Summary
Här presenteras ett protokoll för att isolera och transfektera primära iris och retinal pigment epitelial celler från olika däggdjur (möss, råtta, kanin, gris och nötkreatur). Metoden är idealisk för att studera okulära genterapimetoder i olika upplägg för ex vivo-analyser och in vivo-studier som kan överföras till människor.
Abstract
Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är den vanligaste orsaken till blindhet hos patienter >60 år, vilket påverkar ~ 30 miljoner människor över hela världen. AMD är en multifaktoriell sjukdom som påverkas av miljömässiga och genetiska faktorer, som leder till funktionella nedskrivningar av näthinnan på grund av att retinal pigment epitelial (RPE) cell degeneration följt av photoreceptor nedbrytning. En idealisk behandling skulle omfatta transplantation av friska RPE celler utsöndrar neuroprotektiva faktorer för att förhindra RPE cell död och photoreceptor degeneration. På grund av funktionella och genetiska likheter och möjligheten till en mindre invasiv biopsi, föreslogs transplantation av iris pigment epitelial (IPE) celler som ersättning för de urartade RPE. Utsöndring av neuroprotektiva faktorer med ett lågt antal subretinally transplanterade celler kan uppnås genom Törnrosa (SB100X) transposonmedierad transfektion med gener som kodar för pigmentet epitel-härledd faktor (PEDF) och/eller granulocyt makrofagkolonistimulerande faktor (GM-CSF). Vi etablerade isolering, kultur och SB100X-medieradtransfektion av RPE- och IPE-celler från olika arter inklusive gnagare, grisar och nötkreatur. Jordglober explanteras och hornhinnan och linsen avlägsnas för att komma åt iris och näthinnan. Med hjälp av en specialtillverkad spatel avlägsnas IPE-celler från den isolerade iris. För att skörda RPE-celler kan en trypsininkubation krävas, beroende på arten. Sedan, med hjälp av RPE-anpassad spatel, suspenderas cellerna i medium. Efter sådd övervakas cellerna två gånger i veckan och, efter att ha nått sammanflöde, transfected av elektroporation. Gen integration, uttryck, protein utsöndring och funktion bekräftades av qPCR, WB, ELISA, immunofluorescens och funktionella analyser. Beroende på arten kan 30 000-5 miljoner (RPE) och 10 000-1,5 miljoner (IPE) celler isoleras per öga. Genetiskt modifierade celler visar betydande PEDF/GM-CSF överuttryck med kapacitet att minska oxidativ stress och erbjuder ett flexibelt system för ex vivo-analyser och in vivo-studier som kan överföras till människor för att utveckla okulära genterapimetoder.
Introduction
Vår grupp fokuserar på utveckling av regenerativa metoder för att behandla neuroretinal degeneration, det vill säga AMD, genom RPE- och IPE-baserad icke-viral genterapi. Den prekliniska etableringen av sådana terapier kräver in vitro-modeller som kan överföras till människor. Således är målet med studien som presenteras här att leverera protokoll för isolering, kultur och genteknik av primära RPE- och IPE-celler. Motiveringen för att fastställa isoleringen av PE-celler från flera arter är att på ett robust sätt bekräfta säkerheten och effektiviteten i tillvägagångssättet och öka dess reproducerbarhet och överförbarhet. Den tillgängliga humana RPE-cellinjen ARPE-19 skiljer sig från primärceller (t.ex. de är mindre pigmenterade) och är därför endast av begränsat värde för prekliniska analyser1. Dessutom kan icke-mänskliga däggdjursceller köpas för mindre kostnad och i större mängder; mänsklig donatorvävnad kan erhållas från olika eyebanks, men tillgängligheten är begränsad och dyr. Slutligen måste nya läkemedel för avancerad terapi (ATMP, dvs. cell-, vävnads- eller genterapiläkemedel) appliceras på minst två olika arter innan de testas på patienter och dessa in vivo-studier kräver att allogena celltransplantationer förbereds.
Retinal neurodegenerativa sjukdomar är den ledande orsaken till blindhet i industrialiserade länder, bestående av vanliga sjukdomar som AMD, liksom sällsynta sjukdomar som retinitis pigmentosa, där retinalcellens död så småningom leder till blindhet. RPE-celler, fotoreceptor och retinal ganglion celler (RGC) skador kan i vissa fall bromsas, men det finns för närvarande inga botande terapier tillgängliga. ATMPs erbjuder potential att korrigera gendefekter, integrera terapeutiska gener eller ersätta degenererade celler, vilket möjliggör utveckling av regenerativa och botande terapier för sjukdomar som AMD; 13 genterapier har redan fått godkännande för försäljning inklusive en behandling för att behandla RPE65 mutationsassocierad retinal degeneration2,3. Bland äldre vuxna (>60 år) påverkas ~ 30 miljoner människor över hela världen av antingen neovaskulära (nvAMD) eller avascular (aAMD) AMD4. Båda formerna framkallas av åldersrelaterade utlösare inklusive oxidativ skada, funktionsnedsättning och förlust av RPE-celler följt av fotoreceptornedbrytning, bland annat (t.ex. genetiska risk alleler, rökning, högt blodtryck)5,6. I nvAMD förvärras patogenesen av en obalans av angiogena och anti-angiogena faktorer till förmån för den angiogena vaskulär endotel tillväxtfaktorn (VEGF) som inducerar choroidal neovascularization (CNV). Hittills kan endast nvAMD behandlas med månatliga intravitreala injektioner av hämmare av VEGF-proteinet för att undertrycka CNV; ingen effektiv behandling ännu är tillgänglig för aAMD6,7.
