Summary
Ici, un protocole pour isoler et transfecter les cellules épithéliales pigmentaires primaires de l’iris et de la rétine de divers mammifères (souris, rats, lapins, porcs et bovins) est présenté. La méthode est parfaitement adaptée à l’étude des approches de thérapie génique oculaire dans diverses configurations pour des analyses ex vivo et des études in vivo transférables à l’homme.
Abstract
La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est la cause la plus fréquente de cécité chez les patients >60 ans, affectant environ 30 millions de personnes dans le monde. La DMLA est une maladie multifactorielle influencée par des facteurs environnementaux et génétiques, qui entraînent une altération fonctionnelle de la rétine due à la dégénérescence des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) suivie d’une dégradation des photorécepteurs. Un traitement idéal comprendrait la transplantation de cellules RPE saines sécrant des facteurs neuroprotecteurs pour prévenir la mort cellulaire RPE et la dégénérescence des photorécepteurs. En raison des similitudes fonctionnelles et génétiques et de la possibilité d’une biopsie moins invasive, la transplantation de cellules épithéliales pigmentaires de l’iris (EPI) a été proposée comme substitut à l’EPR dégénérée. La sécrétion de facteurs neuroprotecteurs par un faible nombre de cellules transplantées sous-rétinales peut être obtenue par transfection à médiation transposonée par la Belle au bois dormant (SB100X)avec des gènes codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) et / ou le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF). Nous avons établi l’isolement, la culture et la transfection médiée par SB100Xdes cellules RPE et IPE de diverses espèces, y compris les rongeurs, les porcs et les bovins. Les globes sont explantés et la cornée et le cristallin sont enlevés pour accéder à l’iris et à la rétine. À l’aide d’une spatule sur mesure, les cellules IPE sont retirées de l’iris isolé. Pour récolter des cellules EPR, une incubation de trypsine peut être nécessaire, selon l’espèce. Ensuite, à l’aide d’une spatule personnalisée RPE, les cellules sont suspendues dans un milieu. Après l’ensemencement, les cellules sont surveillées deux fois par semaine et, après avoir atteint la confluence, transfectées par électroporation. L’intégration, l’expression, la sécrétion et la fonction des protéines ont été confirmées par qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence et tests fonctionnels. Selon les espèces, 30 000 à 5 millions de cellules (EPR) et 10 000 à 1,5 million de cellules (IPE) peuvent être isolées par œil. Les cellules génétiquement modifiées présentent une surexpression significative du PEDF/GM-CSF avec la capacité de réduire le stress oxydatif et offrent un système flexible pour les analyses ex vivo et les études in vivo transférables à l’homme pour développer des approches de thérapie génique oculaire.
Introduction
Notre groupe se concentre sur le développement d’approches régénératives pour traiter la dégénérescence neurorétinienne, c’est-à-dire la DMLA, par thérapie génique non virale basée sur l’EPR et l’IPE. L’établissement préclinique de telles thérapies nécessite des modèles in vitro transférables à l’homme. Ainsi, l’objectif de l’étude présentée ici est de fournir des protocoles pour l’isolement, la culture et le génie génétique des cellules PRIMAIRES RPE et IPE. La raison d’être de l’isolement des cellules PE de plusieurs espèces est de confirmer de manière robuste l’innocuité et l’efficacité de l’approche et d’accroître sa reproductibilité et sa transférabilité. La lignée cellulaire ARPE-19 humaine disponible diffère des cellules primaires (par exemple, elles sont moins pigmentées) et n’a donc qu’une valeur limitée pour les analyses précliniques1. De plus, les cellules de mammifères non humains peuvent être achetées à moindre coût et en plus grandes quantités; les tissus de donneurs humains peuvent être obtenus à partir de diverses banques d’yeux, mais la disponibilité est limitée et coûteuse. Enfin, les nouveaux médicaments de thérapie innovante (ATMP, c’est-à-dire les cellules, les tissus ou les médicaments de thérapie génique) doivent être appliqués à au moins deux espèces différentes avant d’être testés chez les patients et ces études in vivo demandent la préparation de greffes de cellules allogéniques.
Les maladies neurodégénératives de la rétine sont la principale cause de cécité dans les pays industrialisés, comprenant des maladies courantes comme la DMLA, ainsi que des maladies rares comme la rétinite pigmentaire, dans laquelle la mort cellulaire rétinienne conduit finalement à la cécité. Les lésions des cellules EPR, des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) peuvent dans certains cas être ralenties, mais il n’existe actuellement aucun traitement curatif. Les ATMP offrent la possibilité de corriger les défauts génétiques, d’intégrer des gènes thérapeutiques ou de remplacer les cellules dégénérées, permettant ainsi le développement de thérapies régénératives et curatives pour des maladies telles que la DMLA; 13 thérapies géniques ont déjà obtenu l’autorisation de commercialisation, y compris une thérapie pour traiter la dégénérescence rétinienne associée à la mutation RPE652,3. Parmi les personnes âgées (>60 ans), environ 30 millions de personnes dans le monde sont touchées par la DMLA néovasculaire (nvAMD) ou avasculaire (aAMD)4. Les deux formes sont induites par des déclencheurs associés à l’âge, y compris des dommages oxydatifs, une altération de la fonction et une perte de cellules EPR suivies d’une dégradation des photorécepteurs, entre autres (par exemple, allèles de risque génétique, tabagisme, hypertension)5,6. Dans la nvAMD, la pathogenèse est aggravée par un déséquilibre des facteurs angiogéniques et anti-angiogéniques en faveur du facteur de croissance endothélial vasculaire angiogénique (VEGF) qui induit la néovascularisation choroïdienne (CNV). À ce jour, seule la nvAMD peut être traité par des injections intravitréennes mensuelles d’inhibiteurs de la protéine VEGF pour supprimer le CNV; aucun traitement efficace n’est encore disponible pourl’AAMD 6,7.
