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Developmental Biology

मॉडल केराटिनसाइट स्टेम सेल प्लास्टिसिटी के लिए एक उच्च थ्रूपुट एपिडर्मल स्पेरोइड कल्चर सिस्टम की स्थापना

Published: January 30, 2021 doi: 10.3791/62182
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 5, 6, 1
1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, University of South Carolina School of Medicine, 2Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine Baltimore, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Drug Discovery and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, University of South Carolina

Summary

यहां हम 3डी निलंबन संस्कृति में एपिडर्मल स्फेरॉइड की व्यवस्थित खेती के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में विभिन्न प्रकार के एपिथेलियल ऊतक प्रकारों में उपयोग के लिए और कई मानव रोगों और स्थितियों के मॉडलिंग के लिए व्यापक अनुप्रयोग हैं।

Abstract

एपिथेलियल डिस्रेगुलेशन विभिन्न प्रकार की मानव स्थितियों और बीमारियों के लिए एक नोड है, जिसमें पुरानी घायल, सूजन और सभी मानव कैंसर का 80% से अधिक शामिल है। एक अस्तर ऊतक के रूप में, त्वचा एपिथेलियम अक्सर चोट के अधीन होता है और क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत के लिए आवश्यक सेलुलर प्लास्टिसिटी प्राप्त करके विकासवादी रूप से अनुकूलित होता है। इन वर्षों में, इन विट्रो और पूर्व वीवो सेल आधारित मॉडलों का उपयोग करके एपिथेलियल प्लास्टिसिटी का अध्ययन करने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। हालांकि, ये प्रयास एपिथेलियल सेल प्लास्टिसिटी के विभिन्न चरणों को फिर से शुरू करने की उनकी क्षमता में सीमित रहे हैं । हम यहां प्राथमिक नवजात मानव केराटिनोसाइट्स से 3 डी एपिडर्मल स्फेरॉइड और एपिडर्मल स्पेरोइड-व्युत्पन्न कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल एपिडर्मल स्पेरोइड संस्कृतियों की क्षमता को रेखांकित करता है ताकि केराटिनसाइट जनरेटिव प्लास्टिसिटी के अलग-अलग चरणों को कार्यात्मक रूप से मॉडल किया जा सके और यह दर्शाता है कि एपिडर्मल स्पेरोइड री-प्लेटिंग इनटेग्रिने6 हाय/ईजीएफआरलो केराटिनोट उप-जनसंख्या के लिए विषम सामान्य मानव केराटिनोसाइट्स (एनएचकेसी) संस्कृतियों को समृद्ध कर सकता है। हमारी रिपोर्ट में त्वचा केराटिनोसिट प्लास्टिसिटी और एपिडर्मल पुनर्जनन के अध्ययन के लिए एक उच्च थ्रूपुट प्रणाली के विकास और रखरखाव का वर्णन किया गया है।

Introduction

स्तनधारी स्तरीकृत एपिथेलियम सभी जीवित प्रणालियों में सबसे जटिल एपिथेलियल आर्किटेक्चर है और अक्सर नुकसान और चोट के अधीन होता है। एक सुरक्षात्मक ऊतक के रूप में, एक जटिल और प्रभावी ऊतक क्षति प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए स्तरीकृत एपिथेलियम विकसित हुआ है। चोट लगने पर, इन कोशिकाओं को वंश प्लास्टिसिटी कार्यक्रमों को सक्रिय करना चाहिए, जो उन्हें घायल स्थल पर स्थानांतरित करने औरमरम्मत 1,2,3करने में सक्षम बनाता है। यह बहुआयामी प्रतिक्रिया कई अनुक्रमिक चरणों में होती है जो खराब समझ में आती हैं ।

एपिथेलियल पुनर्जनन की जटिल प्रक्रिया का अध्ययन करने में एक बड़ी बाधा उच्च थ्रूपुट मॉडल प्रणालियों की कमी में निहित है जो सेल पुनर्जनन के परिभाषित चरणों में गतिशील सेलुलर गतिविधियों को कैप्चर कर सकते हैं। जबकि वीवो माउस मॉडल में घाव भरने में प्रासंगिक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और मानव पुनर्योजी प्रक्रिया को सबसे बारीकी से पुन: कृत करते हैं, उनके विकास के लिए श्रमसाध्य प्रयासों और महत्वपूर्ण लागत की आवश्यकता होती है, जिससे उनकी थ्रूपुट क्षमता सीमित हो जाता है। इसलिए, ऐसी प्रणालियों की स्थापना की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है जो उच्च थ्रूपुट पैमाने पर मानव एपिथेलियल ऊतक उत्थान की कार्यात्मक जांच को सक्षम करती है।

हाल के वर्षों में स्केलेबिलिटी चैलेंज से निपटने के लिए कई प्रयास किए गए हैं । यह अभिनव इन विट्रो और पूर्व वीवो सेल-आधारित मॉडल के महान विस्तार के माध्यम से देखा जाता है जो वीवो पुनर्योजी संदर्भ में बारीकी से नकल करते हैं। इसमें ऑर्गन-ऑन-चिप4,स्फेरॉइड5,ऑर्गेनॉइड6और ऑर्गेनोटिपिक कल्चर्स7में प्रगति शामिल है । ये 3डी सेल-आधारित सिस्टम प्रत्येक अद्वितीय लाभ प्रदान करते हैं और अलग-अलग प्रयोगात्मक सीमाएं प्रस्तुत करते हैं। आज तक, गोलाकार संस्कृति सबसे अधिक लागत प्रभावी और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली 3डी सेल संस्कृति मॉडल बनी हुई है। और जब कई रिपोर्टों से संकेत मिला है कि स्फेरॉइड संस्कृतियों का उपयोग त्वचा स्टेम सेल विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, इन अध्ययनों को काफी हद तक पशु ऊतक8,9,या डर्मल फाइब्रोब्लास्ट10के साथ आयोजित किया गया है, जिसमें लगभग कोई रिपोर्ट मानव एपिडरमल स्फेरॉइड संस्कृतियों के पुनर्योजी गुणों की विशेषता नहीं है। इस प्रोटोकॉल में हम सामान्य मानव केराटिनोसाइट्स (एनएचकेसी) से एपिडर्मल स्फेरॉइड संस्कृतियों के कार्यात्मक विकास, संस्कृति और रखरखाव का विस्तार करते हैं। हम इस प्रणाली की उपयोगिता का समान रूप से वर्णन करने के लिए एपिडर्मल उत्थान और केराटिनोसिटे स्टेम सेल प्लास्टिसिटी इन विट्रो के अनुक्रमिक चरणों मॉडल ।

