Summary
Syftet med detta protokoll är att använda levande imaging för att visualisera effekterna av oxidativ skada på lokalisering och dynamik av subcellulära strukturer i Drosophila äggstockar.
Abstract
Live imaging av Drosophila melanogaster äggstockar har varit avgörande för att förstå en mängd grundläggande cellulära processer under utveckling, inklusive ribonukleoprotein partikelrörelse, mRNA lokalisering, organelle rörelse och cytoskeletal dynamik. Det finns flera metoder för live imaging som har utvecklats. På grund av det faktum att varje metod innebär dissekering av enskilda ovarioler placerade i media eller halokarbonolja, kommer cellulära skador på grund av hypoxi och/eller fysisk manipulering oundvikligen att uppstå med tiden. En nedströms effekt av hypoxi är att öka oxidativ skada i cellerna. Syftet med detta protokoll är att använda levande imaging för att visualisera effekterna av oxidativ skada på lokalisering och dynamik av subcellulära strukturer i Drosophila äggstockar efter induktion av kontrollerade cellulära skador. Här använder vi väteperoxid för att inducera cellulära oxidativa skador och ge exempel på effekterna av sådana skador på två subcellulära strukturer, mitokondrier och Clu-lycksalighetspartiklar. Denna metod är dock tillämplig på alla subcellulära strukturer. Begränsningarna är att väteperoxid endast kan tillsättas vattenhaltiga medier och inte skulle fungera för avbildning som använder halokarbonolja. Fördelarna är att väteperoxid är lättillgängligt och billigt, verkar snabbt, dess koncentrationer kan moduleras och oxidativ skada är en bra approximation av skador orsakade av hypoxi samt allmän vävnadsskada på grund av manipulering.
Introduction
Flera olika cellulära stressfaktorer kan uppstå under experimentell kultur och manipulering av vävnader ex vivo, inklusive värmechock, oxidativ stress, osmotisk stress, näringsstress och toxicitetsförhållanden. Live imaging är ett kraftfullt verktyg som används för att visualisera realtidsförändringar i ex vivo-vävnader efter experimentell behandling och manipulering. Fina vävnadsavvektioner och manipulering övar, och tiden från dissekering till avbildning kan variera beroende på erfarenhet. Motiveringen för att utveckla denna metod bygger på oron för att beredning av vävnad för levande avbildning kan orsaka cellulär stress under dissekering och bildberedning. Detta kan vara särskilt problematiskt för processer som är känsliga för förändringar i cellulär metabolism och tillgängliga syrenivåer, såsom mitokondriell funktion. Även om ett parallellt vildtypsprov är en viktig kontroll, finns det fortfarande möjlighet att vissa eller alla observerade förändringar i subcellulära strukturer kan bero på skador eller cellstress från dissekering och inte återspeglar normal fysiologi eller den behandling eller mutation som studeras.
För att ta itu med detta potentiella problem använder vi väteperoxid addition under levande avbildning för att inducera cellulära oxidativ skada1. Syftet med denna metod är att inducera skador på vävnader för att övervaka effekten på subcellulära strukturer. Detta protokoll är användbart för två ändamål: 1) att avgöra om förändringar i subcellulär lokalisering av intressestrukturen beror på den stress som orsakas av oerfaren dissekering och 2) när forskaren är säker på de dissektionstekniker som beskrivs för att övervaka effekten av kontrollerad stress på intressestrukturen. Här visar vi två exempel på hur ökad oxidativ skada orsakar förändringar i två subcellulära strukturer, mitokondrier och Clu lycksalighetspartiklar. För att göra detta använder vi Drosophila äggstocken som är en vanlig modell för live imaging studier. Det första exemplet undersöker mitokondriell lokalisering. Enligt vår erfarenhet är normal mitokondriell lokalisering i kvinnliga könsceller mycket känslig för belastningar och kan fungera som en harbinger av cellulär stress. Mitokondrier i Drosophila kvinnliga könsceller är normalt jämnt spridda över hela cytoplasman2. Väteperoxid tillägg orsakar organellerna att snabbt fellokalisera och kluster på liknande sätt som olika mutationer3,4,5. Det andra exemplet är lycksaliga partiklar som bildas av Clueless (Clu). Clu är ett ribonukleoprotein som är diffust i hela cytoplasman; emellertid bildar det också mitokondrier-associerade partiklar under optimala cellulära förhållanden5. Eftersom närvaron av Clu-partiklar är beroende av friska cellulära förhållanden, har vi termerat dem "salighet" partiklar3,5,6. Tillsats av väteperoxid gör att dessa partiklar snabbt sprids och blir homogena i cytoplasman5. Under våra studier har vi observerat förändringar i lokalisering av båda dessa subcellulära strukturer, men först efter att ha utfört levande bildstudier kunde vi fullt ut uppskatta effekten av cellulär stress och oxidativ skada på lokalisering och dynamik av mitokondrier och salighetspartiklar.
