Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Allestedsnærværende og vevsspesifikk RNA-målretting i Drosophila Melanogaster med CRISPR/CasRx

Published: February 5, 2021 doi: 10.3791/62154
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California

Summary

Denne artikkelen skisserer en detaljert protokoll for bruk av RNA-rettet Cas13D-enzymet (RfxCas13D) i fluer.

Abstract

CasRx, et medlem av den RNA-målrettede Cas13-familien, er et lovende nytt tillegg av CRISPR/Cas-teknologiene i effektiv gentranskripsjonsreduksjon med en attraktiv off-target profil på både cellulært og organismenivå. Det er nylig rapportert at CRISPR / CasRx-systemet kan brukes til å oppnå allestedsnærværende og vevsspesifikk gentranskripsjonsreduksjon i Drosophila melanogaster. Denne artikkelen beskriver metodene fra det nylige arbeidet, bestående av tre deler: 1) allestedsnærværende in vivo endogene RNA-målretting ved hjelp av et to-komponent CasRx-system; 2) allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretting ved hjelp av en tre-komponent CasRx system; og 3) vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved hjelp av et tre-komponent CasRx-system. Effektene av observert RNA-målretting inkluderer målrettede genspesifikke fenotypiske endringer, målrettet reduksjon av RNA-transkripsjon og sporadiske dødelighetsfenotyper forbundet med høyt uttrykk for CasRx-protein og sikkerhetsaktivitet. Samlet sett viste disse resultatene at CasRx-systemet er i stand til å målrette RNA-transkripsjonsreduksjon på organismenivå på en programmerbar og effektiv måte, noe som viser at in vivo transcriptome målretting, og engineering er gjennomførbart og legger grunnlaget for fremtidige in vivo CRISPR-baserte RNA-målrettingsteknologier.

Introduction

Siden fremveksten av Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-teknologier, har mye av fokuset på dette feltet vært på DNA-redigering, som tilbyr transformative applikasjoner innen medisin og bioteknologi1. Permanent endring av DNA-sekvenser er imidlertid ikke alltid ønskelig på grunn av etiske hensyn. I lys av dette begynte nyere studier å utvikle CRISPR-baserte verktøy for målretting av RNA og viste at CRISPR-teknologier faktisk kan brukes til RNA-målretting i en rekke biologiske systemer2,3,4,5,6,7. I mange av disse systemene som er testet, er den nåværende mye brukte tilnærmingen for målretting av RNA og transkripsjonsreduksjon RNA-interferens (RNAi), som er langt fra perfekt, ofte med variert effekt og høy off-target aktivitet når den brukes i vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Derfor, gitt statusen til disse teknologiene, er det verdt å utforske potensialene til CRISPR-baserte verktøy for RNA-målretting ytterligere.

En bemerkelsesverdig nylig studie rapporterte at ribonuklease CasRx, et medlem av Cas13d-klassen, effektivt kan redusere gentranskripsjonsnivåer i menneskelig cellekultur og har en attraktiv off-target profil4. Dette funnet førte til spørsmålet om denne nye ribonuklease kan opprettholde sin effekt og lave off-target rate for RNA-målretting på organismenivå. En nylig studie tok opp dette spørsmålet ved å vise at CasRx-systemet kan brukes til å oppnå allestedsnærværende og vevsspesifikk gentranskripsjonsreduksjon i Drosophila melanogaster5.

For å effektivisere brukervennligheten til denne nylig publiserte tilnærmingen, beskriver denne protokollen metodene fra dette nylige arbeidet, som består av tre hoveddeler: 1) allestedsnærværende in vivo RNA-målretting ved hjelp av et to-komponent CasRx-system; 2) allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretting ved hjelp av en tre-komponent CasRx system; og 3) vevsspesifikk vivo RNA-målretting ved hjelp av et tre-komponent CasRx-system.

Guide RNAs (gRNA) rettet mot forskjellige målgener under kontroll av en allestedsnærværende promotor ble designet og flylinjer som uttrykker disse gRNA-inneholdende konstruksjonene ble generert. CasRx konstruksjoner under kontroll av enten en allestedsnærværende promotør, eller en betinget oppstrøms aktivering sekvens (UASt) promotør activatable av GAL4 transkripsjon faktor, ble også designet og fly linjer som huser disse CasRx-inneholdende konstruksjoner generert. Katalytisk inaktive CasRx-konstruksjoner, dCasRx, ble designet og brukt som negative kontroller. Allestedsnærværende RNA-målretting i fluer oppnås ved å krysse gRNA-uttrykkende fluelinjer med allestedsnærværende CasRx-uttrykkende fluelinjer. Avkommet som uttrykker både gRNA-konstruksjonen rettet mot en bestemt gentranskripsjon og CasRx-proteinet har en allestedsnærværende reduksjon av målrettede gentranskripsjoner. Vevsspesifikk RNA-målretting i fluer oppnås ved først å krysse gRNA-uttrykkende fluer med UASt-CasRx som uttrykker fluer, og oppnår transheterozygote fluer som bærer både gRNA- og UASt-CasRx-konstruksjoner. Slike fluer krysses i sin tur med vevsspesifikke GAL4-uttrykkende fluer, noe som resulterer i generering av vevsspesifikk CasRx-uttrykk og RNA-målretting i fluer.

CasRx-systemets programmerbare natur gir mulighet for tilpasning og optimalisering for å oppnå høy effekt og lav off-target aktivitet for in vivo RNA-målretting. Potensielle anvendelser av CRISPR-basert RNA-målretting er mange, inkludert å erstatte RNAi i laboratoriet og bidra til insektvektorkontroll i naturen. Av sistnevnte er et av de globale udekkede behovene utvikling av effektive verktøy for å bekjempe infeksjoner av RNA-virus som overføres via mygg. Mange RNA-virus, som denguefeber, Zika og chikungunya-virus, overføres via mygg, påvirker menneskers helse og bidrar til dødelighet. Mange forslag til ingeniør myggpopulasjoner med virusresistens for sykdomsforebygging er laget; Imidlertid er ingen nåværende teknologi i stand til å gjøre mygg samtidig motstandsdyktig mot alle betydelige RNA-virus18,19,20,21,22,23. RNA-målrettede Cas-systemer kan gi et utgangspunkt for en slik teknologi ved å muliggjøre en programmerbar plattform for å målrette mot alle myggbårne RNA-virus.

