Summary
Het doel van dit protocol is om live imaging te gebruiken om de effecten van oxidatieve schade op de lokalisatie en dynamiek van subcellulaire structuren in Drosophila eierstokken te visualiseren.
Abstract
Live beeldvorming van Drosophila melanogaster eierstokken heeft een belangrijke rol gespeeld bij het begrijpen van een verscheidenheid aan basis cellulaire processen tijdens de ontwikkeling, waaronder ribonucleoproteïne deeltjesbeweging, mRNA-lokalisatie, organellenbeweging en cytoskeletdynamiek. Er zijn verschillende methoden voor live beeldvorming ontwikkeld. Vanwege het feit dat elke methode betrekking heeft op het ontleden van individuele ovarioles die in media of halocarbonolie zijn geplaatst, zal cellulaire schade als gevolg van hypoxie en/of fysieke manipulatie onvermijdelijk na verloop van tijd optreden. Een downstream-effect van hypoxie is het verhogen van oxidatieve schade in de cellen. Het doel van dit protocol is om live beeldvorming te gebruiken om de effecten van oxidatieve schade op de lokalisatie en dynamiek van subcellulaire structuren in Drosophila-eierstokken te visualiseren na inductie van gecontroleerde cellulaire schade. Hier gebruiken we waterstofperoxide om cellulaire oxidatieve schade op te wekken en geven we voorbeelden van de effecten van dergelijke schade op twee subcellulaire structuren, mitochondriën en Clu bliss-deeltjes. Deze methode is echter van toepassing op elke subcellulaire structuur. De beperkingen zijn dat waterstofperoxide alleen kan worden toegevoegd aan waterige media en niet zou werken voor beeldvorming die halokoolstofolie gebruikt. De voordelen zijn dat waterstofperoxide direct beschikbaar en goedkoop is, snel werkt, de concentraties ervan kunnen worden gemoduleerd en oxidatieve schade een goede benadering is van schade veroorzaakt door hypoxie en algemene weefselschade als gevolg van manipulatie.
Introduction
Meerdere verschillende cellulaire stressoren kunnen ontstaan tijdens de experimentele kweek en manipulatie van weefsels ex vivo, waaronder hitteschok, oxidatieve stress, osmotische stress, voedingsstress en toxiciteitsomstandigheden. Live imaging is een krachtig hulpmiddel dat wordt gebruikt om real-time veranderingen in ex vivo weefsels te visualiseren na experimentele behandeling en manipulatie. Fijne weefseldissecties en manipulatie nemen oefening in, en de hoeveelheid tijd van dissectie tot beeldvorming kan variëren afhankelijk van de ervaring. De reden voor het ontwikkelen van deze methode is gebaseerd op de zorg dat het voorbereiden van weefsel op levende beeldvorming cellulaire stress kan veroorzaken tijdens dissectie en beeldvormingsvoorbereiding. Dit kan met name problematisch zijn voor processen die gevoelig zijn voor veranderingen in het cellulaire metabolisme en het beschikbare zuurstofgehalte, zoals de mitochondriale functie. Hoewel het hebben van een parallel wild type monster een belangrijke controle is, is er nog steeds de mogelijkheid dat sommige of alle waargenomen veranderingen in subcellulaire structuren te wijten kunnen zijn aan schade of celstress door dissectie en geen normale fysiologie weerspiegelen of de behandeling of mutatie die wordt bestudeerd.