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Protocol

त्वचा के नमूनों और मानव keratinocytes के अलगाव के संग्रह और हैंडलिंग के लिए प्रोटोकॉल दक्षिण कैरोलिना विश्वविद्यालय (UofSC) आईआरबी द्वारा समीक्षा की गई है और "मानव विषयों को शामिल नहीं अनुसंधान" के रूप में वर्गीकृत किया गया है, क्योंकि चमड़ी के नमूनों को नियमित शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं (नवजात लड़कों का खतना) के दौरान उत्पादित सर्जिकल डिस्कार्ड किया गया था और पूरी तरह से जानकारी की पहचान करने से रहित थे। यूओएफएससी बायोसेफ्टी समिति द्वारा नियमित आधार पर प्रोटोकॉल की समीक्षा और अनुमोदन भी किया गया और सभी प्रयोगशाला कर्मियों को प्रयोगशाला जैव सुरक्षा प्रशिक्षण दिया गया । सभी प्रक्रियाओं को UofSC की सुरक्षा और नैतिकता मानकों के लिए सामंजस्य में आयोजित किया गया ।

1. नवजात चमड़ी ऊतक से मानव केराटिनोसाइट्स का अलगाव और संस्कृति

  1. केएसएफएम माध्यम के 500 एमएल में 0.1 एम एचईपीई बफर जोड़कर वॉश मीडियम तैयार करें और इसे 7.2 के पीएच में एडजस्ट करें। 500 एमएल वैक्यूम फिल्टर (0.22 माइक्रोन पोर आकार) में माध्यम को स्टरलाइज करें। MCDB 153-एलबी बेसल मीडियम का इस्तेमाल केएसएफएम के स्थान पर वैकल्पिक वॉश सॉल्यूशन के तौर पर भी किया जा सकता है।
  2. एक लैमिनार फ्लो हुड में, 50 एमएल शंकु नली में 5 एमएल वॉश मीडिया के साथ नवजात चमड़ी धोएं। दो बार दोहराएं।
  3. एक बाँझ पेट्री डिश के लिए धोया चमड़ी हस्तांतरण। एक स्केलपेल और संदंश का उपयोग करके, डर्मल परत से एडीपोज और ढीले कनेक्टिव ऊतकों को कुरेदें। 50 एमएल शंकु नली में वॉश मीडिया के 5 एमएल के साथ चमड़ी को फिर से धोएं।
  4. वॉश मीडिया (50 यू/एमएल) में पतला डिसपासे एंजाइम के 2 एमएल युक्त 6-अच्छी प्लेट में चमड़ी एपिडर्मिस साइड रखें।
  5. प्लेट को 4 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता) के लिए एक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  6. इनक्यूबेटर से चमड़ी निकालें और, बाँझ परिस्थितियों में, इसे पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। फाइन-टिप संदंश का उपयोग करके, एपिडर्मिस को डर्मिस परत से अलग करें।
  7. एपिडर्मिस को 15 एमएल शंकु नली में रखें जिसमें 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए का 2 मिलील है। 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, यांत्रिक रूप से फ्लोटिंग एपिडर्मिस को कुचल दें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट 5 एस हर 5 मिनट के लिए आवधिक भंवर के साथ।
  8. इनक्यूबेशन के बाद, 2 एमएल सोयाबीन ट्राइप्सिन अवरोधक जोड़ें और ट्राइप्सिन को बेअसर करने के लिए पिपटिंग करके मिलाएं।
  9. 450 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए सेंट्रलाइज सेल सस्पेंशन, और फिर 250 x ग्राम पर 8 मिनट केलिए।
  10. संदंश के साथ अस्थायी मलबे को हटाएं, सेल पेलेट को उखाड़ फेंकने के लिए सावधान न रहें। सावधानी से सेल पेलेट से सुपरनेट को एस्पिरेट करें।
  11. 10 सेमी डिश में कंप्लीट केएसएफएम-सीएम मीडियम और प्लेट के 12 एमएल में रिस्सपेंड पेलेट। रात भर में इनक्यूबेट डिश (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता)।
  12. अगले दिन, एक एस्पिरेटिंग पिपेट का उपयोग करके माध्यम को हटा दें और 12 एमएल पूर्ण केएसएफएम-सीएम के साथ बदलें। 4 और 7 दिन पर दोहराएं।
  13. सामान्य मानव केराटिनोसिटे (एनएचकेसी) संस्कृतियों के इष्टतम विकास को बनाए रखने के लिए, कोशिकाओं को 10 दिन में 1:5 तक ले जाया जाता है ताकि कोशिकाओं को 80% से अधिक की आपूर्ति प्राप्त करने से रोका जा सके।