Protocol

1. Allestedsnærværende in vivo RNA-målretting ved hjelp av et to-komponent casrx-system

  1. Genererer Ubiq-CasRx- og Ubiq-dCasRx-uttrykksvektor
    1. Forsterk CasRx-sekvensen ved hjelp av en polymerasekjedereaksjon (PCR) med primer 1050E. C3 og 1050E. C4 og den originale CasRx konstruere pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx); og forsterke dCasRx-sekvensen ved hjelp av PCR med primer 1050E. C3 og 1050E. C4 og den opprinnelige dCasRx-konstruksjonen pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)4 (tabell 1). Gelrens de forsterkede CasRx- og dCasRx-fragmentene etterpå ved hjelp av et gelrensesett.
    2. Fordøye base vektor (Addgene plasmid #112686) med begrensning enzymer SwaI og PacI24. I de resulterende produktene, bruk et sett for å gelrense det større fragmentet, som kalles basevektor ryggraden.
    3. Monter Ubiq-CasRx-vektoren med ryggraden for grunnvektvekten og CasRx-fragmentet ved hjelp av Gibson-monteringsmetoden; monter Ubiq-dCasRx-vektoren med ryggraden i grunnvektvekten og dCasRx-fragmentet ved hjelp av Gibson-monteringsmetoden25.
      MERK: Addgene-IDen til Ubiq-CasRx-vektoren (OA-1050E) er #132416, og Addgene-IDen til Ubiq-dCasRx-vektoren (OA-1050R) er #132417.
  2. Genererer gRNA-uttrykksvektor
    1. Design hvert gRNA-fragment basert på følgende kriterier: målsekvensen er 30 nukleotider i lengde; Maksimal lengde på poly-U strekker seg i målsekvensen er 4 basispar; målsekvensen GC-innhold er i området 30% - 70%; målsekvensen spådde ikke å danne sterke RNA-hårnålsstrukturer; og målsekvensen som inneholder minimal predikert RNA sekundær eller tertiær struktur5.
      MERK: Denne studien designet hver gRNA som 4 tandemsekvenser hver 30 nukleotider lange, fordelt på 36 nukleotid lange direkte repetisjoner, og med en 7-tymin terminator i begge ender5. For det eksogene målgenet, GFP, ble de samme kriteriene som ovenfor etterfulgt av et OpIE2-GFP-fragment5.
    2. Forsterk U6:3-promotorsekvensen ved hjelp av PCR med primere 1043.C1 og 1043.C23 og Addgene plasmid #112688 (tabell 1)26. Gelrens de forsterkede U6:3-fragmentene ved hjelp av gelrensingssett.
    3. Digest Addgene plasmid #112688 med begrensningsenzym AscI og XbaI24. I de resulterende produktene, bruk et sett for å gelrense de større fragmentene, som kalles pre-base vektor ryggraden.
    4. Monter basisvektoren med pre-base vektor ryggraden og U6: 3 fragment ved hjelp av Gibson montering metode25. Basisvektoren heretter heter OA-1043.
      MERK: Plasmid OA-1043s Addgene ID er #164586.
    5. Syntetisere målgenets gRNA-fragment ved hjelp av ekstern gensyntesetjeneste.
    6. Fordøye basevektoren OA-1043 med begrensning enzym PstI og NotI24. Hold hele fordøyelsesproduktet, som kalles fordøyd OA-1043.
    7. Sett sammen gRNA-uttrykksvektor med den fordøyde OA-1043 og målgenet gRNA fragment ved hjelp av Gibson-monteringsmetoden25.
      MERK: Fire målgener ble studert: tre var endogene (hvite, hakk, gule), ett var eksogent (GFP). Addgene-IDene deres er: #132420 (gRNAw), #132421(gRNAN), #132425 (gRNAy) og #133304 (gRNAGFP).
  3. Genererer transgene fluer
    1. Injiser uttrykksvektorer i flyembryoer ved hjelp av ekstern flyembryoinjeksjonstjeneste og embryoer fra fluer som inneholder ØC31-integrasjonssteder. Bak de injiserte embryoene ved 26 °C.
      MERK: Attp40w (med integrasjonssteder på det andre kromosomet) linjen ble brukt til å generere CasRx linjer og 8622 (med integrasjonssteder på tredje kromosom) linjen ble brukt til å generere ulike gRNA linjer.
    2. Hold fluene enten som homozygote linjer eller som balanserte heterozygote linjer.
      MERK: Ubiq-CasRx og Ubiq-dCasRx fluer ble holdt som heterozygote balanserte linjer med CyO som balansere. I tillegg inneholder både Ubiq-CasRx- og Ubiq-dCasRx-vektorer en dsRed-markør. Som et resultat har Ubiq-CasRx og Ubiq-dCasRx fluer følgende tre fenotyper: dsRed-positive, krøllete vinger og hvite øyne. De gRNA-uttrykkende fluene ble holdt som homozygote linjer. Deres Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) fly stock tall er: #84118 (Ubiq-CasRx), #84119 (Ubiq-dCasRx), #84124 (gRNAw), #84122 (gRNAN), #84123 (gRNAY), #84986 (gRNAGFP).
  4. Flygenetikk (figur 1A)
    1. Samle 10 jomfru voksne kvinnelige fluer fra den homozygote gRNA-linjen og samle 5 voksne mannlige fluer fra den balanserte heterozygote Ubiq-CasRx / CyO-linjen. Sett de oppsamlede kvinnelige og mannlige fluene, som kalles foreldrefluene, i et hetteglass supplert med tørt gjærpulver (figur 1A).
    2. Gjenta forrige trinn 3 ganger for å generere 3 replikeringer. For kontrollgruppen bruker du Ubiq-dCasRx/CyO-linjen samtidig som du beholder alt annet på samme måte.
      MERK: For et vanlig hetteglass med mat er 0,1 g tørt gjærpulver tilstrekkelig. BDSC's fluematoppskrift brukes.
    3. Bak hetteglassene som inneholder foreldrefluene ved 26 °C i 48 timer. Fjern deretter alle foreldrefluer fra hvert hetteglass. Hold deretter hetteglassene ved 26 °C i minst 20 dager.
    4. Vær oppmerksom på hetteglassene hver dag for å se om noen nye voksne avkom dukket opp fra pupper av F1 generasjon. I så fall bedøv dem med karbondioksid ved å sette inn et rør koblet til en karbondioksidtank inne i fly hetteglassene, og slå deretter på strømningsbryteren i 10 sekunder.
    5. Når fluene blir immobile, tøm dem fra hetteglasset til en fly-pad, som også er koblet til karbondioksidtanken og karbondioksid strømmer kontinuerlig ut gjennom flyputen.
    6. Skår de bedøvede fluenes fenotype og bilde dem ved hjelp av fargekamera koblet til et fluorescerende stereomikroskop. Tell antall avkom med forskjellige fenotyper. Bruk bildebehandlingsprogramvare for etterbehandling og kompilering av bilder (figur 2A - 2D).
      MERK: Basert på mendelsk genetikk forventes det to typer fluer blant avkomene for hvert kors (figur 1A).
  5. RNA-Seq (Figur 2E – 2G)
    1. Eksempel på samling
      MERK: Velg en passende prøveinnsamlingsmetode fra de tre eksemplene nedenfor; 3 replikeringer for hver distinkte eksempeltype kreves.
      1. Prøvesamling for flygehode for voksne
        1. Samle 10 jomfru voksne kvinnelige fluer fra den homozygote gRNA-linjen. Samle 5 voksne mannlige fluer fra den balanserte heterozygote Ubiq-CasRx / CyO-linjen. Sett de oppsamlede kvinnelige og mannlige fluene, som er foreldrefluene, i et hetteglass supplert med tørt gjærpulver.
        2. Gjenta forrige trinn 3 ganger for 3 replikeringer. For kontrollgruppen bruker du Ubiq-dCasRx/CyO-linjen samtidig som du beholder alt annet på samme måte.
        3. Bak hetteglassene som inneholder foreldrefluene ved 26 °C i 48 timer. Fjern deretter alle foreldrefluer fra hvert hetteglass. Hold deretter hetteglassene ved 26 °C til avkom kommer ut av pupper.
        4. Samle 10 1-dagers gamle voksne fluer med riktig fenotype. Bedøv fluene med karbondioksid, kutt deretter av fluehodet og legg hodene i et 1,5 ml sentrifugerør på tørris. Oppbevar sentrifugerøret ved -80 °C. Gjenta dette trinnet tre ganger for tre replikeringer.
      2. 17 – 20 timer gammel embryoprøvesamling
        1. Samle 8-10 jomfru voksen kvinne flyr fra den homozygote gRNA-linjen. Samle 4-5 voksne mannlige fluer fra den balanserte heterozygote Ubiq-CasRx / CyO-linjen. Sett de oppsamlede kvinnelige og mannlige fluene, som er foreldrefluene, i et hetteglass supplert med tørt gjærpulver.
        2. Gjenta forrige trinn 3 ganger for 3 replikeringer. For kontrollgruppen bruker du Ubiq-dCasRx/CyO-linjen samtidig som du beholder alt annet på samme måte.
        3. Bak hetteglassene som inneholder foreldrefluene ved 26 °C i 48 timer.
        4. Forbered en drue-juice embryo samlingskammer for hver replikering etter denne oppskriften: 376 ml vann, 126 ml druejuice, 15 g agar og 6 g sukrose. Sett media i et 1 L beger og mikrobølgeovn det høyt i 5-6 minutter mens du holder øye med media i begeret for å sjekke om bobler / skum vises. I så fall må du stoppe mikrobølgeovnen og la boblen/skummet slå seg ned. Fortsett mikrowaving på denne måten til boblen blir klar. Ikke virvle før alle bobler er klare. Til slutt, tilsett 10 ml 100% alkohol og 5 ml eddiksyre. Bland godt, og rør deretter mediet i 35 mm Petri-retter med en 25 ml serologisk pipet. Når media størkner i Petri-parabolen, er den klar til bruk.
        5. På slutten av den 48-timers inkubasjonen, overfør foreldrefluer til drue-juice embryo samlingskamre og inkubert dem ved 26 °C i 3 timer. Fjern deretter de voksne fluene mens du holder de nylagde embryoene på druejuiceplatene i ytterligere 17 timer ved 26 °C.
        6. Etter inkubasjon samler du de 50 - 100 embryoene fra druejuiceplatene, rengjør embryooverflaten ved å senke dem ned i deionisert vann, og overfør dem deretter til et 1,5 ml sentrifugerør på is. Oppbevar dem ved -80 °C. Gjenta dette trinnet tre ganger for tre replikeringer.
      3. Første instar larver prøve samling
        1. Samle 8-10 jomfru voksen kvinne flyr fra den homozygote gRNA-linjen. Samle 4-5 voksne mannlige fluer fra den balanserte heterozygote Ubiq-CasRx / CyO-linjen. Sett de oppsamlede kvinnelige og mannlige fluene, som er foreldrefluene, i et hetteglass supplert med tørt gjærpulver. Gjenta dette trinnet tre ganger for tre replikeringer. For kontrollgruppen bruker du Ubiq-dCasRx/CyO-linjen samtidig som du beholder alt annet på samme måte.
        2. Bak hetteglassene som inneholder foreldrefluene ved 26 °C i 48 timer. Overfør deretter de voksne fluene til et annet nytt vanlig hetteglass for overnatting inkubasjon (16 h) ved 26 °C. Fjern deretter de voksne fluene.
        3. Hold det embryoholdige hetteglasset ved 26 °C i 24 timer, og skår deretter de transheterozygote første instar larver under mikroskopet ved hjelp av baserte distinkte markører. Samle 15-30 larver med riktige fenotyper og legg dem i et 1,5 ml sentrifugerør og lagre dem ved -80 °C. Gjenta dette trinnet tre ganger for tre replikeringer.
    2. Sekvensering
      1. RNA-ekstraksjon: Bruk et kommersielt tilgjengelig RNA-ekstraksjonssett og følg settets instruksjon for å behandle alle prøver. Deretter inkuberer du de ekstraherte RNA-prøvene med kommersielt tilgjengelig deoksyribonuklease og følger instruksjonene for å fjerne eventuelt forurensende DNA fra prøvene.
      2. Mål RNA-konsentrasjonen ved hjelp av kommersielt tilgjengelig UV-vis spektrofotometer. Mål RNA-integriteten i prøvene ved hjelp av kommersielt tilgjengelig analyseoppsett av RNA-integritet.
      3. Konstruer RNA-seq-bibliotekene ved hjelp av kommersielt tilgjengelig RNA-bibliotekforberedelsessett.
      4. Bruk ekstern sekvenseringstjeneste for biblioteksekvensering med følgende innstillinger: enkeltlesingsmodus; leselengde: 50nt, dybde: 20 millioner leser per bibliotek. Utfør basisanrop med RTA 1.18.64, og konverter deretter dataene til FASTQ ved hjelp av bcl2fastq 1.8.4.
        MERK: Rå sekvenseringsdata finnes i National Center for Biotechnology Information Sequencing Read Archive (innleverings-ID: SUB6818910 [BioProject: PRJNA600654]).
    3. Bioinformatikk
      1. Kartet leser fra sekvenseringsdataene til Release 6 Drosophila melanogaster-genomet fra Berkeley Drosophila Genome Project (GenBank-tiltredelsesnummer: GCA_000001215.4) og de eksogene CasRx - og GFP-sekvensene ved hjelp av standard parameterinnstilling for STAR aligner28 med tillegg av filteralternativet "-outFilterType BySJout" og "-sjdbGTFfile Drosophila_melanogaster. BDGP6.22.97.gtf" genoverføringsformatfil fra ENSEMBL.
      2. Bestem rå transkripsjonsantall for hver kommenterte transkripsjon med funksjonen Counts35 ved hjelp av alternativene "-t exon -g gene_id -M -O --brøk". Normaliser deretter rå transkripsjonstall ved hjelp av totalt transkripsjonstall ved hjelp av "addTpmFpkmToFeatureCounts.pl" Perl-skriptet.
      3. Bruk den maksimale posteriorimetoden med den opprinnelige krympeestimatoren i DESeq2-rørledningen til å estimere hvert gens transkripsjoners logaritmiske foldeendring (LFC).

