Summary
该协议的目的是使用活成像来可视化氧化损伤对 果蝇 卵巢中亚细胞结构的定位和动力学的影响。
Abstract
血友病黑色素卵巢的活成像有助于了解发育过程中的各种基本细胞过程，包括核糖核蛋白粒子运动、mRNA定位、细胞运动和细胞骨骼动力学。已开发出多种实时成像方法。由于每个方法都涉及解剖放置在介质或卤氢油中的单个卵巢，因此随着时间的推移，由于缺氧和/或物理操作而导致的细胞损伤将不可避免地发生。缺氧的一个下游效应是增加细胞的氧化损伤。此协议的目的是使用实时成像来可视化氧化损伤对受控细胞损伤诱导后淋病卵巢中亚细胞结构的定位和动态的影响。在这里，我们使用过氧化氢诱导细胞氧化损伤，并举例说明这种损伤对两个亚细胞结构的影响，线粒体和Clu幸福颗粒。但是，此方法适用于任何子细胞结构。限制是过氧化氢只能添加到水介质中，不能用于使用卤碳油的成像。其优点是过氧化氢是现成的，价格便宜，作用迅速，其浓度可以调节，氧化损伤是缺氧造成的损害以及操作造成的一般组织损伤的良好近似。
Introduction
在实验培养和组织前体内操作过程中，可能会产生多种不同的细胞应激因素，包括热休克、氧化应激、渗透应激、营养应激和毒性条件。实时成像是一种强大的工具，用于在实验治疗和操作后可视化前体内组织的实时变化。精细组织解剖和操作需要实践，从解剖到成像的时间可能因经验而异。开发这种方法的理由是担心为活体成像准备组织在解剖和成像准备过程中会导致细胞应激。对于对细胞代谢变化和可用氧气水平（如线粒体功能）敏感的过程，这可能特别成问题。虽然有一个平行的野生类型样本是一个重要的控制，仍然有可能部分或全部观察到的细胞下结构的变化可能是由于解剖造成的损伤或细胞应力，并不反映正常的生理或正在研究的治疗或突变。
为了解决这个潜在的问题，我们在实时成像过程中使用过氧化氢添加物来诱导细胞氧化损伤1。这种方法的目的是诱发组织损伤，以监测对细胞下结构的影响。此协议有两个用途：1） 确定兴趣结构的亚细胞定位变化是否是由于缺乏经验的解剖造成的压力，2） 一旦研究人员对所述的解剖技术有信心，以监测受控压力对利益结构的影响。在这里，我们展示了两个例子，说明增加的氧化损伤如何导致两个亚细胞结构的变化，线粒体和Clu幸福颗粒。为此，我们使用嗜血杆菌卵巢，这是现场成像研究的常见模型。第一个例子检查线粒体定位。根据我们的经验，女性生殖细胞中正常的线粒体定位对扰动非常敏感，可以作为细胞应激的预兆。嗜血杆菌中女性生殖细胞中的线粒体通常均匀地分散在整个细胞质2。过氧化氢的添加导致细胞器迅速误位和聚集的方式类似于各种突变3，4，5。第二个例子是由无线索（Clu）形成的幸福粒子。Clu 是一种核糖核蛋白，在整个细胞质中扩散：然而，它也形成线粒体相关的粒子在最佳的细胞条件5。由于Clu粒子的存在取决于健康的细胞条件，我们称它们为"幸福"粒子3，5，6。添加过氧化氢会导致这些颗粒迅速分散，并在细胞质5中变得均匀。在我们的研究过程中，我们观察到这两种亚细胞结构的定位变化，但只有在进行现场成像研究之后，我们才能充分了解细胞应力和氧化损伤对线粒体和幸福粒子的定位和动力学的影响。
本协议作为已建立或替代方法的补充的用途取决于几个因素。首先，成像协议必须适应药物添加。如果样品安装在盖夹下，并安装在光环油中，这种方法将是不可能的7。H2O2 添加会导致氧化损伤迅速增加，因此，此时间尺度可能不合适。氧化损伤可视为缺氧的代名。然而，它可能过于苛刻或过于笼统，无法作为对某些亚细胞组件损坏的适当控制。最后，对于持续数小时的成像实验，例如那些遵循发育过程的成像实验，H2O2 的添加可能太强（例如8）。测试浓度曲线可以克服此限制。
Protocol
1. 准备解剖和成像介质
注：最适合此实时成像实验的介质包含施耐德的果蝇介质，其中含有 15% 的热灭活胎儿牛血清、0.6 倍笔链和 200μg/mL 牛胰岛素，以下简称完全施耐德介质。
- 在无菌条件下进行媒体准备，以确保它不会受到污染。该媒体被开发，以支持果蝇卵巢很长一段时间9。
