Summary
Målet med denne protokollen er å bruke levende bildebehandling for å visualisere effekten av oksidativ skade på lokalisering og dynamikk av subcellulære strukturer i Drosophila eggstokkene.
Abstract
Levende avbildning av Drosophila melanogaster eggstokkene har vært medvirkende til å forstå en rekke grunnleggende cellulære prosesser under utvikling, inkludert ribonucleoprotein partikkelbevegelse, mRNA lokalisering, organellebevegelse og cytoskeletal dynamikk. Det finnes flere metoder for levende bildebehandling som er utviklet. På grunn av det faktum at hver metode innebærer dissekering individuelle ovarioles plassert i media eller halokarbonolje, cellulær skade på grunn av hypoksi og / eller fysisk manipulasjon vil uunngåelig oppstå over tid. En nedstrøms effekt av hypoksi er å øke oksidativ skade i cellene. Formålet med denne protokollen er å bruke levende bildebehandling for å visualisere effekten av oksidativ skade på lokalisering og dynamikk av subcellulære strukturer i Drosophila eggstokkene etter induksjon av kontrollert cellulær skade. Her bruker vi hydrogenperoksid for å indusere cellulær oksidativ skade og gi eksempler på effekten av slik skade på to subcellulære strukturer, mitokondrier og Clu bliss partikler. Denne metoden gjelder imidlertid for en hvilken som helst subcellulær struktur. Begrensningene er at hydrogenperoksid bare kan legges til vandige medier og ikke vil fungere for bildebehandling som bruker halokarbonolje. Fordelene er at hydrogenperoksid er lett tilgjengelig og billig, virker raskt, konsentrasjonene kan moduleres, og oksidativ skade er en god tilnærming av skade forårsaket av hypoksi samt generell vevsskade på grunn av manipulasjon.
Introduction
Flere forskjellige cellulære stressfaktorer kan oppstå under eksperimentell kultur og manipulering av vev ex vivo, inkludert varmesjokk, oksidativt stress, osmotisk stress, ernæringsmessige stress og toksisitetsforhold. Live imaging er et kraftig verktøy som brukes til å visualisere sanntidsendringer i ex vivo vev etter eksperimentell behandling og manipulasjon. Fine vevsdeksjoner og manipulasjon tar praksis, og tiden fra disseksjon til bildebehandling kan variere avhengig av erfaring. Begrunnelsen for å utvikle denne metoden er basert på bekymringen om at å forberede vev for levende avbildning kan forårsake cellulær stress under disseksjon og bildebehandlingspreparat. Dette kan være spesielt problematisk for prosesser som er følsomme for endringer i cellulær metabolisme og tilgjengelig oksygennivå, for eksempel mitokondriefunksjon. Mens å ha en parallell vill type prøve er en viktig kontroll, det er fortsatt mulighet for at noen eller alle observerte endringer i subcellulære strukturer kan skyldes skade eller celle stress fra disseksjon og reflekterer ikke normal fysiologi eller behandling eller mutasjon blir studert.
For å løse dette potensielle problemet bruker vi hydrogenperoksidtillegg under levende bildebehandling for å indusere cellulær oksidativ skade1. Formålet med denne metoden er å indusere skade på vev for å overvåke effekten på subcellulære strukturer. Denne protokollen er nyttig for to formål: 1) avgjøre om endringer i subcellulær lokalisering av strukturen av interesse skyldes stress forårsaket av uerfaren disseksjon og 2) når forskeren er trygg med disseksjon teknikker beskrevet for å overvåke effekten av kontrollert stress på strukturen av interesse. Her viser vi to eksempler på hvordan økt oksidativ skade forårsaker endringer i to subcellulære strukturer, mitokondrier og Clu bliss partikler. For å gjøre dette bruker vi Drosophila eggstokken som er en vanlig modell for levende bildebehandlingsstudier. Det første eksemplet undersøker mitokondrie lokalisering. Etter vår erfaring er normal mitokondrie lokalisering i kvinnelige bakterieceller svært følsomme for perturbasjoner og kan fungere som en harbinger av cellulær stress. Mitokondrier i Drosophila kvinnelige bakterieceller er normalt jevnt spredt over hele cytoplasma2. Hydrogenperoksid tillegg fører organeller å raskt feillokalisere og klynge på samme måte som ulike mutasjoner3,4,5. Det andre eksemplet er lykkepartikler dannet av Clueless (Clu). Clu er et ribonucleoprotein som er diffust gjennom cytoplasma; Det danner imidlertid også mitokondrier-tilknyttede partikler under optimale cellulære forhold5. Fordi tilstedeværelsen av Clu partikler er avhengig av sunne cellulære forhold, har vi kalt dem "bliss"partikler 3,5,6. Tilsetning av hydrogenperoksid fører til at disse partiklene raskt sprer seg og blir homogene i cytoplasma5. I løpet av våre studier har vi observert endringer i lokalisering av begge disse subcellulære strukturene, men først etter å ha utført levende bildestudier, kan vi fullt ut sette pris på effekten av cellulær stress og oksidativ skade på lokalisering og dynamikk av mitokondrier og lykkepartikler.
