Summary
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य ड्रोसोफिला अंडाशय में उपकोशिकीय संरचनाओं के स्थानीयकरण और गतिशीलता पर ऑक्सीडेटिव क्षति के प्रभावों की कल्पना करने के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग करना है।
Abstract
ड्रोसोफिला मेलनोगास्टर अंडाशय की लाइव इमेजिंग विकास के दौरान विभिन्न बुनियादी सेलुलर प्रक्रियाओं को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जिसमें रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन कण आंदोलन, एमआरएनए स्थानीयकरण, ऑर्गेनेल आंदोलन और साइटोस्केलेल गतिशीलता शामिल हैं। लाइव इमेजिंग के लिए कई तरीके हैं जिन्हें विकसित किया गया है। इस तथ्य के कारण कि प्रत्येक विधि में मीडिया या हेलोकार्बन तेल में रखे गए व्यक्तिगत अंडाशय को विच्छेदन करना शामिल है, हाइपोक्सिया के कारण सेलुलर क्षति और/या शारीरिक हेरफेर अनिवार्य रूप से समय के साथ हो जाएगा । हाइपोक्सिया का एक डाउनस्ट्रीम प्रभाव कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव क्षति को बढ़ाना है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य नियंत्रित सेलुलर क्षति के प्रेरण के बाद ड्रोसोफिला अंडाशय में उपकोशिकीय संरचनाओं के स्थानीयकरण और गतिशीलता पर ऑक्सीडेटिव क्षति के प्रभावों की कल्पना करने के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग करना है। यहां, हम सेलुलर ऑक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करते हैं और दो उपकोशिकीय संरचनाओं, माइटोकॉन्ड्रिया और सीएलयू आनंद कणों पर इस तरह के नुकसान के प्रभावों का उदाहरण देते हैं। हालांकि, यह विधि किसी भी उपकोशिकीय संरचना पर लागू होती है। सीमाएं हैं कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड को केवल जलीय मीडिया में जोड़ा जा सकता है और वेलोकार्बन तेल का उपयोग करने वाले इमेजिंग के लिए काम नहीं करेगा। फायदे यह हैं कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड आसानी से उपलब्ध है और सस्ती है, जल्दी से कार्य करता है, इसकी सांद्रता को संग्राहक किया जा सकता है, और ऑक्सीडेटिव क्षति हाइपोक्सिया के साथ-साथ हेरफेर के कारण सामान्य ऊतक क्षति के कारण होने वाले नुकसान का एक अच्छा सन्निकटन है।
Introduction
कई अलग-अलग सेलुलर तनाव प्रयोगात्मक संस्कृति और ऊतकों के हेरफेर के दौरान उत्पन्न हो सकते हैं, जिनमें गर्मी का झटका, ऑक्सीडेटिव तनाव, ऑस्मोटिक तनाव, पोषण तनाव और विषाक्तता की स्थिति शामिल है। लाइव इमेजिंग एक शक्तिशाली उपकरण है जो प्रयोगात्मक उपचार और हेरफेर के बाद पूर्व वीवो ऊतकों में वास्तविक समय में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है। ठीक ऊतक विच्छेदन और हेरफेर अभ्यास लेते हैं, और विच्छेदन से इमेजिंग तक समय की मात्रा अनुभव के आधार पर भिन्न हो सकती है। इस विधि को विकसित करने का औचित्य इस चिंता पर आधारित है कि लाइव इमेजिंग के लिए ऊतक तैयार करने से विच्छेदन और इमेजिंग तैयारी के दौरान सेलुलर तनाव हो सकता है। यह सेलुलर मेटाबोलिज्म और उपलब्ध ऑक्सीजन स्तर, जैसे माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील प्रक्रियाओं के लिए विशेष रूप से समस्याग्रस्त हो सकता है। जबकि एक समानांतर जंगली प्रकार का नमूना होना एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है, अभी भी संभावना है कि उपकोशिकीय संरचनाओं में कुछ या सभी देखे गए परिवर्तन विच्छेदन से नुकसान या सेल तनाव के कारण हो सकते हैं और सामान्य शरीर विज्ञान या उपचार या उत्परिवर्तन का अध्ययन नहीं करते हैं।