Flera studier utvärderade cellbaserade terapier för att ersätta anti-VEGF-behandlingen: studier gjorda av Binder et al., där nyskördade autologa RPE-celler transplanterades till patienter med nAMD8,9,10, visade måttlig visuell förbättring, men endast en liten grupp patienter nådde en slutlig synskärpa tillräckligt hög för att möjliggöra läsning. Nyligen använde en klinisk fas I-studie ett embryonalt stamcellsbaserat RPE-plåster för att behandla AMD med lovande resultat; RPE-plåstrets effekt, stabilitet och säkerhet i upp till 12 månader hos 2 av de 10 behandlade patienterna11. Dessutom har flera grupper publicerat studier där autologa RPE-Bruchs membran-choroid fläckar skördades från den perifera näthinnan och transplanterades till makula12,13,14; och inducerad pluripotent stamcell (iPSC)-härledda RPE plåster genererades för transplantation15. För aAMD har antikroppar riktade mot komplementvägen testats i kliniska prövningar6,16 och en fas I-studie med en enda intravitreal injektion av en adenoassocierad virusvektor (AAV) som kodar genen för faktorn CD59 (AAVCAGsCD59) hos patienter med geografisk atrofi (GA) slutfördes17; fas II-studien har nyligen påbörjats och syftar till att rekrytera 132 patienter med avancerad aAMD och att utvärdera utfallet vid 2 år efter intervention18. Slutligen har FocuS-studiegruppen inlett en klinisk fas I/II-studie med multicenter som utvärderar säkerheten, dosresponsen och effekten hos en rekombinant icke-replikerande AAV-vektor som kodar för ett mänskligt komplementfaktor19.
I första hand är målet med en regenerativ AMD-terapi transplantation av funktionella RPE-celler, som skadades eller förlorades. IPE- och RPE-celler delar dock många funktionella och genetiska likheter (t.ex. fagocytos och retinolmetabolism), och eftersom IPE-celler är mer genomförbara skördade har de föreslagits som ett RPE-substitut20. Även om det tidigare har visats att IPE-celltransplantationen fördröjer fotoreceptordegeneration i djurmodeller21,22 och stabiliserar den visuella funktionen hos patienter med slutfas nvAMD, observerades ingen signifikant förbättring hos dessa patienter23. Bristen på effekt kan bero på det låga antalet transplanterade celler och/eller obalansen av neuroprotektiva näthinnefaktorer. Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att transplantera transfected pigment epitelial celler som överuttryck neuroprotektiva faktorer för att återställa retinal homeostas, upprätthålla återstående RPE celler och skydda photoreceptors och RGCs från degeneration. Följaktligen föreslår vi en ny terapi som omfattar transplantation av funktionella RPE- eller IPE-celler som har genomgått genteknik för att utsöndra neuroprotektiva och anti-angiogena proteiner, såsom PEDF, GM-CSF eller insulinliknande tillväxtfaktorer (IGF). Fördelen med att utveckla och analysera detta tillvägagångssätt hos flera arter istället för att använda en cellinje, endast en art eller mänsklig vävnad är: 1) ökad reproducerbarhet och överförbarhet av resultaten som framgår av många studier som realiseras i oberoende laboratorier och olika arter1,24,25; 2) Gris- eller nötkreatursceller är möjliga engångsceller utan att ytterligare djur offras. 3) Tillgången till särskilt svin- och nötkreatursceller gör det möjligt för stora testserier att ge robusta resultat. 4) Kunskapen om att isolera, odla och genetiskt modifiera celler från de mest använda modellerna möjliggör in vivo-analyser hos flera arter24,25,26 och erbjuder därmed ett förbättrat risk-nyttoförhållande för de första behandlade patienterna. 5) Flexibiliteten i det protokoll som presenteras gör det möjligt att använda det i olika modeller och experimentella upplägg och för alla okulära cellbaserade terapier med och utan genteknik. Alternativa tekniker som cellinjer eller mänsklig vävnad är däremot endast av begränsad överförbarhet och/eller begränsad disposabilitet. Cellinjer som ARPE-19 är idealiska för preliminära experiment; Låg pigmentering och hög spridning skiljer sig dock avsevärt från primärcellerna1. RPE- och IPE-celler, som är isolerade från mänsklig donatorvävnad, erbjuder en värdefull källa för överförbara in vitro-experiment. Vi får dock mänsklig vävnad från en amerikansk-amerikansk ögonbank vilket innebär att vävnaden är minst två dagar gammal (efter enucleation) och kräver en lång och dyr transport, men lokal donatorvävnad är inte tillgänglig i tillräckliga mängder för en produktiv forskning. Fördelen med användning av primärceller bekräftas av flera studier från andra grupper27,28.
För utveckling av en cellbaserad icke-viral genterapi med hjälp av SB100X transposonsystem för transfektering av primära RPE- och IPE-celler med generna som kodar för PEDF och/eller GM-CSF för att behandla nvAMD respektive aAMD, respektive29,30,31,32,fastställde vi först transfektionen av ARPE-19 celler1 . Därefter fastställdes isolerings- och transfektion protokollen i lättillgängliga bovin och svin primära celler. Nu har isolering och transfektion av primära RPE- och IPE-celler från fem olika arter etablerats, från små (som mus) till stora däggdjur (som nötkreatur). Det bekräftades i primära RPE- och IPE-celler som härrör från mänskliga donatorögon30. Produktionen av god tillverkningssed (GMP) av ATMP validerades med hjälp av mänsklig donatorvävnad samt33. Slutligen bedömdes både säkerhet och effektivitet i tillvägagångssättet in vivo i tre olika arter för vilka protokollet har anpassats: mus, råtta och kanin. I den kliniska installationen kommer en irisbiopsi att skördas från patienten och IPE-celler kommer att isoleras och transfekteras i renrummet, innan cellerna transplanteras subretinally tillbaka till samma patient. Hela processen kommer att ske under en enda kirurgisk session som varar cirka 60 minuter. Utvecklingen av behandlingsmetoden och utvärderingen av dess effektivitet begärde utmärkta in vitro- och ex vivo-modeller för att implementera robusta och effektiva genleveransmetoder, analysera effektiviteten hos genleverans, terapeutisk proteinproduktion och neuroprotektiva effekter och för att producera celltransplantationer för att testa tillvägagångssättet in vivo1,24,25,29,30 . Det är värt att nämna att behandlingen har det etiska godkännandet för en klinisk fas Ib/ IIa-studie från den etiska kommissionen för forskning i kantonen Genève (nr 2019-00250) och för närvarande sista prekliniska data som begärts för godkännande av schweiziska tillsynsmyndigheter samlas in med hjälp av det presenterade protokollet. I detta avseende visade prekliniska in vivo-data en signifikant minskning av CNV och utmärkt säkerhet24,25,31.