Nytten av denne protokollen som et tillegg til allerede etablerte eller alternative metoder avhenger av flere faktorer. For det første må bildeprotokollen være mottagelig for legemiddeltillegg. Hvis prøven er montert under en dekkslipp og i halokarbonolje, vil denne metoden ikke være mulig7. H2O2 tillegg forårsaker en rask økning i oksidativ skade, derfor kan denne tidsskalaen ikke være hensiktsmessig. Oksidativ skade kan betraktes som en proxy for hypoksi; Det kan imidlertid være for hardt eller for generalisert til å fungere som en passende kontroll for skade for visse subcellulære komponenter. Til slutt, for bildeeksperimenter som varer timer, for eksempel de som følger en utviklingsprosess, kan H2O2-tillegget være for sterkt (for eksempel8). Testing av en konsentrasjonskurve kan overvinne denne begrensningen.
Protocol
1. Utarbeidelse av disseksjons- og bildemedier
MERK: Mediene som passer best for dette levende bildeeksperimentet inneholder Schneiders Drosophila-medier som inneholder 15 % varmeinaktivert fosterbovinserum, 0,6 x Pen-Strep og 200 μg/ml storfeinsulin, heretter kalt Complete Schneiders medier.
- Utfør mediepreparatet under sterile forhold for å sikre at det ikke blir forurenset. Media ble utviklet for å støtte Drosophila ovarioles i lengre perioder9.
- Tilsett 15 % varmeinaktivert fosterbovinserum, 0,6 x Penn-Strep og 200 μg/ml storfeinsulin i Schneiders medier.
- Bland innholdet godt og oppbevar ved 4 °C over natten.
MERK: Insulin oppløses ikke helt i hele Schneiders medier, og du vil legge merke til en utfelling i bunnen av røret. - Gjør aliquots av media, sørg for å forlate stupet som det vil forstyrre bildebehandling.
MERK: Denne oppløsningen kan brukes innen én måned hvis den oppbevares i aliquots ved 4 °C.
2. Innsamling av Drosophila for disseksjon
MERK: Detaljerte Drosophila-innsamlings- og disseksjonsprosedyrer finnes også i Weil et al.10 og Parker et al.11.
- For optimal kvinnelig bakteriecelleavbildning, lag først et hetteglass som inneholder standard maismelfluemat og en dab med våt gjærpasta som er konsistensen av peanøttsmør. Dette sikrer at de kvinnelige fluene er godt matet og vil produsere alle follikkelutviklingsstadier for avbildning.
- For optimalt sunne fluer, samle 0-1 dag gamle kvinner og overfør med menn til et flymat hetteglass som inneholder våt gjærpasta.
MERK: Pass på at de sovende fluene ikke kontakter gjærpastaen, da de kan holde seg til den. - Mate fluene 3-7 dager, endre hetteglasset og gjærpastaen daglig.
MERK: Pass på at gjærpastaen kommer i kontakt med flymaten slik at den ikke tørker ut.
3. Drosophila eggstokk disseksjon
MERK: Det er viktig å forberede medieløsningene friske fordi hydrogenperoksid er utsatt for oksidasjon og TMRE brytes ned over tid.
- Rett før disseksjon, i Complete Schneiders medier, forberede en frisk aliquot av 2 μM H2O2 løsning, en frisk aliquot av 46 nM tetramethylrhodamine, etyl ester (TMRE), og en frisk aliquot av en 46 nM TMRE løsning som inneholder 2 μM H2O2.
- For eggstokk disseksjon, bruk to par fine tang og et par elektrolytisk skjerpet wolfram nåler12. For å dissekere eggstokkene, fyll 2-3 brønner av en glassbunns dissekeringsfat (klokkeglass) med Complete Schneiders som har blitt varmet opp til romtemperatur.
- Bedøve hetteglasset med fete fluer med karbondioksid og segregere ønsket antall kvinnelige fluer som skal dissekeres. Plasser en enkelt fly i media ved hjelp av tang.
- Under et dissekerende mikroskop, ta forsiktig tak i flyet ved thoraxen ved hjelp av ett par fine tang. Med det andre paret tang, ta tak i bakre, og trekk forsiktig for å fjerne eggstokkene.
MERK: Hvis eggstokkene ikke kommer ut jevnt ved hjelp av denne metoden, kan hele magen også fjernes fra flyet, og eggstokkene kan forsiktig klemmes ut av hver ende av magen ved hjelp av tang. - Fjern eventuelle overflødige neglebånd eller vev, og overfør deretter eggstokkene til en ny brønn som inneholder friske medier. Eggstokkene skal fortsatt bevege seg fra den omkringliggende muskelhylsen.
4. Klargjøre ovarioles for bildebehandling
- Bruk skjerpet wolframnåler, erte forsiktig ovariolene fra hverandre, og ta vare på å fjerne den omkringliggende muskelhylsen (figur 1).
- Erte forsiktig bort enhver muskelhylse og nervefibre festet til de isolerte ovariolene (figur 2).
MERK: Hvis muskelhylsen ikke fjernes, vil ovariolen rykke og bevege seg, noe som forårsaker problemer med bildeoppkjøp (Video 1). - Hvis de subcellulære strukturene av interesse er endogenously merket, fortsett til trinn 4.4. Hvis strukturene av interesse vil bli merket med et fluorescerende fargestoff, fortsett til § 5.
- Når ovariolene har blitt ren dissekert, ved hjelp av en mikropipette, overføre dem i en 100 μL dråpe Complete Schneiders bildemedier inn i glassdepresjonen til en glassbunnsrett. De enkelte ovariolene vil synke til bunnen av dråpen.
- Gå videre til avsnitt 6 for bildebehandling.
MERK: For bildetrakondrier og Clu bliss partikler, bør ikke mer enn fem-ti minutter gå fra starten av disseksjon til avbildning.
5. Farging mitokondrier med TMRE
MERK: Ytterligere detaljerte prosedyrer for levende farging av mitokondrier med fluorescerende fargestoffer finnes i Parker et al. 2017.
- Etter trinn 4.3, overfør de isolerte ovariolene i en 100 μL dråpe på 46 nM TMRE-medier til glassdepresjonen til en glassbunnsrett. De enkelte ovariolene vil synke til bunnen av dråpen.
- Inkuber ved romtemperatur i 20 minutter. Legg lokket på glassbunnsfatet og legg fatet i en overbygd boks i løpet av eksperimentet for å beskytte mot lys.
MERK: Etter inkubasjon kan prøvene avbildes direkte uten vask. - Gjenta trinn 5.1-5.2 for å tilberede minst to retter av TMRE-merkede ovarioles, en for å tjene som en eksperimentell gruppe og en for å tjene som en kontroll.
6. Live bilde oppkjøp
- Når ovariolene er montert, legg en av glassbunnsrettene på mikroskopet og konfigurer bildeparametrene etter behov. De optimale eksitasjons-/utslippsbølgelengdene for TMRE som brukes her er 549 nm/574 nm.
- Etter å ha lokalisere ønsket synsfelt, kan du skaffe stillbilder eller korte videoer av en eller flere ovarioles etter ønske som en registrering av pre-behandlingsforhold.
7. Tilsetning av hydrogenperoksid under avbildning
- Sett levende bildebehandling på pause, fjern lokket fra glassbunnsfatet, og tilsett forsiktig 100 μL 2 μM H2O2-løsning til fatet ved hjelp av en mikropipette hvis avbildning av endogene merkede strukturer. Hvis bildegokondrier forsiktig tilsett 100 μL av 46 nM TMRE med 2 μM H2O2 løsning til fatet ved hjelp av en mikropipette (Video 2).
- Unngå å bryte overflaten av den eksisterende mediedråpen eller legge til løsningen for fort for ikke å fortrenge eggløsningene hviler på bunnen av parabolen (Video 2).
- Sett oppvasklokket (oppvaskdekselet), flytt og refokuser ønsket synsfelt om nødvendig, og fortsett bildebehandling (Video 3, Video 4, Figur 3, Figur 4).
- Vær forsiktig med å gjenoppta bildebehandlingen så raskt som mulig etter H2O2-tillegget, da den eksperimentelle behandlingen er tidssensitiv ( Video5).
- Få stillbilder eller korte videoer av en eller flere ovarioles etter ønske. Dette vil tjene som en oversikt over etterbehandlingsforhold.
- For kontrollen, plasser den andre glassbunnsfatet på mikroskopet og gjenta seksjon 6.
- Gjenta trinn 7.1, denne gangen legger du til 100 μL TMRE-bare medier i parabolen. Hvis du avbilder endogene merkede strukturer, legger du til 100 μL av Complete Schneiders kun medieløsning.
- Gjenta trinn 7.2 og 7.3 for å hente data for kontrollgruppen.
MERK: For bilde mitokondrier og Clu bliss partikler, bør ikke mer enn tre-fem minutter gå fra tilsetning av hydrogenperoksid til avbildning.
Representative Results
De beskrevne protokollene kan brukes til å studere effekten av hydrogenperoksid under levende avbildning av Drosophila eggstokkene. Som vist i figur 3, figur 4, video 3 og video 4, gir denne prosedyren et effektivt middel for å visualisere vevsendringer og dynamikk etter eksperimentell behandling i sanntid. Viktigere, denne protokollen er spesifikk for tillegg av H2O2 til ovarioles under avbildning; Det kan imidlertid tilpasses eksogene tillegg av andre legemidler eller reagenser av interesse. I tillegg kan follikler merkes med fluorescerende fargestoffer av interesse (f.eks tetrametylrhodamin (TMRE), LysoTracker) før bildebehandling (Video 3). De mest kritiske trinnene for å oppnå klare bilderesultater er 1) riktig disseksjon og isolering av enkeltovarioles med alle kontraktile elementer fjernet (figur 1 og figur 2) og 2) hastigheten som bildebehandling startes på nytt etter hydrogenperoksid tillegg. Video 4 er en illustrasjon av en riktig dissekert follikkel som forblir stødig gjennom hele bildetiden sammenlignet med Video 1, noe som illustrerer en dårlig dissekert follikkel som går ut av synsfeltet under bildebehandling. Video 5 er en illustrasjon der H2O2-effektene på TMRE-merkede mitokondrier allerede har utviklet seg før bildebehandlingsstart som følge av for mye forløpt tid. Sammenlignet med Video 3 der bildebehandling ble startet på nytt umiddelbart etter hydrogenperoksid tillegg (tid 0) og intakt, spredt mitokondrier er fortsatt synlige, mitokondriene i Video 5 har allerede begynt å synlig klumpe og miste membranpotensialet ved omstart av avbildning. Dette problemet tilskrives for det meste avbrudd av prøveposisjonene under H2O2-tillegget, og kan lindres ved å følge teknikken for å holde bildemediet og prøveposisjonen intakt ( Video2). Merk, i kontrolleksperimenter utført uten H2O2 lagt til i media, forblir mitokondriene i follikler riktig spredt, og TMRE-fargestoffet forblir sequestered i mitokondriene.
