Developmental Biology

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

Published: April 10, 2021 doi: 10.3791/62157

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Uniformed Services University

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בהדמיה חיה כדי לדמיין את ההשפעות של נזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של מבנים תת תאיים בשחלות Drosophila.

Abstract

הדמיה חיה של שחלות Drosophila melanogaster סייעה בהבנת מגוון תהליכים תאיים בסיסיים במהלך הפיתוח, כולל תנועת חלקיקי ריבונוקלאופרוטאין, לוקליזציה של mRNA, תנועת ארגון ודינמיקה ציטוסלטלית. קיימות מספר שיטות להדמיה חיה שפותחו. בשל העובדה כי כל שיטה כרוכה בניתוח ovarioles בודדים להציב מדיה או שמן halocarbon, נזק הסלולר עקב היפוקסיה ו / או מניפולציה פיזית בהכרח יתרחש לאורך זמן. השפעה אחת במורד הזרם של היפוקסיה היא להגדיל את הנזק החמצוני בתאים. מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בהדמיה חיה כדי לדמיין את ההשפעות של נזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של מבנים תת תאיים בשחלות Drosophila לאחר אינדוקציה של נזק תאי מבוקר. כאן, אנו משתמשים במי חמצן כדי לגרום נזק חמצוני הסלולר ולתת דוגמאות של ההשפעות של נזק כזה על שני מבנים תת תאיים, מיטוכונדריה ו Clu bliss חלקיקים. עם זאת, שיטה זו ישימה לכל מבנה תת-תאי. המגבלות הן כי מי חמצן ניתן להוסיף רק למדיה מימית ולא יעבוד עבור הדמיה המשתמשת בשמן halocarbon. היתרונות הם כי מי חמצן זמין וזול, פועל במהירות, הריכוזים שלה ניתן לווסת, נזק חמצוני הוא קירוב טוב של נזק שנגרם על ידי היפוקסיה, כמו גם נזק כללי לרקמות עקב מניפולציה.

Introduction

גורמי לחץ תאיים שונים רבים עשויים להתעורר במהלך התרבות הניסיונית ומניפולציה של רקמות ex vivo, כולל הלם חום, מתח חמצוני, מתח אוסמוטי, מתח תזונתי, ותנאי רעילות. הדמיה חיה היא כלי רב עוצמה המשמש לדמיין שינויים בזמן אמת ברקמות ex vivo לאחר טיפול ניסיוני ומניפולציה. ניתוחי רקמות עדינים ומניפולציה דורשים תרגול, וכמות הזמן מניתוח להדמיה יכולה להשתנות בהתאם לניסיון. הרציונל לפיתוח שיטה זו מבוסס על החשש כי הכנת רקמה להדמיה חיה עלולה לגרום ללחץ תאי במהלך ניתוח והכנת הדמיה. זה יכול להיות בעייתי במיוחד עבור תהליכים רגישים לשינויים בחילוף החומרים הסלולר ורמות החמצן הזמינות, כגון תפקוד המיטוכונדריה. בעוד שיש מדגם סוג פראי מקביל הוא שליטה חשובה, עדיין קיימת האפשרות כי חלק או כל השינויים שנצפו במבנים תת תאיים יכול להיות בגלל נזק או מתח התא מניתוק ואינם משקפים פיזיולוגיה נורמלית או טיפול או מוטציה הנחקרים.