Här beskrivs isoleringen och kulturen av RPE/IPE-celler från nötkreatur, gris, kanin, råtta och mus och användningen av det integrativa SB100X transposon-systemet i kombination med elektroporation som en effektiv genleveransmetod. Särskilt primära PE celler transfected för att överuttryck PEDF och GM-CSF. Insamlingen av dessa protokoll gör det möjligt att genomföra in vitro- och in vivo-studierna i alla prekliniska faser av ATMP-utveckling. Dessutom har upplägget potential att anpassas till andra gener av intresse och sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De protokoll i vilka djur var inblandade utfördes av certifierad personal och efter godkännande av det kantonala Département de la sécurité, de l'emploi et de la santé (DSES), Domaine de l'expérimentation animale i Genève, Schweiz, och enligt ARVO-uttalandet om användning av djur i oftalmisk forskning och visionsforskning (godkännande nr. GE/94/17). Vuxna friska bruna norge råttor, C57BL/6 möss och Nya Zeeland vita kaniner avlivades genom en överdos av Pentobarbital (150 mg/kg) utspädd i 0,9% NaCl injiceras intraperitoneal och ögonen var enucleated omedelbart efter uppoffring. Svin och nötkreatur ögon erhölls från ett lokalt slakteri inom 6 timmar efter offer och transporterades till laboratoriet på is.
1. Före beredning
- Förbered komplett medium (DMEM/Hams F12 kompletterat med 10% fetalt bovinserum (FBS), 80 U/mL penicillin / 80 μg/mL streptomycin och 2,5 μg/mL amphotericin B). Värm mediet, 1x PBS och 0,25% trypsin (om nödvändigt) i ett vattenbad på 37 °C.
- Sätt ett sterilt draperi i huven för att förbereda en aseptisk arbetsplats. Introducera alla nödvändiga sterila instrument och material inuti huven.
OBS: Endast enucleation av ögonen och rengöring av återstående muskelvävnad och hud är de procedurer som utförs utanför huven, resten av stegen måste utföras inuti huven.
2. Isolering av pe-celler för råtta/mus
- Använd böjd sax och Colibri-tång för att omformiga ögonen efter avlivning av djuret. Rengör den återstående muskelvävnaden och huden från ögonen med sax och tång (icke-steril).
OBS: Storleken på saxen och tången som används för att enukleering och rengöring av ögonen beror på arten (t.ex. för råtta och mus kommer instrumenten att vara mindre än de som används för gris och nötkreatur) (se figur S1).- Samla ögonen i ett 50 ml-rör fyllt med icke-steril PBS och överför röret till den laminära flödeshuven. Desinficera ögonen genom att sänka i 2 min i jodbaserad lösning och överför dem sedan till en Petri-maträtt fylld med steril PBS.
- Glödlampans öppning
- Efter att ha överfört ögonen till en steril Petri-maträtt, håll en stadigt nära synnerven med Colibri eller spetsiga tångar. Stansa ett hål nära irisgränsen (mellan pars plana och ora serrata) med en 18 G nål. Sätt in en liten sax i hålet och skär runt iris. Ta bort det främre segmentet (hornhinna, lins och iris) och lägg det i en Petri-maträtt. Lämna glödlampan med glaskroppen tills RPE-cellerna är isolerade.
- Isolering av IPE-celler
- Ta bort linsen och dra försiktigt ut iris som innehåller IPE-cellerna med fina tångar. Placera iris i en Petri-skål, tvätta med steril PBS och lämna den i PBS tills mer iris är beredd.
- Upprepa steg 2.2.1 till 2.3.1 för att alla ögon ska vara förberedda den dagen.
- Tillsätt 50 μL 0,25% trypsin per iris och inkubera i 10 min vid 37 °C. Ta bort trypsin, tillsätt 150 μL komplett medium per iris och skrapa IPE försiktigt med en platt brandpolerad Pasteur pipetter; använd fina tångar för att immobilisera vävnaden. Samla cellfjädringen och lägg i ett 1,5 ml-rör. Använd 10 μL av cellupphängningen utspädd 1:3 med trypan blå för att räkna cellerna i Neubauer-kammaren34,35.
- Om det inte transfekterades omedelbart, så 200 000 celler/brunn i en 24-brunnsplatta (100 000 celler/cm2) i 1 ml komplett medium (10% FBS) (för sådd se tabell 1). Placera plattan i en inkubator och odla den vid 37 °C, 5% CO2.
OBS: Det kan vara nödvändigt att slå samman flera ögon tillsammans för att ha tillräckligt med celler för sådd.
- Isolering av RPE-celler
- Ta bort glasaktig humor och näthinna från det bakre segmentet med tunna tångar. Undvik att skada näthinnepigmentet epitel.
- Skär segmentet i hälften med en #10 skalpell för att få jordgloben helt öppen och tvätta med steril PBS.
- Tillsätt 50 μL trypsin per öga och inkubera i 10 min vid 37 °C. Ta bort trypsin och tillsätt 150 μL komplett medium per jordglob och skrapa RPE-cellerna försiktigt med en rund skalpell; använd fina tångar för att immobilisera vävnaden. Samla cellfjädringen och lägg den i ett 1,5 ml-rör. Ta 10 μL av cellupphängningen; späd 1:4 med trypan blå för att räkna cellerna i Neubauer-kammaren.
- Se steg 2.3.4.
OBS: Det kan vara nödvändigt att slå samman flera ögon tillsammans för att ha tillräckligt med celler för sådd.
3. Isolering av kanin PE-celler
- Utför rengöring och desinfektion enligt beskrivningen i steg 2.1 till 2.1.1.
- Sätt ett öga på en steril gasbindning och håll den ordentligt nära synnerven. Öppna ögat med skalpellen #11 och saxen ca 2 mm under limbus. Ta bort det främre segmentet (hornhinna, lins och iris) och lägg det i en Petri-maträtt. Lämna glödlampan med glaskroppen tills RPE-cellerna är isolerade.
- Isolering av IPE-celler
- Utför steg 2.3.1. Ta bort ciliary kroppen från iris genom att skära med en skalpell #10.