Plusieurs études ont évalué les thérapies cellulaires pour remplacer le traitement anti-VEGF: des études réalisées par Binder et al., dans lesquelles des cellules RPE autologues fraîchement récoltées ont été transplantées chez des patients atteints de nAMD8,9,10, ont montré une amélioration visuelle modérée, mais seul un petit groupe de patients a atteint une acuité visuelle finale suffisamment élevée pour permettre la lecture. Récemment, une étude clinique de phase I a utilisé un patch RPE dérivé de cellules souches embryonnaires pour traiter la DMLA avec des résultats prometteurs; c’est-à-dire l’efficacité, la stabilité et l’innocuité du timbre RPE jusqu’à 12 mois chez 2 des 10 patients traités11. En outre, plusieurs groupes ont publié des études dans lesquelles des plaques autologues de la membrane-choroïde de BRUCH ont été récoltées dans la rétine périphérique et transplantées dans la macula12,13,14; et des patchs d’EPR induits dérivés de cellules souches pluripotentes (iPSC) ont été générés pour la transplantation15. Pour l’aAMD, des anticorps ciblant la voie du complément ont été testés dans les essais cliniques6,16 et une étude de phase I utilisant une seule injection intravitréenne d’un vecteur viral adéno-associé (AAV) codant le gène du facteur CD59 (AAVCAGsCD59) chez des patients atteints d’atrophie géographique (GA) a été réalisée17; l’étude de phase II a récemment débuté et vise à recruter 132 patients atteints de DMA avancée et à évaluer le résultat à 2 ans après l’intervention18. Enfin, le groupe d’étude FocuS a entamé un essai clinique multicentrique de phase I/II évaluant l’innocuité, la dose-réponse et l’efficacité d’un vecteur AAV recombinant non répliquant codé pour un facteur de complément humain19.
Principalement, l’objectif d’une thérapie régénérative de la DMLA est la transplantation de cellules RPE fonctionnelles, qui ont été endommagées ou perdues. Cependant, les cellules IPE et RPE partagent de nombreuses similitudes fonctionnelles et génétiques (par exemple, la phagocytose et le métabolisme du rétinol), et comme les cellules IPE sont plus facilement récoltées, elles ont été proposées comme substitut RPE20. Même s’il a déjà été démontré que la greffe de cellules IPE retarde la dégénérescence des photorécepteurs dans les modèles animaux21,22 et stabilise la fonction visuelle chez les patients atteints de nvAMD en phase finale, aucune amélioration significative n’a été observée chez ces patients23. Le manque d’efficacité peut être dû au faible nombre de cellules transplantées et/ou au déséquilibre des facteurs rétiniens neuroprotecteurs. Une autre approche consisterait à transplanter des cellules épithéliales pigmentaires transfectées qui surexpriment les facteurs neuroprotecteurs pour restaurer l’homéostasie rétinienne, maintenir les cellules EPR restantes et protéger les photorécepteurs et les CRG de la dégénérescence. Par conséquent, nous proposons une nouvelle thérapie qui comprend la transplantation de cellules RPE ou IPE fonctionnelles qui ont subi un génie génétique pour sécrétiser des protéines neuroprotectrices et anti-angiogéniques, telles que le PEDF, le GM-CSF ou les facteurs de croissance analogues à l’insuline (IGF). L’avantage de développer et d’analyser cette approche chez plusieurs espèces au lieu d’utiliser une lignée cellulaire, une seule espèce, ou un tissu humain est : 1) une reproductibilité et une transférabilité accrues des résultats comme le montrent de nombreuses études réalisées dans des laboratoires indépendants et différentes espèces1,24,25; 2) les cellules de porc ou de bovin sont jetables sans le sacrifice d’animaux supplémentaires; 3) la disponibilité de cellules de porc et de bovins en particulier permet à de grandes séries d’essais de produire des résultats robustes; 4) la connaissance de l’isolement, de la culture et de la modification génétique des cellules à partir des modèles les plus utilisés permet des analyses in vivo chez plusieurs espèces24,25,26 et offre ainsi un meilleur rapport bénéfice-risque pour les premiers patients traités; 5) la flexibilité du protocole présenté permet son utilisation dans divers modèles et dispositifs expérimentaux et pour toutes les thérapies à base de cellules oculaires avec et sans génie génétique. En revanche, les techniques alternatives telles que les lignées cellulaires ou les tissus humains ne sont que d’une transférabilité limitée et/ou d’une jetabilité limitée. Les lignées cellulaires telles que l’ARPE-19 sont idéales pour les expériences préliminaires; cependant, une faible pigmentation et une prolifération élevée diffèrent significativement des cellules primaires1. Les cellules RPE et IPE, qui sont isolées à partir de tissus de donneurs humains, constituent une source précieuse pour des expériences in vitro transférables; cependant, nous obtenons du tissu humain auprès d’une banque d’yeux américano-américaine, ce qui signifie que le tissu a au moins deux jours (après l’énucléation) et nécessite un transport long et coûteux, mais que le tissu du donneur local n’est pas disponible en quantité suffisante pour une recherche productive. L’avantage de l’utilisation de cellules primaires est confirmé par de multiples études d’autres groupes27,28.