इस संभावित समस्या का समाधान करने के लिए, हम सेलुलर ऑक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित करने के लिए लाइव इमेजिंग के दौरान हाइड्रोजन पेरोक्साइड अतिरिक्त का उपयोग करते हैं1। इस विधि का उद्देश्य उपकोशिकीय संरचनाओं पर प्रभाव की निगरानी करने के लिए ऊतकों को नुकसान पहुंचाना है। यह प्रोटोकॉल दो उद्देश्यों के लिए उपयोगी है: 1) यह निर्धारित करना कि क्या ब्याज की संरचना के उपकोशिकीय स्थानीयकरण में परिवर्तन अनुभवहीन विच्छेदन और 2 के कारण होने वाले तनाव के कारण होता है) एक बार शोधकर्ता ब्याज की संरचना पर नियंत्रित तनाव के प्रभाव की निगरानी के लिए वर्णित विच्छेदन तकनीकों के साथ आश्वस्त है। यहां हम दो उदाहरण दिखाते हैं कि कैसे बढ़ी हुई ऑक्सीडेटिव क्षति दो उपकोशिकीय संरचनाओं, माइटोकॉन्ड्रिया और सीएलयू आनंद कणों में परिवर्तन का कारण बनती है। ऐसा करने के लिए, हम ड्रोसोफिला अंडाशय का उपयोग करते हैं जो लाइव इमेजिंग अध्ययन के लिए एक आम मॉडल है। पहला उदाहरण माइटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण की जांच करता है। हमारे अनुभव में, महिला रोगाणु कोशिकाओं में सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल स्थानीयकरण क्षोभ के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है और सेलुलर तनाव के अग्रदूत के रूप में कार्य कर सकता है। ड्रोसोफिला मादा रोगाणु कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया सामान्य रूप से साइटोप्लाज्म 2 में समान रूप से फैलायाजाताहै। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा ऑर्गेनेल्स को विभिन्न म्यूटेशन 3 ,4,5के समान तरीके से जल्दी से गलत और क्लस्टर करने का कारणबनताहै । दूसरा उदाहरण अनजान (सीएलयू) द्वारा गठित आनंद कण हैं। सीएलयू एक राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन है जो पूरे साइटोप्लाज्म में फैलाना है; हालांकि, यह इष्टतम सेलुलर स्थितियों5के तहत माइटोकॉन्ड्रिया से जुड़े कण भी बनाता है । क्योंकि सीएलयू कणों की उपस्थिति स्वस्थ सेलुलर स्थितियों पर निर्भर है, हमने उन्हें "आनंद"कणों को 3,5,6करार दिया है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा इन कणों को जल्दी से तितर - बितर करने और साइटोप्लाज्म5में सजातीय हो जाता है । हमारे अध्ययनों के दौरान, हमने इन दोनों उपकोशिकीय संरचनाओं के स्थानीयकरण में परिवर्तन देखा है, लेकिन लाइव इमेजिंग अध्ययन करने के बाद ही हम माइटोकॉन्ड्रिया और आनंद कणों के स्थानीयकरण और गतिशीलता पर सेलुलर तनाव और ऑक्सीडेटिव क्षति के प्रभाव की पूरी तरह से सराहना कर सकते हैं।
पहले से ही स्थापित या वैकल्पिक तरीकों के अलावा के रूप में इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता कई कारकों पर निर्भर करती है। सबसे पहले, इमेजिंग प्रोटोकॉल दवा के अलावा करने के लिए उत्तरदायी होना चाहिए । यदि नमूना एक कवरस्लिप के तहत और हेलोकार्बन तेल में रखा जाता है, तो यह विधि संभव नहीं होगी7। एच2ओ2 इसके अलावा ऑक्सीडेटिव डैमेज में तेजी से बढ़ोतरी होती है, इसलिए यह टाइमस्केल उचित नहीं हो सकता है। ऑक्सीडेटिव क्षति को हाइपोक्सिया के लिए प्रॉक्सी माना जा सकता है; हालांकि, कुछ उपकोशिकीय घटकों के लिए क्षति के लिए उचित नियंत्रण के रूप में कार्य करना बहुत कठोर या बहुत सामान्यीकृत हो सकता है। अंत में, इमेजिंग प्रयोगों के लिए जो पिछले घंटों जैसे कि विकास प्रक्रिया का पालन करने वाले, एच2ओ2 अतिरिक्त बहुत मजबूत हो सकते हैं (उदाहरण के लिए8)। एकाग्रता वक्र का परीक्षण इस सीमा को दूर कर सकता है।
Protocol
1. विच्छेदन और इमेजिंग मीडिया की तैयारी
नोट: इस लाइव इमेजिंग प्रयोग के लिए सबसे उपयुक्त मीडिया में श्नाइडर के ड्रोसोफिला मीडिया शामिल हैं जिनमें 15% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 0.6x पेन-स्ट्रीप, और 200 माइक्रोग्राम/एमएल गोजातीय इंसुलिन शामिल है, जिसे इसके बाद पूर्ण श्नाइडर के मीडिया के रूप में संदर्भित किया जाता है।
- बाँझ परिस्थितियों में मीडिया की तैयारी करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह दूषित न हो। मीडिया को9वर्ष की विस्तारित अवधि के लिए ड्रोसोफिला ओवरियोल्स का समर्थन करने के लिए विकसित किया गया था ।
- श्नाइडर के मीडिया में 15% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 0.6x पेन-स्ट्रीप, और 200 μg/mL गोजातीय इंसुलिन जोड़ें।
- सामग्री को अच्छी तरह से मिलाएं और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: इंसुलिन पूरी तरह से श्नाइडर के मीडिया में पूरी तरह से भंग नहीं करता है, और आप एक तेज़ ट्यूब के नीचे में बसने देखेंगे । - मीडिया के aliquots बनाओ, के रूप में यह इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा तेज़ छोड़ने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है ।
नोट: इस समाधान का उपयोग एक महीने के भीतर किया जा सकता है यदि 4 डिग्री सेल्सियस पर अलीकोट में संग्रहीत किया जाता है।
2. विच्छेदन के लिए ड्रोसोफिला का संग्रह
नोट: विस्तृत ड्रोसोफिला संग्रह और विच्छेदन प्रक्रियाएं भी Weil एट अल10 और पार्कर एट अल11में पाया जा सकता है ।
- इष्टतम महिला रोगाणु सेल इमेजिंग के लिए, पहले मानक कॉर्नमील फ्लाई फूड युक्त एक शीशी तैयार करें और गीले खमीर पेस्ट का एक थपका जो मूंगफली के मक्खन की स्थिरता है। यह सुनिश्चित करता है कि मादा मक्खियों को अच्छी तरह से खिलाया जाता है और इमेजिंग के लिए सभी कूप विकास चरणों का उत्पादन होगा।
- इष्टतम स्वस्थ मक्खियों के लिए, 0-1 दिन पुरानी महिलाओं को इकट्ठा करें और गीले खमीर पेस्ट युक्त फ्लाई फूड शीशी में पुरुषों के साथ स्थानांतरित करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि नींद की मक्खियों खमीर पेस्ट से संपर्क नहीं करते हैं क्योंकि वे इससे चिपके रह सकते हैं। - मक्खियों को 3-7 दिन खिलाएं, शीशी और खमीर पेस्ट को रोजाना बदलें।
नोट: सुनिश्चित करें कि खमीर पेस्ट फ्लाई फूड से संपर्क करता है ताकि यह सूख न जाए।
3. ड्रोसोफिला अंडाशय विच्छेदन
नोट: मीडिया समाधानों को ताजा तैयार करना महत्वपूर्ण है क्योंकि हाइड्रोजन पेरोक्साइड ऑक्सीकरण के लिए अतिसंवेदनशील होता है और समय के साथ टीएमआरई कम हो जाता है।
- विच्छेदन से ठीक पहले, पूर्ण श्नाइडर के मीडिया में, 2 माइक्रोन एच2ओ2 समाधान का एक ताजा बहाना तैयार करें, 46 एनएम टेट्रामेथाइलरोडमाइन, एथिल एस्टर (टीएमआरई) का एक ताजा एलिकोट, और 46 एनएम टीएमईएच 2 ओ2युक्त 46 एनएम टीएमआरई समाधान का एक ताजा एलिकोटतैयार करें।
- अंडाशय विच्छेदन के लिए, दो जोड़ी बारीक संदंश और इलेक्ट्रोलाइटल तेज टंगस्टन सुइयों की एक जोड़ी का उपयोग करें12। अंडाशय को विच्छेदन करने के लिए, एक ग्लास बॉटम विच्छेदन डिश (घड़ी ग्लास) के 2-3 कुओं को पूर्ण श्नाइडर के साथ भरें जिसे कमरे के तापमान पर गर्म किया गया है।
- कार्बन डाइऑक्साइड के साथ मेद मक्खियों की शीशी को एनेस्थेटाइज करें और मादा मक्खियों की वांछित संख्या को विच्छेदित करने के लिए अलग करें। संदंश का उपयोग कर मीडिया में एक भी मक्खी रखें।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करके छाती द्वारा फ्लाई को धीरे-धीरे समझें। संदंश की अन्य जोड़ी के साथ, पीछे की समझ, और धीरे अंडाशय को हटाने के लिए खींच।
नोट: यदि अंडाशय इस विधि का उपयोग करके सुचारू रूप से बाहर नहीं आते हैं, तो पूरे पेट को मक्खी से भी हटाया जा सकता है, और अंडाशय को धीरे-धीरे संदंश का उपयोग करके पेट के दोनों छोर से निचोड़ा जा सकता है। - किसी भी बाहरी क्यूटिकल या ऊतक को हटा दें, फिर अंडाशय को एक नए अच्छी तरह से ताजा मीडिया में स्थानांतरित करें। अंडाशय अभी भी आसपास की मांसपेशी म्यान से आगे बढ़ना चाहिए।
4. इमेजिंग के लिए ovarioles तैयार
- तेज टंगस्टन सुइयों का उपयोग करके, धीरे-धीरे अंडाशय को अलग करें, आसपास की मांसपेशियों के म्यान(चित्रा 1)को हटाने का ख्याल रखते हुए।
- धीरे-धीरे अलग ovarioles(चित्रा 2)से जुड़े किसी भी मांसपेशी म्यान और तंत्रिका फाइबर को दूर चिढ़ाते हैं।
नोट: यदि मांसपेशी म्यान को हटाया नहीं जाता है, तो ओवेरिओल चिकोटी और आगे बढ़ेगा, जिससे छवि अधिग्रहण(वीडियो 1)के साथ समस्याएं पैदा होंगी। - यदि ब्याज की उपकोशिकीय संरचनाओं को अंतर्जात लेबल किया जाता है, तो चरण 4.4 पर आगे बढ़ें। यदि ब्याज की संरचनाओं को फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया जाएगा, तो धारा 5 पर आगे बढ़ें।
- एक बार जब ओवियोल्स को साफ-सुथरा विच्छेदित कर दिया गया है, तो माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, उन्हें ग्लास बॉटम डिश के ग्लास डिप्रेशन में पूर्ण श्नाइडर के इमेजिंग मीडिया की 100 माइक्रोन ड्रॉप में स्थानांतरित करें। व्यक्तिगत अंडाशय बूंद के नीचे तक डूब जाएगा।
- इमेजिंग के लिए धारा 6 पर आगे बढ़ें।
नोट: इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रिया और सीएलयू आनंद कणों के लिए, विच्छेदन की शुरुआत से इमेजिंग तक पांच-दस मिनट से अधिक नहीं बीतना चाहिए।
5. TMRE के साथ धुंधला माइटोकॉन्ड्रिया
नोट: फ्लोरोसेंट रंगों के साथ माइटोकॉन्ड्रिया के लाइव धुंधला पर अतिरिक्त विस्तृत प्रक्रियाएं पार्कर एट अल 2017 में पाई जा सकती हैं।
- चरण 4.3 के बाद, 46 एनएम टीएमआरई मीडिया के 100 माइक्रोल ड्रॉप में अलग-थलग ओवरियोल्स को ग्लास बॉटम डिश के ग्लास डिप्रेशन में स्थानांतरित करें। व्यक्तिगत अंडाशय बूंद के नीचे तक डूब जाएगा।
- 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। ढक्कन को ग्लास-बॉटम डिश पर रखें और प्रकाश से बचाने के लिए प्रयोग की अवधि के लिए डिश को एक कवर बॉक्स में रखें।
नोट: इनक्यूबेशन के बाद, नमूनों को सीधे कोई वॉश के साथ चित्रित किया जा सकता है। - टीएमआरई-लेबल वाले ओव्यूलस के कम से कम दो व्यंजन तैयार करने के लिए कदम 5.1-5.2 दोहराएं, एक एक प्रयोगात्मक समूह के रूप में सेवा करने के लिए और एक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए।
6. लाइव छवि अधिग्रहण
- एक बार जब ओवरियोल्स को माउंट किया जाता है, तो ग्लास बॉटम व्यंजनों में से एक को माइक्रोस्कोप पर रखें और इमेजिंग मापदंडों को आवश्यक रूप से कॉन्फ़िगर करें। यहां उपयोग किए जाने वाले टीएमआरई के लिए इष्टतम उत्तेजना/उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 549 एनएम/574 एनएम हैं।
- देखने के वांछित क्षेत्र का पता लगाने के बाद, पूर्व उपचार स्थितियों के रिकॉर्ड के रूप में वांछित के रूप में एक या एक से अधिक ovarioles के अभी भी छवियों या संक्षिप्त वीडियो प्राप्त करें।
7. इमेजिंग के दौरान हाइड्रोजन पेरोक्साइड का जोड़
- लाइव इमेजिंग को रोकें, ग्लास बॉटम डिश से ढक्कन हटा दें, और ध्यान से2 माइक्रोपिटेट का उपयोग करके डिश में 100 माइक्रोल जोड़ें यदि इमेजिंग एंडोजेनस लेबल वालीसंरचनाएं हैं। यदि माइटोकॉन्ड्रिया इमेजिंग करते हैं, तो माइक्रोपिपेट (वीडियो2)का उपयोग करके डिश के लिए 2 माइक्रोनएम एच 2 ओ 2 समाधान के साथ 46 एनएमटीएम टीएमआरई के100माइक्रोएल को सावधानी से जोड़ें।
- मौजूदा मीडिया की बूंद की सतह को तोड़ने या समाधान को बहुत जल्दी जोड़ने से बचें ताकि डिश(वीडियो 2)के तल पर आराम करने वाले ओवियोल्स को विस्थापित न किया जा सके।
- यदि आवश्यक हो तो डिश लिड (डिश कवर) को बदलें, वांछित क्षेत्र को स्थानांतरित करें और फिर से केंद्रित करें, और इमेजिंग(वीडियो 3, वीडियो 4, चित्रा 3, चित्रा 4)फिर से शुरू करें।
- एच 2ओ 2 के अतिरिक्त के बादजितनीजल्दी हो सके इमेजिंग फिर से शुरू करने का ध्यान रखें क्योंकि प्रयोगात्मक उपचार समय-संवेदनशील(वीडियो 5)है।
- वांछित के रूप में एक या एक से अधिक ovarioles के अभी भी छवियों या संक्षिप्त वीडियो प्राप्त करें। यह उपचार के बाद की स्थिति के रिकॉर्ड के रूप में काम करेगा।
- नियंत्रण के लिए, दूसरा ग्लास बॉटम डिश माइक्रोस्कोप पर रखें और धारा 6 दोहराएं।
- दोहराएं चरण 7.1, इस बार डिश में टीएमआरई-केवल मीडिया के 100 माइक्रोन जोड़ते हैं। यदि इमेजिंग एंडोजेनस द्वारा संरचनाओं को लेबल किया जाता है, तो पूर्ण श्नाइडर के मीडिया-केवल समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें।
- नियंत्रण समूह के लिए डेटा प्राप्त करने के लिए चरण 7.2 और 7.3 दोहराएं।
नोट: इमेजिंग माइटोकॉन्ड्रिया और सीएलयू आनंद कणों के लिए, हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा इमेजिंग से तीन-पांच मिनट से अधिक नहीं बीतना चाहिए।
Representative Results
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग ड्रोसोफिला अंडाशय की लाइव इमेजिंग के दौरान हाइड्रोजन पेरोक्साइड के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 3, चित्रा 4,वीडियो 3 और वीडियो 4 में दिखाया गया है, यह प्रक्रिया वास्तविक समय में प्रयोगात्मक उपचार के बाद ऊतक परिवर्तन और गतिशीलता की कल्पना करने का एक प्रभावी साधन प्रदान करती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इमेजिंग करते समय यह प्रोटोकॉल एच2ओ2 से ओवरियोल्स के अलावा विशिष्ट है; हालांकि, इसे अन्य दवाओं या रुचि के अभिकर्णों के बहिर्जात जोड़ के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके अलावा, रोम को इमेजिंग(वीडियो 3)से पहले किसी भी फ्लोरोसेंट रंगों (जैसे, टेट्रामेथाइलरोडमाइन (टीएमआरई), लिसोट्रैकर) के साथ लेबल किया जा सकता है। स्पष्ट इमेजिंग परिणाम प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम 1) सभी अनुबंध तत्वों(चित्रा 1 और चित्रा 2) और 2)के साथ एकल अंडाशय के उचित विच्छेदन और अलगाव को हटा दिया गया है जिस गति से हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा इमेजिंग को पुनः आरंभ किया जाता है। वीडियो 4 एक ठीक से विच्छेदित कूप का एक उदाहरण है जो वीडियो 1की तुलना में इमेजिंग अवधि में स्थिर रहता है, जो इमेजिंग के दौरान देखने के क्षेत्र से बाहर निकलने वाले खराब विच्छेदित कूप को दिखाता है। वीडियो 5 एक उदाहरण है जिसमें TMRE लेबल माइटोकॉन्ड्रिया पर एच 2 O2 प्रभाव पहले से ही बहुत ज्यादा बीता समय का एक परिणाम के रूप में इमेजिंग की शुरुआत से पहले प्रगति की है । वीडियो 3 की तुलना में जिसमें इमेजिंग को हाइड्रोजन पेरोक्साइड इसके अलावा (समय 0) और बरकरार रहने के तुरंत बाद पुनः आरंभ किया गया था, तितर-बितर माइटोकॉन्ड्रिया अभी भी दिखाई दे रहा है, वीडियो 5 में माइटोकॉन्ड्रिया पहले से ही दिखने लगा है और इमेजिंग के पुनः आरंभ होने पर अपनी झिल्ली क्षमता खो देता है। इस मुद्दे को ज्यादातर एच 2 O2 इसके अलावा केदौराननमूना पदों के व्यवधान के लिए जिंमेदार ठहराया है और इमेजिंग मीडिया और नमूना स्थिति बरकरार रखने के लिए तकनीक का पालन करके समाप्त किया जा सकताहै (वीडियो 2)। ध्यान दें, मीडिया में जोड़े गए एच2ओ2 के बिना किए गए नियंत्रण प्रयोगों में, रोम में माइटोकॉन्ड्रिया ठीक से फैला हुआ रहता है, और टीएमआरई डाई माइटोकॉन्ड्रिया में तनहा रहता है।
चित्र 1: ड्रोसोफिला अंडाशय से एकल अंडाशय का अलगाव। (ए)कार्टून जिसमें अंडाशय की एक जोड़ी, टिप (तीर सिर) पर जर्मेरियम के साथ एक एकल ओवेरिओल (तीर) और दो मांसपेशी म्यान का संकेत मिलता है जो ओवेरियोल (भूरा, एपिथेलियल) और अंडाशय (भूरा, पेरिटोनियल) के चारों ओर होता है। (ख)विच्छेदित ड्रोसोफिला अंडाशय। (ग)छेड़ा अंडाशय को व्यक्तिगत अंडाशय (तीर) में अलग करना। स्केल बार = 100 उम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:तंत्रिका तंतुओं और संकुचन तत्वों को एकल अंडाशय से हटाना। (ए)तंत्रिका ऊतक के अवशेषों के साथ एकल ओवेरिओल और मांसपेशियों की म्यान अभी भी संलग्न (तीर)। (ख)ए (तीर) में ओवेयोल से जुड़े शेष सभी ऊतकों को कोमल हटाना। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3:एच2ओ2 माइटोकॉन्ड्रियल मिसमोकलाइजेशन का कारण बनता है।(ए-ए")एक अच्छी तरह से खिलाया सीएलयू CA06604 (सीएलयू::GFP मक्खियों) कूप के लाइव छवि पोस्टरों । एच2ओ2 के अलावा इमेजिंग की अवधि में झुरमुट करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया का कारण बनता है। माइटोकॉन्ड्रिया की टीएमआरई लेबलिंग इंगित करती है कि माइटोकॉन्ड्रिया को शुरू में समय 0(ए)में फैलाया जाता है, और यह कि माइटोकॉन्ड्रिया बाद के समय-बिंदु पर एच2ओ2 अतिरिक्त (ए′)के बाद झुरमुट करना शुरू कर देता है, टीएमआरई लेबलिंग माइटोकॉन्ड्रिया को अपनी झिल्ली क्षमता खोने और इसलिए डाई(ए"को तनहा करने की उनकी क्षमता के कारण धब्बेदार हो जातीहै। सफेद = TMRE(ए-ए")। स्केल बार: ए-एके लिए 10 माइक्रोन(ए)5। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4:एच2ओ2 सीएलयू को फैलाता है। (ए-ए" एक अच्छी तरह से खिलाया सीएलयूCA06604 कूप के लाइव छवि पोस्टरों । एच2ओ2 के अलावा कणों को तितर-बितर करने और इमेजिंग की अवधि में साइटोप्लाज्म में सजातीय बनने का कारण बनता है। सफेद = सीएलयू:: GFP(ए-ए")। स्केल बार: ए-एके लिए 40 माइक्रोन(ए)5। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
वीडियो 1: एक सीएलयूCA06604 महिला से कूप। जैसा कि चित्र 2में वर्णित है, एकल अंडाशय से तंत्रिका फाइबर अनुबंध तत्वों को हटाने में विफलता इमेजिंग और इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करने में बाद में असमर्थता के दौरान अंडाशय के चिह्नित बहती और आंदोलन का कारण बनेगी। सफेद = सीएलयू::जीएफपी। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
वीडियो 2: नमूना पकवान के लिए एच2O2 के उचित इसके अलावा । हाइड्रोजन पेरोक्साइड को उचित आकार के माइक्रोपिपेट का उपयोग करके नमूना पकवान में जोड़ा जाना चाहिए। मीडिया की सतह को तोड़ने के बिना एच2O2 वितरण। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा के दौरान नमूना बहाव को कम करने के लिए इमेजिंग मीडिया की सतह को तोड़ने से बचने के लिए देखभाल की जाती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
वीडियो 3: TMRE लेबल रोम की इमेजिंग के दौरान एच2O2 इसके अलावा । एक सीएलयूCA06604 महिला TMRE के साथ दाग से कूप । एच2ओ2 ड्रोसोफिला रोम में माइटोकॉन्ड्रियल मिसमोकलाइजेशन का कारण बनता है। सफेद = TMRE डाई। 20 मिनट के लिए प्रति 15 एस एक फ्रेम इमेज्ड, और वीडियो 10 फ्रेम प्रति सेकंड5है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
वीडियो 4: सीएलयू की इमेजिंग के दौरान एच2ओ2 अतिरिक्त:: ग्एफपी रोम। एक सीएलयूCA06604 महिला से कूप। एच2ओ2 चित्रा 4में वर्णित सीएलयू कणों को फैलाता है । सफेद = सीएलयू::जीएफपी। 15 मिनट के लिए प्रति 15 एस एक फ्रेम इमेज्ड, और वीडियो प्रति सेकंड 10 फ्रेम है । 5इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
वीडियो 5: एच 2 O2इसके अलावाके बाद देरी इमेजिंग । एक सीएलयूCA06604 महिला से कूप। रोम के लिए हाइड्रोजन-पेरोक्साइड के अलावा एक समय संवेदनशील उपचार है। इमेजिंग के पुनः आरंभ एच 2 O2 इसके अलावा केदौराननमूना विस्थापन का एक परिणाम के रूप में इस वीडियो में देरी हुई थी । माइटोकॉन्ड्रिया ने पहले से ही दिखने वाली झुरमुट करना शुरू कर दिया है और समय 0 (वीडियो 3 में समय 0 की तुलना में) इमेजिंग के पुनः आरंभ होने पर अपनी झिल्ली क्षमता खो दी है। उपचार के बाद जल्दी इमेजिंग फिर से शुरू करने में विफलता के परिणामस्वरूप गलत और अनुपयोगी परिणाम होंगे क्योंकि जल्दी प्रयोगात्मक प्रभाव इमेजिंग से पहले छूट जाएंगे। सफेद = TMRE। 20 मिनट के लिए प्रति 15 एस एक फ्रेम इमेज्ड, और वीडियो प्रति सेकंड 10 फ्रेम है । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
यह प्रोटोकॉल किसी भी लाइव इमेजिंग प्रयोग के लिए अंडाशय विच्छेदन और ऊतक इनक्यूबेशन के कारण कलाकृतियों के लिए एक नियंत्रण के रूप में एक उपयोगी अतिरिक्त हो सकता है। महत्वपूर्ण कदम अन्य लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल के लिए पाए जाने वाले लोगों के समान हैं। सीखना कैसे पूरे ड्रोसोफिला अंडाशय विच्छेदन करने के लिए अभ्यास लेता है; हालांकि, इस कौशल को आमतौर पर उचित विच्छेदन उपकरणों के साथ काफी जल्दी सीखा जा सकता है। अधिक मुश्किल में महारत हासिल करने के लिए मांसपेशियों अंडाशय और प्रत्येक ovariole13घेर हटा रहा है । यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए कि मांसपेशियों के संकुचन छवि अधिग्रहण में हस्तक्षेप न करें। यदि ऐसा करने के लिए तेज टंगस्टन सुइयों का उपयोग सफल साबित नहीं होता है, तो ओवेरियोल की नोक पर जर्मेरियम को संदंश के साथ समझा जा सकता है और मांसपेशियों के म्यान से ओवेरोल खींचा जा सकता है। हालांकि, यह तकनीक समस्याग्रस्त है यदि शुरुआती विकास चरणों की जांच की जानी है क्योंकि वे क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। एक अन्य महत्वपूर्ण कदम यह है कि एच 2 ओ2को जोड़ते समय डिश के तल पर आराम करने वाले ओवियोल्स को उखाड़ नफेंकाजाए । एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण पहलू सभी लाइव इमेजिंग द्वारा साझा किया जाता है: शोधकर्ता को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ब्याज की संरचना इलाज से पहले फ्लोरोसेंटली रूप से अच्छी तरह से लेबल की गई है। यहां उपयोग किए जाने वाले व्यंजन(सामग्री की तालिका)आमतौर पर लाइव इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाते हैं; हालांकि, नीचे या यहां तक कि एक बड़े ग्लास कवरस्लिप पर ग्लास कवरलिप के साथ कोई भी पकवान या स्लाइड तब तक काम करना चाहिए जब तक मीडिया की बूंद को मीडिया वाष्पीकरण को रोकने के लिए कवर किया जा सकता है। जबकि हम एक विशेष माइक्रोस्कोप का उपयोग करते हैं, प्रश्न में उपकोशिकीय संरचना को देखने के लिए पर्याप्त आवर्धन के उद्देश्य के साथ किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप और एक संलग्न कैमरा जिसमें पर्याप्त संकल्प और छवि कैप्चर दर है, काम करना चाहिए।
जबकि हमारी प्रयोगशाला मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन में रुचि रखती है, यह विधि किसी भी उपकोशिक संरचना या ऑर्गेनेल की गतिशीलता और स्थानीयकरण की जांच करने में सहायक हो सकती है, जैसे नाभिक, साइटोस्केलेटन या एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम। हालांकि, इस विधि की सीमाएं हैं। हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़ने के लिए, ऊतक एक जलीय मीडिया में होना चाहिए। लाइव इमेजिंग के लिए एक वैकल्पिक विधि हेलोकार्बन तेल का उपयोग करना है, जो ड्रोसोफिला ओवरियोल्स में कई महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं का वर्णन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता रहा है जिसमें एक मॉडल जीव7,14में जीएफपी के गतिशील आंदोलन का पहला उदाहरण शामिल है। इसके अलावा, मीडिया में हाइड्रोजन पेरोक्साइड जोड़ने से व्यापक रूप से फैलने वाले ऑक्सीडेटिव क्षति का कारण बनता है जो ऊतक के लिए एक अपमान भी सामान्य हो सकता है ब्याज की सेलुलर प्रक्रिया के लिए जानकारीपूर्ण हो, विशेष रूप से विकास की जांच करने वाले लंबे प्रयोगों के लिए। हालांकि यह प्रयोग है जो इस तेजी से, व्यापक, और संभावना अपरिवर्तनीय ऑक्सीडेटिव क्षति के कारण समय की लंबी अवधि में सेल कल्पना की आवश्यकता प्रदर्शन करने के लिए संभव नहीं हो सकता है, हमने देखा है कि तीव्र हाइड्रोजन पेरोक्साइड उपचार हमने वर्णित है oogenesis के अधिकांश चरणों के लिए लागू है के रूप में हम इमेजिंग समय अवधि के भीतर अधिकांश चरणों में एक ही प्रभाव देखने में सक्षम हैं । कम लागत और प्रोटोकॉल की आसानी को देखते हुए, यह नुकसान के लिए एक उपयोगी नियंत्रण हो सकता है और निर्धारण और एंटीबॉडी लेबलिंग से पहले एक उपचार के रूप में भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
हमारे हाथों में, एच2ओ2 उपचार माइटोकॉन्ड्रियल मिसमोकलाइजेशन और सीएलयू आनंद कण फैलाव में परिवर्तनों की नकल करता है जिसे हम विभिन्न ड्रोसोफिला म्यूटेंट में देखते हैं। यह भी परिणाम हम प्रयोगशाला सीखने विच्छेदन तकनीकों में नए शोधकर्ताओं के लिए देखने की नकल करता है । इसलिए, इस विधि से स्पष्ट रूप से पता चला है कि नमूना तैयारी और सामान्य सेलुलर तनाव माइटोकॉन्ड्रियल मिसमोकलाइजेशन और आनंद कणों की उपस्थिति में अप्रत्याशित और पहले अस्पष्टीकृत परिवर्तन का कारण बन सकता है। इस तकनीक को आगे बढ़ाते हुए, हाइड्रोजन पेरोक्साइड सांद्रता को उच्च या कम एकाग्रता का उपयोग करके संग्राहक किया जा सकता है। यदि एक सेलुलर प्रभाव कम एकाग्रता का उपयोग करते हुए देखा जाता है, तो यह संभव है कि मीडिया को पूर्ण श्नाइडर के साथ बदलकर तनाव फेनोटाइप प्रतिवर्ती हो सकता है। कार्बोनाइल सायनाइड एम-क्लोरोफेनिल हाइड्राजोन (सीसीसीपी), आर्सेनाइट या साधारण हीट शॉक जैसे विभिन्न सेल तनाव अन्य उपकोशिकीय संरचनाओं के लिए सामान्य सेलुलर तनाव के लिए उपयोगी साबित हो सकते हैं। चूंकि पूर्व वीवो ऊतकों की लाइव इमेजिंग के लिए विभिन्न मीडिया में मैन्युअल हेरफेर और इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है, इसलिए यह नियंत्रण यह सुनिश्चित करने के लिए एक उपयोगी अतिरिक्त होना चाहिए कि कोई भी अवलोकन संभव के रूप में सामान्य शरीर विज्ञान के करीब हो।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम इमेजिंग समर्थन और एन सी शेंक के लिए चित्र, उत्पादन और वीडियोग्राफी के लिए डॉ जेरेमी Smyth शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (1R01GM127938 से आर टी.C) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles - PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles - PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles - tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
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