Nyttan av detta protokoll som ett tillägg till redan etablerade eller alternativa metoder beror på flera faktorer. För det första måste avbildningsprotokollet vara mottagligt för läkemedelstillskott. Om provet är monterat under ett locklip och i halokarbonolja skulle denna metod inte vara möjlig7. H2O2 tillägg orsakar en snabb ökning av oxidativ skada, därför kanske denna tidsskala inte är lämplig. Oxidativ skada kan betraktas som en proxy för hypoxi; Det kan dock vara för hårt eller för generaliserat för att fungera som en lämplig kontroll för skador för vissa subcellulära komponenter. Slutligen, för bildexperiment som varar timmar som de som följer en utvecklingsprocess, kan H2O2-tillägget vara för starkt (till exempel8). Testning av en koncentrationskurva kan övervinna denna begränsning.
Protocol
1. Förberedelse av dissekerings- och bildavbildningsmedier
OBS: De medier som är bäst lämpade för detta levande bildexperiment innehåller Schneiders Drosophila-media som innehåller 15% värmeinaktiverat fetala nötkreatursserum, 0,6x Pen-Strep och 200 μg/mL bovininsulin, nedan kallat Complete Schneiders media.
- Utför mediepreparatet under sterila förhållanden för att säkerställa att det inte blir förorenat. Media utvecklades för att stödja Drosophila ovarioles under längre tidsperioder9.
- Tillsätt 15% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, 0,6x Pen-Strep och 200 μg/ml bovininsulin i Schneiders media.
- Blanda innehållet väl och förvara vid 4 °C över natten.
OBS: Insulin löses inte upp helt i Complete Schneiders media, och du kommer att märka en fällning bosätta sig i botten av röret. - Gör alikvoter av media, var noga med att lämna fällningen eftersom det kommer att störa avbildningen.
OBS: Denna lösning kan användas inom en månad om den förvaras i alikvoter vid 4 °C.
2. Insamling av Drosophila för dissekering
OBS: Detaljerade Drosophila insamlings- och dissekeringsförfaranden kan också hittas i Weil et al.10 och Parker et al.11.
- För optimal kvinnlig bakteriecellsavbildning, förbered först en flaska som innehåller standard majsmjölflugamat och en klick våtjästpasta som är konsistensen av jordnötssmör. Detta säkerställer att de kvinnliga flugorna är välmatade och kommer att producera alla follikelutvecklingsstadier för avbildning.
- För optimalt friska flugor, samla 0-1 dag gamla honor och överför med män till en flyga matflaska som innehåller våt jästpasta.
OBS: Se till att de sovande flugorna inte kommer i kontakt med jästpasta eftersom de kan hålla fast vid den. - Mata flugorna 3-7 dagar, ändra injektionsflaskan och jästpasta dagligen.
OBS: Se till att jästpastan kommer i kontakt med flugmaten så att den inte torkar ut.
3. Drosophila äggstock dissekering
OBS: Det är viktigt att förbereda medielösningarna färska eftersom väteperoxid är mottagligt för oxidation och TMRE bryts ned med tiden.