Om dit potentiële probleem aan te pakken, gebruiken we waterstofperoxidetoevoeging tijdens live beeldvorming om cellulaire oxidatieve schade op te wekken1. Het doel van deze methode is om weefselschade aan te brengen om het effect op subcellulaire structuren te controleren. Dit protocol is nuttig voor twee doeleinden: 1) bepalen of veranderingen in subcellulaire lokalisatie van de structuur van belang te wijten zijn aan de stress veroorzaakt door onervaren dissectie en 2) zodra de onderzoeker vertrouwen heeft in de beschreven dissectietechnieken om het effect van gecontroleerde stress op de structuur van belang te monitoren. Hier laten we twee voorbeelden zien van hoe verhoogde oxidatieve schade veranderingen veroorzaakt in twee subcellulaire structuren, mitochondriën en Clu bliss deeltjes. Om dit te doen, gebruiken we de Drosophila-eierstok, een gemeenschappelijk model voor live beeldvormingsstudies. Het eerste voorbeeld onderzoekt mitochondriale lokalisatie. Onze ervaring is dat normale mitochondriale lokalisatie in vrouwelijke kiemcellen zeer gevoelig is voor verstoringen en kan fungeren als een voorbode van cellulaire stress. Mitochondriën in Drosophila vrouwelijke kiemcellen zijn normaal gesproken gelijkmatig verspreid over het cytoplasma2. Toevoeging van waterstofperoxide zorgt ervoor dat de organellen snel verkeerd worden gelokaliseren en clusteren op een vergelijkbare manier als verschillendemutaties 3,4,5. Het tweede voorbeeld zijn gelukzaligheidsdeeltjes gevormd door Clueless (Clu). Clu is een ribonucleoproteïne dat diffuus is in het cytoplasma; het vormt echter ook mitochondriën-geassocieerde deeltjes onder optimale cellulaire omstandigheden5. Omdat de aanwezigheid van Clu-deeltjes afhankelijk is van gezonde cellulaire omstandigheden, hebben we ze "gelukzaligheidsdeeltjes"genoemd 3,5,6. Toevoeging van waterstofperoxide zorgt ervoor dat deze deeltjes zich snel verspreiden en homogeen worden in het cytoplasma5. In de loop van onze studies hebben we veranderingen waargenomen in de lokalisatie van beide subcellulaire structuren, maar pas na het uitvoeren van live beeldvormingsstudies konden we het effect van cellulaire stress en oxidatieve schade op lokalisatie en dynamiek van mitochondriën en gelukzaligheidsdeeltjes volledig waarderen.
Het nut van dit protocol als aanvulling op reeds vastgestelde of alternatieve methoden hangt af van verschillende factoren. Ten eerste moet het beeldvormingsprotocol vatbaar zijn voor drugstoevoeging. Indien het monster onder een afdeklip en in halocarbonolie wordt gemonteerd, zou deze methode niet mogelijk zijn7. H2O2 toevoeging veroorzaakt een snelle toename van oxidatieve schade, daarom is deze termijn mogelijk niet geschikt. Oxidatieve schade kan worden beschouwd als een proxy voor hypoxie; het kan echter te hard of te veralgemeend zijn om te functioneren als een geschikte controle voor schade voor bepaalde subcellulaire componenten. Ten slotte kan voor beeldvormingsexperimenten die uren duren, zoals die na een ontwikkelingsproces, de toevoeging H2O2 te sterk zijn (bijvoorbeeld8). Het testen van een concentratiecurve kan deze beperking overwinnen.
Protocol
1. Voorbereiding van dissectie- en beeldmedia
OPMERKING: De media die het meest geschikt zijn voor dit live beeldvormingsexperiment bevatten Schneider's Drosophila-media die 15% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 0,6x Pen-Strep en 200 μg/ml runderalimine bevatten, hierna de media van Complete Schneider genoemd.
- Voer het mediapreparaat onder steriele omstandigheden uit om ervoor te zorgen dat het niet verontreinigd raakt. De media werd ontwikkeld om Drosophila ovarioles voor langere tijd te steunen9.
- Voeg 15% warmte geïnactiveerd foetaal runderserum, 0,6x Pen-Strep en 200 μg/ml boviene insuline toe aan de media van schneider.
- Meng de inhoud goed en bewaar ze 's nachts op 4 °C.
OPMERKING: Insuline lost niet volledig op in de media van complete Schneider en u zult merken dat een neerslag zich in de bodem van de buis nestelt. - Maak aliquots van de media, zorg ervoor dat u het neerslag verlaat, omdat het de beeldvorming zal verstoren.