2. Allestedsnærværende in vivo eksogen RNA-målretting ved hjelp av et trekomponent casrx-system

  1. Genererer eksogen mål allestedsnærværende uttrykk vektor
    1. PCR forsterker Ubiq-promotorfragmentet ved hjelp av primere 1052B. C1 og 1052B. C2 og Addgene plasmid #112686 26. Deretter forsterker PCR T2A-eGFP-fragmentet forsterket fra Addgene plasmid #112686 med primere 908A.1 og 908A.2 (tabell 1)26. Deretter forsterker PCR Ubiq-promotorfragmentet som omvendt sekvens ved hjelp av Addgene plasmid #112686 med primere 908A.3 og 908A.4 (tabell 1)26. Gelrens Ubiq-promotorfragmentet, T2A-eGFP-fragmentet og det omvendte Ubiq-promotorfragmentet ved hjelp av gelrensingssett.
    2. Bestill en tilpasset firefly luciferase-kodesekvens og et tilpasset fragment som inneholder et p10 3'UTR-fragment, omvendt renilla luciferase etterfulgt av et SV40 3'UTR-fragment.
    3. Digest Addgene plasmid #112688 med begrensningsenzym AscI og XbaI24. I de resulterende produktene, gelrense de større fragmentene ved hjelp av gelrensingssett, som kalles basevektor ryggraden.
    4. Bruk Gibson-monteringsmetoden til å montere basevektorer med basevektor-ryggraden og følgende fragmenter: Ubiq promotorfragment, T2A-eGFP-fragmentet, det omvendte Ubiq-promotorfragmentet, firefly luciferase-kodesekvensen og den omvendte renilla luciferase etterfulgt av et SV40 3'UTR fragment25.
      MERK: Addgene-IDen til den resulterende dual-luciferase uttrykksvektoren (OA-1052B) er #132426.
  2. Genererer gRNA-uttrykksvektor
    1. PCR forsterker U6:3-promotorsekvensen ved hjelp av primerne 1043.C1 og 1043.C23 og Addgene plasmid #112688 (tabell 1)26. Gelrens de forsterkede U6:3-fragmentene ved hjelp av gelrensingssett.
    2. Digest Addgene plasmid #112688 med begrensningsenzym AscI og XbaI24. I de resulterende produktene, gelrense de større fragmentene, som kalles pre-base vektor ryggraden, ved hjelp av gel rensing kit.
    3. Monter basevektor med pre-base vektor ryggraden og U6: 3 fragment ved hjelp av Gibson montering metode25. Basisvektoren heretter heter OA-1043.
    4. Syntetisere målgenets gRNA-fragment ved hjelp av ekstern gensyntesetjeneste.
    5. Fordøye basevektoren OA-1043 med begrensning enzym PstI og NotI24. Hold hele fordøyelsesproduktet, som kalles fordøyd OA-1043.
    6. Sett sammen gRNA-uttrykksvektor med den fordøyde OA-1043 og målgenet gRNA fragment ved hjelp av Gibson-monteringsmetoden25.
      MERK: Addgene-IDen til den resulterende plasmiden (OA-1052K) er #132422.
  3. Genererer transgene fluer
    1. Injiser OA-1052B vektor i fly embryoer ved hjelp av embryoer fra fluer som inneholder ØC31 integrasjonssted på tredje kromosom, BDSC fly lager nummer 9744, via ekstern fly embryo injeksjon tjeneste. På samme måte injiserer du OA-1052K-vektoren i flyembryoer ved hjelp av embryoer fra fluer som inneholder ØC31-integrasjonsstedet på det tredje kromosomet, BDSC flybestand nummer 8622. Bak de injiserte embryoene ved 26 °C.
    2. Hold de dual-luciferase-uttrykkende fluene og gRNA flyr som homozygote linjer; holde Ubiq-CasRx-linjene som dobbeltbalanserte heterozygote linjer ved å overse den enbalanserte heterozygote Ubiq-CasRx-linjen generert i avsnitt 1 til balanserelinjer som bærer TM6-balanserekromosom med stubbemarkør (Stb) og beholder bare de dobbeltbalanserte avkomene med hvite øyne, krøllete vinger og dsRed-fluorescerende fenotyper samtidig.
      MERK: BDSC fly aksjenumre er: #84127 (Ubiq-Fluc-Rluc), #84125 (gRNAFluc).
  4. Fly genetikk (figur 1B og figur 3A)
    1. Samle 8-10 jomfru voksen kvinne flyr fra dual-luciferase-uttrykkende linje. Samle 4-5 voksne mannlige fluer fra balansert heterozygot Ubiq-CasRx / CyO; +/TM6, Stb-linjen som viser hvite øyne, krøllete vinger og dsRed fluorescens samtidig. Sett de oppsamlede kvinnelige og mannlige fluene, som er foreldrefluene, i et hetteglass supplert med tørt gjærpulver (heretter kalt Trinn 1 Cross).
    2. Gjenta forrige trinn 3 ganger for 3 replikeringer. For kontrollgruppen bruker du Ubiq-dCasRx/CyO. +/TM6, Stb line mens du holder alt annet likt.
    3. Bak Step 1 Cross hetteglass som inneholder foreldrefluer ved 26 °C i 48 timer. Fjern deretter alle foreldrefluer fra hvert hetteglass. Hold deretter hetteglassene ved 26 °C i minst 14 dager. I løpet av denne tiden samler du 8-10 kvinnelige jomfruer fra den homozygote firefly luciferase-målrettede gRNA-linjen. Gjenta dette trinnet tre ganger for tre replikeringer.
    4. Vær oppmerksom på hetteglassene på trinn 1-korset hver dag for å se om en ny voksenflue kommer ut av pupper. I så fall bedøv dem med karbondioksid, samle 5 mannlige fluer som uttrykker både Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) og dual-luciferase reporter fra avkom og legg dem i et nytt hetteglass sammen med 10 jomfruhunner fra firefly luciferase-målrettet gRNA-linje (heretter kalt Step 2 Cross). Gjenta dette trinnet tre ganger for tre replikeringer.
    5. Samle en annen 5 en-dagers gammel mann som uttrykker både Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) og dual-luciferase reporter fra Step 1 Cross hetteglass og inkuberer dem i 2 - 4 dager ved 26 °C. Deretter overfører du dem til 1,5 ml sentrifugerør og lagrer dem ved -80 °C. Gjenta dette trinnet tre ganger for tre replikeringer.
    6. Bak Step 2 Cross hetteglass som inneholder foreldrefluer ved 26 °C i 48 timer. Fjern deretter alle foreldrefluer fra hvert hetteglass. Hold deretter hetteglassene ved 26 °C i minst 20 dager.
    7. Vær oppmerksom på hetteglassene på trinn 2-korset hver dag for å se om det dukket opp nye voksne avkom fra pupper. I så fall bedøver du dem med karbondioksid, scorer de bedøvede fluenes fenotyper og bilder dem ved hjelp av fargekamera utstyrt med et fluorescerende stereomikroskop. Tell antall avkom med forskjellige fenotyper. Bruk bildebehandlingsprogramvare for etterbehandling og kompilering av bilder (figur 3B – 3C).
      MERK: Mendelisk genetikk antyder at hvis fluer alle er levedyktige, forventes 4 typer fluer blant avkomene fra Trinn 2 Cross, som hver står for 25% av befolkningen (figur 1B og figur 3A).
  5. Luciferase-analyse (figur 3D)
    1. Generer trippel transheterozygote fluer samt kontrollen flyr ved å gjenta trinn 2.4.1-2.4.5. Samle mannlige fluer ved fødselen og alder dem til 3 dager gammel.
    2. Overfør de 3-dagers gamle fluene til 1,5 ml sentrifugerør og lyse dem med en pestle og luciferase lysisbufferen til kommersielt tilgjengelig luciferase analysesett.
    3. Bruk 5 μL lysvev fra hver prøve for å måle både firefly- og renilla luciferaseaktivitet ved hjelp av kommersielt tilgjengelig luciferaseanalysesett og luminometer.

3. Vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved hjelp av et trekomponent casrx-system

  1. Genererer UASt-CasRx- og UASt-dCasRx-uttrykksvektor
    1. PCR forsterker UASt-promotorsekvensen ved hjelp av plasmid pJFRC81 og primere 1041.C9 og 1041.C11; Deretter forsterker PCR CasRx fragment ved hjelp av plasmid OA-1050E (Addgene ID #132416) og primere 1050L. C1 og 1050E. C4; og deretter PCR forsterke dCasRx fragmenter ved hjelp av plasmid OA-1050R (Addgene ID #132417) og primere 1050L. C1 og 1050E. C4 (tabell 1)26. Gelrens den forsterkede UASt-promotorsekvensen, CasRx- og dCasRx-fragmentene ved hjelp av gelrensingssett.
    2. Fordøye base vektor (Addgene plasmid #112686) med begrensning enzymer NotI og PacI24. I de resulterende produktene, gelrense det større fragmentet, som kalles basevektor ryggraden, ved hjelp av gelrensingssett.
    3. Monter UASt-CasRx-vektoren med ryggraden for grunnvektvekten, UASt-promotorsekvensen og CasRx-fragmentet ved hjelp av Gibson-enheten; Monter deretter UASt-dCasRx-vektoren med ryggraden i grunnvektvekten, UASt-promotorsekvensen og dCasRx-fragmentet ved hjelp av Gibson-monteringsmetoden25.
      MERK: UASt-CasRx-vektoren er Addgene plasmid #132418, og UASt-dCasRx-vektoren er Addgene plasmid #132419
  2. Genererer transgene fluer
    1. Injiser UASt-CasRx-vektoren i flyembryoer ved hjelp av fly embryoinjeksjonstjeneste og embryoer fra fluer ØC31 integrasjonssted 8621 på deres andre kromosomer; Injiser deretter UASt-dCasRx-vektoren i flyembryoer ved hjelp av fly embryoinjeksjonstjeneste og embryoer fra fluer ØC31 integrasjonssted 8621 på deres andre kromosomer. Bak de injiserte embryoene ved 26 °C.
    2. Hold fluene som dobbeltbalanserte heterozygote linjer med CyO- og SB-markører. MERK: IDene til flylinjene i BDSC er 84121 (UASt-CasRx) og 84120 (UASt-dCasRx).
  3. Flygenetikk (figur 1C)
    1. Bestill ønskede GAL4-linjer fra BDSC; Hent relevante gRNA-linjer fra trinn 3.2.2 (eller fra BDSC).
      MERK: Følgende 2 GAL4 fluer fra BDSC ble brukt: GAL4-GMR (BDSC ID: #29967), GAL4-y (BDSC ID: #44373). De samme 3 gRNA-linjene som ble generert i den første delen ble brukt: gRNAW (BDSC ID: #84124), gRNAN (BDSC ID #84122), gRNAY(BDSC ID: #84123).
    2. Samle 5-10 jomfru voksen kvinne flyr fra gRNA-linjen. Samle 2-4 voksne mannlige fluer fra den dobbeltbalanserte heterozygote UASt-CasRx / CyO; +/TM6, Sb-linje som viser hvite øyne, krøllete vinger og dsRed fluorescens samtidig. Sett de samlede kvinnelige og mannlige fluene, som er foreldrefluene, i et vanlig mathette hetteglass (heretter kalt Trinn 1 Cross). Gjenta dette trinnet tre ganger for tre replikeringer. For kontrollgruppen bruker du UASt-dCasRx/CyO. +/TM6, Sb linje mens du holder alt annet det samme.
    3. Bak Step 1 Cross hetteglass som inneholder foreldrefluer ved 26 °C i 48 timer. Fjern deretter alle foreldrefluer fra hvert hetteglass. Hold deretter hetteglassene ved 26 °C i minst 14 dager. I løpet av denne tiden, samle 5-10 kvinnelige jomfruer fra GAL4 linjen. Gjenta dette trinnet tre ganger for tre replikeringer.
    4. Vær oppmerksom på hetteglassene på trinn 1-korset hver dag for å se om en ny voksenflue kommer ut av pupper. I så fall bedøv dem med karbondioksid, samle 2-4 mannlige fluer som uttrykker både UASt-CasRx (eller UASt-dCasRx) og gRNA-vektoren fra avkomene som samtidig har dsRed-fluorescerende og stubbe fenotyper. Sett de innsamlede hannene fra Trinn 1 Cross inn i et nytt hetteglass sammen med 5-10 samlet jomfru kvinne fra GAL4-linjen (heretter kalt Trinn 2 Cross). Gjenta dette trinnet tre ganger for tre replikeringer.
    5. Bak Step 2 Cross hetteglass som inneholder foreldrefluer ved 26 °C i 48 timer. Fjern deretter alle foreldrefluer fra hvert hetteglass. Hold deretter hetteglassene ved 26 °C i minst 20 dager.
    6. Vær oppmerksom på hetteglassene i Step 2 Cross hver dag for å se om det dukker opp en ny voksenflue fra pupper. I så fall bedøver du dem med karbondioksid, scorer de bedøvede fluenes fenotyper og bilder dem ved hjelp av fargekamera utstyrt med et fluorescerende stereomikroskop. Tell antall avkom med forskjellige fenotyper. Bruk bildebehandlingsprogramvare for etterbehandling og kompilering av bilder (figur 4).
      MERK: Mendelisk genetikk antyder at hvis fluer alle er levedyktige, forventes 4 typer fluer blant avkomene fra Trinn 2 Cross, som hver står for 25% av befolkningen (figur 1C).