- Precis före dissekering, i Complete Schneiders media, bereda en ny alikvot på 2 μM H2O2-lösning, en färsk alikvot på 46 nM tetrametylramhodamin, etylester (TMRE) och en färsk alikvot på en 46 nM TMRE-lösning som innehåller 2 μM H2O2.
- För ägglossning, använd två par fina tångar och ett par elektrolytiskt slipade volframnålar12. För att dissekera äggstockarna, fyll 2-3 brunnar av en glasbotten dissekerande skål (urglas) med Complete Schneiders som har värmts till rumstemperatur.
- Bedöva flaskan av gödda flugor med koldioxid och separera önskat antal kvinnliga flugor som ska dissekeras. Placera en enda fluga i mediet med tång.
- Under ett dissekerande mikroskop, ta försiktigt tag i flugan vid bröstkorgen med ett par fina tångar. Med det andra paret tångar, ta tag i den bakre och dra försiktigt för att ta bort äggstockarna.
OBS: Om äggstockarna inte kommer ut smidigt med denna metod kan hela buken också avlägsnas från flugan, och äggstockarna kan försiktigt pressas ut ur vardera änden av buken med tång. - Ta bort eventuell främmande nagelband eller vävnad och överför sedan äggstockarna till en ny brunn som innehåller färska medier. Äggstockarna bör fortfarande röra sig från den omgivande muskelsenan.
4. Förbereda ovarioler för avbildning
- Använd slipade volframnålar, reta försiktigt ovariolerna isär, var noga med att ta bort den omgivande muskelsylten (Figur 1).
- Reta försiktigt bort alla muskelsyror och nervfibrer som är fästa vid de isolerade ovariolerna (figur 2).
OBS: Om muskelsenath inte tas bort, kommer ovariolen att rycka och röra sig, vilket orsakar problem med bildförvärv (Video 1). - Om de subcellulära strukturerna av intresse är endogent märkta, fortsätt till steg 4.4. Om intressestrukturerna kommer att märkas med ett fluorescerande färgämne, fortsätt till avsnitt 5.
- När ovariolerna har dissekerats rent, med hjälp av en mikropipett, överför de dem i en 100 μL droppe Complete Schneiders bildmedier till glasdepressionen i en glasbottenfat. De enskilda ovariolerna sjunker till botten av droppen.
- Fortsätt till avsnitt 6 för avbildning.
OBS: För avbildning av mitokondrier och Clu-lycksalighetspartiklar bör högst fem-tio minuter gå från början av dissekeringen till avbildningen.
5. Färgning av mitokondrier med TMRE
OBS: Ytterligare detaljerade procedurer för levande färgning av mitokondrier med fluorescerande färgämnen finns i Parker et al. 2017.
- Efter steg 4.3, överför de isolerade ovariolerna i en 100 μL droppe av 46 nM TMRE-media till glasdepressionen av en glasbottenform. De enskilda ovariolerna sjunker till botten av droppen.
- Inkubera i rumstemperatur i 20 minuter. Placera locket på skålen med glasbotten och placera skålen i en täckt låda under hela experimentet för att skydda mot ljus.
OBS: Efter inkubation kan prover avbildas direkt utan tvättar. - Upprepa steg 5.1-5.2 för att förbereda minst två rätter TMRE-märkta ovarioler, en för att fungera som en experimentell grupp och en för att fungera som en kontroll.
6. Live-bildförvärv
- När ovariolerna är monterade placerar du en av glasbottenfaten på mikroskopet och konfigurerar avbildningsparametrarna efter behov. De optimala excitations-/emissionsvåglängderna för TMRE som används här är 549 nm/574 nm.
- Efter att ha lokaliserat önskat synfält, skaffa stillbilder eller korta videor av en eller flera ovarioler efter önskemål som en post över pre-treatment villkor.