OPMERKING: Deze oplossing kan binnen een maand worden gebruikt als deze in aliquots bij 4 °C wordt bewaard.
2. Verzameling van Drosophila voor dissectie
OPMERKING: Gedetailleerde Drosophila-inzamelings- en dissectieprocedures zijn ook te vinden in Weil et al.10 en Parker et al.11.
- Voor een optimale beeldvorming van vrouwelijke kiemcellen, bereid eerst een flacon met standaard maïsmeelvliegvoer en een schar van natte gistpasta die de consistentie van pindakaas is. Dit zorgt ervoor dat de vrouwelijke vliegen goed gevoed zijn en alle follikelontwikkelingsstadia voor beeldvorming produceren.
- Verzamel voor optimaal gezonde vliegen 0-1 dag oude vrouwtjes en breng met mannetjes over in een vliegenvoerflacon met natte gistpasta.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de slapende vliegen niet in contact komen met de gistpasta, omdat ze zich eraan kunnen houden. - Voer de vliegen 3-7 dagen en verschoon dagelijks de flacon en de gistpasta.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de gistpasta contact maakt met het vliegvoer, zodat het niet uitdroogt.
3. Drosophila eierstokdissectie
OPMERKING: Het is belangrijk om de mediaoplossingen vers voor te bereiden, omdat waterstofperoxide gevoelig is voor oxidatie en TMRE na verloop van tijd afbreekt.
- Bereid vlak voor dissectie, in de media van Complete Schneider, een verse aliquot van 2 μM H2O2 oplossing, een verse aliquot van 46 nM tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE) en een verse aliquot van een 46 nM TMRE oplossing die 2 μM H2O2 bevat.
- Gebruik voor eierstokdissectie twee paar fijne tangen en een paar elektrolytisch geslepen wolfraamnaalden12. Om de eierstokken te ontleden, vult u 2-3 putten van een glazen bodem ontleedschaal (horlogeglas) met Complete Schneider's die is opgewarmd tot kamertemperatuur.
- Verdoof de flacon van vetgemeste vliegen met kooldioxide en scheid het gewenste aantal vrouwelijke vliegen dat moet worden ontleed. Plaats een enkele vlieg in het medium met behulp van een tang.
- Pak onder een ontledende microscoop de vlieg voorzichtig vast aan de thorax met behulp van een fijne tang. Pak met het andere paar tangen het achterste vast en trek voorzichtig om de eierstokken te verwijderen.
OPMERKING: als de eierstokken niet soepel uitkomen met behulp van deze methode, kan de hele buik ook van de vlieg worden verwijderd en kunnen de eierstokken voorzichtig uit beide uiteinden van de buik worden geperst met behulp van een tang. - Verwijder eventuele vreemde nagelriem of weefsel en breng de eierstokken vervolgens over naar een nieuwe put met verse media. De eierstokken moeten nog steeds bewegen van de omliggende spierhuls.
4. Ovarioles voorbereiden op beeldvorming
- Gebruik geslepen wolfraamnaalden, plaag de ovarioles voorzichtig uit elkaar en zorg ervoor dat de omliggende spierhuls wordt verwijderd (figuur 1).
- Plaag voorzichtig elke spierhuls en zenuwvezels weg die aan de geïsoleerde ovarioles zijn bevestigd(figuur 2).
OPMERKING: Als de spierhuls niet wordt verwijderd, zal de ovariole trillen en bewegen, wat problemen veroorzaakt met het verkrijgen van beeld (Video 1). - Als de subcellulaire belangenstructuren endogeen zijn geëtiketteerd, gaat u verder met stap 4.4. Als de belangenstructuren worden geëtiketteerd met een fluorescerende kleurstof, gaat u verder met sectie 5.
- Zodra de ovarioles netjes zijn ontleed, breng je ze met behulp van een micropipette over in een druppel van 100 μL van complete Schneiders beeldvormingsmedia in de glazen depressie van een glazen bodemschaal. De individuele ovarioles zinken naar de bodem van de druppel.
- Ga naar sectie 6 voor beeldvorming.
