utføre in vitro- og in vivo-studier i alle prekliniske faser av ATMP-utvikling. Videre har oppsettet potensial til å tilpasses andre gener av interesse og sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollene der dyr var involvert ble utført av sertifisert personell og etter autorisasjon av kantonal Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale of Geneva, Sveits, og ifølge ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research (godkjenning nr. GE/94/17). Voksne friske Brune Norge rotter, C57BL/6 mus, og New Zealand hvite kaniner ble euthanized av en overdose av Pentobarbital (150 mg/kg) fortynnet i 0,9% NaCl injisert intraperitoneal og øynene ble enucleated umiddelbart etter offer. Porcine og bovin øyne ble hentet fra et lokalt slakteri innen 6 timer etter offer og ble transportert til laboratoriet på is.
1. Før tilberedning
- Forbered komplett medium (DMEM/Hams F12 supplert med 10% foster bovint serum (FBS), 80 U/ml penicillin / 80 μg/ml streptomycin og 2,5 μg/ml amfotericin B). Varm opp mediet, 1x PBS og 0,25% trypsin (om nødvendig) i et 37 °C vannbad.
- Sett en steril gardin i hetten for å forberede et aseptisk arbeidssted. Introduser alle nødvendige sterile instrumenter og materialer inne i hetten.
MERK: Bare enucleation av øynene og rengjøring av gjenværende muskelvev og hud er prosedyrene som utføres utenfor hetten, resten av trinnene må utføres inne i hetten.
2. Isolering av ROTTE/mus PE-celler
- Bruk buet saks og Colibri tang for å enucleate øynene etter euthanizing dyret. Rengjør gjenværende muskelvev og hud fra øynene ved hjelp av saks og tang (ikke-steril).
MERK: Størrelsen på saksen og tangene som brukes til enuklering og rengjøring av øynene, avhenger av arten (f.eks. for rotte og mus vil instrumentene være mindre enn de som brukes til gris og storfe) (se figur S1).- Samle øynene i et 50 ml rør fylt med ikke-steril PBS og overfør røret til laminær strømningshette. Desinfiser øynene ved å senke i 2 min i jodbasert løsning, og overfør dem deretter til en Petri-tallerken fylt med steril PBS.
- Åpning av pæren
- Etter å ha overført øynene til en steril Petri-tallerken, hold en fast nær synsnerven med Colibri eller spisse tang. Slå et hull nær grensen til iris (mellom pars plana og ora serrata) med en 18 G nål. Sett inn liten saks i hullet og kutt rundt iris. Fjern det fremre segmentet (hornhinnen, linsen og iris) og legg det i en Petri-tallerken. La pæren stå med glasslegemet til RPE-cellene er isolert.
- Isolering av IPE-celler
- Fjern linsen og dra forsiktig ut iris som inneholder IPE-cellene. Legg iris i en Petri-tallerken, vask med steril PBS og la den stå i PBS til mer iris er tilberedt.
- Gjenta trinn 2.2.1 til 2.3.1 for at alle øyne skal være forberedt den dagen.
- Tilsett 50 μL 0,25% trypsin per iris og inkuber i 10 min ved 37 °C. Fjern trypsin, tilsett 150 μL komplett medium per iris og skrap IPE delikat med en flat brannpolert Pasteur pipette; bruk fine tang for å immobilisere vevet. Samle celleopphenget og legg i et 1,5 ml rør. Bruk 10 μL av celleopphenget fortynnet 1:3 med trypan blå for å telle cellene i Neubauer-kammeret34,35.
- Hvis ikke transfektert umiddelbart, frø 200.000 celler / brønn i en 24-brønns plate (100.000 celler / cm2) i 1 ml komplett medium (10% FBS) (for såing se tabell 1). Plasser platen i en inkubator og kultur den ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Det kan være nødvendig å samle flere øyne for å ha nok celler til sådd.
- Isolering av RPE-celler
- Fjern glasslegemet humor og netthinne fra det bakre segmentet med tynne tang. Unngå å skade retinal pigment epitel.
- Klipp segmentet i halvparten med en #10 skalpell for å ha kloden helt åpen og vask med steril PBS.