7. Tillsats av väteperoxid vid avbildning
- Pausa levande avbildning, ta bort locket från glasbottenformen och tillsätt försiktigt 100 μL 2 μM H2O2-lösning i skålen med hjälp av en mikropipett om du avbildar endogent märkta strukturer. Om du avbildning av mitokondrier, tillsätt försiktigt 100 μL 46 nM TMRE med 2 μM H2O2-lösning i skålen med en mikropipett (Video 2).
- Undvik att bryta ytan på den befintliga mediedroppar eller tillsätt lösningen för snabbt för att inte förskjuta ovariolerna som vilar på botten av skålen (Video 2).
- Byt ut disklocket (disklocket), flytta och fokusera om önskat synfält om det behövs och återuppta avbildningen(Video 3, Video 4, Bild 3, Bild 4).
- Var noga med att återuppta avbildningen så snabbt som möjligt efter H2O2-tillägg eftersom den experimentella behandlingen är tidskänslig (Video 5).
- Skaffa stillbilder eller korta videor av en eller flera ovarioler efter önskemål. Detta kommer att fungera som ett register över efterbehandlingsförhållanden.
- För kontrollen, placera den andra glasbottenformen på mikroskopet och upprepa avsnitt 6.
- Upprepa steg 7.1, den här gången lägger du till 100 μL TMRE-endast media till skålen. Om du avbildar endogent märkta strukturer, tillsätt 100 μL av Complete Schneiders medialösning.
- Upprepa steg 7.2 och 7.3 för att hämta data för kontrollgruppen.
OBS: För avbildning av mitokondrier och Clu-lycksalighetspartiklar bör högst tre-fem minuter gå från tillsats av väteperoxid till avbildning.
Representative Results
De beskrivna protokollen kan användas för att studera effekterna av väteperoxid under levande avbildning av Drosophila äggstockar. Som visas i figur 3, figur 4 , video 3 och video 4, ger denna procedur ett effektivt sätt att visualisera vävnadsförändringar och dynamikefter experimentell behandling i realtid. Viktigt är att detta protokoll är specifikt för tillsats av H2O2 till ovarioler vid avbildning. Det kan dock anpassas för exogen tillsats av andra läkemedel eller reagenser av intresse. Dessutom kan folliklar märkas med fluorescerande färgämnen av intresse (t.ex. tetramethylrhodamine (TMRE), LysoTracker) före avbildning (Video 3). De mest kritiska stegen för att få tydliga bildresultat är 1) korrekt dissekering och isolering av enstaka ovarioler med alla kontraktila element borttagna (figur 1 och figur 2) och 2) den hastighet med vilken avbildning startas om efter väteperoxid addition. Video 4 är en illustration av en korrekt dissekerad follikel som förblir stabil under hela bildbehandlingstiden jämfört med video 1, vilket illustrerar en dåligt dissekerad follikel som lämnar synfältet under bildbehandling. Video 5 är en illustration där H2O2-effekterna på TMRE-märkta mitokondrier redan har utvecklats innan avbildningen börjar på grund av för lång tid. Jämfört med video 3 där avbildning startades om omedelbart efter väteperoxid addition (tid 0) och intakta, spridda mitokondrier är fortfarande synliga, mitokondrierna i video 5 har redan börjat synligt klumpa ihop sig och förlora sin membran potential vid omstart av bildbehandling. Det här problemet beror främst på avbrott i provpositionerna under H2O2-tillägget och kan lindras genom att följa tekniken för att hålla bildmedierna och provpositionen intakta (Video 2). Notera, i kontroll experiment utförs utan H2O2 läggs till media, mitokondrierna i folliklar förblir ordentligt spridda, och TMRE färgämne förblir bindning i mitokondrier.