- Efter beredningen av 2 iris, inkubera med 1 ml 0,25 % trypsin vid 37 °C i 10 minuter. Under denna tid kan RPE-cellerna isoleras (se steg 3.4). Ta bort trypsin och tillsätt 1 ml komplett medium till iris och isolera cellerna genom att försiktigt skrapa med en platt brandpolerad Pasteur pipetter. Resuspend cellerna noggrant genom pipettering och överför cellupphängningen till ett 1,5 ml rör. Ta 10 μL av cellupphängningen och späd 1:3 med trypan blå för att räkna cellerna i Neubauer-kammaren.
- Se steg 2.3.4.
- Isolering av RPE-celler
- Utför steg 2.4.1.
- Lägg en steril gasväv i en 12 brunnsplatta och lägg glödlampan över gasväven.
- Tvätta med PBS och utför steg 2.4.3.
OBS: Använd en böjd brandpolerad Pasteur pipett. - Centrifugera cellerna 10 min vid 120 x g.
- Se steg 2.3.4.
4. Isolering av pe-celler för gris
- Utför rengöring enligt beskrivningen i steg 2.1. Tvätta med PBS och desinficera ögonen genom att sänka i 2 min i jodbaserad lösning, skölj med PBS. Fortsätt med steg 3.2.
- Isolering av IPE-celler
- Utför steg 3.3.1. Efter beredningen av 2 iris, tillsätt 1 ml komplett medium och isolera cellerna genom att försiktigt skrapa med en platt brandpolerad Pasteur-pipett. Överför cellfjädringen till ett 1,5 ml-rör. Ta 10 μL av cellupphängningen och späd 1:4 med trypan blå för att räkna cellerna i Neubauer-kammaren.
- Se steg 2.3.4.
- Isolering av RPE-celler
- Utför steg 2.4.1. Placera glödlampan i en Petri-skål och tvätta med PBS. Fyll glödlampan med 1 ml komplett medium.
- Använd en böjd brandpolerad Pasteur-pipett och ta försiktigt bort RPE-celler. Se till att skrapa från botten till toppen för att undvika att glida ner i choroid-Bruchs membrankomplex. Samla cellfjädringen i glödlampan med en 1 000 μL-pipett och överför till ett 1,5 ml-rör för resuspension. Ta 10 μL av cellupphängningen och späd 1:8 med trypanblå för att räkna cellerna i Neubauer-kammaren.
- Se steg 2.3.4.
5. Isolering av bovin PE-celler
- Utför rengöring enligt beskrivningen i steg 2.1. Tvätta med PBS och desinficera ögonen genom att sänka i 2 min i jodbaserad lösning, skölj med PBS. Fortsätt med steg 3.2.
- Isolering av IPE-celler
- Utför steg 3.3.1. Efter beredningen av två iris, inkubera med 2 ml 0,25% trypsin vid 37 °C i 10 min. Under denna tid kan RPE-cellerna isoleras (se steg 5.3).
- Ta bort trypsin och tillsätt 2 ml komplett medium till iris och isolera cellerna genom att försiktigt skrapa med en platt brandpolerad Pasteur pipetter. Överför cellfjädringen till ett 15 ml-rör. Centrifugera cellerna 10 min vid 120 x g. Ta 10 μL av cellupphängningen och späd 1:4 med trypan blå för att räkna cellerna i Neubauer-kammaren.
- Om det inte transfekterades omedelbart, frö 320 000 celler/brunn i en 6-brunnsplatta i 3 ml komplett medium (10% FBS) (för sådd se tabell 1). Placera plattan i en inkubator och odla den vid 37 °C, 5% CO2.
- Isolering av RPE-celler
- Följ steg 2.4.1. Placera glödlampan i en Petri-skål och tvätta med PBS. Efter beredning av 2 ögon fyll glödlampan ca 3/4 med trypsin och inkubera i 25 min vid 37 °C med locket på Petri skålen ovanpå bulbi.
- Ta bort trypsin och tillsätt 1 ml komplett medium. Utför steg 4.3.2. Centrifugera cellerna 10 min vid 120 x g.
- Se steg 5.2.3.
6. Odling - medelförändring
- Odla cellerna i DMEM/Hams F12, kompletterad med 10% FBS, 80 U/mL penicillin / 80 μg/mL streptomycin, och 2,5 μg/mL amphotericin B, vid 37°C och 5% CO2 i en fuktad inkubator. Efter 3-4 dagar pipetter upp och ner för att samla icke-vidhäftande celler och sätta hälften av volymen i en annan brunn. Fyll upp till 1 ml med komplett medium.
OBS: Detta gör det möjligt att ha en yta som är tillräckligt stor för att alla celler som isoleras ska kunna fästa och maximera utgången. - Efter ytterligare 3-4 dagar upprepa cellsamlingen men den här gången genom att slå samman de icke-vidhäftande cellerna från två brunnar till en brunn (t.ex. A1 +B1 i C1). Lägg till medium till alla brunnar. Observera cellerna och byt medium 2 gånger per vecka (för 6 och 24-brunnsplattor använd 3 respektive 1 ml/brunn). När cellerna når sammanflöde, byt till komplett medium med 1% FBS eller använd cellerna för experiment (t.ex. transfektion).
OBS: RPE- och IPE-celler är sammanflöde efter 3-4 respektive 4-5 veckor efter isolering. Cellodlingens renhet bekräftades kontrollera cellmorfologin (pigmenterade celler) och specifika markörer som beskrivs av Johnen och kollegor36.
7. Elektroporation av primära PE-celler
- Utför elektroporation enligt beskrivningen före1,37.
- Beroende på antalet transfekterade celler använd 6-, 24- eller 48-brunnsplattor (se tabell 2) för att så cellerna i medium utan antibiotika eller antimykotika. Under de följande 2 veckorna tillsätt droppar med medium innehållande penicillin (80 U/ml), streptomycin (80 μg/ml) och amphotericin B (2,5 μg/mL) två gånger i veckan. Byt ut mediet helt 2 veckor efter transfektion.
- För att bestämma celltillväxt, transfektionseffektivitet och proteinutsöndring, övervaka cellerna varje vecka genom mikroskopi och analysera cellkulturens supernatant med västra blot. Innan kulturen avslutas, ta en 24-timmars cellkultur supernatant för att kvantifiera proteinutsöndring av ELISA, räkna cellerna, mäta fluorescens efter bildbaserad cytometri (vid Venus-transfekterade celler) enligt tillverkarens instruktioner (se Tabell över material), och samla cellpelleten för RT-qPCR-baserad genuttrycksanalys.
OBS: Dessa metoder ingår inte i detta dokument eftersom det inte är syftet att i detalj förklara analysen av cellerna utan snarare deras isolering. Cellsåddstätheten är densamma för alla arter (100 000 celler/cm2) men eftersom antalet isolerade celler varierar användes olika plattor. Dessutom, för möss, råtta och kanin kan det vara nödvändigt att poola 2-3 ögon för att ha tillräckligt med celler för sådd.
| Art | Trypsinbehandling | N° IPE-celler | N° RPE-celler | Platta för sådd (100 000 celler/cm2) |
| Mus/råtta | Ja | ~50 000 | ~150 000 | 24-brunnsplattor |
| Kanin | Ja | ~350 000 | ~2 500 000 | 24-brunnsplattor |
| Gris | Nej | ~ 1 000 000 | ~3 000 000 | 24-brunnsplattor |
| Nötkreatur | Ja | ~ 1 700 000 | ~ 5 000 000 | 6-brunnsplattor |
Tabell 1: Antal primära PE-celler som isolerats från ögon från olika arter.
| Namn | Område | Volymmedium | Trypsin | Volymmedium för att stoppa trypsin-verkan | Såddtäthet |
| 6-brunnsplatta | 9,6 cm² | 3.0 ml | 0.5 ml | 1,0 ml | 3x105 |
| 24-väl tallrik | 2,0 cm² | 1,0 ml | 0.2 ml | 0,8 ml | 5x104 |
| 48-brunnsplatta | 1,1 cm² | 0.5 ml | 0.1 ml | 0.4 ml | 0,5-1x104 |
Tabell 2: Cellodlingsvolymer och såddtäthet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PE isolering från olika däggdjursarter
Med hjälp av ovannämnda protokoll isolerades IPE- och RPE-celler framgångsrikt från fem olika arter. Antalet celler som erhålls från varje förfarande beror på ögats art och storlek(tabell 1). Som visas i figur 1visar cellerna typisk PE-cellmorfologi och pigmentering (med undantag för kaninceller som visas, härledda från albino Nya Zeelands vita (NZW) kaniner). Vid 21 dagar efter isoleringen är cellerna sammanflöde, redo att användas för ytterligare experiment (t.ex. transfektioner). Det måste noteras att kulturer från alla arter övervakas och kontrolleras ytterligare upp till 2 år som bekräftar normal morfologi och stabilt transgenuttryck (data visas inte).
Dedifferentiation, cellulära stress och förändringar i genuttryck uteslöts av RT-qPCR och immunohistochemistry. En panel av gener (VEGF, CRALBP, CATD, ZO-1, KRT8) analyserad i transfekterade mänskliga RPE-celler (ARPE-19 celler) bekräftade normala RPE uttryck mönster1; som kan bekräftas i primära bovin IPE-celler genom immunofluorescens för RPE65(figur 2). Dessutom bekräftade Johnen och kollegor zo-1 immunostaining i primära svin IPE och RPE celler36.
Figur 1: Mikrografer av PE-celler från olika däggdjur 21 dagar efter isoleringen. IPE- och RPE-celler från mus, kanin (albino NZW-kanin), gris och nötkreatur visas dag 21 efter isolering. För alla arter är de kulturer som visas sammanflöde. Observera att kaninen PE-celler inte är pigmenterade (original förstoring, 50x). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: RPE65 immunostaining av primära IPE-celler. RPE65 (grön) färgning av bovin IPE-celler transfekterade med pFAR4-CMV-PEDF transposon plasmid med ett initialt cellnummer på 1 x 104 celler jämfört med icke-transfekterade kontrollceller (ursprunglig förstoring, 200x). Nuclei var färgade med DAPI (blå). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Livskraften hos transfekterad primär RPE
Cellens livskraft visas i figur 3. För att utesluta en potentiell toxicitet hos den buffert som används för elektroporationsprocessen suspenderades förkulturerade primära RPE-celler i elektroporationsbuffert från en kommersiellt tillgänglig sats eller i en näringsbuffert som utvecklats av ett läkemedelsföretag (konfidentiell sammansättning) och elektroporerad (E) (utan tillsats av plasmid) enligt beskrivningen i steg 7 i protokollet. Cellens livskraft studerades 3 ± 1 dagar efter transfektion med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt cytotoxicitetsanalyskit (se Tabell över material)enligt tillverkarens instruktioner. Analyserna utfördes alltid med en kontroll utan effekt (Co-P) (inte elektroporerad). Ingen påverkan på cellens livskraft observerades för någon av de testade buffertarna (figur 3).
Figur 3: Livskraften hos primära RPE-celler som suspenderas i olika buffertar. Cell livskraft mättes 3 ± 1 dagar efter transfektion med hjälp av en kommersiellt tillgänglig cytotoxicitet assay kit. Inga skillnader i lönsamhet observerades mellan de olika buffertarna. data representeras som medelvärde ± SD (n=2 givare, 3 replikat/givare). E: elektroporerade celler, Co-P: styrning utan ström. AU: godtyckliga enheter. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Transfektioner av förkulturerade PE-celler med Venus reportergenen
50 000-100 000 förkulturerade PE-celler från olika arter transfectederades med det gula fluorescerande Venusproteinet (pT2-CAGGS-Venus) med hjälp av det hyperaktiva genleveranssystemet SB100X transposon. Mikrografer som visas i figur 4 bekräftar att cellerna framgångsrikt transfected (fluorescerande celler vid 21 dagar efter transfektion). Figur 5 visar kvantifieringen av transfekteringseffektiviteten i förkulturerade RPE-celler för gris (n=6 givare, 50 000 celler/transfektion) transfekterade med Venus (pT2-CAGGS-Venus). Andelen fluorescerande celler och MFI mättes med hjälp av bildbaserad cytometri enligt tillverkarens instruktioner på dagen för avslutning av cellkulturen (30 ± 5 dagar efter transfektion). Medelprocenten fluorescerande celler var 50 ± 30% men variabel från 95 ± 6% (givare 2) till 28 ± 1% (givare 4) (figur 5). I alla experiment användes transfected ARPE-19 celler som positiv kontroll. Dessutom jämfördes transfekteringseffektiviteten alltid med de negativa kontrollerna: Co-P (control without power [not electroporated]) och Co+P (control with power [electroporated but without addition of plasmids]). Experimentet har också utförts med IPE-celler (data visas inte).
Figur 4: Mikrografer av förkulturerade PE-celler transfekterade med pT2-CAGGS-Venus. Venustransfekteradekanin(A),nötkreatur (B) och svin (C) PE-celler visas vid 21 dagar efter transfektion. Som en positiv kontroll transfected 50 000 ARPE-19 celler med Venus (D). Vänster mikrograf: ljust fält, höger mikrograf: GFP (480 nm) filter (original förstoring, 50x). Transfections gjordes i triplicate och negativa kontroller inkluderades: Co-P (kontroll utan effekt [inte elektroporated]) och Co +P (kontroll med effekt [elektroporerad men utan tillsats av plasmider]) (visas inte). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Transfekteringseffektivitet i RPE-celler i svin som transfekterats med Venus reportergenen. (A) 50 000 primära RPE-celler för svin transfecteds med pT2-CAGGS-Venus, den totala genomsnittliga transfekteringseffektiviteten var 50 ± 30% och den genomsnittliga MFI var 2712 ± 197 vid dagen för avslutande av cellkulturerna (30±5 dagar efter transfektion). Diagrammet visar medelvärdet ± SD (n=3 replikerar) av 6 olika djur. (B) Andelen Venus+ ARPE-19 celler som användes som en positiv kontroll, var 98±6% och var stabil under de 138 dagar cellerna följdes. Den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) var 5 785 ± 1 255. Diagrammet visar medelvärdet ± SD (n=3 replikerar) för varje dag. Co-P (control without power [not electroporated]) och Co+P (control with power [electroporated but without addition of plasmids]) ingick i alla transfekteringsexperiment (visas ej). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Transfektioner av ny-PE-celler med Venus reportergen
10 000-50 000 PE-celler som nyligen isolerats från kaniner transfecteds med det gula fluorescerande proteinet Venus (pFAR4-CMV-Venus), och cellkulturer övervakades av mikroskopi. I figur 6 kan fluorescerande celler observeras dag 21 efter transfektion. Andelen fluorescerande celler som mättes med bildbaserad cytometri var 53 ± 29% för IPE-celler och 28 ± 23% för RPE-celler (data visas inte).
Figur 6: Mikrografer av nytransfekterade PE-celler isolerade från kanin. Fluorescensen visas på dag 21 efter transfektion. Vänster mikrograf: ljust fält, höger mikrograf: GFP (480 nm) filter. I samtliga fall gjordes transfections i tre exemplar (ursprunglig förstoring, 50x). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Transfektioner av PE-celler med de terapeutiska generna PEDF och GM-CSF
50 000 PE-celler transfectederades med PEDF och proteinsekretor övervakades av WB (figur 7). WB-signalen för transfectedceller var högre jämfört med de icke-transfekterade cellerna för alla arter och dagar studerade; ingen minskning av proteinsekreationen observerades inom denna tid.
Figur 7: WB-analys av PEDF-utsöndring av transfekterade PE-celler. WB-analys av supernatanter från gris (förkulturerad) (A) och nötkreatur (ny) (B) PEDF-transfekteradePE-celler visar en högre PEDF-utsöndring jämfört med kontrollen (icke-transfekterade celler) och stabil över tiden. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur S1: Instrument som används för PE-isolering beroende på art. Set 1 används för råtta, mus och kanin, och set 2 används för gris- och nötkreatursögon. b)Sterila instrument som används för PE-isolering. Observera den olika storleken på saxar och tångar som används beroende på ögonstorleken. Runda och platta brandpolerade Pasteur-pipetter används för skrapning av RPE respektive IPE. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att ha standardiserade metoder för att isolera och odla PE-celler är grundläggande för att utveckla nya terapimetoder för retinala degenerativa sjukdomar. Med de protokoll som presenteras här kan PE-celler framgångsrikt isoleras från olika arter och odlas under långa perioder (hittills har den längsta kulturen upprätthållits i 2 år1,38); typisk PE-cellmorfologi, pigmentering och funktion observerades (figur 1, figur 2). Observera att särskilt för rena RPE-kulturer är det viktigt att extrahera näthinnan helt för att undvika förorening med neurala näthinneceller; för IPE-celler ska ciliary-kroppen avlägsnas från iris enligt protokollet. Sammanflödet av cellerna uppnås på relativt kort tid (~ 21 dagar), varefter cellerna är redo för transfektion med terapeutiska gener eller för användning i andra experiment (t.ex. exponering för giftiga ämnen, proteiner etc.). Dessutom är protokollen inte bara avgörande för preklinisk in vitro- och in vivo-testning, utan också viktiga för mänsklig tillämpning, dvs. validering av transfekterade PE-celltransplantationer. särskilt för behandling av AMD som i utveckling av vår grupp, där IPE celler kommer att isoleras från en iris biopsi, omedelbart transfected och transplanteras subretinally till samma patient inom en kirurgisk session. Isolering och subretinal transplantation av autologa IPE celler fastställdes hos kaniner39 och patienter23. Eftersom transplantation av autologa IPE celler var framgångsrika men inte tillräckligt för att återställa vision, transfection av cellerna till överuttryck neuroprotektiva faktorer, såsom PEDF och GM-CSF, hade lagts till tillvägagångssättet och etablerats i ytterligare tre arter (mus, råtta och nötkreatur). Med de metoder som beskrivs här för isolering, kultur och genetisk modifiering av PE-celler kan respektive celltransplantationer nu förberedas från olika arter för att testa toxicitet och effektivitet i tillvägagångssättet in vivo.
Det visade sig att PE-celler av olika ursprung effektivt kan modifieras för att överuttrycka PEDF (figur 7),med hjälp av det hyperaktiva SB100X-transponeringssystemet. liknande resultat med rått-IPE och RPE24 och mänskliga RPE-celler29,30 har publicerats. Transfektionen med PEDF har föreslagits för att behandla nvAMD genom hämning av VEGF-medierad neovaskulärisering och skydd av RPE-celler och näthinneneuroner från glutamat och oxidativ stress samt ischemi40,41. Bekräftelse av stabil långfristig proteinsekreation(figur 7) bekräftade PE-celler som ett tillförlitligt biologiskt "drug delivery system". I detta avseende bekräftade transfekteringseffektivitet som studerats med reportergenen Venus (figur 4, figur 5, figur 6) hög transfektion effektivitet på ~ 20-100% (art- och donatorberoende) som rapporterats i Johnen et al. 1.
Det bör noteras att även om storleken på de använda plasmiderna var varierande, från pFAR-miniplasmider (~ 3 000 bp) till plasmider med ett pT2-stamnät (~ 5 000 bp)30,var transfektionseffektiviteten jämförbart hög. Skillnader som ses i transfektion effektivitet beror förmodligen på variabilitet i tiden från enucleation till cellisolering och i vävnad bevarande men ändrade inte cell morfologi varken den tid som cellerna når sammanflöde (~ 21 dagar efter isolering), eller tid som cellerna följdes efter transfection. I allmänhet är en viktig faktor för att uppnå en framgångsrik transfektion att källan till PE-celler bör vara så färsk som möjligt. Detta är särskilt viktigt för transfektioner med nyisolerade PE-celler.
Jämfört med cellplåtstransplantationer är den terapi som vår grupp utvecklar (transfectedceller transplanterade subretinally som en cellupphängning) mindre invasiv eftersom den första kräver stora retinotomier med tillhörande risker för proliferativ vitreoretinopati och subretinal fibros42. Dessutom, i arktransplantat för våt AMD avlägsnas CNV-området tillsammans med den intilliggande choroiden och därför kan transplantatöverlevnaden äventyras43. Slutligen är tanken på att använda en cellplåster inte förenlig med det föreslagna förfarandet, där isolering, modifiering och transplantation av cellerna görs under en enda kirurgisk session. Å andra sidan är inneboende problem med PE-celler transplanterade som cellupphängningar potentiell celldöd under leverans, brist på vidhäftning och varians i cellulär distribution; men dessa nackdelar kan övervinnas genom vävnadsteknik närmar sig42; Dessutom skulle cellöverlevnaden kunna förbättras genom användning av överlevnadsprostörerna44,45,46,47. Vi anser att transplantation av primära PE-celler som överuttrycker neuroprotektiva faktorer som PEDF och GM-CSF som en cell suspension är ett lovande tillvägagångssätt för att behandla AMD, och att utveckla denna terapi de protokoll som presenteras här är avgörande eftersom de tillåter standardisering av isolering, kultur och analys av de primära PE-cellerna.
Sammanfattningsvis levererar protokollet ett avancerat modellsystem för utveckling och preklinisk in vitro- och in vivo-testning av okulära avancerade medicinska terapier i fem olika arter, tillräckligt robusta för att kompensera för individuella variationer i cellkvalitet från de olika källorna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Ett tack förtjänar till Gregg Sealy och Alain Conti för deras utmärkta tekniska hjälp. Detta arbete stöddes av Europeiska kommissionen inom ramen för det sjunde ramprogrammet, Den schweiziska nationella vetenskapsstiftelsen och Schmieder-Bohrisch-stiftelsen. Z.I. fick finansiering från Europeiska forskningsrådet, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] och B.M.W. från ett Fulbright Research Grant och Swiss Government Excellence Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 353043 | |
| 24-well plates | Corning | 353047 | |
| 48-well plates | ThermoFisher Scientific | 150687 | |
| 6-well plate | Greiner | 7657160 | |
| Betadine | Mundipharma | ||
| Bonn micro forceps flat | |||
| Colibri forceps (sterile) | |||
| CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay | Promega | G9291 | |
| DMEM/Ham`s F12 | Sigma-Aldrich | D8062 | |
| Drape (sterile) | Mölnlycke Health Care | 800530 | |
| Electroporation buffer 3P.14 | 3P Pharmaceutical | ||
| FBS | Brunschwig | P40-37500 | |
| Forceps (different size) (sterile) | |||
| Gauze compress | PROMEDICAL AG | 25403 | |
| NaCl (0.9%) | Laboratorium Dr. Bichsel AG | 1000090 | |
| Needle (18G) | Terumo | TER-NN1838R | |
| Neon Transfection kit 10 µL | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Neon Transfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000S | |
| Neubauer chamber | Marienfeld-superior | 640010 | |
| Pasteur pipette (fire-polish) | Witeg | 4100150 | |
| PBS 1X | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100 | |
| Pentobarbital (Thiopental Inresa) | Ospedalia AG | 31408025 | |
| Petri dish | ThermoFisher Scientific | 150288 | |
| pFAR4-PEDF | |||
| pFAR4-SB100X | |||
| pFAR4-Venus | Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie | ||
| pSB100X (250 ng/µL) | Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak | ||
| pT2-CAGGS-Venus | Johnen et al., 2012 | ||
| pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Cloned in our lab | ||
| pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) | Pastor et al., 2018 | ||
| scarpel no. 10 | Swann-Morton | 501 | |
| scarpel no. 11 | Swann-Morton | 503 | |
| Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile) | |||
| Tali Image-Based Cytometer | ThermoFisher Scientific | T10796 | |
| Trypsin 0.25% | ThermoFisher Scientific | 25050014 | |
| Trypsin 5%/EDTA 2% | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| Vannas spring scissors curved (sterile) |
References
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Prado, D. A., Acosta-Acero, M., Maldonado, R. S. Gene therapy beyond luxturna: A new horizon of the treatment for inherited retinal disease. Current Opinion in Ophthalmology. 31 (3), 147-154 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. The Lancet. 390, 849-860 (2017).
- Age Related Macular Degeneration and Data and Statistics. NIH. , Available from: https://nei.nih.gov/learn-about-eye-health/resources-for-health-educators/eye-health-data-and-statistics/age-related-macular-degeneration-amd-data-and-statistics (2020).
- Al-Zamil, W. M., Yassin, S. A. Recent developments in age-related macular degeneration: A review. Clinical Interventions in Aging. 12, 1313-1330 (2017).
- Stahl, A. The diagnosis and treatment of age-related macular degeneration. Deutsches Arzteblatt International. 117, 513-520 (2020).
- Mitchell, P., Liew, G., Gopinath, B., Wong, T. Y.
- Binder, S., et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. American Journal of Ophthalmology. 133 (2), 215-225 (2002).
- Binder, S., et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (11), 4151-4160 (2004).
- Binder, S. The Macula. Diagnosis, treatment and future trends. , Springer-VerlaglWien. New York. 7985-7987 (2004).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 1-10 (2018).
- Stanga, P. E., et al. Retinal pigment epithelium translocation after choroidal neovascular membrane removal in age-related macular degeneration. Ophthalmology. 109 (8), 1492-1498 (2002).
- Van Zeeburg, E. J. T., Maaijwee, K. J. M., Missotten, T. O. A. R., Heimann, H., Van Meurs, J. C. A free retinal pigment epitheliumchoroid graft in patients with exudative age-related macular degeneration: Results up to 7 years. American Journal of Ophthalmology. 153 (1), 120-127 (2012).
- Chen, F. K., et al. Long-term visual and microperimetry outcomes following autologous retinal pigment epithelium choroid graft for neovascular age-related macular degeneration. Clinical and Experimental Ophthalmology. 37 (3), 275-285 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Akyol, E., Lotery, A. Gene, cell and antibody-based therapies for the treatment of age-related macular degeneration. Biologics: Targets and Therapy. 14, 83-94 (2020).
- Hemera Biosciences. Treatment of advanced dry age related macular degeneration with AAVCAGsCD59. ClinicalTrialsgov. , NCT03144999 (2019).
- , Hemera Biosciences. Intravitreal AAVCAGsCD59 for advanced dry age-related macular degeneration (AMD) with geographic atrophy (GA). ClinicalTrialsgov. , NCT04358471 (2020).
- Gyroscope Therapeutics. First in human study to evaluate the safety and efficacy of GT005 administered in subjects with dry AMD. ClinicalTrialsgov. , NCT03846193 (2019).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium after removal of choroidal neovascular membranes. Archives of Ophthalmology. 118 (10), 1350-1355 (2000).
- Thumann, G., Salz, A. K., Walter, P., Johnen, S. Preservation of photoreceptors in dystrophic RCS rats following allo- and xenotransplantation of IPE cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (3), 363-369 (2009).
- Crafoord, S., Geng, L., Seregard, S., Algvere, P. V. Photoreceptor survival in transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 80 (4), 387-394 (2002).
- Aisenbrey, S., et al. Iris pigment epithelial translocation in the treatment of exudative macular degeneration: A 3-year follow-up. Archives of Ophthalmology. 124 (2), 183-188 (2006).
- Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after sleeping beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
- Kropp, M., et al. Results of a biodistribution study of Venus transfected pigment epithelial cells transplanted subretinally in rabbits. Association for Research in Vision and Ophthalmology. , (2016).
- Kropp, M., et al. Improved transferability of a disease model for avascular age-related macular degeneration (AMD) to evaluate cell-based gene therapies using aged mice. ISSCR Annual Meeting. , Boston, USA. Meeting Abstract: MDD228. Poster (2020).
- Uebersax, E. D., Grindstaff, R. D., Defoe, D. M. Survival of the retinal pigment epithelium in vitro: Comparison of freshly isolated and subcultured cells. Experimental Eye Research. 70 (3), 381-390 (2000).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
- Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the sb transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
- Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the sleeping beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
- Hernández-Pinto, A., et al. PEDF peptides promote photoreceptor survival in rd10 retina models. Experimental Eye Research. 184, 24-29 (2019).
- Bascuas, T., et al. Non-virally transfected primary human pigment epithelium cells overexpressing the oxidative stress reduction factors PEDF and GM-CSF to treat retinal neurodegeneration neurodegenerationl. Human Gene Therapy. 30 (11), (2019).
- Kropp, M., et al. Development of GMP-compliant production of freshly isolated and transfected iris pigment epithelial (IPE) cells to treat age-related macular degeneration (AMD). Human Gene Therapy. Meeting abstract: P371 Poster. , (2017).
- Marienfeld. Marienfeld Technical information Neubauer-improved. , Available from: https://www.marienfeld-superior.com/information-about-our-counting-chambers.html (2020).
- Electron Microscopy Sciences. Neubauer Haemocytometry. , Available from: https://www.emsdiasum.com/microscopy/technical/datasheet/68052-14.aspx (2020).
- Johnen, S., Wickert, L., Meier, M., Salz, A. K., Walter, P., Thumann, G. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
- Bascuas, T., et al. Induction and analysis of oxidative stress in sleeping beauty transposon-transfected human retinal pigment epithelial cells. Journal of Visualized Experiments. , e61957 (2020).
- Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17, 181-189 (2010).
- Thumann, G., et al. Transplantation of autologous iris pigment epithelium to the subretinal space in rabbits. Transplantation. 68, 195-201 (1999).
- Bilak, M. M., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) protects motor neurons from chronic glutamate-mediated neurodegeneration. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 58, 719-728 (1999).
- Duh, E. J., et al. Pigment epithelium-derived factor suppresses ischemia-induced retinal neovascularization and VEGF-induced migration and growth. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 43, 821-829 (2002).
- Chichagova, V., et al. Cellular regeneration strategies for macular degeneration: Past, present and future. Eye. 32 (5), 946-971 (2018).
- Veckeneer, M., et al. angiography documented reperfusion of translocated autologous full thickness RPE-choroid graft for complicated neovascular age-related macular degeneration. Eye. 31, 1274-1283 (2017).
- Afshari, F. T., et al. Integrin activation or alpha9 expression allows retinal pigmented epithelial cell adhesion on Bruch's membrane in wet age-related macular degeneration. Brain. 133, 448-464 (2010).
- Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (2), 467-476 (1999).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 45 (9), 3337-3348 (2004).
- Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (3), 767-774 (1999).