2. विट्रो में त्वचा एपिडर्मॉस्फीयर संस्कृतियों का सृजन

  1. 50 एमएल ग्लास की बोतल में 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 50 एमएल में 2.5 ग्राम एग्रिसड करके 5% एग्राजेड मिश्रण तैयार करें। तरल चक्र के तहत ऑटोक्लेव बोतल। कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति दें।
  2. प्लेटें तैयार करने के लिए, 200 एमएल डिओनाइज्ड वॉटर (डीएच2ओ) से भरे 1 एल प्लास्टिक बीकर में एगर उठे समाधान युक्त ठंडी कांच की बोतल रखें। पिघल agarose मिश्रण एक अनुसंधान ग्रेड माइक्रोवेव में 2 मिनट तक के लिए, आगर हर ६० एस मिश्रण धीरे से बोतल की ओर झुकाव द्वारा पक्ष ।
    सावधानी: माइक्रोवेव में पिघलने एगर के कारण फ्लास्क कंटेनर बेहद गर्म हो जाएगा जिसके परिणामस्वरूप दबाव बिल्डअप होगा। हर 30 एस पर प्रेशर बिल्डअप जारी करें। चोट को रोकने के लिए उचित सुरक्षा उपकरण पहनें।
  3. 1% एगर उठी (wt/vol) की अंतिम एकाग्रता के लिए 12 मिलियन केएसएफएम-सीएम को 42 डिग्री सेल्सियस से पहले पिघला हुआ 5% की 3 एमएल जोड़ें।
    वैकल्पिक: नरम आगार के समय से पहले बहुलीकरण को रोकने के लिए सीरोलॉजिकल पिपेट और पिपेट टिप्स को प्री-वार्म करें।
  4. मल्टीचैनल पिपेटर (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में1%एगर मिश्रण के 200 माइक्रोन को जल्दी से पिपेट करें। 4 घंटे के लिए बाँझ वातावरण में प्लेट को 25 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें ताकि एगरेज़ पूरी तरह से बहुलक हो सके।
    नोट: प्रयोग यहां बंद कर दिया जा सकता है और अगले दिन जारी रखा । पॉलीमराइज्ड एगरेंग प्लेट्स को 24 घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस या पैराफिल्म रैप के साथ सील किए जाने पर 48 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जा सकता है। उपयोग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए एक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म प्लेट।
  5. पीबीएस के 2 एमएल में मीडिया और वाशिंग सेल को एस्पिरेट करके एनएचकेसी बनाने वाले मार्ग। पीबीएस को एस्पिरेट करें और धोया कोशिकाओं के लिए 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 2 एमसीएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए या जब तक सभी कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग नहीं किया जाता है। प्लेट में सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक के 2 एमएल जोड़ें और प्लेट से कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में धोएं। 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  6. पीबीएस के 1 एमएल में पैलेट को रीसुस्पेंड करें। ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग और एक हीमोसाइटोमीटर या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करें।
  7. Aliquot 2 x 104 NHKc KSFM-scm के १०० μL में और बीज पहले से तैयार ९६-अच्छी तरह से गोल नीचे थाली के व्यक्तिगत कुओं में । रात भर में इनक्यूबेट प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता)।
  8. एक उल्टे चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, एपिडर्मॉस्फीयर गठन के लिए अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त का विश्लेषण करें।
    नोट: सामान्य मानव केराटिनोसाइट्स से मानव एपिडर्मोस्फीयर 96 घंटे तक 3डी निलंबन संस्कृति में व्यवहार्य रह सकते हैं, हालांकि सेल व्यवहार्यता(चित्रा 2)में काफी कमी के साथ।

3. एपिडर्मल स्पेरोइड री-प्लेटिंग परख

  1. 3डी एपिडर्मॉस्फीयर फॉर्मेशन के बाद 24-48 घंटे, प्रीवार्मेड केएसएफएम-सीएम के 4 एमएल को 6 सेमी डिश में जोड़ें। प्लेट में एक गोलाकार स्थानांतरित करने के लिए एक विस्तृत बोर 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करें, इसे अलग नहीं तोड़ने के लिए सुनिश्चित करें। वैकल्पिक रूप से, टिप को काटने के लिए बाँझ रेजर ब्लेड का उपयोग करके 1 एमएल पिपेट टिप को चौड़ा करें।
  2. रात भर प्लेट को इनक्यूबेट करें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता)।
  3. प्लेट के नीचे से लगाव के लिए वरीयता प्राप्त गोला का विश्लेषण करें और उल्टे चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप(चित्र 3)का उपयोग करके कोशिकाओं के प्रचार के लिए निरीक्षण करें। फ़ीड कोशिकाओं हर ९६ घंटे धीरे थाली के अंदर मीडिया के 2 ml हटाने और धीरे से थाली में 2 एमएल ताजा KSFM-सीएम मीडिया जोड़ने के द्वारा ।
  4. एक बार 70-80% की ढुलमुलता तक पहुंचने और पसंद की परख जारी रखने के बाद मार्ग-व्युत्पन्न (एसडी) एनएचकेसी। कोशिकाओं को संस्कृति में पूर्ण स्तर तक पहुंचने से रोकने के लिए एसडी-एनएचकेसी की अक्सर निगरानी करें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप समय से पहले भेदभाव और सेल विकास गिरफ्तारी(चित्रा 3E-F)होती है।
  5. एपिडर्मल स्पेरोइड रिफ्लेटिंग परख मॉडल केराटिनोसिटे-मध्यस्थता घाव की मरम्मत एपिडर्मल पुनर्योजी प्लास्टिसिटी के प्रमुख अनुक्रमिक चरणों में से प्रत्येक पर कब्जा करके: क) होयरोस्टैटिक रखरखाव, ख) भेदभाव रोकने/उलट सी) तनाव वंश गतिशीलता, और डी) ऊतक बहाली(चित्रा 1B; तालिका 2)। इस परख का उपयोग ऑर्गेनोटिपिक बेड़ा संस्कृतियों के लिए सेल आबादी का उत्पादन करने या एचपीवी-मध्यस्थता वाले नियोप्लासिया को मॉडल बनाने के लिए भी किया जा सकता है जैसा कि हमारे पिछले काम 11,12में प्रदर्शित किया गया था।