Representative Results

Allestedsnærværende in vivo RNA-målretting ved hjelp av et tokomponent casrx-system
F1 transheterozygote fluer som uttrykte både Ubiq-CasRx og gRNA (rettet mot både endogene og eksogene gener) viste markerte fenotyper sammenlignet med kontrollfluene som uttrykte Ubiq-dCasRx- og gRNA-konstruksjonene (figur 2 og figur 4). Spesielt har de transheterozygote CasRx-fluene betydelig lavere nivåer av overlevelsesrate sammenlignet med de transheterozgyøse dCasRx-fluene, noe som indikerer toksisitet av Ubiq-CasRx-systemet (figur 2A og figur 4A). Det er verdt å merke seg at både transheterozygote CasRx- og dCasRx-fluer har mindre enn 50% arverate, som er det forventede forholdet basert på mendelisk genetikk. Av de tre målgenene er Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ fluer og Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAY/+ fluer er ikke-levedyktige (0% arv) og vokste ikke utover det andre instar larverstadiet (figur 2A-2B). Den overlevende Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAW/+ fluer, hvis arv var 12,9%, viste en distinkt fullt penetrant hvitøyet fenotype (figur 2B). I tillegg til observerbare egenskaper forbundet med CasRx, kunne vi bekrefte betydelig reduksjon av målgentranskripsjoner for 3 målgener: Hakk, gul og GFP (figur 2E-2G). Reduksjon av hvite gentranskripsjoner ble observert i Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAW/+ fluer, sammenlignet med kontrollen Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAW/+ fluer, selv om reduksjonen ikke var statistisk signifikant (figur 2E - 2F). Bevis på off-target aktivitet indusert av CasRx ble funnet ved sammenligning av differensialt uttrykte transkripsjoner mellom prøver fra CasRx-uttrykkende fluer og prøver fra dCasRx-uttrykkende fluer (Figur 2E, 2G). Antall ikke-målrettede transkripsjoner som er vesentlig differensialt uttrykt er som følger: hvit, 253 (1,4% av totale transkripsjoner); Hakk, 300 (1,7%); gul, 41 (0,23%); GFP, 5880 (33 %) (Figur2G). Av de totalt 17 779 ulike transkripsjonene ble 6 ikke-målrettede transkripsjoner signifikant uttrykt i alle de 4 utvalgsgruppene. En av de 6 transkripsjonene som ble identifisert var Gadd45, et gen involvert i apoptose og cellulær arrestasjon i fluer, noe som øker muligheten for at den enzymatiske virkningen av CasRx enten direkte kan utløse cellulær apoptose eller indirekte utløse feilutpressing av andre gener, noe som igjen fører til apoptose. Til slutt er det verdt å merke seg at Ubiq-CasRx og Ubiq-dCasRx fluer ikke ble etablert som homozygote bestander, antagelig på grunn av toksisitet gitt av høyt allestedsnærværende uttrykk. Som et resultat ble heterozygote Ubiq-CasRx / CyO og Ubiq-dCasRx / CyO fluer brukt til kryssing med homozygote gRNA-fluelinjer. I sum er to-komponent Ubiq-CasRx-systemet i stand til å oppnå allestedsnærværende RNA-målretting for både endogene og eksogene mål, noe som resulterer i observerbare fenotyper og transkripsjonsreduksjon. Disse resultatene viste også at CasRx-mediert RNA-målretting kan introdusere toksisitet in vivo.

Allestedsnærværende in vivo eksogen RNA-målretting ved hjelp av et trekomponent casrx-system
Resultatene fra totrinnskorset viste at til tross for målgenets eksogene natur (dvs. Fluc), som uttrykte alle tre transgenes i F2 trippeltransheterozygoter (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) resulterte i 100 % dødelighet sammenlignet med kontrollkryss som involverte Ubiq-dCasRx, der det ikke ble observert dødelighet i F2 trippeltransheterozygoter (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) (figur 3B-C ). Mer spesifikt resulterte bare kombinasjonen av alle tre transgenes (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) i 100% dødelighet (figur 3B og D), mens (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) og (Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) genotyper var levedyktige og manglet fenotyper med arvetallene som samsvarte med de forventede mendeliske overføringsratene, antyder at tilgjengeligheten av målsekvensen (dvs. firefly luciferase) i kombinasjon med Ubiq-CasRx/+ og gRNAFluc er det som resulterte i de observerte dødelighetsfenotypene, antagelig stammer fra sikkerhetsaktiviteten til Cas13 enzymer2,8 . I tillegg er det ingen skille mellom fenotyper eller dramatisk påvirkning på arv i F1 transheterozygoter (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ eller Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) ble observert sammenlignet med Ubiq-dCasRx-kontroller (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ eller Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Figur 3B), noe som indikerer at et katalytisk aktivt enzym er avgjørende for å oppnå de observerte dødelighetsfenotypene. Videre viste Fluc og Rluc uttrykksnivåer i fluer av alle levedyktige genotyper ikke signifikant reduksjon i Fluc-uttrykket i Ubiq-dCasRx trippeltransheterozygotes (Ubiq-dCasRx /+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) sammenlignet med doble luciferase reporterkontroller. Dette antyder at Fluc proteinuttrykksnivåer ikke ble redusert ved dCasRx-målretting (figur 3D). Samlet sett indikerer den vanlige dødelighetsfenotypen i de to forskjellige CasRx-medierte allestedsnærværende RNA-målrettingsforsøkene at når den brukes på vev allestedsnærværende, kan CasRx-mediert RNA-målretting være giftig for organismen.

Vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved hjelp av et trekomponent casrx-system
Det høye toksisitetsnivået som ble observert i allestedsnærværende RNA-målrettingsforsøk, fikk oss til å utforske den vevsspesifikke RNA-målrettingen ved hjelp av en tre-komponent CasRx-systemdesign som er beskrevet i metodedelen. Faktisk ble nivået av toksisitet observert redusert da det totale CasRx-uttrykket ble senket ved hjelp av UASt-promotoren sammenlignet med Ubiq-promotoren, Dette eksemplifiseres i tre aspekter: 1) UASt-CasRx- og UASt-dCasRx-linjene ble opprettholdt som homozygote linjer, men basert på totrinns kryssordningen ble dobbeltbalanserte UASt-CasRx- og UASt-dCasRx-linjer brukt til å utføre kryssene, 2) alle F2 generasjon dCasRx trippel transheterozygot arverater samsvarte med forventet 25% Mendelian arverate, og 3) F2 generasjon CasRx trippel transheterozygot dødelighet fenotype ble moderat redusert. I det hvite målrettingseksperimentet, av de 25% mendeliske arvetallene som forventes i F2 trippeltransheterozygoter, ble bare 0,57% levedyktige voksne fluer (UASt-CasRx /+; gRNAW/GMR-Gal4) observert, som alle viste alvorlig øyespesifikk pigmentering og morfologifenotyper (figur 4A og 4B). For det hvite målrettingskorset var den CasRx-uttrykkende trippel transheterozygote F2-arveprosenten betydelig lavere enn for dCasRx-uttrykkende trippel transheterozygot kontrollgruppe (27,6 %) (figur 4A). I Notch-målrettingseksperimentet var CasRx-uttrykkende trippel tranheterozygot som fraktet alle tre transgenes 100% dødelige, mens dCasRx-kontrollarvraten var 29,3% (figur 4A). I det gule målrettingseksperimentet viste F2 trippel transheterozygot CasRx-uttrykkende, gRNAy og y-GAL4 marginal chitinpigmentreduksjon som små flekker av gul kutiklet på thoraxen og magen med en arverate på 2,67%, mye lavere enn dCasRx-kontrollgruppen (25,2%) (Figur4A ). Alle dCasRx kontroll trippel transheterozygot fluer presenterte ikke åpenbare fenotyper som CasRx-uttrykkende fluer, noe som indikerer at katalytisk aktivitet av CasRx bidro til de observerte fenotypene. Den lave arveprosenten i CasRx trippel transheterozygot gruppe antydet at to kilder til toksisitet eksisterer i CasRx RNA-målretting: den ene er forbundet med høyt uttrykk for CasRx, hvis toksisitet ble redusert av restriktivt CasRx-uttrykk, den andre er knyttet til sikkerhetsaktiviteten. Samlet viste disse resultatene at CasRx-systemet kan oppnå vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved å utnytte det klassiske Gal4/UASt-systemet og i mellomtiden redusere toksisiteten. Imidlertid ble toksisitet og sporadiske dødelighet fenotyper fortsatt observert på et lavere nivå av alvorlighetsgrad sammenlignet med de allestedsnærværende tilnærmingene, noe som indikerer at sikkerhetsmessig spaltingsaktivitet er forbundet med toksisitet.