Figur 1: Isolering av enkle eggstokker fra Drosophila eggstokkene. (A) Tegneserie som indikerer et par eggstokkene, en enkelt ovariol (pil) med germarium på spissen (pilspiss) og de to muskelsliene som omgir ovariolen (brun, epitel) og eggstokken (brun, peritoneal). (B)Dissekert Drosophila eggstokk. (C)Etterfølgende separasjon av ertet eggstokken i individuelle ovarioles (pil). Skala bar = 100 um. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Fjerning av nervefibre og kontraktile elementer fra enkelt ovarioles. (A) Enkelt ovariol med rester av nervevev og muskelhylsen fortsatt festet (pil). (B)Skånsom fjerning av alt gjenværende vev festet til ovariol i A (pil). Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: H2O2 forårsaker mitokondrie mislokalisering. (A-A") Live-image stillbilder av en godt matet cluCA06604 (Clu::GFP fluer) follikkel. Tilsetning av H2O2 forårsaker mitokondrier å klumpe seg over varigheten av avbildningen. TMRE merking av mitokondrier indikerer at mitokondrier er i utgangspunktet spredt på tid 0 (A), og at mitokondrier begynner å klumpe etter H2O2 tillegg (A') På et senere tidspunkt, TMRE merking blir spotty på grunn av mitokondrier mister sin membran potensial og derfor deres evne til å sequester fargestoffet (A"). Hvit = TMRE (A-A"). Vektstenger: 10 μm tor(A)for A-A"5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: H2O2 sprer Clu. (A-A") Levende bilder stillbilder av en godt matet cluCA06604 follikkel. Tilsetning av H2O2 fører til at partikler sprer seg og blir homogene i cytoplasma over avbildningen. Hvit = Clu::GFP (A-A"). Vektstangen: 40 μm tor(A)for A-A"5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Follikkel fra en cluCA06604 kvinne. Som beskrevet i figur 2, vil manglende fjerning av nervefiber kontraktile elementer fra enkle ovarioles føre til markert drivende og bevegelse av ovariolene under bildebehandling og påfølgende manglende evne til å analysere bildedata. Hvit = Clu::GFP. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Riktig tilsetning av H2O2 for å prøve parabolen. Hydrogenperoksid skal legges til prøven ved hjelp av en mikropipett i riktig størrelse. Dispensering H2O2 uten å bryte medieoverflaten. Det tas hensyn til å unngå å bryte overflaten av bildemediet for å minimere prøvedrift under hydrogenperoksidtillegg. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: H2O2 tillegg under avbildning av TMRE merket follikler. Follikkel fra en cluCA06604 hunn farget med TMRE. H2O2 forårsaker mitokondrie mislokalisering i Drosophila follikler. Hvit = TMRE fargestoff. Avbildet en ramme per 15 s i 20 min, og videoen er 10 bilder per sekund5. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 4: H2O2-tillegg under avbildning av Clu::GFP follikler. Follikkel fra en cluCA06604 kvinne. H2O2 dispergerer Clu partikler som beskrevet i figur 4. Hvit = Clu::GFP. Bilde en ramme per 15 s i 15 min, og videoen er 10 bilder per sekund. 5 Vennligstklikk her for å laste ned denne videoen.
Video 5: Forsinket bildebehandling etter H2O2-tillegg. Follikkel fra en cluCA06604 kvinne. Tilsetning av hydrogenperoksid til follikler er en tidssensitiv behandling. Omstart av bildebehandling ble forsinket i denne videoen som følge av prøveforskyvning under H2O2-tillegg. Mitokondriene har allerede begynt å synlig klumpe seg og miste membranpotensialet ved omstart av bildebehandling på tidspunktet 0 (sammenlignet med tid 0 i Video 3). Hvis du ikke gjenopptar bildet raskt etter behandling, vil det føre til unøyaktige og ubrukelige resultater, da de tidlige eksperimentelle effektene vil bli savnet før avbildning. Hvit = TMRE. Bilde en ramme per 15 s i 20 min, og videoen er 10 bilder per sekund. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Denne protokollen kan være et nyttig tillegg som en kontroll for artefakter på grunn av eggstokkavhandling og vev inkubasjon for alle levende bildebehandling eksperiment. De kritiske trinnene ligner på de som finnes for andre live imaging protokoller. Lære å dissekere hele Drosophila eggstokkene tar praksis; Denne ferdigheten kan imidlertid vanligvis læres ganske raskt med de riktige disseksjonsverktøyene. Vanskeligere å mestre er å fjerne muskelen omslutte eggstokkene og hver ovariol13. Dette må gjøres for å sikre at muskelsammentrekninger ikke forstyrrer bildeoppkjøp. Hvis bruk av skjerpet wolfram nåler for å gjøre dette ikke viser seg vellykket, germarium på spissen av ovariol kan gripes med tang og ovariol trukket fra muskelhylsen. Denne teknikken er imidlertid problematisk hvis de tidligste utviklingsstadiene skal undersøkes fordi de kan bli skadet. Et annet viktig trinn er å ikke løsne ovariolene hviler på bunnen av parabolen når du legger H2O2. Et ekstra viktig aspekt deles av all levende bildebehandling: forskeren bør sørge for at strukturen av interesse er fluorescerende godt merket før behandling. Rettene som brukes her (Table of Materials) brukes ofte til levende bildebehandling; Men enhver tallerken eller skli med en glassdeksler på bunnen eller til og med en stor glassdekslerslips skal fungere så lenge mediedråpen kan dekkes for å forhindre mediefordampning. Mens vi bruker et bestemt mikroskop, bør ethvert omvendt mikroskop med et mål om tilstrekkelig forstørrelse for å se den subcellulære strukturen det gjelder og et vedlagt kamera som har tilstrekkelig oppløsning og bildeopptakshastighet, fungere.
Mens vårt laboratorium primært er interessert i mitokondriefunksjon, kan denne metoden være nyttig å undersøke dynamikken og lokaliseringen av enhver subcellulær struktur eller organelle, for eksempel kjernen, cytoskeleton eller endoplasmatisk reticulum. Denne metoden har imidlertid begrensninger. For å legge til hydrogenperoksid må vevet være i vandige medier. En alternativ metode for levende bildebehandling er å bruke halokarbonolje, som har vært medvirkende til å beskrive mange viktige prosesser i Drosophila ovarioles, inkludert det første eksemplet på dynamisk bevegelse av GFP i en modellorganisme7,14. I tillegg forårsaker tilsetning av hydrogenperoksid til media bredspredning oksidativ skade som kan være for generell en fornærmelse mot vevet for å være informativ for den cellulære prosessen av interesse, spesielt for lengre eksperimenter som undersøker utvikling. Selv om det kanskje ikke er mulig å utføre eksperimenter som krever visualisering av cellen over lange perioder på grunn av denne raske, omfattende og sannsynligvis irreversible oksidativ skade, har vi sett at den akutte hydrogenperoksidbehandlingen vi har beskrevet, gjelder for de fleste stadier av oogenese, da vi er i stand til å se de samme effektene i de fleste stadier innen bildeperioden. Gitt den lave prisen og enkel av protokollen, det kan være en nyttig kontroll for skade og kan brukes som en behandling før fiksering og antistoff merking også.
I våre hender etterligner H2O2-behandling endringene i mitokondriedislokalisering og Clu bliss partikkeldispersjon som vi ser i ulike Drosophila mutanter. Det etterligner også resultater vi ser for nye forskere i laboratoriet læring disseksjon teknikker. Derfor viste denne metoden tydelig at prøveforberedelse og generell cellulær stress kan føre til uventede og tidligere uforklarlige endringer i mitokondriedislokalisering og tilstedeværelsen av lykkepartikler. Flytte denne teknikken fremover, hydrogenperoksid konsentrasjoner kan moduleres ved hjelp av en høyere eller lavere konsentrasjon. Hvis en cellulær effekt ses ved hjelp av en lavere konsentrasjon, er det mulig at stressfenotypen kan være reversibel ved å erstatte mediet med Complete Schneiders. Ulike cellestressorer som karbonylcyanid m-klorofenylhydrazon (CCCP), arsenitt eller enkelt varmesjokk kan være nyttig for generell cellulært stress for andre subcellulære strukturer. Siden levende avbildning av ex vivo vev krever manuell manipulering og inkubasjon i forskjellige medier, bør denne kontrollen være et nyttig tillegg for å sikre at eventuelle observasjoner er så nær normal fysiologi som mulig.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Jeremy Smyth for bildestøtte og Ann C. Shenk for illustrasjoner, produksjon og videografi. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (1R01GM127938 til R.T.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles - PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles - PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles - tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