Pour le développement d’une thérapie génique non virale à base de cellules utilisant le système de transposon SB100X pour transfecter les cellules RPE et IPE primaires avec les gènes codant pour PEDF et / ou GM-CSF pour traiter nvAMD et aAMD, respectivement29,30,31,32, nous avons d’abord établi la transfection des cellules ARPE-191 . Ensuite, les protocoles d’isolement et de transfection ont été établis dans des cellules primaires bovines et porcines facilement accessibles. Maintenant, l’isolement et la transfection des cellules primaires RPE et IPE de cinq espèces différentes ont été établis, des petits (comme la souris) aux grands mammifères (comme le bétail). Elle a été confirmée dans des cellules primaires RPE et IPE dérivées d’yeux de donneurs humains30. La production conforme aux Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) de l’ATMP a également été validée à l’aide de tissus de donneurshumains 33. Enfin, l’innocuité et l’efficacité de l’approche ont été évaluées in vivo chez trois espèces différentes pour lesquelles le protocole a été adapté : la souris, le rat et le lapin. Dans la configuration clinique, une biopsie de l’iris sera prélevée sur le patient et les cellules IPE seront isolées et transfectées dans la salle blanche, avant que les cellules ne soient transplantées par voie sous-rétinale chez le même patient. L’ensemble du processus aura lieu au cours d’une seule séance chirurgicale d’une durée d’environ 60 minutes. Le développement de l’approche thérapeutique et l’évaluation de son efficacité ont demandé d’excellents modèles in vitro et ex vivo pour mettre en œuvre des méthodes d’administration de gènes robustes et efficaces, pour analyser l’efficacité de l’administration de gènes, la production de protéines thérapeutiques et les effets neuroprotecteurs, et pour produire des greffes de cellules pour testerl’approche in vivo1,24, 25,29,30 . Il convient de mentionner que la thérapie a l’approbation éthique pour un essai clinique de phase Ib/IIa de la commission éthique pour la recherche du canton de Genève (n° 2019-00250) et que les dernières données précliniques actuellement demandées pour autorisation par les autorités réglementaires suisses sont collectées à l’aide du protocole présenté. À cet égard, les données précliniques in vivo ont démontré une réduction significative de la CNV et une excellente sécurité24,25,31.
Ici, l’isolement et la culture de cellules RPE/IPE de bovins, de porcs, de lapins, de rats et de souris, ainsi que l’utilisation du système de transposition intégratif SB100X combiné à l’électroporation comme méthode efficace d’administration de gènes sont décrits. En particulier, les cellules PE primaires ont été transfectées pour surexprimer le PEDF et le GM-CSF. La collecte de ces protocoles permet de réalisées dans toutes les phases précliniques du développement de l’ATMP. De plus, la configuration a le potentiel d’être adaptée à d’autres gènes d’intérêt et maladies.
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Protocol
Les protocoles dans lesquels les animaux ont été impliqués ont été réalisés par du personnel certifié et après autorisation du Département cantonal de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale de Genève, Suisse, et conformément à la Déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle (approbation no. GE/94/17). Des rats bruns de Norvège adultes en bonne santé, des souris C57BL/6 et des lapins blancs néo-zélandais ont été euthanasiés par une surdose de Pentobarbital (150 mg/kg) dilué dans du NaCl injecté par voie intrapéritonéale à 0,9 % et les yeux ont été énucléés immédiatement après le sacrifice. Les yeux de porc et de bovin ont été obtenus dans un abattoir local dans les 6 heures suivant le sacrifice et ont été transportés au laboratoire sur de la glace.
1. Avant la préparation
- Préparer un milieu complet (DMEM/Ham’s F12 complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 80 U/mL de pénicilline / 80 μg/mL de streptomycine et 2,5 μg/mL d’amphotéricine B). Chauffer le fluide, 1x PBS, et 0,25% de trypsine (si nécessaire) dans un bain-marie à 37 °C.
- Mettez un drap stérile dans la capuche pour préparer un lieu de travail aseptique. Introduisez tous les instruments et matériaux stériles nécessaires à l’intérieur du capot.
REMARQUE: Seule l’énucléation des yeux et le nettoyage du tissu musculaire et de la peau restants sont les procédures effectuées à l’extérieur de la hotte, le reste des étapes doit être effectué à l’intérieur de la hotte.
2. Isolement des cellules PE de rat/souris
- Utilisez des ciseaux incurvés et des pinces Colibri pour énucléer les yeux après l’euthanasie de l’animal. Nettoyez le tissu musculaire et la peau restants des yeux à l’aide de ciseaux et de pinces (non stériles).
REMARQUE: La taille des ciseaux et des pinces utilisés pour l’énucléation et le nettoyage des yeux dépend de l’espèce (par exemple, pour le rat et la souris, les instruments seront plus petits que ceux utilisés pour les porcs et les bovins) (voir figure S1).- Recueillir les yeux dans un tube de 50 mL rempli de PBS non stérile et transférer le tube dans la hotte à écoulement laminaire. Désinfectez les yeux en les immergeant pendant 2 min dans une solution à base d’iode, puis transférez-les dans une boîte de Petri remplie de PBS stérile.
- Ouverture de l’ampoule
- Après avoir transféré les yeux dans une boîte de Petri stérile, tenez-en une fermement près du nerf optique avec Colibri ou une pince pointue. Percez un trou près de la limite de l’iris (entre pars plana et ora serrata) avec une aiguille de 18 G. Insérez de petits ciseaux dans le trou et coupez autour de l’iris. Retirez le segment antérieur (cornée, lentille et iris) et mettez-le dans une boîte de Pétri. Laissez le bulbe avec le vitré jusqu’à ce que les cellules RPE soient isolées.