- 在施耐德的媒体上加入15%的热灭活胎儿牛血清、0.6倍的笔链和200μg/mL牛胰岛素。
- 将内容混合好，在4°C下存放过夜。
注意：胰岛素不会完全溶解在完全施耐德的介质中，您会注意到沉淀物沉淀在管子底部。 - 制作媒体的别名，一定要离开沉淀物，因为它会干扰成像。
注：如果将此解决方案存储在 4 °C 的别名中，则此解决方案可在一个月内使用。
2. 用于解剖的 果蝇 收藏
注：详细的嗜血杆菌收集和解剖程序也可能在威尔等人10和帕克等人11。
- 为了获得最佳雌性生殖细胞成像效果，首先准备一个含有标准玉米粉飞食的瓶装和一小块湿酵母糊，这是花生酱的一致性。这确保了雌蝇的喂养良好，并将产生所有卵泡发育阶段的成像。
- 对于最佳健康的苍蝇，收集0-1天大的女性，并与雄性转移到含有湿酵母糊的苍蝇食物瓶。
注意：确保熟睡的苍蝇不会接触酵母糊，因为它们可以坚持它。 - 喂苍蝇3-7天，每天更换小瓶和酵母糊。
注意：确保酵母糊接触苍蝇的食物，使其不干涸。
3. 嗜血杆菌 卵巢解剖
注：重要的是要准备新的媒体解决方案，因为过氧化氢容易氧化和TMRE随着时间的推移降解。
- 就在解剖前，在完全施耐德的媒体上，准备一份 2 μM H2O2 溶液的新鲜别名，46 nM 四甲基二胺、乙酯 （TMRE） 和包含 2 μM H 2 O2的 46 nM TMRE 溶液的新鲜别名。
- 对于卵巢解剖，使用两对细钳和一对电解锐化钨针12。要解剖卵巢，请将 2-3 口玻璃底解剖盘（手表玻璃）与已加热到室温的完全施耐德的碗（手表玻璃）填充。
- 用二氧化碳麻醉育肥苍蝇的体内，并分离出需要解剖的雌蝇数量。使用钳子将一只苍蝇放在媒体上。
- 在解剖显微镜下，用一对细钳轻轻抓住梭子旁的苍蝇。用另一对钳子，抓住后部，轻轻拉取卵巢。
注意：如果使用这种方法卵巢不能顺利出来，整个腹部也可以从苍蝇身上取出，卵巢可以用钳子轻轻地从腹部两端挤出。 - 取出任何无关的卡质层或组织，然后将卵巢转移到含有新鲜介质的新井中。卵巢应该仍然从周围的肌肉护套移动。
4. 为成像准备卵巢
- 使用锋利的钨针，轻轻地将卵巢分开，小心去除周围的肌肉护套（图1）。
- 轻轻地取笑任何肌肉护套和神经纤维连接到孤立的卵巢（图2）。
注意：如果不切除肌肉护套，卵巢会抽搐和移动，导致图像获取问题（视频1）。 - 如果感兴趣的亚细胞结构被内源性标记，请继续到步骤 4.4。如果感兴趣的结构将标记为荧光染料，请继续到第 5 节。
- 一旦卵巢净解剖，使用微点，转移他们在100μL滴完全施耐德的成像介质到玻璃底盘的玻璃凹陷。单个卵巢会沉入液滴的底部。
- 继续到第 6 节进行成像。
注：对于成像线粒体和Clu幸福粒子，从解剖开始到成像的时间不应超过五到十分钟。
5. 染色线粒体与 TMRE
注：在派克等人2017年可能会发现有关线粒体与荧光染料活染色的其他详细程序。
- 第 4.3 步后，将 100 微升 46 nM TMRE 介质中的孤立卵巢转移到玻璃底盘的玻璃凹陷中。单个卵巢会沉入液滴的底部。
- 在室温下孵化20分钟。将盖子放在玻璃底盘上，并在实验期间将盘子放入带盖的盒子中，以防止光线照射。
注：孵化后，样品可直接成像，无需清洗。 - 重复步骤 5.1-5.2 准备至少两道 TMRE 标记的卵巢菜，一个作为实验组，一个作为控制。
6. 实时图像采集
- 安装卵巢后，将玻璃底盘之一放在显微镜上，并在必要时配置成像参数。此处使用的 TMRE 的最佳激发/发射波长为 549 nm/574 nm。
- 找到所需的视场后，根据需要获取一个或多个卵巢的静止图像或简短视频，作为治疗前状况的记录。
7. 成像过程中添加过氧化氢
- 暂停实时成像，从玻璃底盘上取下盖子，并仔细添加 100 μL 的 2 μM H2O2溶液到该盘中，如果成像内源性标记结构，则使用微拍。如果成像线粒体，小心添加 100μL 的 46 nM TMRE 与 2 μM H2O2解决方案的菜使用微点 （视频 2）.