כדי לטפל בבעיה פוטנציאלית זו, אנו משתמשים בתוספת מי חמצן במהלך הדמיה חיה על מנת לגרום נזק חמצוני הסלולר¹. מטרת שיטה זו היא לגרום נזק לרקמות על מנת לפקח על ההשפעה על מבנים תת תאיים. פרוטוקול זה שימושי לשתי מטרות: 1) הקובע אם שינויים בלוקליזציה תת-תאית של מבנה העניין נובעים מהלחץ שנגרם על ידי ניתוח לא מנוסה ו -2) ברגע שהמתו החוקר בטוח בטכניקות הניתוח המתוארות כדי לפקח על השפעת הלחץ המבוקר על מבנה העניין. כאן אנו מראים שתי דוגמאות של איך נזק חמצוני מוגבר גורם לשינויים בשני מבנים תת תאיים, מיטוכונדריה וחלקיקי אושר קלו. כדי לעשות זאת, אנו משתמשים בשחלת דרוזופילה שהיא מודל נפוץ למחקרי הדמיה חיה. הדוגמה הראשונה בוחנת לוקליזציה מיטוכונדרית. מניסיוננו, לוקליזציה מיטוכונדרית נורמלית בתאי נבט נקבה רגישה מאוד להפרעות ויכולה לשמש כמבשרת של מתח תאי. המיטוכונדריה בתאי הנבט הנשיים של דרוזופילה מפוזרים בדרך כלל באופן שווה לאורך הציטופלסמה². תוספת מי חמצן גורמת אברונים במהירות mislocalize ו cluster באופן דומה מוטציות שונות³^,⁴^,⁵. הדוגמה השנייה היא חלקיקי אושר שנוצרו על ידי Clueless (קלו). קלו הוא ריבונוקלאופרוטאין מפוזר לאורך הציטופלסמה; עם זאת, הוא גם יוצר חלקיקים הקשורים המיטוכונדריה בתנאים תאיים אופטימליים⁵. מכיוון שנוכחותם של חלקיקי קלו תלויה בתנאים תאיים בריאים, כינו אותם חלקיקי "אושר"³^,⁵^,⁶. תוספת של מי חמצן גורמת לחלקיקים אלה להתפזר במהירות ולהיות הומוגניים בציטופלסמה⁵. במהלך המחקרים שלנו, ראינו שינויים בלוקליזציה של שני מבנים תת-תאיים אלה, אך רק לאחר ביצוע מחקרי הדמיה חיים נוכל להעריך באופן מלא את ההשפעה של מתח תאי ונזק חמצוני על לוקליזציה ודינמיקה של חלקיקי מיטוכונדריה ואושר.

התועלת של פרוטוקול זה כתוספת לשיטות שכבר הוקמו או חלופיות תלויה במספר גורמים. ראשית, פרוטוקול ההדמיה חייב להיות נוח לתוספת סמים. אם המדגם מותקן תחת כריכה ובשמן הלוקרבון, שיטה זו לא תהיה אפשרית⁷. H₂O 2 תוספת_גורמת לעלייה מהירה בנזק חמצוני, ולכן, ציר זמן זה לא יכול להיות מתאים. נזק חמצוני עשוי להיחשב פרוקסי עבור היפוקסיה; עם זאת, זה עשוי להיות קשה מדי או כללי מדי לתפקד כפקד מתאים לנזק עבור רכיבים תת תאיים מסוימים. לבסוף, עבור ניסויי הדמיה שנמשכים שעות כגון אלה הבאים_תהליךהתפתחותי, תוספת H 2 O₂ עשוי להיות חזק מדי (למשל⁸). בדיקת עקומת ריכוז עשויה להתגבר על מגבלה זו.

Protocol

1. הכנת מדיית ניתוח והדמיה

הערה: המדיה המתאימה ביותר לניסוי הדמיה חיה זה מכילה את המדיה Drosophila של שניידר המכילה 15% חום מומת סרום שור עוברי, 0.6x עט סטרפטוקוקוס, ו 200 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין שור, להלן המכונה המדיה של שניידר שלם.

בצע את ההכנה התקשורתית בתנאים סטריליים כדי להבטיח שהיא לא תזוהם. התקשורת פותחה כדי לתמוך Drosophila ovarioles לתקופות ממושכות של זמן⁹.
הוסיפו 15% סרום שור עוברי מומת בחום, 0.6x Pen-Strep ואינסולין בקר 200 מיקרוגרם/מ"ל למדיה של שניידר.
מערבבים היטב את התוכן ומאחסנים ב 4 מעלות צלזיוס לילה.
הערה: האינסולין אינו מתמוסס לחלוטין במדיה המלאה של שניידר, ותבחינו במשקע המתיישב בתחתית הצינור.
הפוך aliquots של התקשורת, להיות בטוח לעזוב את המשקעים כפי שהוא יפריע הדמיה.
הערה: פתרון זה עשוי לשמש בתוך חודש אם מאוחסן aliquots ב 4 °C (69 °F).

2. אוסף דרוזופילה לניתוח

הערה: ניתן למצוא גם נהלי איסוף וניתוק מפורטים של Drosophila בוייל ואח^'10 ופרקר ואח^'11.