- Isolement des cellules IPE
- Retirez la lentille et, à l’avec de fines pinces, retirez délicatement l’iris contenant les cellules IPE. Placez l’iris dans une boîte de Pétri, lavez-le avec du PBS stérile et laissez-le dans du PBS jusqu’à ce que plus d’iris soit préparé.
- Répétez les étapes 2.2.1 à 2.3.1 pour que tous les yeux soient préparés ce jour-là.
- Ajouter 50 μL de trypsine à 0,25 % par iris et incuber pendant 10 min à 37 °C. Retirer la trypsine, ajouter 150 μL de milieu complet par iris et gratter délicatement l’IPE avec une pipette Pasteur plate polie au feu; utiliser des pinces fines pour immobiliser le tissu. Recueillir la suspension cellulaire et la mettre dans un tube de 1,5 mL. Utilisez 10 μL de la suspension cellulaire diluée 1:3 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer34,35.
- S’ils ne sont pas transfectés immédiatement, ensemencer 200 000 cellules/puits dans une plaque de 24 puits (100 000 cellules/cm2)dans 1 mL de milieu complet (10 % FBS) (pour l’ensemencement, voir tableau 1). Placez la plaque dans un incubateur et culturez-la à 37 °C, 5% de CO2.
REMARQUE: Il peut être nécessaire de regrouper plusieurs yeux pour avoir suffisamment de cellules pour l’ensemencement.
- Isolement des cellules RPE
- Enlevez l’humeur vitrée et la rétine du segment postérieur avec une pince mince. Évitez d’endommager l’épithélium pigmentaire rétinien.
- Coupez le segment en deux avec un scalpel #10 pour que le globe soit complètement ouvert et lavez-le avec du PBS stérile.
- Ajouter 50 μL de trypsine à 0,25 % par œil et incuber pendant 10 min à 37 °C. Retirer la trypsine et ajouter 150 μL de milieu complet par globe et gratter délicatement les cellules RPE avec un scalpel rond; utiliser des pinces fines pour immobiliser le tissu. Recueillez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 mL. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire; diluer 1:4 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
- Voir l’étape 2.3.4.
REMARQUE: Il peut être nécessaire de regrouper plusieurs yeux pour avoir suffisamment de cellules pour l’ensemencement.
3. Isolement des cellules PE du lapin
- Effectuer le nettoyage et la désinfection comme décrit aux étapes 2.1 à 2.1.1.
- Placez un œil sur une compresse de gaze stérile et maintenez-la fermement près du nerf optique. Ouvrez l’œil avec le scalpel #11 et des ciseaux à environ 2 mm sous les limbes. Retirez le segment antérieur (cornée, lentille et iris) et mettez-le dans une boîte de Pétri. Laissez le bulbe avec le vitré jusqu’à ce que les cellules RPE soient isolées.
- Isolement des cellules IPE
- Effectuez l’étape 2.3.1. Retirez le corps ciliaire de l’iris en coupant avec un scalpel #10.
- Après la préparation de 2 iris, incuber avec 1 mL de trypsine à 0,25 % à 37 °C pendant 10 min; pendant ce temps, les cellules RPE peuvent être isolées (voir l’étape 3.4). Retirer la trypsine et ajouter 1 mL de milieu complet à l’iris et isoler les cellules en les grattant soigneusement avec une pipette Pasteur plate polie au feu. Resuspendez soigneusement les cellules par pipetage et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer 1:3 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
- Voir l’étape 2.3.4.
- Isolement des cellules RPE
- Effectuez l’étape 2.4.1.
- Mettez une gaze stérile dans une plaque de 12 puits et mettez l’ampoule sur la gaze.
- Lavez avec PBS et effectuez l’étape 2.4.3.
REMARQUE: Utilisez une pipette Pasteur incurvée polie au feu. - Centrifuger les cellules 10 min à 120 x g.
- Voir l’étape 2.3.4.
4. Isolement des cellules PE du porc
- Effectuez le nettoyage comme décrit à l’étape 2.1. Laver avec du PBS et désinfecter les yeux en les immergeant pendant 2 min dans une solution à base d’iode, rincer avec du PBS. Passez à l’étape 3.2.
- Isolement des cellules IPE
- Effectuez l’étape 3.3.1. Après la préparation de 2 iris, ajouter 1 mL de milieu complet et isoler les cellules en les grattant soigneusement avec une pipette Pasteur plate polie au feu. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer 1:4 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
- Voir l’étape 2.3.4.
- Isolement des cellules RPE
- Effectuez l’étape 2.4.1. Placez l’ampoule dans une boîte de Pétri et lavez-la avec du PBS. Remplissez l’ampoule avec 1 mL de milieu complet.
- À l’aide d’une pipette Pasteur incurvée polie au feu, retirez soigneusement les cellules RPE. Assurez-vous de gratter du bas vers le haut pour éviter de glisser vers le bas du complexe membranaire choroïde-Bruch. Recueillir la suspension cellulaire à l’intérieur de l’ampoule à l’aide d’une pipette de 1 000 μL et la transférer dans un tube de 1,5 mL pour la remise en suspension. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer 1:8 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
- Voir l’étape 2.3.4.
5. Isolement des cellules PE bovines
- Effectuez le nettoyage comme décrit à l’étape 2.1. Laver avec du PBS et désinfecter les yeux en les immergeant pendant 2 min dans une solution à base d’iode, rincer avec du PBS. Passez à l’étape 3.2.