Figur 1: Isolering av enstaka ovarioler från Drosophila äggstockar. (A) Tecknad film som anger ett par äggstockar, en enda ovariol (pil) med pelargonen vid spetsen (pilspetsen) och de två muskelsänglar som omger ovariolen (brun, epitelial) och äggstocken (brun, peritoneal). B)Dissekerad Drosophila äggstock. C)Efterföljande separation av den retade äggstocken till enskilda ovarioler (pil). Skalbar = 100 um. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Avlägsnande av nervfibrer och kontraktila element från enstaka ovarioler. (A) Enkel ovariol med rester av nervvävnad och muskelsenathen fortfarande fastsatt (pil). B)Försiktigt avlägsnande av all återstående vävnad som är fäst vid ovariol i A (pil). Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: H2O2 orsakar mitokondriell fellokalisering. Tillägg av H2O2 orsakar mitokondrier att klumpa ihop sig under avbildningstiden. TMRE-märkning av mitokondrier indikerar att mitokondrier först sprids vid tidpunkt 0 (A), och att mitokondrier börjar klumpa ihop sig efter H2O2-tillägg (A′) Vid en senare tidpunkt blir TMRE-märkningen fläckig på grund av att mitokondrier förlorar sin membranpotential och därmed deras förmåga att binda färgämnet (A"). Vit = TMRE (A-A"). Skalstänger: 10 μm i (A) för A-A"5. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:H2O2 sprider Clu. A-A) Live-bild stillbilder av en välmatad cluCA06604 follikel. Tillsats av H2O2 gör att partiklar sprids och blir homogena i cytoplasman under avbildningstiden. Vit = Clu::GFP (A-A"). Skalstång: 40 μm i (A) för A-A"5. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Follikel från en cluCA06604 kvinna. Som beskrivs i figur 2kommer underlåtenhet att ta bort nervfiberkontraktilelement från enstaka ovarioler att orsaka markant drifting och rörelse av ovariolerna under avbildning och efterföljande oförmåga att analysera bilddata. Vit = Clu::GFP. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: Korrekt tillsats av H2O2 till provskålen. Väteperoxid bör tillsättas till provfatet med hjälp av en mikropipett av lämplig storlek. Dispensering H2O2 utan att bryta medieytan. Försiktighet vidtas för att undvika att bryta avbildningsmediets yta för att minimera provdrift under väteperoxid tillsats. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 3: H2O2 tillsats vid avbildning av TMRE-märkta folliklar. Follikel från en cluCA06604 hona färgas med TMRE. H2O2 orsakar mitokondriell fellokalisering i Drosophila folliklar. Vit = TMRE färgämne. Bildbild en bildruta per 15 s i 20 min, och videon är 10 bilder per sekund5. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 4: H2O2 tillägg under bildbehandling av Clu::GFP folliklar. Follikel från en cluCA06604 kvinna. H2O2 sprider Clu-partiklar enligt beskrivningen i figur 4. Vit = Clu::GFP. Bildbild en bildruta per 15 s i 15 min och videon är 10 bilder per sekund. 5 Klickahär för att ladda ner den här videon.
Video 5: Fördröjd bildbehandling efter H2O2 tillägg. Follikel från en cluCA06604 kvinna. Tillsats av väteperoxid till folliklar är en tidskänslig behandling. Omstarten av bildbehandling försenades i denna video till följd av provförskjutning under H2O2 tillägg. Mitokondrierna har redan börjat klumpa ihop sig synligt och förlora sin membranpotential vid omstart av avbildning vid tidpunkten 0 (jämfört med tid 0 i video 3). Underlåtenhet att återuppta avbildningen snabbt efter behandlingen kommer att resultera i felaktiga och oanvändbara resultat eftersom de tidiga experimentella effekterna kommer att missas före avbildning. Vit = TMRE. Bildbild en bildruta per 15 s i 20 min och videon är 10 bilder per sekund. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Detta protokoll kan vara ett användbart tillägg som en kontroll för artefakter på grund av äggstocksavledning och vävnad inkubation för alla levande imaging experiment. De kritiska stegen liknar de som finns för andra live imaging-protokoll. Att lära sig att dissekera hela Drosophila äggstockar kräver övning; Denna färdighet kan dock vanligtvis läras ganska snabbt med lämpliga dissektionsverktyg. Svårare att behärska är att ta bort muskeln som omsluter äggstockarna och varje ovariol13. Detta måste göras för att säkerställa att muskelkontraktioner inte stör bildförvärvet. Om det inte visar sig framgångsrikt att använda slipade volframnålar för att göra detta, kan pelargonen vid ovariolspetsen gripas med tång och ovariolen dras från muskelsenan. Denna teknik är dock problematisk om de tidigaste utvecklingsstadierna ska undersökas eftersom de kan skadas. Ett annat viktigt steg är att inte lossa ovariolerna som vilar på botten av skålen när du lägger till H2O2. En annan viktig aspekt delas av all live imaging: forskaren bör se till att intressestrukturen är fluorescerande välmärkt före behandling. De rätter som används här (Table of Materials) används ofta för live imaging; Varje skål eller rutschkana med ett glaslock på botten eller till och med ett stort glaslock bör dock fungera så länge mediedroppe kan täckas för att förhindra avdunstning av media. Medan vi använder ett visst mikroskop bör alla inverterade mikroskop med ett mål om tillräcklig förstoring för att se den subcellulära strukturen i fråga och en ansluten kamera som har tillräcklig upplösning och bildinspelningshastighet fungera.