OPMERKING: Voor beeldvorming van mitochondriën en Clu-gelukzaligheidsdeeltjes mag niet meer dan vijf-tien minuten verstrijken vanaf het begin van de dissectie tot beeldvorming.
5. Vlekken op mitochondriën met TMRE
OPMERKING: Aanvullende gedetailleerde procedures voor het levend kleuren van mitochondriën met fluorescerende kleurstoffen zijn te vinden in Parker et al. 2017.
- Breng na stap 4.3 de geïsoleerde ovarioles in een druppel van 100 μL van 46 nM TMRE-media over in de glazen depressie van een glazen bodemschaal. De individuele ovarioles zinken naar de bodem van de druppel.
- Incubeer 20 minuten op kamertemperatuur. Plaats het deksel op de schaal met glazen bodem en plaats de schaal in een overdekte doos voor de duur van het experiment om te beschermen tegen licht.
OPMERKING: Na incubatie kunnen monsters direct zonder wasbeurten in beeld worden genomen. - Herhaal stap 5.1-5.2 om ten minste twee gerechten met TMRE-gelabelde ovarioles te bereiden, één om als experimentele groep te dienen en één om als controle te dienen.
6. Live beeldverwerving
- Zodra de ovarioles zijn gemonteerd, plaatst u een van de glazen bodemschotels op de microscoop en configureert u indien nodig de beeldparameters. De optimale excitatie/emissie golflengten voor de hier gebruikte TMRE zijn 549 nm/574 nm.
- Na het lokaliseren van het gewenste gezichtsveld, verkrijgt u stilstaande beelden of korte video's van een of meer ovarioles zoals gewenst als een verslag van voorbehandelingsaandoeningen.
7. Toevoeging van waterstofperoxide tijdens beeldvorming
- Pauzeer live beeldvorming, verwijder het deksel van de glazen bodemschaal en voeg voorzichtig 100 μL van 2 μM H2O2-oplossing toe aan de schaal met behulp van een micropipette als de beeldvorming endogene gelabelde structuren. Als beeldvorming van mitochondriën, voeg dan voorzichtig 100 μL van 46 nM TMRE met 2 μM H2O2-oplossing toe aan de schaal met behulp van een micropipette (Video 2).
- Vermijd het breken van het oppervlak van de bestaande mediadruppel of het toevoegen van de oplossing te snel om de ovarioles die op de bodem van de schaal rusten niet te verplaatsen (Video 2).
- Vervang het deksel van de schotel (afdekkap), verplaats en richt indien nodig het gewenste gezichtsveld opnieuw scherp en hervat de beeldvorming (Video 3, Video 4, Figuur 3, Figuur 4).
- Zorg ervoor dat de beeldvorming zo snel mogelijk wordt hervat na toevoeging H2O2, omdat de experimentele behandeling tijdgevoelig is (Video 5).
- Verkrijg naar wens stilstaande beelden of korte video's van een of meer ovarioles. Dit zal dienen als een verslag van de aandoeningen na de behandeling.
- Plaats voor de bediening de tweede glazen bodemschaal op de microscoop en herhaal sectie 6.
- Herhaal stap 7.1, dit keer door 100 μL TMRE-only media aan de schaal toe te voegen. Als beeldvorming endogeen gelabelde structuren, voeg 100 μL van de Complete Schneider's media-only oplossing.
- Herhaal stap 7.2 en 7.3 om gegevens voor de besturingsgroep te verkrijgen.
OPMERKING: Voor beeldvorming van mitochondriën en Clu bliss deeltjes mag niet meer dan drie-vijf minuten verstrijken van de toevoeging van waterstofperoxide aan beeldvorming.