- Isolement des cellules IPE
- Effectuez l’étape 3.3.1. Après la préparation de deux iris, incuber avec 2 mL de trypsine à 0,25 % à 37 °C pendant 10 min. Pendant ce temps, les cellules RPE peuvent être isolées (voir l’étape 5.3).
- Retirer la trypsine et ajouter 2 mL de milieu complet à l’iris et isoler les cellules en les rayant soigneusement avec une pipette Pasteur plate polie au feu. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Centrifuger les cellules 10 min à 120 x g. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer 1:4 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
- S’ils ne sont pas transfectés immédiatement, semer 320 000 cellules/puits dans une plaque de 6 puits dans 3 mL de milieu complet (10 % FBS) (pour l’ensemencement voir tableau 1). Placez la plaque dans un incubateur et culturez-la à 37 °C, 5% de CO2.
- Isolement des cellules RPE
- Suivez l’étape 2.4.1. Placez l’ampoule dans une boîte de Pétri et lavez-la avec du PBS. Après préparation de 2 yeux, remplissez le bulbe environ 3/4 de trypsine et incubez pendant 25 min à 37 °C avec le couvercle de la boîte de Petri sur le dessus du bulbi.
- Retirer la trypsine et ajouter 1 mL de milieu complet. Effectuez l’étape 4.3.2. Centrifuger les cellules 10 min à 120 x g.
- Voir l’étape 5.2.3.
6. Culture - changement moyen
- Culture des cellules dans le F12 de DMEM/Ham, complété par 10 % de FBS, 80 U/mL de pénicilline /80 μg/mL de streptomycine et 2,5 μg/mL d’amphotéricine B, à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Après 3-4 jours, pipettez de haut en bas pour recueillir les cellules non adhérentes et mettez la moitié du volume dans un autre puits. Remplir jusqu’à 1 mL avec un milieu complet.
REMARQUE: Cela permet d’avoir une surface suffisamment grande pour que toutes les cellules isolées se fixent et maximisent la sortie. - Après 3-4 jours supplémentaires, répétez la collecte de cellules, mais cette fois en remettant en commun les cellules non adhérentes de deux puits en un seul puits (par exemple, A1 + B1 dans C1). Ajouter du milieu à tous les puits. Observez les cellules et changez le milieu 2 fois par semaine (pour les plaques de 6 et 24 puits, utilisez respectivement 3 et 1 mL / puits). Lorsque les cellules atteignent la confluence, passez à un milieu complet avec 1% de FBS ou utilisez les cellules pour des expériences (par exemple, transfection).
REMARQUE: Les cellules RPE et IPE sont confluentes après 3-4 et 4-5 semaines après l’isolement, respectivement. La pureté de la culture cellulaire a été corroborée en vérifiant la morphologie cellulaire (cellules pigmentées) et les marqueurs spécifiques tels que décrits par Johnen et ses collègues36.
7. Électroporation des cellules PE primaires
- Effectuer l’électroporation comme décrit avant1,37.
- Selon le nombre de cellules transfectées, utilisez des plaques de 6, 24 ou 48 puits (voir tableau 2)pour ensemencer les cellules dans un milieu sans antibiotiques ni antimycotiques. Pendant les 2 semaines suivantes, ajouter des gouttes contenant du milieu contenant de la pénicilline (80 U/mL), de la streptomycine (80 μg/mL) et de l’amphotéricine B (2,5 μg/mL) deux fois par semaine. Échangez complètement le milieu 2 semaines après la transfection.
- Pour déterminer la croissance cellulaire, l’efficacité de la transfection et la sécrétion de protéines, surveillez les cellules chaque semaine par microscopie et analysez le surnageant de culture cellulaire par transfert western. Avant la fin de la culture, prendre un surnageant de culture cellulaire de 24 heures pour quantifier la sécrétion de protéines par ELISA, compter les cellules, mesurer la fluorescence par cytométrie basée sur l’image (dans le cas des cellules transfectées de Vénus)en suivant les instructions des fabricants (voir Tableau des matériaux),et collecter la pastille cellulaire pour l’analyse de l’expression génique basée sur la RT-qPCR.
NOTE: Ces méthodes ne sont pas incluses dans le présent document car il ne s’agit pas d’expliquer en détail l’analyse des cellules, mais plutôt leur isolement. La densité d’ensemencement cellulaire est la même pour toutes les espèces (100 000cellules/cm2)mais comme le nombre de cellules isolées varie, différentes plaques ont été utilisées. De plus, pour les souris, les rats et les lapins, il peut être nécessaire de mettre en commun 2-3 yeux pour avoir suffisamment de cellules pour l’ensemencement.
| Espèce | Traitement à la trypsine | N° Cellules IPE | N° Cellules RPE | Plaque pour l’ensemencement (100 000 cellules/cm2) |
| Souris/rat | Oui | Environ 50 000 | ~150 000 | Plaques de 24 puits |
| Lapin | Oui | Environ 350 000 | ~2 500 000 | Plaques de 24 puits |
| Cochon | Non | ~1 000 000 | ~3 000 000 | Plaques de 24 puits |
| Bovin | Oui | ~1 700 000 | ~5 000 000 | Plaques à 6 puits |
Tableau 1 : Nombre de cellules PE primaires isolées à partir d’yeux de différentes espèces.
| Nom | Aire | Volume moyen | Trypsine | Milieu volumique pour arrêter l’action de la trypsine | Densité d’ensemencement |
| Plaque à 6 puits | 9,6 cm² | 3,0 mL | 0,5 mL | 1,0 mL | 3x105 |
| Plaque de 24 puits | 2,0 cm² | 1,0 mL | 0,2 mL | 0,8 mL | 5x104 |
| Plaque de 48 puits | 1,1 cm² | 0,5 mL | 0,1 mL | 0,4 mL | 0,5-1x104 |
Tableau 2 : Volumes de culture cellulaire et densités d’ensemencement.