Medan vårt laboratorium främst är intresserade av mitokondriell funktion, kan denna metod vara till hjälp undersöka dynamiken och lokaliseringen av någon subcellulär struktur eller organell, såsom kärnan, cytoskeletonen eller endoplasma retikulum. Denna metod har dock begränsningar. För att tillsätta väteperoxid måste vävnaden vara i ett vattenhaltigt medium. En alternativ metod för levande avbildning är att använda halokarbonolja, som har varit avgörande för att beskriva många viktiga processer i Drosophila ovarioles inklusive det första exemplet på dynamisk rörelse av GFP i en modellorganism7,14. Dessutom orsakar tillsats av väteperoxid till media omfattande oxidativ skada som kan vara en alltför allmän förolämpning mot vävnaden för att vara informativ för den cellulära processen av intresse, särskilt för längre experiment som undersöker utveckling. Även om det kanske inte är möjligt att utföra experiment som kräver visualisering av cellen under långa tidsperioder på grund av denna snabba, omfattande och sannolikt irreversibla oxidativa skada, har vi sett att den akuta väteperoxidbehandlingen vi har beskrivit är tillämplig på de flesta stadier av oogenes eftersom vi kan se samma effekter i de flesta steg inom bildperioden. Med tanke på protokollets låga kostnad och lätthet kan det vara en användbar kontroll för skador och kan också användas som behandling före fixering och antikroppsmärkning.
I våra händer efterliknar H2O2 behandling förändringarna i mitokondriell fellokalisering och Clu bliss partikel dispersion som vi ser i olika Drosophila mutanter. Det efterliknar också resultat som vi ser för nya forskare i labbinlärningsdisektionstekniken. Därför visade denna metod tydligt att provberedning och allmän cellulär stress kan leda till oväntade och tidigare oförklarliga förändringar av mitokondriell fellokalisering och förekomsten av lycksalighetspartiklar. För att föra denna teknik framåt kan väteperoxidkoncentrationer moduleras med en högre eller lägre koncentration. Om en cellulär effekt ses med en lägre koncentration är det möjligt att stress fenotypen kan vara reversibel genom att ersätta mediet med Complete Schneiders. Olika cellstressfaktorer som karbonylcyanid m-klorfenylhydrazon (CCCP), arsenit eller enkel värmechock kan visa sig vara användbara för allmän cellulär stress för andra subcellulära strukturer. Eftersom levande avbildning av ex vivo vävnader kräver manuell manipulering och inkubation i olika medier, bör denna kontroll vara ett användbart tillägg för att säkerställa att eventuella observationer är så nära normal fysiologi som möjligt.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Jeremy Smyth för bildstöd och Ann C. Shenk för illustrationer, produktion och videografi. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (1R01GM127938 till R.T.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles - PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles - PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles - tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