להדמיה אופטימלית של תאי נבט נשיים, הכינו תחילה בקבוקון המכיל מזון זבוב קמח תירס סטנדרטי וקצת משחת שמרים רטובה שהיא עקביות של חמאת בוטנים. פעולה זו מבטיחה שהזבובים הנשיים יוזנו היטב וייצרו את כל שלבי התפתחות הזקיק להדמיה.
עבור זבובים בריאים אופטימלית, לאסוף נקבות 0-1 יום והעברה עם זכרים לתוך בקבוקון מזון זבוב המכיל הדבק שמרים רטובים.
הערה: ודא זבובים ישנים לא ליצור קשר עם הדבק שמרים כפי שהם יכולים לדבוק בו.
להאכיל את הזבובים 3-7 ימים, שינוי הבקבוקון ואת הדבק שמרים מדי יום.
הערה: ודא את הדבק שמרים קשר מזון לטוס כך שהוא לא להתייבש.

3. ניתוח שחלות דרוזופילה

הערה: חשוב להכין את פתרונות המדיה טריים כי מי חמצן רגישים חמצון TMRE משפיל לאורך זמן.

ממש לפני הניתוח, במדיה של שלם שניידר, להכין aliquot טרי של 2 μM H₂O₂פתרון, aliquot טרי של 46 nM tetramethylrhodamine, אתיל אסתר (TMRE), ו aliquot טרי של פתרון 46 nM TMRE המכיל 2 מיקרומטר H₂O_2.
לניתוח השחלות, השתמשו בשני זוגות מלקחיים עדינים וזוג מחטי טונגסטן מחודדות אלקטרוליטיות¹². כדי לנתח את השחלות, מלאו 2-3 בארות של צלחת ניתוח תחתית זכוכית (זכוכית שעון) עם שלם שניידר שהתחמם לטמפרטורת החדר.
הרדמה של בקבוקון של זבובים משומנים עם פחמן דו חמצני ולהפריד את המספר הרצוי של זבובים נקבה להיות מנותח. מקם זבוב בודד במדיה באמצעות מלקחיים.
תחת מיקרוסקופ מנתח, בעדינות לתפוס את הזבוב על ידי בית החזה באמצעות זוג אחד של מלקחיים עדינים. עם זוג מלקחיים אחרים, לתפוס את האחורי, בעדינות למשוך כדי להסיר את השחלות.
הערה: אם השחלות אינן יוצאות בצורה חלקה בשיטה זו, ניתן גם להסיר את הבטן כולה מהעף, ואת השחלות ניתן לסחוט בעדינות משני קצה הבטן באמצעות מלקחיים.
הסר כל קוטיקולה או רקמה חוץ גופית, ולאחר מכן להעביר את השחלות לבאר חדשה המכילה מדיה טרייה. השחלות עדיין צריכות לנוע ממעטפת השרירים שמסביב.

4. הכנת אובריול להדמיה

באמצעות מחטי טונגסטן מחודדות, להקניט בעדינות את ovarioles לגזרים, מקפיד להסיר את נדן השריר שמסביב (איור 1).
להקניט בעדינות את כל נדן השרירים וסיבי העצב המחוברים לאובריולס המבודדים(איור 2).
הערה: אם נדן השריר אינו מוסר, ovariole יהיה עווית ולזוז, גרימת בעיות עם רכישת תמונה (וידאו 1).
אם המבנים התת-תאיים בעלי העניין מסומנים באופן אנדוגני, המשך לשלב 4.4. אם מבני העניין יסומנו בצבע פלואורסצנטי, המשך לסעיף 5.
לאחר ovarioles כבר נותחו בצורה נקייה, באמצעות micropipette, להעביר אותם טיפה 100 μL של מדיה הדמיה של מלא שניידר לתוך דיכאון זכוכית של צלחת תחתית זכוכית. ovarioles בודדים ישקע לתחתית הטרופ.
המשך לסעיף 6 להדמיה.
הערה: להדמיית חלקיקי מיטוכונדריה וקלו, לא יותר מחמש-עשר דקות אמורות לחלוף מתחילת הניתוח ועד להדמיה.

5. מיטוכונדריה מכתימה עם TMRE

הערה: נהלים מפורטים נוספים על כתמים חיים של המיטוכונדריה עם צבעים פלואורסצנטיים ניתן למצוא פארקר ואח '. 2017.