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Representative Results
Isolement de l’EP de différentes espèces de mammifères
En utilisant les protocoles susmentionnés, les cellules IPE et RPE ont été isolées et cultivées avec succès à partir de cinq espèces différentes. Le nombre de cellules obtenues à partir de chaque procédure dépend de l’espèce et de la taille de l’œil (Tableau 1). Comme le montre la figure 1,les cellules présentent une morphologie et une pigmentation typiques des cellules PE (à l’exception des cellules de lapin montrées, dérivées de lapins blancs de Nouvelle-Zélande (NZW) albinos). 21 jours après l’isolement, les cellules sont confluentes, prêtes à être utilisées pour d’autres expériences (par exemple, des transfections). Il convient de noter que les cultures de toutes les espèces sont surveillées et contrôlées plus avant jusqu’à 2 ans confirmant une morphologie normale et une expression transgénique stable (données non présentées).
La dédifférenciation, le stress cellulaire et les changements dans l’expression des gènes ont été exclus par la RT-qPCR et l’immunohistochimie. Un panel de gènes (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8) analysés dans des cellules RPE humaines transfectées (cellules ARPE-19) a confirmé un schéma d’expression normal de l’EPR1; qui ont pu être confirmés dans les cellules IPE bovines primaires par immunofluorescence pour RPE65 (Figure 2). En outre, Johnen et ses collègues ont corroboré l’immunocoloration ZO-1 dans les cellules IPE et RPE porcines primaires36.
Figure 1: Micrographies de cellules PE de divers mammifères 21 jours après l’isolement. Les cellules IPE et RPE de souris, de lapin (lapin albinos NZW), de porc et de bovin sont montrées au jour 21 après l’isolement. Pour toutes les espèces, les cultures montrées sont confluentes. Notez que les cellules PE du lapin ne sont pas pigmentées (grossissement d’origine, 50x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Immunocoloration RPE65 des cellules IPE primaires. Coloration RPE65 (vert) des cellules IPE bovines transfectées avec le plasmide transposon pFAR4-CMV-PEDF en utilisant un nombre initial de cellules de 1 x 104 cellules par rapport aux cellules témoins non transfectées (grossissement original, 200x). Les noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Viabilité de l’EPR primaire transfecté
La viabilité des cellules est illustrée à la figure 3. Pour exclure une toxicité potentielle du tampon utilisé pour le procédé d’électroporation, des cellules EPR primaires pré-cultivées ont été suspendues dans un tampon d’électroporation à partir d’un kit disponible dans le commerce, ou dans un tampon nutritif développé par une société pharmaceutique (composition confidentielle) et électroporés (E) (sans ajout de plasmide) comme décrit à l’étape 7 du protocole. La viabilité cellulaire a été étudiée 3 jours ± 1 jour après la transfection à l’aide d’un kit de dosage de cytotoxicité disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux)en suivant les instructions du fabricant. Les essais ont toujours été effectués avec une commande sans puissance (Co-P) (non électroporée). Aucun impact sur la viabilité cellulaire n’a été observé pour aucun des tampons testés(figure 3).
Figure 3: Viabilité des cellules EPR primaires en suspension dans différents tampons. 1 x 104 cellules ont été suspendues dans un tampon d’électroporation à partir d’un kit disponible dans le commerce ou dans un tampon nutritif. La viabilité cellulaire a été mesurée 3 jours ± 1 jour après la transfection à l’aide d’un kit de dosage de cytotoxicité disponible dans le commerce. Aucune différence de viabilité n’a été observée entre les différents tampons; les données sont représentées par la moyenne ± et le DS (n = 2 donneurs, 3 répliqués/donneurs). E: cellules électroporées, Co-P: contrôle sans alimentation. AU : unités arbitraires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Transfections de cellules PE pré-cultivées avec le gène rapporteur de Vénus
50 000 à 100 000 cellules PE pré-cultivées de différentes espèces ont été transfectées avec la protéine fluorescente jaune de Vénus (pT2-CAGGS-Vénus) à l’aide du système hyperactif SB100X transposon gene delivery. Les micrographies montrées à la figure 4 corroborent que les cellules ont été transfectées avec succès (cellules fluorescentes 21 jours après la transfection). La figure 5 montre la quantification de l’efficacité de la transfection dans les cellules RPE de porc pré-cultivées (n = 6 donneurs, 50 000 cellules/transfection) transfectées avec Vénus (pT2-CAGGS-Vénus). Le pourcentage de cellules fluorescentes et d’IMF a été mesuré à l’aide de la cytométrie basée sur l’image en suivant les instructions du fabricant le jour de la fin de la culture cellulaire (30 ± 5 jours après la transfection). Le pourcentage moyen de cellules fluorescentes était de 50 ± 30 %, mais variable allant de 95 ± 6 % (donneur 2) à 28 ± 1 % (donneur 4)(figure 5). Dans toutes les expériences, des cellules ARPE-19 transfectées ont été utilisées comme témoin positif. De plus, l’efficacité de la transfection a toujours été comparée aux contrôles négatifs : Co-P (contrôle sans puissance [non électroporé]) et Co+P (contrôle avec puissance [électroporé mais sans ajout de plasmides]). L’expérience a également été réalisée avec des cellules IPE (données non présentées).