Representative Results
De beschreven protocollen kunnen worden gebruikt om de effecten van waterstofperoxide tijdens live beeldvorming van Drosophila-eierstokken te bestuderen. Zoals getoond in figuur 3, figuur 4, video 3 en video 4, biedt deze procedure een effectief middel om weefselveranderingen en dynamiek na experimentele behandeling in realtime te visualiseren. Belangrijk is dat dit protocol specifiek is voor de toevoeging van H2O2 aan ovarioles tijdens beeldvorming; het kan echter worden aangepast voor de exogene toevoeging van andere geneesmiddelen of reagentia van belang. Bovendien kunnen follikels worden geëtiketteerd met alle fluorescerende kleurstoffen die van belang zijn (bijv. tetramethylrhodamine (TMRE), LysoTracker) voorafgaand aan de beeldvorming (Video 3). De meest kritieke stappen om duidelijke beeldvormingsresultaten te verkrijgen zijn 1) de juiste dissectie en isolatie van enkele ovarioles waarbij alle samentrekkende elementen worden verwijderd (figuur 1 en figuur 2) en 2) de snelheid waarmee beeldvorming opnieuw wordt gestart na toevoeging van waterstofperoxide. Video 4 is een illustratie van een goed ontleed follikel dat stabiel blijft gedurende de beeldduur in vergelijking met Video 1, wat een slecht ontleed follikel illustreert dat het gezichtsveld verlaat tijdens de beeldvorming. Video 5 is een illustratie waarin de H2O2 effecten op TMRE-gelabelde mitochondriën al zijn gevorderd voor het begin van de beeldvorming als gevolg van te veel verstreken tijd. In vergelijking met Video 3 waarin beeldvorming onmiddellijk na toevoeging van waterstofperoxide (tijd 0) opnieuw werd opgestart en intact, zijn verspreide mitochondriën nog steeds zichtbaar, de mitochondriën in Video 5 zijn al zichtbaar begonnen te klonteren en verliezen hun membraanpotentieel bij het opnieuw opstarten van beeldvorming. Dit probleem wordt meestal toegeschreven aan verstoring van de monsterposities tijdens de toevoeging H2O2 en kan worden verlicht door de techniek te volgen om de beeldmedia en de monsterpositie intact te houden (Video 2). Van belang is dat bij controle-experimenten die zonder H2O2 aan de media zijn toegevoegd, de mitochondriën in follikels goed verspreid blijven en de TMRE-kleurstof in de mitochondriën wordt opgesloten.
Figuur 1: Isolatie van enkele eierstokken van Drosophila eierstokken. (A) Cartoon die wijst op een paar eierstokken, een enkele eierstok (pijl) met het kiemarium aan de punt (pijlpunt) en de twee spiermanden die de eierstok (bruin, epitheel) en de eierstok (bruin, peritoneaal) omringen. (B) Ontleed Drosophila eierstok. (C) Latere scheiding van de geplaagde eierstok in individuele eierstokken (pijl). Schaalbalk = 100 um. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verwijdering van zenuwvezels en samentrekkende elementen uit enkele ovarioles. (A) Enkele ovariole met restanten van zenuwweefsel en de spierhuls nog steeds bevestigd (pijl). (B) Voorzichtig verwijderen van al het resterende weefsel dat aan ovariole in A (pijl) is bevestigd. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: H2O2 veroorzaakt mitochondriale mislokalisatie. (A-A") Live-image stills van een goed gevoede cluCA06604 (Clu::GFP vliegen) follikel. Toevoeging van H2O2 zorgt ervoor dat mitochondriën klonteren gedurende de duur van de beeldvorming. TMRE-etikettering van mitochondriën geeft aan dat mitochondriën in eerste instantie worden verspreid op tijd 0 (A), en dat mitochondriën beginnen te klonteren na H2O2 toevoeging (A′) Op een later tijdstip wordt de TMRE-etikettering vlekkerig doordat mitochondriën hun membraanpotentieel verliezen en daarom hun vermogen om de kleurstof te sequesteren (A"). Wit = TMRE (A-A"). Schaalbalken: 10 μm in (A) voor A-A"5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: H2O2 verspreidt Clu. (A-A") Live-image stills van een goed gevoede cluCA06604 follikel. Toevoeging van H2O2 zorgt ervoor dat deeltjes zich verspreiden en homogeen worden in het cytoplasma gedurende de beeldvormingsduur. Wit = Clu::GFP (A-A"). Schaalbalk: 40 μm in (A) voor A-A"5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Follikel van een cluCA06604 vrouw. Zoals beschreven in figuur 2,zal het niet verwijderen van zenuwvezelcontractiele elementen uit enkele ovarioles een duidelijke drifting en beweging van de ovarioles veroorzaken tijdens beeldvorming en het daaropvolgende onvermogen om beeldvormingsgegevens te analyseren. Wit = Clu::GFP. Klik hier om deze Video te downloaden.