- 避免打破现有介质液滴的表面或过快添加溶液，以免取代放在菜底的卵巢（视频 2）。
- 更换菜盖（菜盖），如有必要，重新定位和重新聚焦所需的视场，并恢复成像（视频3，视频4，图3，图4）。
- 请注意在H2O2添加后尽快恢复成像，因为实验治疗对时间敏感（视频5）。
- 根据需要获取一个或多个卵巢的静止图像或简短视频。这将作为治疗后状况的记录。
- 对于控制，将第二个玻璃底盘放在显微镜上，重复第 6 节。
- 重复步骤 7.1，这次在菜中添加 100 μL 的 TMRE 专用介质。如果成像内源性标记结构，则添加 100μL 的完整施耐德仅介质解决方案。
- 重复步骤 7.2 和 7.3 以获取对照组的数据。
注：对于成像线粒体和Clu幸福粒子，从在成像中添加过氧化氢到成像，时间不应超过三到五分钟。
Representative Results
上述协议可用于研究过氧化氢在果蝇卵巢活体成像过程中的影响。如图3、图 4、视频 3和视频 4 所示，此过程提供了实时可视化实验治疗后组织变化和动态的有效方法。重要的是，此协议是专门为在成像时添加 H2O2到卵巢：然而，它可以适应外源性添加其他药物或试剂的兴趣。此外，卵泡在成像（视频 3）之前可标记为任何感兴趣的荧光染料（例如四甲基霍达明 （TMRE）、莱索跟踪器）。获得清晰成像结果的最关键步骤是 1） 正确解剖和隔离所有收缩元素的单卵巢（图 1和图 2），以及 2） 过氧化氢添加后重新启动成像的速度。与视频 1相比，视频 4 是正确解剖的毛囊的例证，在整个成像过程中保持稳定，这说明在成像过程中，一个解剖不当的毛囊会退出视野。视频 5是一个例证，其中 H2O2对 TMRE 标记线粒体的影响在成像开始前已经取得进展，由于时间过多。与视频3相比，在添加过氧化氢后立即重新启动成像（时间 0），并且仍然可见完整、分散的线粒体，视频 5中的线粒体已经开始明显聚集，并在重新开始成像时失去其膜潜力。此问题主要归因于在 H2O2添加过程中样品位置的中断，并且可以通过遵循保持成像介质和样品位置完好无损的技术来缓解（视频 2）。值得注意的是，在没有将H2O2添加到介质的情况下进行的对照实验中，毛囊中的线粒体仍然适当分散，TMRE染料仍然被隔离在线粒体中。
图1：从果蝇卵巢中分离出单卵巢。（A）卡通，表示一对卵巢，一只卵巢（箭头），尖端（箭头）和卵巢周围的两个肌肉护套（棕色，上皮）和卵巢（棕色，腹膜）。（B） 分离的果蝇卵巢。（C） 随后将被取笑的卵巢分离成单独的卵巢（箭头）。缩放条=100嗯。请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：去除神经纤维和收缩元素从单卵巢。（A）单卵子与神经组织的残余和肌肉护套仍然连接（箭头）。（B） 温和地去除A（箭头）中附着在卵巢上的所有剩余组织。缩放条 = 100μm。请单击此处查看此数字的较大版本。
图3：H2O2导致线粒体误位。 （A-A）一个喂养良好的cluCA06604（Clu：：GFP苍蝇）卵泡的活体图像静物。加入 H2O2会导致线粒体在成像期间聚集。线粒体的TMRE标记表明线粒体最初在时间0（A）时分散，线粒体在H2O2添加（A′）后开始聚集，在较晚的时间点，TMRE标签变得斑点，由于线粒体失去其膜潜力，因此他们的能力，以封存染料（A）。白色=TMRE（A-A）。比例尺条： 10μm 在（A） 为A-A"5.请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：H2O2驱散克鲁。（A-A）喂养良好的cluCA06604毛囊的实时图像静止图像。加入H2O2会导致粒子在成像期间在细胞质中分散并变得均匀。白色 =克卢：：GFP（A-A）。比例尺栏： 40μm 在（A） 为A-A"5.请点击这里查看此数字的较大版本。
视频1： 来自 卡鲁CA06604 女性的毛囊。如 图2所述，如果未能从单卵巢中去除神经纤维收缩元素，将导致卵巢在成像过程中出现明显的漂移和移动，随后无法分析成像数据。白色 =克卢：：GFP。请点击这里下载此视频。
视频2：在样品盘中适当添加H2O2。 过氧化氢应使用适当大小的微点添加到样品盘中。分配H2O2而不破坏媒体表面。注意避免破坏成像介质的表面，以尽量减少过氧化氢添加过程中的样品漂移。请点击这里下载此视频。
视频 3： H2O2 添加在 TMRE 标记毛囊成像期间。来自cluCA06604女性沾染TMRE的毛囊。H2O2导致嗜血杆菌毛囊的线粒体误位。白色=TMRE染料。每15秒拍摄一帧20分钟，视频为每秒10帧5。请点击这里下载此视频。
视频4：H 2O2在Clu成像过程中添加：：GFP毛囊。来自卡鲁CA06604女性的毛囊。H2O 2 分散图 4中描述的 Clu 粒子。白色 =克卢：：GFP。每 15 秒拍摄一帧，时间为 15 分钟，视频为每秒 10 帧。5请点击这里下载此视频。
视频 5： H2O2添加后延迟成像。来自卡鲁CA06604女性的毛囊。在毛囊中添加过氧化氢是一种对时间敏感的处理方法。由于H2O2添加过程中的样本位移，此视频中的影像重启被延迟。线粒体已经开始明显聚集，并失去他们的膜潜力时，重新开始成像的时间0（相比之下，时间0在视频3）。治疗后无法迅速恢复成像将导致不准确和无法使用的结果，因为早期的实验效果将在成像前错过。白色=TMRE。每 15 秒拍摄一帧 20 分钟，视频为每秒 10 帧。请点击这里下载此视频。
Discussion
此协议可能是一个有用的补充，作为对由于卵巢解剖和组织孵化任何活成像实验的神器的控制。关键步骤与其他实时成像协议中的步骤类似。学习如何解剖整个 嗜血杆菌 卵巢需要实践：但是，使用适当的解剖工具通常可以相当快地学习此技能。更难掌握的是切除包围卵巢的肌肉和每个卵巢13。必须这样做，以确保肌肉收缩不会干扰图像采集。如果使用锋利的钨针做到这一点并不成功，在卵巢尖端的细菌可以抓住钳子和卵巢从肌肉护套拉。然而，如果要检查最早的发展阶段，这种技术是有问题的，因为它们可能会损坏。另一个关键步骤是不要在添加H2O2时将放在菜底的卵巢移除。另一个重要方面是所有现场成像共享：研究人员应确保在治疗前对兴趣结构进行荧光良好的标记。这里使用的菜肴（材料表）通常用于现场成像：但是，只要可以覆盖介质的掉落以防止介质蒸发，任何底部有玻璃盖片的碟子或滑动，甚至大玻璃盖片都应该有效。当我们使用特定显微镜时，任何具有足够放大目标的倒置显微镜，以查看所涉及的亚细胞结构以及具有足够分辨率和图像捕获速率的附加摄像机，都应有效。
虽然我们的实验室主要对线粒体功能感兴趣，但这种方法可能有助于检查任何亚细胞结构或细胞器的动态和定位，如细胞核、细胞骨骼或内质视网膜。但是，此方法有局限性。为了添加过氧化氢，组织必须在水介质中。活体成像的另一种方法是使用卤碳油，它有助于描述果蝇卵巢中的许多重要过程，包括GFP在模型生物体7，14中的动态运动的第一个例子。此外，在介质中添加过氧化氢会导致广泛传播的氧化损伤，这可能过于普遍，对组织造成侮辱，无法为感兴趣的细胞过程提供信息，尤其是对于研究发育的较长实验而言。虽然由于这种快速、广泛和可能不可逆转的氧化损伤，进行需要长时间可视化细胞的实验可能不可行，但我们已经看到，我们描述的急性过氧化氢处理适用于卵母细胞生成的大多数阶段，因为我们能够在成像期间的大多数阶段看到相同的效果。鉴于协议成本低且易于使用，它可能是一种有用的损伤控制方法，在固定和抗体标记之前也可用作治疗。
在我们手中，H2O2 治疗模仿线粒体错位和 Clu 幸福粒子分散的变化，我们在各种 嗜血杆菌 突变体中看到。它还模仿了我们在实验室中学习解剖技术的新研究人员发现的结果。因此，这种方法清楚地表明，样品制备和一般细胞应力可导致线粒体错位和幸福颗粒的存在的意外和以前无法解释的变化。将这项技术向前推进，过氧化氢浓度可以使用更高或更低的浓度进行调节。如果使用较低的浓度来观察细胞效应，则通过将介质替换为"完全施耐德"，则压力表型可能是可逆的。不同的细胞应激剂，如氰化物m-叶绿素氢化物（CCCP）、砷酸盐或简单的热冲击，可能证明对其他细胞下结构的一般细胞应力有用。由于前体内组织的活体成像需要在不同的介质中手动操作和孵化，因此这种控制应该是一个有用的补充，以确保任何观测结果尽可能接近正常生理学。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢杰里米·斯密斯博士的成像支持和安·申克的插图，制作和摄像。这项工作得到了国家卫生研究院（1R01GM127938至R.T.C）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles - PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles - PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles - tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
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