4.3D फ्लोरेसेंस सेल ट्रैकिंग

  1. एक 6 सेमी डिश में, ट्रांसफेक्ट स्फेरॉइड-बनाने वाले 2D मोनोलेयर एनएचकेसी संस्कृतियों के साथ 1 माइक्रोग्राम के साथ 1 माइक्रोग्राम के साथ pMSCV-IRES-EGFP प्लाज्मिड वेक्टर बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (eGFP) जीन ले जाने । इनक्यूबेट प्लेट रात भर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता) माइक्रोस्कोप(चित्रा 4A)।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि ट्रांसफैक्शन सीरम मुक्त एंटीबायोटिक मुक्त स्थितियों में पूरा हो गया है।
  2. ट्रांसफेक्शन मिक्स को हटाए बिना, कोशिकाओं में प्रीवार्मेड केएसएफएम-सीएम का 2 एमएल जोड़ें। रात भर में इनक्यूबेट प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता)।
  3. प्लेट और फीड सेल से सभी ट्रांसफैक्शन मीडिया को प्रीवार्मेड केएसएफएम-सीएम के 3 एमएल के साथ एस्पिरेट करें। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के फिटसी चैनल के तहत ईजीएफपी-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं की उपस्थिति का आकलन करें।
  4. मार्ग और बीज 2 x 104 EGFP-संक्रमित कोशिकाओं को पहले से तैयार 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में। रात भर में इनक्यूबेट प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता)। फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप(चित्रा 4B-C)के फिटसी चैनल के तहत ईजीएफपीपीओएस स्फेरॉइड सेल मूवमेंट की कल्पना और निगरानी करें।
  5. चढ़ाना के बाद 24 घंटे, प्रीवार्मेड केएसएफएम-सीएम के 3 एमएल को 6 सेमी डिश में डालें। प्लेट में एक गोलाकार स्थानांतरित करने के लिए एक विस्तृत बोर 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करें, इसे अलग नहीं तोड़ने के लिए सुनिश्चित करें। रात भर में इनक्यूबेट प्लेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता)।
  6. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एसडी-एनएचकेसीईजीएफपी का प्रचार और विश्लेषण करें। फ़ीड कोशिकाओं हर 96 घंटे धीरे से 2 mL थाली के अंदर मीडिया को हटाने और धीरे से थाली में 2 एमएल ताजा KSFM-सीएम मीडिया जोड़ने के द्वारा।
  7. फसल एसडी-एनएचकेसीईजीएफपी FACS अलगाव या पसंद की परख के लिए।

5. FACS द्वारा स्पेरोइड-व्युत्पन्न (एसडी) उप-आबादी का लक्षण वर्णन

  1. पीबीएस के 2 एमएल में पुराने मीडिया और वाशिंग सेल को एस्पिरेट करके पैसेज एसडी-एनएचकेसी और इसी ऑटोलॉगस 2डी मोनोलेयर संस्कृतियों। पीबीएस निकालें और धोया कोशिकाओं के लिए 0.25% ट्रिप्पसिन-EDTA के 2 ml जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या जब तक सभी कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग नहीं किया जाता है।
  2. 15 एमएल ट्यूब में प्लेट और ट्रांसफर कोशिकाओं में सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक के 2 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  3. पीबीएस के 1 एमएल में छर्रों को फिर से रीसुस्पेंड करें। ट्राइपैन ब्लू और हीमोसाइटोमीटर के एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करें।
  4. अलीकोट 100 माइक्रोल जिसमें 0.1-4 x 106 एनएचकेसी कोशिकाएं 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब हैं। एक अंधेरे वातावरण में बर्फ पर ट्यूब रखें, लैमिनार हुड के भीतर उज्ज्वल रोशनी को बंद करके बनाया गया।
  5. 1:50 कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए ट्यूबों में पीई-संयुग्मित एंटी-ईजीएफआर के फिटसी-कंजूएक एंटी-इंटीग्रिन 6 और 2 माइक्रोन के 2 माइक्रोन जोड़ें। अन दाग नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए जोड़ा कोई एंटीबॉडी के साथ एक ट्यूब तैयार करें। अंधेरे में बर्फ पर या 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट ट्यूब। मोतियों या त्वचा एससीसी लाइन का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम कर सकता है, क्योंकि त्वचा एससीसी कोशिकाएं integrinα6 और EGFR के ऊंचा स्तर व्यक्त करती हैं।
  6. उचित लेजर के साथ युक्त पसंद के प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण करें।
  7. गेट्स स्थापित करने के लिए नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें। integrinα6 हाय/EGFRलो कोशिकाओं की उपआबादी सॉर्ट; ये एपिडर्मल स्टेम सेल अंश हैं। Integrinα6 हाय/EGFRहाय कोशिकाओं प्रसार जनक जनक सेल अंश हैं । integrinα6lo/EGFRहाय कोशिकाओं प्रतिबद्ध जनक सेल अंश(चित्रा 4D)हैं । यूएफएस ट्यूब की छंटाई में कम से कम 1 एमएल बर्फ-ठंडे केएसएफएम-सीएम होना चाहिए।
  8. प्रत्येक संबंधित छंटाई ट्यूब की सामग्री को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करके सॉर्ट सेल सबपॉजनेशन की प्रोलिफेरेटिव क्षमता के लिए परीक्षण करें जिसमें पीबीएस में सॉर्ट की गई कोशिकाओं की मात्रा 10x होती है। नोट: कई बार छंटाई FACS ट्यूब (ओं) की दीवार को पाइपिंग करके रिम से जुड़ी सभी कोशिकाओं को हटाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि केराटिनोसाइट्स अक्सर वहां पालन कर सकते हैं।
  9. 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेंट्रलाइज 15 एमएल ट्यूब। केएसएफएम-सीएम के 12 एमसीएल में सुपरनैंट और रिसिमुल पेलेट को हटा दें। 6 सेमी प्लेट में रिलाइज्ड सेल्स को ट्रांसफर करें और रात भर इनक्यूबेट करें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता)।
  10. अगले दिन प्लेटों में मीडिया को हटाएं और 8 एमएल प्री-गरम केएसएफएम-सीएम डालें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें। 70-80% कॉन्फ्लूंट(चित्रा 4E)तक हर 3 दिनों में 12 एमएल माध्यम के साथ री-फीड सेल।

6. बेसल स्टेम सेल मार्कर के लिए एपिडर्मोस्फीस का इम्यूनोफ्लोरेसेंस और धुंधला

  1. पॉली-lysine के साथ लेपित कवरस्लिप पर एपिडर्मोस्फीयर स्थानांतरित करें। एसडी-एनएचकेसी को 75% तक प्रचारित करने की अनुमति दें।
  2. प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) में दो बार कोशिकाओं को धोएं।
  3. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  4. 1% ग्लाइसिन में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के साथ कोशिकाओं को पार करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 0.5% बीएसए और 5% बकरी सीरम का उपयोग कर ब्लॉक करें।
  5. P63 (1:200) और साइटोकेराटिन 14 (1:200) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर समाधान अवरुद्ध करने में इनक्यूबेट नमूने।
  6. पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ तीन बार धोएं जिसमें ट्वीन 20 (पीबीएसटी) होता है, जिसके बाद फिटसी और एलेक्सा 568-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:1000 कमजोर पड़ने) के साथ इनक्यूबेशन है।
  7. बढ़ते कोशिकाओं से पहले 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) (1:5000 कमजोर पड़ने) के साथ दाग नाभिक।
  8. फिटसी और पीई लेजर लाइनों(चित्रा 4F)के साथ फ्लोरोसेंट-सक्षम माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कोशिकाओं का निरीक्षण करें।

7. एपिडर्मॉस्फीयर संस्कृतियों का ट्रांसक्रिप्शनल विश्लेषण

  1. आरएनए को अलग करने के लिए कम पैसेज एनएचकेसी संस्कृतियों की ट्रिपलीकेट प्लेटें सेट करना एक ही ऑटोलॉगस सेल लाइन से मोनोलेयर, गोलाकार और गोला-व्युत्पन्न संस्कृतियों से हो सकता है।
  2. पूल 3-5 इसी एपिडर्मोस्फीयर को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में। अलग से फसल ऑटोलॉगस एसडी-एनएचकेसी और 2डी मोनोलेयर संस्कृतियों।
  3. तीनों समूहों से कुल आरएनए को अलग करें।
  4. कुल आरएनए के 1 माइक्रोन के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करें।
  5. सीडीएनए का उपयोग करके, आंतरिक नियंत्रण(तालिका 1)के रूप में गैपध का उपयोग करते हुए वास्तविक समय पीसीआर करें।
  6. एगरेज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (2% v/v) द्वारा एम्प्लिकॉन उत्पाद आकार को मान्य करें।
    नोट: पूरे जीनोम माइक्रोएरे विश्लेषण का उपयोग करके एपिडर्मोस्फीयर संस्कृतियों की ट्रांसक्रिप्ट-वाइड प्रोफाइलिंग के लिए, एक ही एनएचकेसी दाता की जन संस्कृतियों से कुल आरएनए को अलग करें और एक ही दाता से इसी एसडी-एनएचकेसी, छह में प्रत्येक प्रतिकृति ।
  7. कम से कम 9.0 से 9.1 तक आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) प्राप्त करने के लिए बायोएनालाइजर का उपयोग करके आरएनए गुणवत्ता का आकलन करें।
  8. कुल आरएनए नमूनों को बढ़ाना और बायोटिनाइलेट करके माइक्रोएरे प्रयोग करें।
  9. टी 7 आरएनए पॉलीमरेज प्रमोटर अनुक्रम वाले एनएनएन रैंडम प्राइमर का उपयोग करके डीएस-सीडीएनए में प्रति नमूना कुल आरएनए के 100 एनजी रिवर्स टाइप करें।
  10. आरएनए को बढ़ाने के लिए सीडीएनए नमूनों में T7 आरएनए पॉलीमरेज जोड़ें, फिर एसएस-सीडीएनए को आरएनए कॉपी करें। RNase एच का उपयोग करके अतिरिक्त आरएनए नीचा ।
  11. टुकड़ा sscDNA अणुओं और बायोटिन के साथ लेबल।
  12. 45 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए लेबल नमूनों को बढ़ाना।
  13. संकरण ओवन और एक धोने और दाग किट का उपयोग कर नमूनों को संकरित करें।
  14. धोएं और दाग संकरित सरणी।
  15. सिस्टम और कंप्यूटर वर्कस्टेशन का उपयोग करके सरणी स्कैन करें।
  16. सरणी स्कैन के पूरा होने के बाद, सीएचपी फाइल उत्पन्न करने के लिए लाइब्रेरी फाइल और मजबूत मल्टीचिप एनालिसिस (आरएमए) एल्गोरिदम का उपयोग करके जीन-स्तर पर अभिव्यक्ति कंसोल सॉफ्टवेयर और प्रक्रिया में आयात जांच सेल तीव्रता (सीईएल) फ़ाइलें।
  17. अभिव्यक्ति कंसोल के भीतर डेटा की गुणवत्ता की पुष्टि करने के बाद, एक ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण सॉफ्टवेयर में प्रत्येक जांच के लिए लॉग2 अभिव्यक्ति संकेतों वाली CHP फ़ाइलों का आयात करें ताकि विचरण के विषय विश्लेषण के बीच एक तरह से उपयोग करके सेल प्रकार विशिष्ट प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण किया जा सके।

8. एसडी-एनएचकेसी कॉलोनी बनाने की दक्षता का आकलन करना

  1. प्लेटों से मीडिया को एस्पिरेट करें जब कोशिकाएं 70-80% तक पहुंच जाती हैं। प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस (4 डिग्री सेल्सियस) में तीन बार कोशिकाओं को धोएं।
  2. 15 मिनट के लिए 100% मेथनॉल (4 डिग्री सेल्सियस) के 3 एमएल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार धोएं।
  3. 30 मिनट के लिए 10% Giemsa के 3 एमएल में दाग कोशिकाओं। प्रत्येक 5 मिनट के लिए पीबीएस में तीन बार धोएं। कोशिकाओं को रात भर सूखी हवा की अनुमति दें।
  4. अगले दिन कॉलोनी गठन का विश्लेषण करें और प्राप्त कॉलोनियों की संख्या की मात्रा निर्धारित करें

9. एसडी-एनएचकेसी जनसंख्या दोगुनी निर्धारित करें

  1. 2mL PBS में पुराने मीडिया और वाशिंग सेल को एस्पिरेट करके पैसेज एसडी-एनएचकेसी और इसी ऑटोलॉगस 2डी मोनोलेयर संस्कृतियों। पीबीएस निकालें और धोया कोशिकाओं के लिए 2 मिलील 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA जोड़ें। 5 मिनट के लिए या जब तक सभी कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग नहीं किया जाता है (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता)।
  2. 15 एमएल ट्यूब में प्लेट और ट्रांसफर कोशिकाओं में सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक के 2 एमएल जोड़ें।
  3. 5 मिनट के लिए 250 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  4. केएसएफएम-सीएम के 12 एमएल में सुपरनैंट और रिसिपेंड पैलेट को हटा दें।
  5. कम घनत्व पर बीज कोशिकाओं 1-2 x 104 एनएचकेसी व्यक्तिगत 10 सेमी व्यंजन में और रात भर इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,95% आर्द्रता)।
  6. अगले दिन 8 एमएल केएसएमएफ-सीएम के साथ प्लेटें खिलाएं। हर 4 दिनों में कम से कम 25% कॉन्फ्ल्यूंट होने तक खिलाएं, फिर हर 2 दिन में खिलाएं।
  7. कोशिका वृद्धि क्षमता समाप्त होने तक 60 सेमी व्यंजनों में क्रमिक मार्ग कोशिकाएं 1:5। ट्राइपैन ब्लू स्टेनिंग द्वारा सेल व्यवहार्यता की मात्रा निर्धारित करें। फार्मूले का उपयोग करके प्रत्येक मार्ग पर जनसंख्या दोगुनी निर्धारित करें: लॉग(N/N 0)/log2,जहां एन प्रत्येक मार्ग पर प्राप्त कुल सेल संख्या का प्रतिनिधित्व करता है और एन0 प्रयोग की शुरुआत में चढ़ाया कोशिकाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है ।

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Representative Results

त्वचा एपिडर्मॉस्फीयर परख के दौरान, एनएचकेसी संस्कृतियों को 96-वेल प्लेट(चित्रा 1 ए)के एगर उठे-लेपित कुओं में वरीयता प्राप्त किया जाता है। स्फेरॉइड बनाने वाली कोशिकाओं को 48h के भीतर स्वयं-कुल होना चाहिए। एक मानक उल्टे चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्वायत्त गोलाकार गठन का मूल्यांकन 24 घंटे के रूप में किया जा सकता है। त्वचा एपिडर्मोस्फीयर गठन और री-प्लेटिंग परख मॉडल एपिडर्मल ऊतक उत्थान(चित्रा 1B)के विभिन्न चरणों। चित्रा 2 3 डी संस्कृति में एपिडर्मल गोला बनाने की क्षमता के लिए परख किए गए विभिन्न एनएचकेसी उपभेदों की उच्च संकल्प छवियों को दिखाता है। घने गोलाकार आकार के एकत्रीकरण के लिए कोशिकाओं की जांच करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह सहज गोलाकार गठन की पहचान है। हमने उचित सहज एकत्रीकरण सुनिश्चित करने के लिए 2 x 104 कोशिकाओं से अधिक का उपयोग करना आवश्यक पाया। गैर-गोलाकार सेल एकत्रीकरण, जैसे उपभेदों में देखा गया चित्र 2 ए,पर्याप्त एपिडर्मॉस्फीयर गठन नहीं माना जाता है। 2डी मोनोलेयर संस्कृति में गैर-स्फेरॉइड बनाने वाले सेल निलंबन शायद ही कभी व्यवहार्य एनएचकेसी सेल विकास में परिणाम होते हैं। हालांकि, 2डी संस्कृति में एपिडर्मोस्फीयर चढ़ाना छोटे आकार के व्यवहार्य एनएचकेसी(चित्र 3)के प्रसार में परिणाम देता है। एपिडर्मोस्फीयर और एसडी-एनएचकेसी की छवियों को मानक उल्टे चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करके देखा और निगरानी की जा सकती है। 100% से नीचे इन संस्कृतियों को बनाए रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह संस्कृति में उनके विकास और स्टेम सेल राज्य(चित्रा 3E-F)को काफी इम्प्रेस कर सकता है। एपिडर्मल गोलाकार गठन की प्रक्रिया को फ्लोरोसेंट रिपोर्टर(चित्रा 4ए-सी)के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करके एकल कोशिका स्तर पर कार्यात्मक रूप से ट्रैक किया जा सकताहै। इष्टतम परिस्थितियों में, मुख्य रूप से एसडी-एनएचकेसी संस्कृतियों में समृद्ध केराटिनोसिटे उप-जनसंख्या Integrinα6 हाय/ईजीएफआरलो कोशिकाएं हैं। ये कोशिकाएं आम तौर पर सभी एसडी-एनएचकेसी संस्कृतियों का लगभग 25% बनाती हैं और उन्हें एफएएफएस(चित्रा 4D)द्वारा आसानी से अलग किया जा सकता है। हालांकि, डबल्स(चित्रा 4डी)को बाहर करने के लिए फॉरवर्ड साइड स्कैटर एरिया (एफएससी-ए) और साइड स्कैटर एरिया (एसएससी-ए) गेट्स स्थापित करना महत्वपूर्ण है। इस स्टेम की तरह केराटिनोसाइट उपजनसंख्या का आगे लक्षण वर्णन एपिडर्मल स्टेम सेल मार्कर अभिव्यक्ति के इम्यूनोफ्लोरिस्टेंट धुंधला विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जैसे बेसल साइटोकेराटिन 14 (K14) और ट्यूमर प्रोटीन 63 (P63)(चित्रा 4F; तालिका 2)।

Figure 1
चित्रा 1:3डी निलंबन में एनएचकेसी एपिडर्मोस्फीयर की खेती। (ए) एपिडर्मल स्पेरोइड री-प्लेटिंग परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व 11से अनुकूलित। (ख) एपिडर्मल स्पेरोइड री-प्लेटिंग परख के प्रत्येक अनुक्रमिक कदम पर एनएचकेसी संस्कृतियों, एपिडर्मल स्पेरोइड्स और एसडी-एनएचकेसी की प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियां । स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2:त्वचा एपिडर्मॉस्फीयर विकास का आकलन करना। (ए) फ्लोटिंग 3डी सस्पेंशन में छह व्यक्तिगत स्फेरॉइड नॉन-फॉर्मिंग और (बी) स्फेरॉइड बनाने वाले एनएचकेसी उपभेदों की छवियां । (ग) एनएचकेसी (डी) फ्लोटिंग 3डी सस्पेंशन कल्चर में एनएचकेसी की विभिन्न मात्राओं का उपयोग करके प्राप्त किए गए एपिडर्मॉस्फेर का विभिन्न मात्राओं का उपयोग करके प्राप्त किया गया है । बार मानक विचलन का संकेत देते हैं। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3:बढ़ती गोलाकार-व्युत्पन्न संस्कृतियों । (ए) समय पाठ्यक्रम चरण-एसडी-एनएचकेसी मोनोलेयर संस्कृतियों के विपरीत इमेजिंग एक संलग्न एपिडर्मॉस्फीयर 24 एच, (बी) ४८ एच, (सी) ७२ एच, और (डी) ९६ घंटे से प्रचारित 2D प्लास्टिक संस्कृति में फिर से चढ़ाना के बाद । (ई) एसडी-एनएचकेसी संस्कृतियों में 80% की ढुलमुल और (एफ) 100% की ढुलमुलता 15 और 20 दिन बाद क्रमशः 2डी प्लास्टिक कल्चर में रिफ्लेटिंग के बाद। स्केल बार = 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4:स्फेरॉइड-व्युत्पन्न (एसडी) उप-आबादी का लक्षण वर्णन। (क) विट्रो में एपिडर्मोस्फीस की 3डी सेल ट्रैकिंग परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जैसा कि वोप्पी एट अल द्वारा वर्णित है । २०२०१२। (ख) ईजीएफपी-व्यक्त एपिडर्मोस्फीयर 2 एच और (सी) 24 एच 3 डी संस्कृति में सीडिंग के बाद । (घ) एसडी-एनएचकेसी उपआबादी की फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल छंटाई (FACS) । सभी कोशिकाओं में से लगभग1/4 integrinα6 हाय/EGFRलोहोना चाहिए । (ङ) इंटीग्रिन 6 हाय/ईजीएफआरलो उपजनसंख्या केराटिनोसिटे होलोलोन का उत्पादन करती है । (च) इंटीग्रिन 6 हाय/ईजीएफआरलो कोशिकाओं में बेसल एपिथेलियल स्टेम सेल मार्कर अभिव्यक्ति का इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला विश्लेषण। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्राइमर अनुक्रम (5'-3')
जीन नाम फॉरवर्ड प्राइमर रिवर्स प्राइमर
एएलएच1 जीसीएसीजीसीसीएटीटीसी सीसीटीसीसीटीसीटीजीजीकेजीएग
ईजीएफआर AGGCACGAGTAACACACTCAC ATGAGGACATAACCAGCCACC
गप्पे GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT GGCTGTTTTCATCATTCCATCATGG
K14 TGAGCCCCGCATTCTGAACGAGG GATGACTGCGATCCAGAGGAGA
केए-67 ACGCCTGGTTATATAAAGG CAGACCCATCATACTTGGGGGGA
केएलएफ4 सीसीसीएसीएसीएकैगैकगैकटीसीसीसी CAGGTCCAAGAAGATCTGAA
टीपी63 GGACCAGCAGATTCAGAACGG AGGACACGTCGAAACTGGGC
β-ऐक्टिन CATGTACGTTTTCTCCAGGC सीटीसीसीएटगटीसीसीएसीसीजीएटी
1N TP63 ATGTTGTACCTGGAAAAAAAAATGCC CAGGCATGGCACGGATAAC

तालिका 1। नवजात केराटिनसाइट प्लास्टिसिटी में शामिल चुनिंदा जीन का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीसीआर प्राइमर दृश्यों को रेखांकित करता है।

संस्कृति की स्थिति फेज कंट्रास्ट उपस्थिति इम्यूनोस्टेपिंग FACS विश्लेषण ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर
होमोस्टेटिक रखरखाव 2D मोनोलेयर छोटे आकार की कोशिकाएं 30 माइक्रोन < हैं K14, P63 ITGα6 मेड/EGFPमेड एपिडर्मल रखरखाव (K14, P63, आईवीएल, K10)
भेदभाव रोकने/उलट 3डी स्फेरॉइड कॉम्पैक्ट मल्टीसेलुलर एग्रीगेट > 50 माइक्रोन K14, P63, Ki-67 N/A डी-विभेदन: नैनोजी, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67
तनाव वंश गतिशीलता 3डी-टू-2डी स्फेरॉइड अटैचमेंट स्फेरॉइड एज से छोटे आकार की कोशिकाओं (< 20 माइक्रोन) को फैलाना K14, P63, Ki-67 ITGα6 हाय/EGFPमेड त्वचा कोशिकाओं का प्रसार: K14, K16, K17, Ki-67
ऊतक बहाली 3डी-टू-2डी स्पेरोइड मोनोलेयर छोटे आकार की कोशिकाओं का प्रचार 20 माइक्रोन < K14, P63, IVL ITGα6 हाय/EGFPलो और ITGα6हाय/EGFPहाय एपिडर्मिस का गठन: K14, आईवीएल, एफएलजी

तालिका 2। एपिडर्मल स्पेरोइड रिपलेटिंग परख के फेनोटाइपिक और आणविक लक्षण वर्णन के लिए रणनीतियां।

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Discussion

3डी स्फेरॉइड कल्चर सिस्टम के उपयोग से सेल स्टेमनेस का आकलन करने में व्यापक उपयोगिता रही है । इन प्रणालियों को ऊतक स्टेम कोशिकाओं के संवर्धन को बढ़ाने के लिए प्रदर्शित किया गया है13,फिर भी मानव एपिडर्मल स्टेम कोशिकाओं के अध्ययन के लिए उनकी उपयोगिता का सीमित रूप से पता लगाया गया है । यहां, हम 3 डी संस्कृति तकनीकों का उपयोग करके मानव केराटिनोसिटे स्टेम कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए एक रणनीति का वर्णन करते हैं। इस प्रणाली में, एनएचकेसी को स्व-कोडांतरण बहुकोशिकीय गोलाकार निलंबन के रूप में खेती की जाती है, जिसमें केएसएफएम-सीएम युक्त एग्राडेड बेड के शीर्ष पर निलंबित कई केराटिनोसिट उपप्रकार शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए सेटअप समय संवेदनशील है क्योंकि आगर कमरे के तापमान पर तेजी से बहुलक होता है। प्रीहीटिंग सीरोलॉजिकल पिपेट, माइक्रोपिपेट टिप्स, और एगर/सेल मिक्सिंग ट्यूब, साथ ही मीडिया को ४२ डिग्री सेल्सियस तक, नाटकीय रूप से समय से पहले बहुलकीकरण को कम कर सकते हैं । हमने देखा कि कुओं में आगर/मीडिया मिश्रण जोड़ने के तुरंत बाद 4 डिग्री सेल्सियस में ९६-अच्छी प्लेट रखने से बहुलीकरण में काफी तेजी आ सकती है और यह सुनिश्चित किया जा सकता है कि आगार तकिया कोशिकाओं के बाद के बोने के लिए पर्याप्त रूप से दृढ़ हो । यह बहुलकीकरण प्रक्रिया के दौरान हर समय थाली) स्तर को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में आगर के गरीब बहुलीकरण/