Figure 4: Micrographies de cellules PE pré-cultivées transfectées avec pT2-CAGGS-Vénus. Lescellules PE de lapin transfecté de Vénus (A), bovine (B) et porcine (C) sont montrées 21 jours après la transfection. Comme témoin positif, 50 000 cellules ARPE-19 ont été transfectées avec Vénus (D). Micrographie gauche: champ lumineux, micrographie droite: filtre GFP (480 nm) (grossissement d’origine, 50x). Les transfections ont été effectuées en trois exemplaires et les témoins négatifs ont été inclus : Co-P (contrôle sans puissance [non électroporé]) et Co+P (contrôle avec puissance [électroporé mais sans ajout de plasmides]) (non montré). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Efficacité de transfection dans les cellules EPR porcines transfectées avec le gène rapporteur de Vénus. (A)50 000 cellules EPR porcines primaires ont été transfectées avec pT2-CAGGS-Vénus, l’efficacité moyenne globale de la transfection était de 50 ± 30 % et l’IFM moyenne était de 2712 ± 197 au jour de la fin des cultures cellulaires (30±5 jours après la transfection). Le graphique montre la moyenne ± SD (n = 3 répliques) de 6 animaux différents. (B) Le pourcentage de cellules Vénus+ ARPE-19 utilisées comme témoin positif était de 98±6% et était stable pendant les 138 jours où les cellules ont été suivies. L’intensité moyenne de fluorescence (IMF) était de 5 785 ± 1 255. Le graphique montre la moyenne ± SD (n = 3 réplications) pour chaque jour. Co-P (contrôle sans puissance [non électroporé]) et Co+P (contrôle avec puissance [électroporé mais sans ajout de plasmides]) ont été inclus dans toutes les expériences de transfection (non montré). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Transfections de cellules PE fraîchement avec le gène rapporteur de Vénus
10 000 à 50 000 cellules PE fraîchement isolées de lapins ont été transfectées avec la protéine fluorescente jaune Vénus (pFAR4-CMV-Vénus), et les cultures cellulaires ont été surveillées par microscopie. Dans la figure 6, des cellules fluorescentes peuvent être observées au jour 21 après la transfection. Le pourcentage de cellules fluorescentes mesurées par cytométrie basée sur l’image était de 53 ± de 29 % pour les cellules IPE et de 28 ± 23 % pour les cellules RPE (données non présentées).
Figure 6: Micrographies de cellules PE fraîchement transfectées isolées de lapin. 50 000 cellules IPE et RPE de lapin ont été transfectées avec pFAR4-CMV-Vénus. La fluorescence est montrée au jour 21 après la transfection. Micrographie gauche: champ lumineux, micrographie droite: filtre GFP (480 nm). Dans tous les cas, les transfections ont été effectuées en trois exemplaires (grossissement original, 50x). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Transfections de cellules PE avec les gènes thérapeutiques PEDF et GM-CSF
50 000 cellules PE ont été transfectées avec peDF et la sécrétion de protéines a été surveillée par WB (Figure 7). Le signal WB pour les cellules transfectées était plus élevé que pour les cellules non transfectées pour toutes les espèces et tous les jours étudiés; aucune diminution de la sécrétion de protéines n’a été observée au cours de cette période.
Figure 7: Analyse WB de la sécrétion de PEDF des cellules PE transfectées. L’analyse WB des surnageants provenant de cellules PEDFtransfectées de porcs (pré-cultivés) (A) et de bovins (fraîchement) (B) montre une sécrétion de PEDF plus élevée par rapport au témoin (cellules non transfectées) et stable dans le temps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure S1: Instruments utilisés pour l’isolement de l’EP selon les espèces. (A) Instruments non stériles utilisés pour l’énucléation des yeux et le nettoyage des tissus musculaires et de la peau restants. L’ensemble 1 est utilisé pour le rat, la souris et le lapin, et l’ensemble 2 est utilisé pour les yeux de porc et de bovin. (B) Instruments stériles utilisés pour l’isolement du PE. Notez les différentes tailles de ciseaux et de pinces utilisées en fonction de la taille des yeux. Les pipettes Pasteur rondes et plates polies au feu sont utilisées pour le grattage de RPE et IPE, respectivement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Avoir des méthodes normalisées pour isoler et mettre en culture des cellules PE est fondamental dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies dégénératives de la rétine. Avec les protocoles présentés ici, les cellules PE peuvent être isolées avec succès de différentes espèces et cultivées pendant de longues périodes (jusqu’à présent, la culture la plus longue était maintenue pendant 2 ans1,38); la morphologie, la pigmentation et la fonction typiques des cellules PE ont été observées (Figure 1, Figure 2). Notez que, en particulier pour les cultures RPE pures, il est important d’extraire complètement la rétine pour éviter la contamination par les cellules rétiniennes neurales; pour les cellules IPE, le corps ciliaire doit être retiré de l’iris comme expliqué dans le protocole. La confluence des cellules est obtenue en un temps relativement court (~ 21 jours), après quoi les cellules sont prêtes pour la transfection avec des gènes thérapeutiques ou pour une utilisation dans d’autres expériences (par exemple, exposition à des agents toxiques, des protéines, etc.). De plus, les protocoles sont non seulement cruciaux pour les essais précliniques in vitro et in vivo, mais aussi importants pour l’application humaine, c’est-à-dire la validation des greffes de cellules PE transfectées; en particulier pour le traitement de la DMLA tel qu’il est en cours de développement par notre groupe, où les cellules IPE seront isolées à partir d’une biopsie de l’iris, immédiatement transfectées et transplantées sous-rétinales au même patient en une seule séance chirurgicale. L’isolement et la transplantation sous-rétinale de cellules IPE autologues ont été établis chez des lapins39 et des patients23. Étant donné que la transplantation de cellules IPE autologues a été réussie mais pas suffisante pour restaurer la vision, la transfection des cellules pour surexprimer les facteurs neuroprotecteurs, tels que le PEDF et le GM-CSF, avait été ajoutée à l’approche et établie chez trois autres espèces (souris, rats et bovins). Avec les méthodes décrites ici pour l’isolement, la culture et la modification génétique des cellules PE, les greffes de cellules respectives peuvent maintenant être préparées à partir de diverses espèces pour tester la toxicité et l’efficacité de l’approche in vivo.