- Tilsett 50 μL 0,25% trypsin per øye og inkuber i 10 min ved 37 °C. Fjern trypsin og tilsett 150 μL komplett medium per globus og skrap RPE-cellene delikat med en rund skalpell; bruk fine tang for å immobilisere vevet. Samle celleopphenget og legg det i et 1,5 ml rør. Ta 10 μL av celleopphenget; fortynne 1:4 med trypan blå for å telle cellene i Neubauer-kammeret.
- Se trinn 2.3.4.
MERK: Det kan være nødvendig å samle flere øyne for å ha nok celler til sådd.
3. Isolering av kanin PE-celler
- Utfør rengjøring og desinfeksjon som beskrevet i trinn 2.1 til 2.1.1.
- Sett ett øye på en steril gasbind komprimere og hold den fast nær synsnerven. Åpne øyet med skalpell #11 og saks ca 2 mm under limbusen. Fjern det fremre segmentet (hornhinnen, linsen og iris) og legg det i en Petri-tallerken. La pæren stå med glasslegemet til RPE-cellene er isolert.
- Isolering av IPE-celler
- Utfør trinn 2.3.1. Fjern ciliary kroppen fra iris ved å kutte med en skalpell # 10.
- Etter tilberedning av 2 iris, inkuber med 1 ml 0,25% trypsin ved 37 °C i 10 minutter; I løpet av denne tiden kan RPE-cellene isoleres (se trinn 3.4). Fjern trypsin og tilsett 1 ml komplett medium til iris og isoler cellene ved å forsiktig skrape med en flat brannpolert Pasteur pipette. Resuspend cellene forsiktig ved pipettering og overføre celle suspensjon til en 1,5 ml rør. Ta 10 μL av celleopphenget og fortynn 1:3 med trypanblå for å telle cellene i Neubauer-kammeret.
- Se trinn 2.3.4.
- Isolering av RPE-celler
- Utfør trinn 2.4.1.
- Sett en steril gasbind i en 12 brønnplate og legg pæren over gasbindet.
- Vask med PBS og utfør trinn 2.4.3.
MERK: Bruk en buet brannpolert Pasteur pipette. - Sentrifuger cellene 10 min ved 120 x g.
- Se trinn 2.3.4.
4. Isolering av gris PE-celler
- Utfør rengjøring som beskrevet i trinn 2.1. Vask med PBS og desinfiser øynene ved å senke i 2 min i jodbasert løsning, skyll med PBS. Fortsett med trinn 3.2.
- Isolering av IPE-celler
- Utfør trinn 3.3.1. Etter tilberedning av 2 iris, tilsett 1 ml komplett medium og isoler cellene ved å forsiktig skrape med en flat brannpolert Pasteur pipette. Overfør celleopphenget til et 1,5 ml rør. Ta 10 μL av celleopphenget og fortynn 1:4 med trypanblå for å telle cellene i Neubauer-kammeret.
- Se trinn 2.3.4.
- Isolering av RPE-celler
- Utfør trinn 2.4.1. Legg pæren i en Petri-tallerken og vask med PBS. Fyll pæren med 1 ml komplett medium.
- Bruk en buet brannpolert Pasteur pipette til å fjerne RPE-celler forsiktig. Sørg for å skrape fra bunnen til toppen for å unngå å skli ned av choroid-Bruchs membrankompleks. Samle cellefjæringen i pæren ved hjelp av en 1000 μL pipette og overfør til et 1,5 ml rør for resuspensjon. Ta 10 μL av celleopphenget og fortynn 1:8 med trypanblå for å telle cellene i Neubauer-kammeret.
- Se trinn 2.3.4.
5. Isolering av storfe PE-celler
- Utfør rengjøring som beskrevet i trinn 2.1. Vask med PBS og desinfiser øynene ved å senke i 2 min i jodbasert løsning, skyll med PBS. Fortsett med trinn 3.2.
- Isolering av IPE-celler
- Utfør trinn 3.3.1. Etter tilberedning av to iris, inkuber med 2 ml 0,25% trypsin ved 37 °C i 10 minutter. I løpet av denne tiden kan RPE-cellene isoleres (se trinn 5.3).
- Fjern trypsin og tilsett 2 ml komplett medium til iris og isoler cellene ved å forsiktig skrape med en flat brannpolert Pasteur pipette. Overfør celleopphenget til et 15 ml rør. Sentrifuger cellene 10 min ved 120 x g. Ta 10 μL av celleopphenget og fortynn 1:4 med trypanblå for å telle cellene i Neubauer-kammeret.
- Hvis ikke transfektert umiddelbart, frø 320.000 celler / brønn i en 6-brønns plate i 3 ml komplett medium (10% FBS) (for såing se tabell 1). Plasser platen i en inkubator og kultur den ved 37 °C, 5 % CO2.
- Isolering av RPE-celler
- Følg trinn 2.4.1. Legg pæren i en Petri-tallerken og vask med PBS. Etter tilberedning av 2 øyne fyll pæren ca 3/4 med trypsin og inkuber i 25 min ved 37 °C med lokket på Petri-parabolen på toppen av bulbi.
- Fjern trypsin og tilsett 1 ml komplett medium. Utfør trinn 4.3.2. Sentrifuger cellene 10 min ved 120 x g.
- Se trinn 5.2.3.
6. Dyrking - middels endring
- Kultur cellene i DMEM /Ham's F12, supplert med 10% FBS, 80 U/ml penicillin / 80 μg/ml streptomycin, og 2,5 μg/ml amphotericin B, ved 37 °C og 5 % CO2 i en fuktet inkubator. Etter 3-4 dager pipette opp og ned for å samle ikke-tilhengerceller og sette halvparten av volumet i en annen brønn. Fyll opptil 1 ml med komplett medium.
MERK: Dette gjør det mulig å ha en overflate stor nok til at alle celler isolert kan feste og maksimere utgangen. - Etter ytterligere 3-4 dager gjenta cellesamlingen, men denne gangen ved å slå sammen ikke-tilhengercellene fra to brønner i en brønn (f.eks. A1 +B1 i C1). Tilsett medium til alle brønner. Vær oppmerksom på cellene og bytt medium 2 ganger i uken (for henholdsvis 6 og 24-brønnsplater bruker henholdsvis 3 og 1 ml / brønn). Når cellene når samløp, bytt til å fullføre medium med 1% FBS eller bruk cellene til eksperimenter (f.eks. transfeksjon).
MERK: RPE- og IPE-cellene er sammenfallende etter henholdsvis 3-4 og 4-5 uker etter isolasjon. Cellekulturrenheten ble bekreftet ved å sjekke cellemorfologien (pigmenterte celler) og spesifikke markører som beskrevet av Johnen og kolleger36.
7. Elektroporasjon av primære PE-celler
- Utfør elektroporasjon som beskrevet før1,37.
- Avhengig av antall celler transfektert bruk 6-, 24- eller 48-brønnsplater (se tabell 2) for å frø cellene i medium uten antibiotika eller antimykotika. I de følgende 2 ukene tilsett dråper med mediumholdig penicillin (80 U/ml), streptomycin (80 μg/ml) og amfotericin B (2,5 μg/ml) to ganger i uken. Bytt mediet helt 2 uker etter transfeksjon.
- For å bestemme cellevekst, transfeksjonseffektivitet og proteinsekresjon, overvåk cellene ukentlig ved mikroskopi og analyser cellekulturen supernatant av vestlig blot. Før avslutning av kulturen, ta en 24 h cellekultur supernatant for å kvantifisere protein sekresjon av ELISA, telle cellene, måle fluorescens ved bildebasert cytometri (i tilfelle av Venus-transfected celler) etter produserer 'instruksjoner (se Tabell over materialer), og samle cellepellet for RT-qPCR-basert genuttrykk analyse.