לאחר שלב 4.3, להעביר את ovarioles מבודד טיפה 100 μL של 46 nM TMRE מדיה לתוך דיכאון זכוכית של צלחת תחתית זכוכית. ovarioles בודדים ישקע לתחתית הטרופ.
דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. מניחים את המכסה על צלחת תחתית הזכוכית ומניחים את המנה בקופסה מכוסה למשך הניסוי כדי להגן מפני אור.
הערה: לאחר הדגירה, ניתן לדמיין דגימות ישירות ללא שטיפות.
חזור על שלבים 5.1-5.2 כדי להכין לפחות שתי מנות של ovarioles שכותרתו TMRE, אחד לשמש כקבוצה ניסיונית ואחד לשמש שליטה.

6. רכישת תמונה חיה

לאחר ovarioles מותקן, מניחים את אחת הכלים התחתונים זכוכית על המיקרוסקופ ולהגדיר את הפרמטרים הדמיה לפי הצורך. אורכי הגל האופטימליים של עירור/פליטה עבור TMRE המשמשים כאן הם 549 ננומטר/574 ננומטר.
לאחר איתור שדה הראייה הרצוי, לרכוש תמונות סטילס או קטעי וידאו קצרים של ovarioles אחד או יותר לפי הצורך כמו תיעוד של תנאים טרום טיפול.

7. תוספת של מי חמצן במהלך ההדמיה

השהה הדמיה חיה, הסר את המכסה מהתבנית התחתונה של הזכוכית, והוסף בזהירות 100 μL של 2 μM H₂O₂פתרון לצלחת באמצעות micropipette אם הדמיה מבנים מסומנים אנדוגני. אם הדמיה המיטוכונדריה, בזהירות להוסיף 100 μL של 46 nM TMRE עם 2 μM H₂O₂פתרון לצלחת באמצעות micropipette (וידאו 2).
1. הימנע משבירת פני השטח של טיפת המדיה הקיימת או הוספת הפתרון מהר מדי כדי לא לעקור את ovarioles נח על החלק התחתון של המנה (וידאו 2).
החליפו את מכסה המנה (כיסוי כלים), החליפו מחדש את שדה הראייה הרצוי ומיקדו אותו מחדש במידת הצורך, וחידשו את ההדמיה (וידאו 3, וידאו 4, איור 3, איור 4).
1. יש להקפיד לחדש את ההדמיה במהירות האפשרית לאחר תוספת H₂O₂מכיוון שהטיפול הניסיוני רגיש לזמן (וידאו 5).
לרכוש תמונות סטילס או קטעי וידאו קצרים של ovarioles אחד או יותר לפי הצורך. זה ישמש כתיעוד של תנאים שלאחר הטיפול.
לשליטה, מניחים את צלחת תחתית הזכוכית השנייה על המיקרוסקופ וחוזרים על סעיף 6.
חזור על שלב 7.1, הפעם הוספת 100 μL של מדיה TMRE בלבד למנה. אם דימות מבנים המסומנים באופן אנדוגני, הוסף 100 μL של פתרון המדיה בלבד של המלאי שניידר.
חזור על שלבים 7.2 ו- 7.3 כדי להשיג נתונים עבור קבוצת הביקורת.
הערה: להדמיית חלקיקי מיטוכונדריה וקלו, לא יותר משלוש-חמש דקות אמורות לחלוף מהתוספת של מי חמצן להדמיה.

Representative Results

הפרוטוקולים המתוארים יכולים לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של מי חמצן במהלך הדמיה חיה של שחלות Drosophila. כפי שמוצג באיור 3, איור 4, וידאו 3 ווידאו 4, הליך זה מספק אמצעי יעיל להמחשה של שינויים ברקמות ודינמיקה לאחר טיפול ניסיוני בזמן אמת. חשוב לציין, פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור תוספת של H₂O₂כדי ovarioles בעת הדמיה; עם זאת, זה עשוי להיות מותאם עבור תוספת אקסוגני של תרופות אחרות או ריאגנטים של עניין. בנוסף, זקיקים עשויים להיות מסומנים עם כל צבעים פלואורסצנטיים של עניין (למשל, tetramethylrhodamine (TMRE), LysoTracker) לפני ההדמיה (וידאו 3). השלבים הקריטיים ביותר להשגת תוצאות הדמיה ברורות הם 1) הניתוח והבידוד הנכונים של אובריולים בודדים עם כל האלמנטים המתכווצים שהוסרו(איור 1 ואיור 2) ו-2)המהירות שבה ההדמיה מופעלת מחדש לאחר תוספת מי חמצן. וידאו 4 הוא איור של זקיק מנותח כראוי שנשאר יציב לאורך כל משך ההדמיה בהשוואה לסרטון 1, הממחיש זקיק מנותח בצורה גרועה היוצא משדה הראייה במהלך ההדמיה. וידאו 5 הוא איור שבו ההשפעות H₂O₂על המיטוכונדריה שכותרתו TMRE כבר התקדמו לפני תחילת ההדמיה כתוצאה של זמן חולף מדי. בהשוואה וידאו 3 שבו ההדמיה הופעלה מחדש מיד לאחר תוספת מי חמצן (זמן 0) ושלמים, מיטוכונדריה מפוזרת עדיין גלויים, המיטוכונדריה בווידאו 5 כבר החלו להתקבץ באופן ניכר ולאבד את פוטנציאל הממברנה שלהם עם ההפעלה מחדש של ההדמיה. בעיה זו מיוחסת בעיקר שיבוש עמדות המדגם במהלך H₂O₂תוספת וניתן להקל על ידי ביצוע הטכניקה כדי לשמור על מדיה הדמיה ומיקום מדגם שלם (וידאו 2). יש לציין, בניסויי בקרה שבוצעו ללא H₂O_{2 הוסיף}לתקשורת, המיטוכונדריה בזקיקים נשאר מפוזר כראוי, ואת צבע TMRE נשאר מבודד המיטוכונדריה.

איור 1: בידוד של אובריולים בודדים מהשחלות של דרוסופילה. (A) קריקטורה המציינת זוג שחלות, אובריולה אחת (חץ) עם הגרמריום בקצה (ראש חץ) ושני נדן השרירים המקיפים את האובריולה (חום, אפיתל) והשחלה (חום, הצפק). (ב)ניתח את השחלה דרוזופילה. (ג)הפרדה עוקבת של השחלה הקניט לתוך ovarioles בודדים (חץ). סרגל קנה מידה = 100 אום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הסרת סיבי עצב ואלמנטים מתכווצים מאובריול יחיד. (A) אובריולה אחת עם שרידים של רקמת עצב ומעטפת השרירים עדיין מחוברת (חץ). (B)הסרה עדינה של כל הרקמות הנותרות המחוברות לאובריולה ב- A (חץ). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.

איור 3: H₂O_{2 גורם} לאי-לוקליזציה מיטוכונדרית. (A-A") תמונות סטילס של clu^CA06604 (Clu::GFP זבובים) זקיק. תוספת של H₂O_{2 גורמת} למיטוכונדריה להתקבץ לאורך זמן ההדמיה. תיוג TMRE של המיטוכונדריה מציין כי המיטוכונדריה מפוזרים בתחילה בזמן 0 (A), וכי המיטוכונדריה מתחילים להתקבץ לאחר H₂O₂ תוספת (A′) בנקודת זמן מאוחרת יותר, תיוג TMRE הופך ספוט עקב המיטוכונדריה לאבד את פוטנציאל הממברנה שלהם ולכן היכולת שלהם לבודד את הצבע (A"). לבן = TMRE(A-A").). סרגלי קנה מידה: 10 מיקרומטר ב (A) עבור A-A"⁵. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: H₂O₂ מפזר את קלו. (A-A") תמונות סטילס של זקיק קלו^CA06604 מוזן היטב. תוספת של H₂O_{2 גורמת} לחלקיקים להתפזר ולהיות הומוגניים בציטופלסמה לאורך זמן ההדמיה. לבן = Clu::GFP (A-A"). סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר ב (A) עבור A-A"⁵. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: זקיק מנקבת ^{קלו CA06604.} כפי שמתואר באיור 2, כישלון בהסרת סיבי עצב אלמנטים מתכווצים מאובריול יחיד יגרום לסחף ותנועה מסומנים של האובריולס במהלך ההדמיה וחוסר היכולת לנתח נתוני הדמיה. לבן = קלו::GFP. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 2: תוספת נכונה של H₂O₂ לדגום צלחת. מי חמצן יש להוסיף את צלחת המדגם באמצעות micropipette בגודל מתאים. מחלק H₂O₂ מבלי לשבור את משטח התקשורת. טיפול נלקח כדי למנוע שבירת פני השטח של מדיית ההדמיה כדי למזער את ה דגימת להיסחף במהלך תוספת מי חמצן. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 3: H₂O₂תוספת במהלך הדמיה של זקיקים שכותרתו TMRE. זקיק מנקבה קלו^CA06604 מוכתמת ב- TMRE. H₂O_{2 גורם} אי-תיאום מיטוכונדריאלי זקיקי דרוזופילה. לבן = צבע TMRE. תמונה מסגרת אחת לכל 15 שניות במשך 20 דקות, והסרטון הוא 10 מסגרות לשנייה⁵. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 4: H₂O₂ תוספת במהלך הדמיה של Clu::זקיקים GFP. זקיק מנקבת ^{קלו CA06604.} H₂O₂ מפזר חלקיקי קלו כמתואר באיור 4. לבן = קלו::GFP. תמונה מסגרת אחת לכל 15 שניות במשך 15 דקות, והסרטון הוא 10 מסגרות לשנייה. ⁵אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 5: הדמיה מושהית לאחר תוספת H₂O_2. זקיק מנקבת ^{קלו CA06604.} תוספת של מי חמצן לזקיקים היא טיפול רגיש לזמן. ההפעלה מחדש של ההדמיה התעכבה בסרטון זה כתוצאה מהעתקת מדגם במהלך תוספת H₂O_2. המיטוכונדריה כבר החלה להתקבץ באופן ניכר ולאבד את פוטנציאל הממברנה שלהם עם הפעלה מחדש של ההדמיה בזמן 0 (לעומת זמן 0 בסרטון 3). אי חידוש ההדמיה במהירות לאחר הטיפול יגרום לתוצאות לא מדויקות ובלתי שמיש שכן ההשפעות הניסיוניות המוקדמות יחסרו לפני ההדמיה. לבן = TMRE. תמונה מסגרת אחת לכל 15 שניות במשך 20 דקות, והסרטון הוא 10 מסגרות לשנייה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Discussion

פרוטוקול זה יכול להיות תוספת שימושית כפקד עבור חפצים עקב ניתוח השחלות ודגרת רקמות עבור כל ניסוי הדמיה חיה. השלבים הקריטיים דומים לאלה שנמצאו עבור פרוטוקולי הדמיה חיים אחרים. ללמוד כיצד לנתח שחלות Drosophila שלמות לוקח בפועל; עם זאת, מיומנות זו בדרך כלל ניתן ללמוד די מהר עם כלי הניתוח המתאימים. קשה יותר לשלוט הוא הסרת השריר עוטף את השחלות וכל ovariole¹³. יש לעשות זאת כדי להבטיח שהתכווצויות שרירים לא יפריעו לרכישת התמונה. אם באמצעות מחטי טונגסטן מחודד לעשות זאת אינו מוכיח מוצלח, germarium בקצה ovariole ניתן לתפוס עם מלקחיים ovariole משך מן נדן השריר. עם זאת, טכניקה זו היא בעייתית אם השלבים ההתפתחותיים המוקדמים ביותר ייבחנו כי הם יכולים להיפגע. צעד מפתח נוסף הוא לא לעקור את ovarioles נח על החלק התחתון של המנה בעת הוספת H₂O₂. היבט חשוב נוסף משותף לכל ההדמיה החיה: על החוקר לוודא שמבנה העניין מתויג היטב לפני הטיפול. המנות המשמשות כאן(שולחן החומרים)משמשות בדרך כלל להדמיה חיה; עם זאת, כל מנה או שקופית עם כיסוי זכוכית בתחתית או אפילו כיסוי זכוכית גדול צריך לעבוד כל עוד טיפת המדיה יכולה להיות מכוסה כדי למנוע אידוי מדיה. בעוד אנו משתמשים במיקרוסקופ מסוים, כל מיקרוסקופ הפוך עם מטרה של הגדלה מספקת כדי לראות את המבנה התת-תאי המדובר ומצלמה מחוברת בעלת רזולוציה מספקת וקצב לכידת תמונה אמורים לעבוד.

בעוד המעבדה שלנו מתעניינת בעיקר בתפקוד המיטוכונדריאלי, שיטה זו יכולה להיות מועילה בבחינת הדינמיקה והלוקליזציה של כל מבנה תת תאי או organelle, כגון הגרעין, ציטוסקלטון או רשתית אנדופלזמית. עם זאת, לשיטה זו יש מגבלות. על מנת להוסיף מי חמצן, הרקמה חייבת להיות במדיה מימית. שיטה חלופית להדמיה חיה היא להשתמש בשמן halocarbon, אשר סייע בתיאור תהליכים חשובים רבים ב Drosophila ovarioles כולל הדוגמה הראשונה של תנועה דינמית של GFP באורגניזם מודל⁷^,¹⁴. בנוסף, הוספת מי חמצן לתקשורת גורמת לנזק חמצוני רחב אשר עשוי להיות עלבון כללי מדי לרקמה כדי להיות אינפורמטיבי עבור תהליך הסלולר של עניין, במיוחד עבור ניסויים ארוכים יותר בוחן פיתוח. למרות שזה לא יכול להיות ריאלי לבצע ניסויים הדורשים לדמיין את התא על פני תקופות זמן ארוכות בשל זה נזק חמצוני מהיר, נרחב, וסביר להניח בלתי הפיך, ראינו כי טיפול מי חמצן חריף שתיארנו ישים ברוב שלבי oogenesis כפי שאנו מסוגלים לראות את אותן השפעות ברוב השלבים בתוך תקופת זמן ההדמיה. בהתחשב בעלות ובקלות הנמוכה של הפרוטוקול, זה עשוי להיות שליטה שימושית לנזק והוא יכול לשמש כטיפול לפני קיבעון ותיוג נוגדנים גם כן.

בידיים שלנו, טיפול H₂O₂ מחקה את השינויים ב mislocalization המיטוכונדריה ופיזור חלקיקי אושר Clu שאנו רואים מוטציות Drosophila שונים. זה גם מחקה תוצאות שאנו רואים עבור חוקרים חדשים בטכניקות ניתוח למידה במעבדה. לכן, שיטה זו חשפה בבירור כי הכנת מדגם ומתח תאי כללי יכול להוביל לשינויים בלתי צפויים ובלתי מוסברים בעבר mislocalization המיטוכונדריה ואת נוכחותם של חלקיקי אושר. הזזת טכניקה זו קדימה, ריכוזי מי חמצן יכול להיות מווסת באמצעות ריכוז גבוה או נמוך יותר. אם אפקט תאי נראה באמצעות ריכוז נמוך יותר, ייתכן כי פנוטיפ הלחץ עשוי להיות הפיך על ידי החלפת המדיה ב- Complete Schneider's. גורמי לחץ שונים של תאים כגון קרבוניל ציאניד m-כלורופניל הידראזון (CCCP), ארסניט או הלם חום פשוט עשויים להיות שימושיים ללחץ תאי כללי עבור מבנים תת-תאיים אחרים. מאז הדמיה חיה של רקמות ex vivo דורש מניפולציה ידנית דגירה במדיה שונה, שליטה זו צריכה להיות תוספת שימושית כדי להבטיח כל תצפיות קרובים לפיזיולוגיה נורמלית ככל האפשר.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לד"ר ג'רמי סמית על תמיכת ההדמיה ולאן סי שנק על האיורים, ההפקה והווידאוגרפיה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (1R01GM127938 כדי R.T.C.).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active dry yeast	Red Star®
CO₂ gas			99.9% purity
CO₂ pad
Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model	Nikon
Dissecting needles - PrecisionGlide needles	BD	305165	B-D 21G1 size
Dissecting needles - PrecisionGlide syringes	BD	309657	Luer-Lok tip, 3 mL size
Dissecting needles - tungsten wire	Electron Microscopy Sciences	73800
Dumont #5 forceps (2 pairs)	Fine Science Tools	11251-10
NI-150 High Intensity Illuminator	Nikon Instruments Inc.
Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Fisher Scientific	10082-147
Gibco Schneider's Drosophila Media	Sigma-Aldrich	21720-024
Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O	Sigma-Aldrich	H1009
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I6634
Spinning disk microscope	Nikon		Equivalent scopes may also be used
Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures	Fisher Scientific	17-602E
MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm	Fisher Scientific	NC9344527
Micropipettes and tips of appropiate size	Eppendorf
Microcentrifuge tubes, 1.7 mL	VWR	87003-294
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)	AnaSpec	AS-88061
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	5905	Wild-type flies
y w; clu[CA06604]		Available upon request.	Clu::GFP trap flies