Il a été démontré qu’en utilisant le système de transposon hyperactif SB100X, les cellules PE de diverses origines peuvent être modifiées efficacement pour surexprimer le PEDF(Figure 7); des résultats similaires utilisant l’IPE et l’EPR24 du rat et les cellules RPEhumaines 29,30 ont été publiés. La transfection avec PEDF a été proposée pour traiter la nvAMD par inhibition de la néovascularisation médiée par le VEGF et protection des cellules RPE et des neurones rétiniens contre le glutamate et le stress oxydatif ainsi que l’ischémie40,41. La corroboration de la sécrétion stable de protéines à long terme(figure 7)a confirmé que les cellules PE sont un « système d’administration de médicaments » biologique fiable. À cet égard, l’efficacité de la transfection étudiée avec le gène rapporteur Venus (Figure 4, Figure 5, Figure 6) a confirmé des efficacités de transfection élevées d’environ 20 à 100% (dépendantes de l’espèce et du donneur), comme indiqué dans Johnen et al. 1.
Il convient de noter que bien que la taille des plasmides utilisés soit variable, des miniplasmides pFAR (~ 3 000 pb) aux plasmides avec un épine dorsale pT2 (~ 5 000 pb)30, les efficacités de transfection étaient comparativement élevées. Les différences observées dans l’efficacité de la transfection sont probablement dues à la variabilité du temps entre l’énucléation et l’isolement cellulaire et à la préservation des tissus, mais n’ont pas modifié la morphologie cellulaire, ni au moment où les cellules atteignent la confluence (~ 21 jours après l’isolement), ni au temps où les cellules ont été suivies après la transfection. En général, une considération importante pour obtenir une transfection réussie est que la source des cellules PE doit être aussi fraîche que possible; ceci est particulièrement important pour les transfections avec des cellules PE fraîchement isolées.
En comparaison avec les greffes de feuilles cellulaires, la thérapie que notre groupe développe (cellules transfectées transplantées sous-rétinales sous forme de suspension cellulaire) est moins invasive puisque la première nécessite de grandes rétinotomies avec les risques associés de vitréorétinopathie proliférative et de fibrose sous-rétinienne42. En outre, dans les greffes de feuille pour la DMLA humide, la zone de CNV est enlevée avec la choroïde adjacente et, par conséquent, la survie du greffon pourrait être compromise43. Enfin, l’idée d’utiliser un patch cellulaire n’est pas compatible avec la procédure proposée, où l’isolement, la modification et la transplantation des cellules se font au cours d’une seule séance chirurgicale. D’autre part, les problèmes inhérents aux cellules PE transplantées sous forme de suspensions cellulaires sont la mort cellulaire potentielle pendant l’accouchement, le manque d’adhésion et la variance de la distribution cellulaire; mais ces inconvénients pourraient être surmontés par des approches d’ingénierie tissulaire42; en outre, la survie cellulaire pourrait être améliorée par l’utilisation d’agents pro-survie44,45,46,47. Nous pensons que la transplantation de cellules PE primaires surexprimant des facteurs neuroprotecteurs tels que le PEDF et le GM-CSF en suspension cellulaire est une approche prometteuse pour traiter la DMLA, et pour développer cette thérapie, les protocoles présentés ici sont cruciaux car ils permettent la normalisation de l’isolement, de la culture et de l’analyse des cellules PE primaires.
En résumé, le protocole fournit un système modèle avancé pour le développement et les tests précliniques in vitro et in vivo de thérapies médicinales oculaires avancées chez cinq espèces différentes, suffisamment robuste pour compenser les variations individuelles de la qualité cellulaire provenant des différentes sources.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Un grand merci à Gregg Sealy et Alain Conti pour leur excellente assistance technique. Ces travaux ont été soutenus par la Commission européenne dans le cadre du septième programme-cadre, du Fonds national suisse de la recherche scientifique et de la Fondation Schmieder-Bohrisch. Z.I. a reçu un financement du Conseil européen de la recherche, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] et B.M.W. d’une bourse de recherche Fulbright et d’une bourse d’excellence de la Confédération suisse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
- Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
- Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
- Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
- Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y.
- Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
- Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , Springer-VerlaglWien. New York. 7985-7987 (2004).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
- Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
- Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
- Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
- Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , NCT03144999 (2019).
- , Hemera Biosciences. Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , NCT04358471 (2020).
- Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , NCT03846193 (2019).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
- Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
- Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
- Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
- Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
- Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
- Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , Boston, USA. Meeting Abstract: MDD228. Poster (2020).
- Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
- Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
- Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
- Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
- Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
- Marienfeld. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
- Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
- Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
- Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
- Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
- Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
- Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
- Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
- Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
- Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
- Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).