Figure 1
Figur 1: Generell oversikt over RNA-målretting ved hjelp av et Cas13D-system. (A) Skjema for det ett-trinns genetiske krysset i det allestedsnærværende in vivo RNA-målrettingen ved hjelp av et tokomponent CasRx-system. (B) Skjematikk av et to-trinns genetisk kryss i allestedsnærværende in vivo eksogen RNA målretting ved hjelp av tre-komponent CasRx-systemet. (C) Skjematikk av et to-trinns genetisk kryss i vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved hjelp av et tre-komponent CasRx-system. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Allestedsnærværende in vivo RNA-målretting ved hjelp av et to-komponent CasRx-system (gjengitt5). (A) Totale arveprosenter av transheterozygote fluer som arver Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) og gRNAer. Blå skyggelegging i boksen plott indikerer fenotype penetrance. (B) Fenotyper av transheterozygote fluer. Piler indikerer vevnekrose i øyet. Svart-hvitt-flue merket med ''X'' representerer dødelighet. (C) Totale arveprosenter av transheterozygote fluer av toveis kryss mellom Ubiq-CasRx (eller Ubiq-dCasRx) og gRNAGFP-OpIE2-GFP fluer. M, mors arv av CasRx; P, fars arv av CasRx. (D) F1 larver avkom i farskorset. (E) Transkripsjoner maksimalt en posteriori estimater for logaritmisk fold endring. DESeq2-rørledningen ble brukt. (F) Transkripsjoner per million (TPM) målrettet med CasRx eller dCasRx. (G) CasRx-depentent differensialt uttrykt transkripsjonsprosent av transkripsjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Allestedsnærværende in vivo eksogen RNA-målretting ved hjelp av et tre-komponent CasRx-system. (A) Skjematikk av det to-trinns genetiske korset. (B) Totale arveprosenter for alle genotyper som dukker opp i F2-generasjonen . Arving av alle tre transgenes (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc og gRNAFLuc) i F2 avkom resulterte i 100% dødelighet og var betydelig lavere sammenlignet med Ubiq-dCasRx trippel transheterozygotes kontrollgruppe (p = 0,001, t-test). (C) Å bære Ubiq-CasRx/gRNAFluc alene eller Ubiq-CasRx og Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc alene førte ikke til alvorlig dødelighet, og arveforholdene mellom Ubiq-CasRx og Ubiq-dCasRx transheterozygoter var ikke signifikant forskjellige (p = 0,41 og p = 0,51, henholdsvis t-test). (D) Luciferase-forholdet normaliserer Fluc-avlesninger til Rluc-avlesninger. Trippel transheterozygote fluer som uttrykte Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc var embryonale dødelige, som var representert av en flue med en "X", og som et resultat ble luciferaseuttrykk ikke målt. Fluc/Rluc-forholdet mellom Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb transheterozygotes var betydelig lavere enn for de andre Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc-uttrykkende gruppene (p = 1,2e-06 eller lavere, t-test). Resultatene fra gRNAFLuc-only-gruppen var signifikant lavere enn for alle andre grupper (p = 1,2e-06 eller lavere, t-test). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Vevsspesifikk in vivo RNA-målretting ved hjelp av et trekomponent CasRx-system (reprinted5). (A) Total arveprosent av trippel transheterozygote fluer som bærer tre transgenes (UASt-CasRx eller UASt-dCasRx, gRNAer og Gal4-driver. (B) Fenotyper av trippel transheterozygote fluer. Den hvite pilen indikerer chitin pigmentreduksjon i thoraxen. Svart-hvitt-flue merket med ''X'' representerer dødelighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Konstruere Beskrivelse Grunning Primersekvens (5 til 3') PCR-mal
OA-1050E CasRx 1050E. C3 TACTAATTTTCCAC
ATCTCTATTTTGAC
CCGCAGATTAATTA
ATGAGCCCCAAGA
AGAA		 pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)
1050E. C4 CAATTGATTTGTTA
TTTTAAAAACGATT
CATTCTAGCTAGCT
TAAGCGTAATCTGG
AACA
OA-1050R dCasRx 1050E. C3 TACTAATTTTCCAC
ATCTCTATTTTGAC
CCGCAGATTAATTA
ATGAGCCCCAAGA
AGAA		 pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)
1050E. C4 CAATTGATTTGTTA
TTTTAAAAACGATT
CATTCTAGCTAGCT
TAAGCGTAATCTG
GAACA
OA-1050L UASt-promotør 1041.C9 GCGGGTTCTCGA
CGGTCACGGCGG
GCATGTCGACGC
GGCCGCAACCAA
CAACACTAGTAG		 pJFRC81
1041.C11 CTGGCCTCCACC
TTTCTCTTCTTCT
TGGGGCTCATGT
TTAAACCCAATT
CCCTATTCAGA
CasRx 1050L. C1 AATACAAGAAGA
GAACTCTGAATA
GGGAATTGGGT
TTAAACATGAGC
CCCAAGAAGAA		 pCasRx
1050E. C4 CAATTGATTTGT
TATTTTAAAAAC
GATTCATTCTA
GCTAGCTTAAG
CGTAATCTGGA
ACA
OA-1050S UASt-promotør 1041.C9 GCGGGTTCTC
GACGGTCACG
GCGGGCATGT
CGACGCGGCC
GCAACCAACAA
CACTAGTAG		 pJFRC81
1041.C11 CTGGCCTCCA
CCTTTCTCTTC
TTCTTGGGGCT
CATGTTTAAAC
CCAATTCCCTA
TTCAGA
dCasRx 1050L. C1 AATACAAGAAG
AGAACTCTGAAT
AGGGAATTGGG
TTTAAACATGAG
CCCCAAGAAGAA		 pdCasRx
1050E. C4 CAATTGATTTGT
TATTTTAAAAAC
GATTCATTC-KODE
CTAGCTTAAGCG
TAATCTGGAACA
OA-1043 U6:3-promotør 1043.C1 GGGAATTGGGA
ATTGGGCAATAT
TTAAATGGCGGC
GCGCCGAATTCT
TTTTGCTCACCT		 Addgene plasmid #164586
1043.C23 ACACTAGTGGAT
CTCTAGAGGTAC
CGTTGCGGCCG
CAAAAAAGTTGT
AATAGCCCCTCA
AAACTGGACCTT
CCACAACTGCAG
CCGACGTTAAAT
TGAAA
OA-1052B Ubiq promotør 1052B. C1 GGGAATTGGGCA
ATATTTAAATGGC
GGCTGCAGCGC
GCAGATCGCCGAT		 Addgene plasmid #112686
1052B. C2 TTTCTTTATGTTT
TTGGCGTCTTCC
ATCCTAGGTCTG
CGGGTCAAAATA
GAGATG
T2A-eGFP 908A1 ATAAAGGCCAAG
AAGGGCGGAAA
GATCGCCGTGG
AGGGCAGAGGA
AGTCTTCTAACAT
GC		 Addgene plasmid #112686
908A2 TTGTTATTTTAAAA
ACGATTCATTCTA
GGCGATCGCTTA
CTTGTACAGCTC
GTCCATGCC
Omvendt Ubiq-promotør 908A3 ACCGTGACCTAC
ATCGTCGACACTA
GTGGATCTCTAGA
CGCGCAGATCGC
CGATG		 Addgene plasmid #112686
908A4 GGATCATAAACTT
TCGAAGTCATGC
GGCCGCTCTGCG
GGTCAAAATAGAG
ATGT

Tabell 1: Liste over molekylær konstruksjon og primere som brukes i denne studien. Denne listen inneholder alle konstruksjoner (både IDen og beskrivelsen) og hver konstruksjons tilknyttede primere (både IDen og sekvensene (5 til 3)) og malene som brukes.