Video 2: Juiste toevoeging van H2O2 aan monsterschaal. Waterstofperoxide moet met behulp van een micropipette van de juiste grootte aan de monsterschaal worden toegevoegd. Het doseren van H2O2 zonder het mediaoppervlak te breken. Er wordt voor gezorgd dat het oppervlak van de beeldvormende media niet wordt gebroken om de monsterdrift tijdens de toevoeging van waterstofperoxide te minimaliseren. Klik hier om deze Video te downloaden.
Video 3: H2O2 toevoeging tijdens beeldvorming van TMRE gelabelde follikels. Follikel van een cluCA06604 vrouw bevlekt met TMRE. H2O2 veroorzaakt mitochondriale mislokalisatie in Drosophila follikels. Wit = TMRE kleurstof. Afbeelding van een frame per 15 s gedurende 20 minuten, en de video is 10 frames per seconde5. Klik hier om deze Video te downloaden.
Video 4: H2O2 toevoeging tijdens beeldvorming van Clu::GFP follikels. Follikel van een cluCA06604 vrouw. H2O2 verspreidt Clu-deeltjes zoals beschreven in figuur 4. Wit = Clu::GFP. Afbeelding van één frame per 15 s gedurende 15 minuten en de video is 10 frames per seconde. 5Klik hier om deze video te downloaden.
Video 5: Vertraagde beeldvorming na toevoeging H2O2. Follikel van een cluCA06604 vrouw. Toevoeging van waterstofperoxide aan follikels is een tijdgevoelige behandeling. Het opnieuw opstarten van beeldvorming werd in deze video vertraagd als gevolg van monsterverplaatsing tijdens de toevoeging H2O2. De mitochondriën zijn al begonnen zichtbaar te klonteren en verliezen hun membraanpotentieel bij het opnieuw opstarten van beeldvorming op tijd 0 (in vergelijking met tijd 0 in video 3). Het niet snel hervatten van de beeldvorming na de behandeling zal leiden tot onnauwkeurige en onbruikbare resultaten, omdat de vroege experimentele effecten voorafgaand aan de beeldvorming zullen worden gemist. Wit = TMRE. Afbeelding van één frame per 15 s gedurende 20 minuten en de video is 10 frames per seconde. Klik hier om deze Video te downloaden.
Discussion
Dit protocol kan een nuttige toevoeging zijn als controle voor artefacten als gevolg van eierstokdissectie en weefselincub incubatie voor elk live beeldvormingsexperiment. De kritieke stappen zijn vergelijkbaar met die voor andere live imaging-protocollen. Het leren ontleden van hele Drosophila eierstokken vergt oefening; deze vaardigheid kan echter meestal vrij snel worden geleerd met de juiste dissectietools. Moeilijker onder de knie te krijgen is het verwijderen van de spier die de eierstokken omhult en elke eierstok13. Dit moet worden gedaan om ervoor te zorgen dat spiercontracties de beeldverwerving niet verstoren. Als het gebruik van geslepen wolfraamnaalden om dit te doen niet succesvol blijkt, kan het kiemarium aan de punt van de ovariole worden vastgegrepen met een tang en de ovariole uit de spierhuls worden getrokken. Deze techniek is echter problematisch als de vroegste ontwikkelingsstadia moeten worden onderzocht omdat ze beschadigd kunnen raken. Een andere belangrijke stap is om de ovarioles die op de bodem van het gerecht rusten niet los te maken bij het toevoegen van H2O2. Een extra belangrijk aspect wordt gedeeld door alle live beeldvorming: de onderzoeker moet ervoor zorgen dat de structuur van belang fluorescerend goed gelabeld is voor de behandeling. De gerechten die hier worden gebruikt (Table of Materials) worden vaak gebruikt voor live beeldvorming; een schotel of glijbaan met een glazen afdeklip aan de onderkant of zelfs een grote glazen hoeslip moet echter werken zolang de druppel media kan worden afgedekt om verdamping van media te voorkomen. Terwijl we een bepaalde microscoop gebruiken, zou elke omgekeerde microscoop met een doel van voldoende vergroting om de betreffende subcellulaire structuur te zien en een bijgevoegde camera met voldoende resolutie en beeldopnamesnelheid moeten werken.