इस प्रोटोकॉल में भी रेखांकित किया गया है, हम स्टेम-जैसे स्फेरॉइड-व्युत्पन्न कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए 2डी मोनोलेयर संस्कृति में एपिडर्मोस्फीयर का प्रचार करने के लिए एक रणनीति पेश करते हैं। एपिडर्मल स्पेरोइड री-प्लेटिंग परख इंटीग्रिन 6 हाय/ईजीएफआरलो केराटिनोसाइट्स की स्टेम सेल जैसी उपआबादी के लिए समृद्ध होती है । इन कोशिकाओं का उपयोग एपिडर्मल पुनर्निर्माण, सोरायसिस, या सेलुलर नियोप्लासिया11, 12,14का अध्ययन करनेकेलिए किया जा सकता है। Integrinα6 हाय/EGFRलो keratinocytes भी आसानी से FACS द्वारा अलग किया जा सकता है और इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला द्वारा विशेषता । इस तरह के प्रयोगों का आयोजन करते समय, हमने नियंत्रण के रूप में अनसोर्ट ऑटोलॉगस 2डी मोनोलेयर कोशिकाओं का उपयोग करना उपयोगी पाया।

संक्षेप में, यह रिपोर्ट दर्शाती है कि मानव एपिडर्मल स्पेरोइड री-प्लेटिंग मॉडल केराटिनोसिएट रिजेनरेटिव प्लास्टिसिटी इन विट्रो,क्योंकि यह पुनर्जनन के चार चरणों में से प्रत्येक को कैप्चर करता है: होमोस्टैटिक रखरखाव, भेदभाव उत्क्रमण, तनाव वंश गतिशीलता, और ऊतक बहाली। हालांकि, आगर आधारित स्व-असेंबली की एक सीमा यह है कि सभी एनएचकेसी दाग अनायास ही स्फेरॉइड बनाने में सक्षम नहीं हैं। हैंगिंग ड्रॉप विधि15 इस चुनौती से उबरने और बहुकोशिकीय गोलाकार गठन को प्रेरित करने के लिए एक अच्छी वैकल्पिक रणनीति है। एपिडर्मल पुनर्जनन पर विभिन्न कोशिका आबादी के योगदान में और अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए मांसपेशियों, स्ट्रोमल या प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ भी इस परख को मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है। यह पता लगाना दिलचस्प होगा कि आगर में मैट्रिक्स के अलावा एपिडर्मॉस्फीयर अस्तित्व और शक्ति को बढ़ा सकता है या नहीं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए वित्तीय संबंध नहीं हैं।

Acknowledgments

यूओएफएसी स्कूल ऑफ मेडिसिन इंस्ट्रूमेंटेशन रिसोर्स फैसिलिटी (आईआरएफ) ने इमेजिंग और सेल छंटाई उपकरण और तकनीकी सहायता तक पहुंच प्रदान की। इस काम को अनुदान द्वारा भाग में समर्थन दिया गया था 1R21CA201853। एमसीएफ और आईआरएफ को एनआईएच ग्रांट P20GM103499, SC INBRE से आंशिक समर्थन मिलता है। एमसीएफ को एनआईएच ग्रांट P20GM109091 से भी समर्थन मिलता है । Yvon Woappi एनआईएच अनुदान 2R25GM066526-06A1 (PREP) और R25GM076277 (IMSD) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, और UofSC में ग्रेस जॉर्डन McFadden प्रोफेसरों कार्यक्रम द्वारा एक फैलोशिप द्वारा । गेराल्डीन एजेका और जस्टिन वर्सेलिनो को यूओएससी में एनआईएच ग्रांट 2R25GM066526-10A1 (PREP) द्वारा समर्थित किया गया था। शॉन एम Bloos UofSC में २०१६ मैगलन विद्वान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Affymetrix platform Affymetrix For microarray experiments
Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file Affymetrix Process
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent For microarray experiments
All Prep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204 Used for RNA isolation
Analysis Console Software version 3.0.0.466 analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance
BD FACSAria II flow cytometer Beckman For flow cytometry
Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
Cytokeratin 14 Santa Cruz Biotechnology sc-53253 1:200 dilution
Dispase Sigma-Aldrich D4818 For cell media
FITC-conjugated anti-integrinα6 Abcam ab30496 For FACS analysis
GeneChip Command Console 4.0 software Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For confirming data quality
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA
GeneChip Hybridization Oven 640 Thermo Fisher Scientific For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples
GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For washing and staining of hybridized arrays
GeneChip Scanner 3000 7G system Affymetrix/Thermo Fisher Scientific Scanning hybridized arrays
GeneChip WT PLUS Reagent Kit Affymetrix/Thermo Fisher Scientific For amplifycation of biotinylating total RNA
Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) Cell Signaling Technology 8910 For cell media
Human Epidermal Growth Factor (hEGF) Cell Signaling Technology 8916 For cell media
Human Insulin Millipore Sigma 9011-M For cell media
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) Bio-Rad 1708880 Used for RT-qPCR
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Used for RT-qPCR
KSFM ThermoFisher Scientific 17005041 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
KSFM-scm ThermoFisher Scientific 17005042 Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml
basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin
MCDB 153-LB basal medium Sigma-Aldrich M7403 MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer
NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS Stellar Scientific NST230111 For immunostaining
P63 Thermo Scientific 703809 1:200 dilution
PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) BD Pharmingen 555997 For FACS analysis
pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector Addgene 20672 For transfection
Promega TransFast kit Promega E2431 For transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro Kit Qiagen For microarray experiments
Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units Thermo Scientific 09-740-63D For cell media
Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope Zeiss Use with Axiovision Rel. 4.5 software

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References

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