Discussion

Med tre forskjellige applikasjonsdesign av CasRx-systemet demonstrerte dette arbeidet in vivoprogrammable RNA-målretting i fluer. De ulike strategiene imøtekommer ulike prosjektbehov, for eksempel endogen versus eksogen genmålretting og allestedsnærværende versus vevsspesifikk RNA-målretting. Effektene av RNA-målretting inkluderte målgenspesifikke fenotypiske endringer, reduksjon av mål-RNA-transkripsjon og sporadiske dødelighetsfenotyper forbundet med høyt uttrykk for CasRx-protein og sikkerhetsaktivitet. Samlet sett viste disse resultatene at CasRx-systemet er i stand til å målrette RNA-transkripsjonsreduksjon på organismenivå på en programmerbar og effektiv måte.

En av nøkkelfaktorene for vellykket tilpasning av CasRx-systemet er utformingen av gRNAer. Spesielt skal følgende råd følges: målsekvensen er rundt 30 nukleotider i lengde, lengden på poly-U strekker seg i målsekvensen er 4 basepar eller mindre, målsekvensen GC-innhold er i området 30% - 70%, målsekvensen er ikke spådd å danne sterke RNA-hårnålstrukturer, og målsekvensen inneholder minimal predikert RNA sekundær eller tertiær struktur5.

I tillegg til gRNA-designene er flygenetikktrinnet i hver protokoll også kritisk i en vellykket implementering. Tilstedeværelsen eller mangelen på de definerte fenotypene som ble sendt ned fra foreldrene i avkomene, er viktig for å identifisere og kvantifisere fenotyper indusert av CasRx-systemet i de transheterozygote avkomene. Det er også nyttig å sette opp kontrollkryss ved hjelp av dCasRx-fluene parallelt i å utelukke ikke-spesifikke fenotyper i de transheterozygote avkomene.

Det er verdt å merke seg at disse resultatene avslørte toksisitetsproblem introdusert ved allestedsnærværende å uttrykke CasRx og dCasRx protein i fluen, en begrensning av CasRx-systemet. Allestedsnærværende uttrykk for CasRx eller dCasRx under Ubiq promotor alene, uten gRNAer, kom med ikke-trivelige treningskostnader, da verken Ubiq-CasRx eller Ubiq-dCasRx fluer kunne etableres som homozygote linjer. Tvert imot kan UASt-CasRx og UASt-dCasRx fluer etableres som sunne homozygote bestander, men på grunn av utformingen av kryssordningen ble de holdt som dobbeltbalanserte aksjer, et faktum som støtter eksistensen av toksisitet indusert av allestedsnærværende CasRx proteinuttrykk. Et annet stykke støttende bevis er at i kontrollforsøk som involverer dCasRx, som er katalytisk inaktive, var prosentandelene av fluer som bærer både dCasRx- og gRNA-konstruksjoner ut av det totale antall fluer i F1-generasjonen konsekvent lavere enn 50%, forholdet som forventes basert på mendelisk genetikk hvis ingen dCasRx-assosiert toksisitet var tilstede. Dette indikerte at allestedsnærværende uttrykker dCasRx, sammen med gRNAer, induserer toksisitet i fluen, noe som resulterer mindre enn forventet arveforhold. Arveforholdene til transheterozygot UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 fluer fulgte mendelisk genetikk, noe som igjen antyder toksisiteten som er indusert spesielt av allestedsnærværende uttrykk for CasRx- og dCasRx-proteiner. Toksisitet i CRISPR/Cas-systemet er ikke nytt. Høye mengder Cas9-protein har vist seg å være giftig i flere organismer, inkludert fluer29,30,31,32. En nylig studie har utviklet et tilpasset GAL4 / UAS-system som kan justere mengden Cas9-protein uttrykt i fluer ved å legge til en åpen leseramme av varierende lengde mellom UAS-sekvensen og Cas9-sekvensen i UAS-Cas9-konstruksjonen33. Derfor er det verdt å utforske måter å redusere CasRx-indusert toksisitet ved å justere CasRx proteinuttrykksnivå.

Bortsett fra toksisiteten forårsaket av allestedsnærværende uttrykk for CasRx- og dCasRx-proteiner, viste resultatene også dødelighet knyttet til CasRx-systemets ikke-spesifikke sikkerhetsmessige off-target effekter, en funksjon av mange CRISPR-systemer1,2,7,34. I noen av CasRx og ikke-essensielle gen gRNA-uttrykkende doble eller trippel transheterozygote fluer, for eksempel når de er rettet mot Notch, har de transheterozygote CasRx-fluene betydelig lavere nivåer av overlevelsesrate sammenlignet med de transheterozgyous dCasRx-fluene. I RNA-seq-analysen av disse CasRx- og gRNA-uttrykkende transheterozygote fluene ble både reduksjon av målgentranskripsjonsnivåer og reduksjon av ikke-mål gentranskripsjoner observert. Disse sikkerhetseffektene var CasRx-avhengige og målavhengige, da de bare ble observert i transheterozygote fluer som uttrykte både CasRx-proteinet og gRNA. Det er verdt å påpeke at et av målgenene, hvit, bare viste en begrenset, ikke-statistisk signifikant reduksjon i transkripsjoner da det hvite genet ble målrettet av CasRx, som var i motsetning til den klare pigmentreduksjonsfenotypen. Det er hypoteset at dette kan skyldes det faktum at 1) tidspunktet for RNA-seq prøvetaking ikke var godt tilpasset timingen når det hvite genet når sitt topputtrykk under tidlig utvikling, og 2) det lokaliserte uttrykket for det hvite genet i øynene gjør det utfordrende å samle de relevante vevene i tidlig utviklingsfase når bare hele kroppens prøveinnsamling er mulig. For å redusere sikkerhetsaktiviteten i CasRx-systemet, oppfordres fremtidige studier til å forstå mekanismene som ligger til grunn for off-target fenomensystemet på organismenivå.

Interessant nok syntes en nylig studie35 som beskriver RNA-målrettede Cas13-verktøy i fluer å forbedre den generelle toksisiteten forbundet med CasRx-uttrykk, av flere mulige grunner. For det første omkodet forfatterne Cas13-transgenes for å optimalisere uttrykket i Drosophila og brukte en mer svakt uttrykkende promotor (aktin 5C) sammenlignet med allestedsnærværende promotor som ble brukt i den nåværende studien, sannsynligvis førte til lavere nivåer av Cas13-uttrykk og dermed mindre toksisitet. Faktisk støttes dette av observasjonene om at UASt-drevet CasRx- og dCasRx-uttrykk ikke i seg selv var giftig, da denne studien (og forfatterne i 35) ikke observerte noen åpenbar dødelighet i UASt-CasRx-fluer. Videre kodet disse forfatterne sine gRNAer annerledes sammenlignet med denne studien, noe som kan ha påvirket deres uttrykk og redusert systemets toksisitet i transheterozygote Cas13 / gRNA-fluer. For eksempel ble to gRNAer i studien uttrykt ved hjelp av U6:3-promotoren og flankert av tRNAer for å muliggjøre gRNA-behandling ved tRNA-modning uten å kreve CasRx35. Omvendt, i denne studien, ble gRNAene kodet som matriser rettet mot opptil 4 steder per gen og etterligner den endogene Cas13-matrisestrukturen som finnes i bakterier, noe som krever cas13-enzymet for å behandle hver gRNA. Disse ulike tilnærmingene kan ha ført til forskjeller i gRNA-uttrykksnivåer og andre faktorer som kan ha iboende effekter på toksisiteten til hele systemet. Til slutt målrettet Huynh et al. mot forskjellige gener enn de som er målrettet i den nåværende studien, noe som resulterer i forskjeller i mål-Cas / gRNA interaksjon og sikkerhetsaktivitet og kan ha effekter på de observerte nivåene av dødelighet. Disse forskjellene i observert toksisitet krever videre undersøkelse for å identifisere hvordan de samlede systemene kan forbedres.