Hoewel ons laboratorium voornamelijk geïnteresseerd is in mitochondriale functie, kan deze methode nuttig zijn om de dynamiek en lokalisatie van elke subcellulaire structuur of organel te onderzoeken, zoals de kern, cytoskelet of endoplasmatisch reticulum. Deze methode heeft echter beperkingen. Om waterstofperoxide toe te voegen, moet het weefsel zich in een waterig medium zijn. Een alternatieve methode voor live beeldvorming is het gebruik van halocarbonolie, die een belangrijke rol heeft gespeeld bij het beschrijven van vele belangrijke processen in Drosophila-ovarioles, waaronder het eerste voorbeeld van dynamische beweging van GFP in een modelorganisme7,14. Bovendien veroorzaakt het toevoegen van waterstofperoxide aan de media wijdverspreide oxidatieve schade die een te algemene belediging voor het weefsel kan zijn om informatief te zijn voor het cellulaire proces van belang, met name voor langere experimenten die de ontwikkeling onderzoeken. Hoewel het misschien niet haalbaar is om experimenten uit te voeren waarvoor de cel gedurende lange tijd moet worden gevisualiseerd vanwege deze snelle, uitgebreide en waarschijnlijk onomkeerbare oxidatieve schade, hebben we gezien dat de acute waterstofperoxidebehandeling die we hebben beschreven van toepassing is op de meeste stadia van oogenese, omdat we in de meeste stadia binnen de beeldvormingsperiode dezelfde effecten kunnen zien. Gezien de lage kosten en het gemak van het protocol, kan het een nuttige controle zijn voor schade en kan het ook worden gebruikt als een behandeling vóór fixatie en antilichaametikettering.
In onze handen bootst de H2O2-behandeling de veranderingen in mitochondriale mislocatie en Clu bliss deeltjesdispersie na die we zien in verschillende Drosophila-mutanten. Het bootst ook resultaten na die we zien voor nieuwe onderzoekers in het lab die dissectietechnieken leren. Daarom toonde deze methode duidelijk aan dat monstervoorbereiding en algemene cellulaire stress kunnen leiden tot onverwachte en eerder onverklaarbare veranderingen in mitochondriale mislocatie en de aanwezigheid van gelukzaligheidsdeeltjes. Door deze techniek vooruit te helpen, kunnen waterstofperoxideconcentraties worden gemoduleerd met een hogere of lagere concentratie. Als een cellulair effect wordt gezien met een lagere concentratie, is het mogelijk dat het stressfenotype omkeerbaar is door het medium te vervangen door dat van Complete Schneider. Verschillende celstressoren zoals carbonylcyanide m-chlorofenylhydrazon (CCCP), arseen of eenvoudige hitteschok kunnen nuttig zijn voor algemene cellulaire stress voor andere subcellulaire structuren. Aangezien live beeldvorming van ex vivo weefsels manuele manipulatie en incubatie in verschillende media vereist, moet deze controle een nuttige aanvulling zijn om ervoor te zorgen dat eventuele waarnemingen zo dicht mogelijk bij de normale fysiologie liggen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Dr. Jeremy Smyth bedanken voor beeldvormingsondersteuning en Ann C. Shenk voor illustraties, productie en videografie. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (1R01GM127938 t.n.v. R.T.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles - PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles - PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles - tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