MERK: Disse metodene er ikke inkludert i det nåværende papiret, siden det ikke er formålet å forklare i detalj analysen av cellene, men snarere isolasjonen. Cellefrøtettheten er den samme for alle arter (100 000 celler/cm2), men fordi antall isolerte celler varierer, ble forskjellige plater brukt. I tillegg, for mus, rotte og kanin, kan det være nødvendig å samle 2-3 øyne for å ha nok celler til sådd.
| Art | Trypsin behandling | N° IPE-celler | N° RPE-celler | Plate for såing (100 000 celler/cm2) |
| Mus/rotte | Ja | ~50 000 | ~150 000 | 24-brønns plater |
| Kanin | Ja | ~350 000 | ~2 500 000 | 24-brønns plater |
| Gris | Nei | ~1 000 000 | ~3 000 000 | 24-brønns plater |
| Storfe | Ja | ~1 700 000 | ~5 000 000 | 6-brønns plater |
Tabell 1: Antall primære PE-celler isolert fra øyne fra ulike arter.
| Navn | Område | Volum middels | Trypsin | Volummedium for å stoppe handlingen trypsin | Såddtetthet |
| 6-brønns plate | 9,6 cm² | 3,0 ml | 0,5 ml | 1,0 ml | 3 x 105 |
| 24-brønns plate | 2,0 cm² | 1,0 ml | 0,2 ml | 0,8 ml | 5 x 104 |
| 48-brønns plate | 1,1 cm² | 0,5 ml | 0,1 ml | 0,4 ml | 0,5-1x104 |
Tabell 2: Cellekulturvolumer og såddtettheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PE-isolasjon fra ulike pattedyrarter
Ved hjelp av de nevnte protokollene ble IPE- og RPE-celler vellykket isolert og dyrket fra fem forskjellige arter. Antall celler oppnådd fra hver prosedyre avhenger av arten og størrelsen på øyet (Tabell 1). Som vist i figur 1, viser celler typisk PE-cellemorfologi og pigmentering (unntatt kaninceller vist, avledet fra albino New Zealand White (NZW) kaniner). Etter 21 dager etter isolasjon er cellene konfluensielle, klare til bruk til videre eksperimenter (f.eks. transfeksjoner). Det må bemerkes at kulturer fra alle arter overvåkes og kontrolleres videre opptil 2 år som bekrefter normal morfologi og stabilt transgene uttrykk (data ikke vist).
Dedifferensiering, cellulært stress og endringer i genuttrykk ble utelukket av RT-qPCR og immunhiistokjemi. Et panel av gener (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8) analysert i transfekterte humane RPE-celler (ARPE-19 celler) bekreftet normalt RPE-uttrykksmønster1; som kan bekreftes i primære bovine IPE-celler ved immunfluorescens for RPE65 (figur 2). I tillegg bekreftet Johnen og kollegene ZO-1-immuniseringen i primær porcin IPE- og RPE-cellene36.
Figur 1: Mikrografer av PE-celler fra ulike pattedyr etter 21 dager etter isolasjon. IPE- og RPE-celler fra mus, kanin (albino NZW kanin), gris og storfe vises på dag 21 etter isolasjon. For alle arter er kulturene som vises sammenfallende. Vær oppmerksom på at kanin PE-cellene ikke er pigmentert (original forstørrelse, 50x). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: RPE65 immunstaining av primære IPE-celler. RPE65 (grønn) farging av bovine IPE-celler transfektert med pFAR4-CMV-PEDF transposonplasmid ved hjelp av et innledende cellenummer på 1 x 104 celler sammenlignet med ikke-transfekterte kontrollceller (opprinnelig forstørrelse, 200x). Nuclei ble farget med DAPI (blå). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Levedyktighet av transfektert primær RPE
Celle levedyktighet vises i figur 3. For å utelukke en potensiell toksisitet av bufferen som brukes til elektroporasjonsprosessen, ble prekulturerte primære RPE-celler suspendert i elektroporasjonsbuffer fra et kommersielt tilgjengelig sett, eller i en næringsbuffer utviklet av et farmasøytisk selskap (konfidensiell sammensetning) og elektroporert (E) (uten tilsetning av plasmid) som beskrevet i trinn 7 i protokollen. Celle levedyktigheten ble studert 3 ± 1 dager etter transfeksjon ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig cytotoksisitetsanalysesett (se Materialfortegnelse) i henhold til produsentens instruksjoner. Analysene ble alltid utført med en kontroll uten strøm (Co-P) (ikke elektroporert). Det ble ikke observert noen innvirkning på celle levedyktigheten for noen av de testede bufferne (figur 3).
Figur 3: Levedyktigheten til primære RPE-celler suspendert i forskjellige buffere. 1 x 104 celler ble suspendert i elektroporasjonsbuffer fra et kommersielt tilgjengelig sett eller i en næringsbuffer. Celle levedyktighet ble målt 3 ± 1 dager etter transfeksjon ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig cytotoksisitet analyse kit. Det ble ikke observert forskjeller i levedyktighet mellom de ulike bufferne. data er representert som gjennomsnittlig ± SD (n = 2 givere, 3 replikerer / donor). E: elektroporerte celler, Co-P: kontroll uten strøm. AU: vilkårlige enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Transfeksjoner av prekulturerte PE-celler med Venus reportergenet
50 000-100 000 prekulturerte PE-celler fra forskjellige arter ble transfektert med det gule fluorescerende Venus-proteinet (pT2-CAGGS-Venus) ved hjelp av det hyperaktive SB100X transposongenleveringssystemet. Mikrografer vist i figur 4 bekrefter at cellene ble vellykket transfektert (fluorescerende celler ved 21 dager etter transfeksjon). Figur 5 viser kvantifiseringen av transfeksjonseffektiviteten i prekulturerte gris RPE-celler (n = 6 givere, 50 000 celler / transfeksjon) transfektet med Venus (pT2-CAGGS-Venus). Prosentandelen fluorescerende celler og MFI ble målt ved hjelp av bildebasert cytometri etter produsentens instruksjoner på dagen for avslutning av cellekulturen (30 ± 5 dager etter transfeksjon). Gjennomsnittlig prosentandel av fluorescerende celler var 50 ± 30 %, men variabel fra 95 ± 6 % (donor 2) til 28 ± 1 % (donor 4) (figur 5). I alle eksperimenter ble transfekterte ARPE-19-celler brukt som positiv kontroll. I tillegg ble transfeksjonseffektivitet alltid sammenlignet med de negative kontrollene: Co-P (kontroll uten strøm [ikke elektroporert]) og Co +P (kontroll med kraft [elektroporert, men uten tilsetning av plasmider]). Eksperimentet er også utført med IPE-celler (data vises ikke).
Figur 4: Mikrografer av prekulturerte PE-celler transfektert med pT2-CAGGS-Venus. Venus-transfektert kanin (A), bovin (B) og svin (C) PE-celler vises ved 21 dager etter transfeksjon. Som en positiv kontroll ble 50 000 ARPE-19 celler transfektet med Venus (D). Venstre mikrograf: lysfelt, høyre mikrograf: GFP (480 nm) filter (original forstørrelse, 50x). Transfeksjoner ble gjort i triplikat og negative kontroller ble inkludert: Co-P (kontroll uten strøm [ikke elektroporated]) og Co +P (kontroll med kraft [elektroporated men uten tilsetning av plasmider]) (ikke vist). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Transfeksjonseffektivitet i svine RPE-celler transfektet med Venus-reportergenet. (A) 50.000 primære porcin RPE-celler ble transfektet med pT2-CAGGS-Venus, den totale gjennomsnittlige transfeksjonseffektiviteten var 50 ± 30% og gjennomsnittlig MFI var 2712 ± 197 på dagen for avslutning av cellekulturene (30±5 dager etter transfeksjon). Grafen viser gjennomsnittlig ± SD (n = 3 replikerer) av 6 forskjellige dyr. (B) Prosentandelen av Venus+ ARPE-19 celler som brukes som en positiv kontroll, var 98±6% og var stabil i de 138 dagene cellene ble fulgt. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) var 5 785 ± 1255. Grafen viser gjennomsnittlig ± SD (n=3 replikerer) for hver dag. Co-P (kontroll uten strøm [ikke elektroporated]) og Co+P (kontroll med kraft [elektroporated, men uten tilsetning av plasmider]) ble inkludert i alle transfeksjonsforsøk (ikke vist). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Transfeksjoner av ferske PE-celler med Venus reportergen
10.000-50.000 PE-celler som var fersk isolert fra kaniner, ble transfektert med det gule fluorescerende proteinet Venus (pFAR4-CMV-Venus), og cellekulturer ble overvåket av mikroskopi. I figur 6 kan fluorescerende celler observeres på dag 21 etter transfeksjon. Prosentandelen fluorescerende celler målt ved bildebasert cytometri var 53 ± 29 % for IPE-celler og 28 ± 23 % for RPE-celler (data ikke vist).
Figur 6: Mikrografer av nytransfekterte PE-celler isolert fra kanin. 50.000 IPE- og RPE-celler fra kanin ble transfektert med pFAR4-CMV-Venus. Fluorescensen vises på dag 21 etter transfeksjon. Venstre mikrograf: lysfelt, høyre mikrograf: GFP (480 nm) filter. I alle tilfeller ble transfeksjoner gjort i triplikat (original forstørrelse, 50x). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Transfeksjoner av PE-celler med terapeutiske gener PEDF og GM-CSF
50 000 PE-celler ble transfektert med PEDF og proteinsekresjon ble overvåket av WB (figur 7). WB-signalet for transfekterte celler var høyere sammenlignet med ikke-transfekerte celler for alle arter og dager studert; ingen reduksjon i proteinsekresjon ble observert innen denne tiden.
Figur 7: WB-analyse av PEDF-sekresjon av transfekterte PE-celler. WB-analyse av supernatanter fra gris (prekulturert) (A) og storfe (fersk) (B) PEDF-transfekterte PE-celler viser en høyere PEDF-sekresjon sammenlignet med kontrollen (ikke-transfekerte celler) og stabil over tid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur S1: Instrumenter som brukes til PE-isolasjon avhengig av arten. (A) Ikke-sterile instrumenter som brukes til å enucleation av øynene og rengjøring av gjenværende muskelvev og hud. Sett 1 brukes til rotte, mus og kanin, og sett 2 brukes til gris- og storfeøyne. (B) Sterile instrumenter som brukes til PE-isolasjon. Legg merke til den forskjellige størrelsen på saks og tang som brukes, avhengig av øyestørrelsen. Runde og flate brannpolerte Pasteur pipetter brukes til skrape av henholdsvis RPE og IPE. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Å ha standardiserte metoder for å isolere og kultur PE-celler er grunnleggende for å utvikle nye terapitilnærminger for retinal degenerative sykdommer. Med protokollene som presenteres her, kan PE-celler isoleres fra forskjellige arter og dyrkes i lange perioder (frem til nå ble den lengste kulturen opprettholdt i 2 år1,38); typisk PE-cellemorfologi, pigmentering og funksjon ble observert (Figur 1, Figur 2). Legg merke til at spesielt for rene RPE-kulturer er det viktig å trekke helt ut netthinnen for å unngå forurensning med nevrale netthinneceller; for IPE-celler, bør ciliary kroppen fjernes fra iris som forklart i protokollen. Sammenløp av cellene oppnås på relativt kort tid (~ 21 dager), hvoretter cellene er klare for transfeksjon med terapeutiske gener eller til bruk i andre eksperimenter (f.eks. eksponering for giftige stoffer, proteiner, etc.). Videre er protokollene ikke bare avgjørende for preklinisk in vitro- og in vivo-testing, men også viktig for menneskelig anvendelse, det vil si validering av transfekterte PE-celletransplantasjoner; spesielt for behandling av AMD som i utvikling av vår gruppe, hvor IPE-celler vil bli isolert fra en irisbiopsi, umiddelbart transfektert og transplantert subretinalt til samme pasient innen en kirurgisk økt. Isolasjon og subretinal transplantasjon av autologe IPE-celler ble etablert hos kaniner39 og pasienter23. Siden transplantasjonen av autologe IPE-celler var vellykket, men ikke tilstrekkelig til å gjenopprette syn, hadde transfeksjon av cellene til overekspress nevrobeskyttende faktorer, som PEDF og GM-CSF, blitt lagt til tilnærmingen og etablert i tre arter (mus, rotte og storfe). Med metodene beskrevet her for isolasjon, kultur og genetisk modifikasjon av PE-celler, kan respektive celletransplantasjoner nå fremstilles fra ulike arter for å teste toksisitet og effektivitet av tilnærmingen in vivo.
Det ble vist at VED hjelp av det hyperaktive SB100X transposonsystemet kan PE-celler fra forskjellig opprinnelse effektivt endres for å overekspressere PEDF (Figur 7); lignende resultater ved bruk av rotte IPE og RPE24 og humane RPE celler29,30 er publisert. Transfeksjonen med PEDF har blitt foreslått å behandle nvAMD ved hemming av VEGF-mediert neovascularization og beskyttelse av RPE-celler og retinal nevroner fra glutamat og oksidativt stress samt iskemi40,41. Bekreftelse av stabil langsiktig proteinsekresjon (Figur 7) bekreftet PE-celler som et pålitelig biologisk "legemiddelleveringssystem". I denne forbindelse bekreftet transfeksjonseffektiviteten med reportergenet Venus (figur 4, figur 5, figur 6) høy transfeksjonseffektivitet på ~ 20-100% (art- og donoravhengig) som rapportert i Johnen et al. 1.
Det skal bemerkes at selv om størrelsen på plasmidene som ble brukt var variabel, fra pFAR-miniplasmider (~ 3000 bp) til plasmider med pT2-ryggrad (~ 5000 bp)30, var transfeksjonseffektiviteten relativt høy. Forskjeller sett i transfeksjonseffektivitet skyldes sannsynligvis variasjon i tiden fra enukleasjon til celleisolasjon og i vevsbevaring, men endret ikke cellemorfologi heller ikke tiden da cellene når samløp (~ 21 dager etter isolasjon), eller tid som cellene ble fulgt etter transfeksjon. Generelt er et viktig hensyn for å oppnå en vellykket transfeksjon at kilden til PE-celler skal være så frisk som mulig; Dette er spesielt viktig for transfeksjoner med nyisolerte PE-celler.
Sammenligning med cellearktransplantasjoner, terapien vår gruppe utvikler (transfekterte celler transplantert subretinalt som celleoppheng) er mindre invasiv siden den første krever store retinotomier med tilhørende risiko for proliferativ vitreoretinopati og subretinal fibrose42. I tillegg, i arktransplantasjoner for våt AMD, fjernes området CNV sammen med den tilstøtende choroiden, og derfor kan graftoverlevelse bli kompromittert43. Til slutt er ideen om å bruke en celleplaster ikke kompatibel med den foreslåtte prosedyren, hvor isolasjon, modifikasjon og transplantasjon av cellene gjøres under en enkelt kirurgisk økt. På den annen side er iboende problemer med PE-celler transplantert som cellesuspensjoner potensiell celledød under levering, mangel på vedheft og varians i cellulær distribusjon; men disse ulempene kan overvinnes av vevsteknikk tilnærminger42; I tillegg kan celleoverlevelse forbedres ved bruk av pro-overlevelsesmidler44,45,46,47. Vi mener at transplantasjon av primære PE-celler som overekspresserer nevrobeskyttende faktorer som PEDF og GM-CSF som cellefjæring er en lovende tilnærming for å behandle AMD, og for å utvikle denne terapien er protokollene som presenteres her avgjørende siden de tillater standardisering av isolasjon, kultur og analyse av de primære PE-cellene.
Oppsummert leverer protokollen et avansert modellsystem for utvikling og preklinisk in vitro- og in vivo-testing av okulære avanserte medisinske terapier i fem forskjellige arter, robust nok til å kompensere for individuelle varianser i cellekvalitet fra de forskjellige kildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
En takk fortjener Gregg Sealy og Alain Conti for deres utmerkede tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av EU-kommisjonen i sammenheng med det syvende rammeprogrammet, Swiss National Sciences Foundation og Schmieder-Bohrisch Foundation. Z.I. mottok støtte fra European Research Council, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] og B.M.W. fra et Fulbright Research Grant og Swiss Government Excellence Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
- Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
- Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
- Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
- Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y.
- Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
- Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , Springer-VerlaglWien. New York. 7985-7987 (2004).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
- Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
- Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
- Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
- Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , NCT03144999 (2019).
- , Hemera Biosciences. Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , NCT04358471 (2020).
- Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , NCT03846193 (2019).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
- Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
- Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
- Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
- Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
- Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
- Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , Boston, USA. Meeting Abstract: MDD228. Poster (2020).
- Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
- Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
- Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
- Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
- Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
- Marienfeld. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
- Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
- Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
- Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
- Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
- Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
- Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
- Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
- Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
- Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
- Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).