Totalt sett er denne studien den første demonstrasjonen av et funksjonelt genetisk kodet programmerbart RNA-målrettet Cas-system i D. melanogaster, om enn ytterligere optimalisering av CasRx-systemet (i tråd med det som rapporteres35) vil bli pålagt å ytterligere redusere off-target-assosiert dødelighet og øke effekten av CasRx på mål spalting. RNA-målretting med Cas-enzymer er et raskt utviklende felt med mange potensielle applikasjoner som spenner fra insektvektorkontroll til terapeutisk bruk1,2,3,4,5,6,7, og denne protokollen tilbyr en startpakke for alle som er interessert i å designe sitt første CasRx-system i fluer, samtidig som den er kompatibel med tilpasning og videre optimalisering av systemet. Eksemplene som presenteres her viser en rekke resultater man kan støte på under implementering av dette systemet in vivo og kan fungere som benchmarks for andre brukere i evaluering av ytelsen til CasRx-systemet i sine applikasjoner.

Disclosures

O.S.A er grunnlegger av Agragene, Inc., har en eierandel, og sitter i selskapets Scientific Advisory Board. Vilkårene i denne ordningen er gjennomgått og godkjent av University of California, San Diego i samsvar med retningslinjene for interessekonflikter. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av finansiering fra et DARPA Safe Genes Program Grant (HR0011-17-2-0047), og NIH-priser (R21RAI149161A, DP2AI152071) tildelt O.S.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100% Grape Juice Welch Foods Inc. N/A
Active Dry Yeast (908g) Red Star Yeast Company, LLC N/A
DMC4500 color camera Leica Microsystems DMC4500
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
GAL4-GMR flies Bloomington Drosophila Stock Center 29967
GAL4-y flies Bloomington Drosophila Stock Center 44373
Glomax 20/20 Luminometer Promega E5331
Illumina HiSeq2500 Sequencer Illumina, Inc. HiSeq2500
M165FC fluorescent stereomicroscope Leica Microsystems M165FC
Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer ThermoFisher NDONEC-W
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit New England Biolabs, Inc. E7770
plasmid # 112686 Addgene 112686
plasmid # 112688 Addgene 112688
plasmid # 132416 Addgene 132416
plasmid # 132417 Addgene 132417
plasmid # 132419 Addgene 132419
plasmid # 132420 Addgene 132420
plasmid # 132421 Addgene 132421
plasmid # 132422 Addgene 132422
plasmid # 132425 Addgene 132425
plasmid # 132426 Addgene 132426
plasmid # 133304 Addgene 133304
plasmid # 164586 Addgene 164586
plasmid #132418 Addgene 132418
plasmid pJFRC81 Addgene 36432
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Restriction endonucleases AscI New England Biolabs Inc. R0558L
Restriction endonucleases NotI New England Biolabs Inc. R0189L
Restriction endonucleases PacI New England Biolabs Inc. R0547L
Restriction endonucleases PstI New England Biolabs Inc. R0140L
Restriction endonucleases SwaI New England Biolabs Inc. R0604L
Restriction endonucleases XbaI New England Biolabs Inc. R0145L
RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer Agilent Technologies 5067-1513
Turbo DNase Invitrogen AM2238
U6-3:4-gRNA-Fluc flies Bloomington Drosophila Stock Center 84125
U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies Bloomington Drosophila Stock Center 84986
U6-3:4-gRNA-N flies Bloomington Drosophila Stock Center 84122
U6-3:4-gRNA-w flies Bloomington Drosophila Stock Center 84124
U6-3:4-gRNA-y flies Bloomington Drosophila Stock Center 84123
UASt-CasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84121
UASt-dCasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84120
Ubiq-CasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84118
Ubiq-dCasRx flies Bloomington Drosophila Stock Center 84119
Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies Bloomington Drosophila Stock Center 84127
Zymoclean Gel DNA Recovery Kits Zymo Research Corporation D4007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Communications. 9, 1911 (2018).
  2. Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), 5573 (2016).
  3. East-Seletsky, A., O'Connell, M., Burstein, D., Knott, G., Doudna, J. RNA Targeting by Functionally Orthogonal Type VI-A CRISPR-Cas Enzymes. Molecular Cell. 66 (3), 373-383 (2017).
  4. Konermann, S., Lotfy, P., Brideau, N., Oki, J., Shokhirev, M., Hsu, P. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell. 173 (3), 665-676 (2018).
  5. Buchman, A., Brogan, D., Sun, R., Yang, T., Hsu, P., Akbari, O. Programmable RNA Targeting Using CasRx in Flies. The CRISPR Journal. 3 (3), 164-176 (2020).
  6. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d Induces Efficient mRNA Knockdown in Animal Embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  7. Abudayyeh, O., et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13. Nature. 550, 280-284 (2017).
  8. Perrimon, N., Ni, J., Perkins, L. In vivo RNAi: today and tomorrow. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 003640 (2010).
  9. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448, 151-156 (2007).
  10. Ni, J., et al. A Drosophila resource of transgenic RNAi lines for neurogenetics. Genetics. 182 (4), 1089-1100 (2009).
  11. Ni, J., et al. A genome-scale shRNA resource for transgenic RNAi in Drosophila. Nature Methods. 8, 405-407 (2011).
  12. Ni, J., et al. Vector and parameters for targeted transgenic RNA interference in Drosophila melanogaster. Nature Methods. 5, 49-51 (2008).
  13. Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genetics. 208 (3), 853-874 (2018).
  14. Kulkarni, M., et al. Evidence of off-target effects associated with long dsRNAs in Drosophila melanogaster cell-based assays. Nature Methods. 3, 833-838 (2006).
  15. Ma, Y., Creanga, A., Lum, L., Beachy, P. Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens. Nature. 443, 359-363 (2006).
  16. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Matter arising: off-targets and genome-scale RNAi screens in Drosophila. Fly. 1 (1), 1-5 (2007).
  17. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nature Genetics. 40, 476-483 (2008).
  18. Champer, J., Buchman, A., Akbari, O. Cheating evolution: engineering gene drives to manipulate the fate of wild populations. Nature Review Genetics. 17 (3), 146-159 (2016).
  19. Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (4), 1008103 (2020).
  20. Mathur, G., Sanchez-Vargas, I., Alvarez, D., Olson, K., Marinotti, O., James, A. Transgene-mediated suppression of dengue viruses in the salivary glands of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 19 (6), 753-763 (2011).
  21. Franz, A., et al. Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4198-4203 (2006).
  22. Yen, P., James, A., Li, J., Chen, C., Failloux, A. Synthetic miRNAs induce dual arboviral-resistance phenotypes in the vector mosquito Aedes aegypti. Communications Biology. 1, 11 (2018).
  23. Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic Aedes aegypti expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
  24. Addgene. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/restriction-digest/ (2020).
  25. Gibson, D., Young, L., Chuang, R., Venter, J., Hutchison, C., Smith, H. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  26. Addgene. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/pcr/ (2020).
  27. Indiana University Bloomington. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.htmL (2020).
  28. Dobin, A., et al. STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  29. Jiang, W., Brueggeman, A., Horken, K., Plucinak, T., Weeks, D. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryotic Cell. 13 (11), 1465-1469 (2014).
  30. Poe, A., et al. Robust CRISPR/Cas9-Mediated Tissue-Specific mutagenesis reveals gene redundancy and perdurance in Drosophila. Genetics. 211 (2), 459-472 (2019).
  31. Port, F., Chen, H., Lee, T., Bullock, S. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient ger mLine and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), 2967-2976 (2014).
  32. Yang, S., Li, S., Li, X. Shortening the Half-Life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Reports. 25 (10), 2653-2659 (2018).
  33. Port, F., et al. A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila. eLife. 9, 53865 (2020).
  34. Zhang, X., Tee, L., Wang, X., Huang, Q., Yang, S. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4 (17), 264 (2015).
  35. Huynh, N., Depner, N., Larson, R., King-Jones, K. A versatile toolkit for CRISPR-Cas13-based RNA manipulation in Drosophila. Genome Biology. 21, 279 (2020).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 168 CRISPR Cas-enzym Ribonuklease CasRx Drosophila melanogaster allestedsnærværende RNA-målretting vevsspesifikk RNA-målretting
Allestedsnærværende og vevsspesifikk RNA-målretting i <em>Drosophila Melanogaster</em> med CRISPR/CasRx
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sun, R., Brogan, D., Buchman, A.,… More

Sun, R., Brogan, D., Buchman, A., Yang, T., Akbari, O. S. Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx. J. Vis. Exp. (168), e62154, doi:10.3791/62154 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter