Summary
Aquí describimos un protocolo para el cultivo sistemático de esferoides epidérmicos en cultivo de suspensión 3D. Este protocolo tiene una amplia gama de aplicaciones para su uso en una variedad de tipos de tejidos epiteliales y para el modelado de varias enfermedades y afecciones humanas.
Abstract
La desregulación epitelial es un nodo para una variedad de afecciones y dolencias humanas, incluidas heridas crónicas, inflamación y más del 80% de todos los cánceres humanos. Como tejido de revestimiento, el epitelio de la piel a menudo está sujeto a lesiones y se ha adaptado evolutivamente al adquirir la plasticidad celular necesaria para reparar el tejido dañado. A lo largo de los años, se han realizado varios esfuerzos para estudiar la plasticidad epitelial utilizando modelos in vitro y ex vivo basados en células. Sin embargo, estos esfuerzos han sido limitados en su capacidad para recapitular las diversas fases de la plasticidad de las células epiteliales. Describimos aquí un protocolo para generar esferoides epidérmicos 3D y células derivadas de esferoides epidérmicos a partir de queratinocitos humanos neonatales primarios. Este protocolo describe la capacidad de los cultivos de esferoides epidérmicos para modelar funcionalmente distintas etapas de la plasticidad generativa de queratinocitos y demuestra que el rechapado de esferoides epidérmicos puede enriquecer cultivos heterogéneos de queratinocitos humanos normales (NHKc) para integrinaα6hi/ EGFRlo queratinocitos subpoblaciones de queratinocitos con características mejoradas similares a los tallos. Nuestro informe describe el desarrollo y mantenimiento de un sistema de alto rendimiento para el estudio de la plasticidad de los queratinocitos cutáneos y la regeneración epidérmica.
Introduction
El epitelio estratificado de mamíferos es la arquitectura epitelial más compleja en todos los sistemas vivos y con mayor frecuencia está sujeto a daños y lesiones. Como tejido protector, el epitelio estratificado ha evolucionado para generar una respuesta compleja y efectiva al daño tisular. Tras la lesión, estas células deben activar programas de plasticidad de linaje, que les permitan migrar al sitio lesionado y llevar a cabo la reparación1,2,3. Esta respuesta multifacética ocurre en varios pasos secuenciales que siguen siendo poco conocidos.
Un obstáculo importante en el estudio del intrincado proceso de regeneración epitelial radica en la escasez de sistemas modelo de alto rendimiento que puedan capturar actividades celulares dinámicas en etapas definidas de regeneración celular. Si bien los modelos de ratones in vivo ofrecen información relevante sobre la cicatrización de heridas y recapitulan más de cerca el proceso regenerativo humano, su desarrollo requiere esfuerzos laboriosos y un costo significativo, lo que limita su capacidad de rendimiento. Existe, por lo tanto, una necesidad crítica de establecer sistemas que permitan la investigación funcional de la regeneración del tejido epitelial humano a una escala de alto rendimiento.
En los últimos años, se han hecho varios intentos para enfrentar el desafío de la escalabilidad. Esto se ve a través de una gran expansión de modelos innovadores basados en células in vitro y ex vivo que imitan de cerca el contexto regenerativo in vivo. Esto incluye avances en organ-on-chip4,esferoide5,organoide6y cultivos organotípicos7. Estos sistemas basados en células 3D ofrecen ventajas únicas y presentan distintas limitaciones experimentales. Hasta la fecha, el cultivo de esferoides sigue siendo el modelo de cultivo celular 3D más rentable y ampliamente utilizado. Y aunque varios informes han indicado que los cultivos de esferoides se pueden utilizar para estudiar las características de las células madre de la piel, estos estudios se han realizado en gran medida con tejido animal8,9o con fibroblastos dérmicos10,sin prácticamente informes que caractericen a fondo las propiedades regenerativas de los cultivos de esferoides epidérmicos humanos. En este protocolo detallamos el desarrollo funcional, el cultivo y el mantenimiento de cultivos de esferoides epidérmicos a partir de queratinocitos humanos normales (NHKc). Igualmente describimos la utilidad de este sistema para modelar las fases secuenciales de la regeneración epidérmica y la plasticidad de las células madre queratinocitos in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El protocolo para la recolección y manejo de muestras de piel y aislamiento de queratinocitos humanos ha sido revisado por el IRB de la Universidad de Carolina del Sur (UofSC) y clasificado como "investigación que no involucra sujetos humanos", ya que los especímenes de prepucio eran descartes quirúrgicos producidos durante procedimientos quirúrgicos de rutina (circuncisión de niños neonatos) y estaban completamente desprovistos de información de identificación. El protocolo también fue revisado y aprobado por el Comité de Bioseguridad de la UofSC de forma regular, y todo el personal de laboratorio se sometió a capacitación en bioseguridad de laboratorio. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con los estándares de seguridad y ética de UofSC.
1. Aislamiento y cultivo de queratinocitos humanos a partir de tejido del prepucio neonatal
- Prepare el medio de lavado agregando un tampón HEPES de 0.1 M a 500 ml de medio KSFM y ajústelo a un pH de 7.2. Esterilizar el medio en un filtro de vacío de 500 ml (tamaño de poro de 0,22 μm). El medio basal MCDB 153-LB también se puede utilizar como una solución de lavado alternativa en lugar de KSFM.
- En una campana de flujo laminar, lave el prepucio neonatal con 5 ml de medios de lavado en un tubo cónico de 50 ml. Repetir dos veces.
- Transfiera el prepucio lavado a una placa de Petri estéril. Usando un bisturí y forzapas, raspe los tejidos conectivos adiposos y sueltos de la capa dérmica. Vuelva a lavar el prepucio con 5 ml de medios de lavado en un tubo cónico de 50 ml.
- Coloque la epidermis del prepucio hacia arriba en una placa de 6 ortes que contenga 2 ml de enzima dispasa diluida en medios de lavado (50 U / ml).
- Transfiera la placa a una incubadora durante 4 horas (37 ° C, 5% CO2,95% de humedad).
- Retire el prepucio de la incubadora y, en condiciones estériles, transfiéralo a una placa de Petri. Usando forrceps de punta fina, separe la epidermis de la capa de la dermis.
- Coloque la epidermis en un tubo cónico de 15 ml que contenga 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25%. Usando una pipeta serológica de 5 ml, aplaste mecánicamente la epidermis flotante. Incubar durante 15 min a 37 °C con vórtice periódico durante 5 s cada 5 min.
- Después de la incubación, agregue 2 ml de inhibidor de tripsina de soja y mezcle mediante pipeteo para neutralizar la tripsina.
- Suspensión de la célula centrífuga durante 2 min a 450 x g, y luego durante 8 min a 250 x g.
- Retire los escombros flotantes con pinzas, teniendo cuidado de no desalojar la bolita de la celda. Aspire cuidadosamente el sobrenadante de la bolita celular.
- Resuspend pellet en 12 mL de medio KSFM-scm completo y plato en un plato de 10 cm. Incubar el plato durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).
- Al día siguiente, retire el medio con una pipeta aspiradora y reemplácelo con 12 ml de KSFM-scm completo. Repita los días 4 y 7.
- Para mantener un crecimiento óptimo de los cultivos normales de queratinocitos humanos (NHKc), las células de paso 1:5 el día 10 para evitar que las células alcancen una confluencia superior al 80%.
2. Generación de cultivos de epidermosfera cutánea in vitro
- Prepare una mezcla de agarosa al 5% agregando 2.5 g de agarosa a 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), en una botella de vidrio de 50 ml. Botella de autoclave bajo ciclo líquido. Dejar enfriar a temperatura ambiente.
- Para preparar los platos, coloque la botella de vidrio enfriada que contiene la solución de agarosa en un vaso de precipitados de plástico de 1 L lleno de agua desionizada de 200 ml (dH2O). Derrita la mezcla de agarosa en un microondas de grado de investigación durante un tiempo de hasta 2 minutos, mezclando el agar cada 60 s inclinando suavemente la botella de lado a lado.
PRECAUCIÓN: La fusión del agar en el microondas hará que el recipiente del matraz se caliente mucho, lo que provocará una acumulación de presión. Libera la acumulación de presión cada 30 s. Use el equipo de protección adecuado para evitar lesiones. - Añadir 3 ml de agarosa derretida al 5% a 12 ml de KSFM-scm precalentado a 42 °C para una concentración final de agarosa al 1% (wt/vol).
Opcional: precalentar las pipetas serológicas y las puntas de la pipeta para evitar la polimerización prematura del agar blando. - Pipetee rápidamente 200 μL de la mezcla de agar al 1% en pozos individuales de una placa de fondo redondo de 96 pozos utilizando un pipeteador multicanal(Figura 1A). Deje la placa en un ambiente estéril a 25 °C durante 4 h para permitir que la agarosa se polimerice por completo.
NOTA: La experimentación se puede detener aquí y continuar al día siguiente. Las placas de agarosa polimerizadas se pueden mantener a 37 °C hasta 24 h o a 4 °C durante un tiempo de hasta 48 h cuando se sellan con envoltura de parafilm. Caliente la placa a 37 °C en una incubadora humidificada durante al menos 1 h antes de su uso. - Paso de NHKc formadora de esferoides mediante medios de aspiración y células de lavado en 2 mL de PBS. Aspire PBS y agregue 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a las células lavadas. Incubar durante 5 min a 37 °C o hasta que todas las células se desprendan por completo. Agregue 2 ml de inhibidor de tripsina de soja a la placa y lave las células de la placa en un tubo de 15 ml. Centrífuga a 250 x g durante 5 min.
- Pellet resuspend en 1 mL de PBS. Cuantifique la viabilidad celular utilizando tinción azul tripano y un hemocitómetro o un contador celular automatizado.
- Alícuota 2 x 104 NHKc en 100 μL de KSFM-scm y semilla en pozos individuales de placa de fondo redondo de 96 pozos previamente preparada. Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).
- Usando un microscopio de contraste de fase invertida, analice bien sembrado para la formación de epidermosfera.
NOTA: Las epidermósferas humanas de queratinocitos humanos normales pueden permanecer viables en cultivo de suspensión 3D hasta 96 h, aunque con una disminución considerable de la viabilidad celular (Figura 2).
3. Ensayo de re-recubrimiento de esferoides epidérmicos
- 24-48 h después de la formación de la epidermosfera 3D, agregue 4 ml de KSFM-scm precalentado a un plato de 6 cm. Use una punta de pipeta de 1 ml de diámetro ancho para transferir un solo esferoide a la placa, asegurándose de no romperla. Alternativamente, ensancha una punta de pipeta de 1 ml usando una cuchilla de afeitar estéril para cortar la punta.
- Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).
- Analice el esferoide sembrado para su fijación a la parte inferior de la placa y observe la propagación de células utilizando un microscopio de contraste de fase invertida(Figura 3). Alimente las células cada 96 h retirando suavemente 2 ml del medio dentro de la placa y agregando lentamente 2 ml de medios KSFM-scm frescos a la placa.
- Paso derivado de esferoides derivados (SD) NHKc una vez que alcanzan el 70-80% de confluencia y continúan con el ensayo de elección. Monitoree SD-NHKc con frecuencia para evitar que las células alcancen la confluencia completa en cultivo, ya que esto resulta en una diferenciación prematura y una detención del crecimiento celular(Figura 3E-F).
- El ensayo de replanteo de esferoides epidérmicos modela la reparación de heridas mediada por queratinocitos capturando cada una de las fases secuenciales clave de la plasticidad regenerativa epidérmica: a) mantenimiento homeostático, b) detención / reversión de la diferenciación c) movilidad del linaje de estrés y d) restauración de tejidos(Figura 1B; Tabla 2). Este ensayo también se puede utilizar para producir poblaciones celulares para cultivos organotípicos en balsa o para modelar neoplasias mediadas por VPH como se demostró en nuestro trabajo anterior 11,12.
4.3D seguimiento de células de fluorescencia
- En un plato de 6 cm, transfectar cultivos NHKc monocapa 2D formadores de esferoides con 1 μg de vector plásmido pMSCV-IRES-EGFP que lleva el gen de la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP). Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad) microscopio(Figura 4A).
NOTA: Es importante que la transfección se complete en condiciones libres de suero y sin antibióticos. - Sin eliminar la mezcla de transfección, agregue 2 ml de KSFM-scm precalentado a las células. Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).
- Aspire todos los medios de transfección de la placa y las células de alimentación con 3 ml de KSFM-scm precalentado. Evalúe la presencia de células que expresan EGFP bajo el canal FITC de un microscopio fluorescente.
- Paso y siembra 2 x 104 células transfectadas por EGFP en pozos individuales de una placa de fondo redondo de 96 pozos previamente preparada. Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad). Visualizar y monitorear el movimiento de las células esferoidespos EGFP bajo el canal FITC de un microscopio de fluorescencia (Figura 4B-C).
- 24 h después del emplatado, agregue 3 ml de KSFM-scm precalentado a un plato de 6 cm. Use una punta de pipeta de 1 ml de diámetro ancho para transferir un solo esferoide a la placa, asegurándose de no romperla. Incubar la placa durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).
- Observe y analice la propagación de SD-NHKcEGFP utilizando un microscopio de fluorescencia. Alimente las células cada 96 h retirando suavemente 2 ml de los medios dentro de la placa y agregando lentamente 2 ml de medios KSFM-scm frescos a la placa.
- Cosecha SD-NHKCEGFP para aislamiento FACS o ensayos de elección.
5. Caracterización de subalternes derivadas de esferoides (DE) por FACS
- Pasaje SD-NHKc y correspondientes cultivos monocapa 2D autólogos mediante aspiración de medios viejos y células de lavado en 2 mL de PBS. Retire el PBS y agregue 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a las células lavadas. Incubar a 37 °C durante 5 min o hasta que todas las células se desprendan por completo.
- Agregue 2 ml de inhibidor de tripsina de soja a la placa y transfiera las células a un tubo de 15 ml. Centrífuga a 250 x g durante 5 min.
- Resuspend pellets en 1 mL de PBS. Cuantificar la viabilidad celular utilizando azul tripano y un contador celular automatizado de hemocitómetro.
- Alícuota de 100 μL que contiene 0,1-4 x 106 células NHKc a 1,5 ml de tubos de microcentrífuga. Coloque el tubo sobre hielo en un ambiente oscuro, creado apagando las luces brillantes dentro de la campana laminar.
- Añadir 2 μL de anti-integrina conjugada con FITCα6 y 2 μL de anti-EGFR conjugado con PE a los tubos para lograr una dilución de 1:50. Prepare un tubo sin anticuerpos agregados para que sirva como control no manchado. Incubar tubos sobre hielo en la oscuridad o a 4 °C durante 30 min. El uso de perlas o una línea de SCC de piel puede servir como control positivo, ya que las células de SCC de la piel expresan niveles elevados de integrinaα6 y EGFR.
- Realizar análisis de citometría de flujo utilizando citómetro de flujo de elección que contenga con láseres apropiados.
- Use los controles negativo y positivo para establecer puertas. Ordenar la subpoblación de integrinaα6hi/EGFRlo células; estos son la fracción de células madre epidérmicas. Las células integrinα6hi/EGFRhi son la fracción de células progenitoras proliferativas. Las células integrinα6lo/EGFRhi son la fracción celular progenitora comprometida (Figura 4D). Los tubos FACS de clasificación deben contener al menos 1 ml de KSFM-scm helado.
- Pruebe la capacidad proliferativa de las subpoblaciones de células clasificadas transfiriendo el contenido de cada tubo de clasificación respectivo a un tubo cónico de 15 ml que contiene 10 veces el volumen de células clasificadas en PBS. NOTA: Es importante eliminar todas las células unidas al borde pipeteando la pared de los tubos FACS de clasificación varias veces, ya que los queratinocitos a menudo pueden adherirse allí.
- Centrífuga de 15 mL tubos a 250 x g durante 5 min. Retire el pellet sobrenadante y resuspend en 12 ml de KSFM-scm. Transfiera las células resuspendidas a una placa de 6 cm e incube durante la noche (37 ° C, 5% CO2, 95% de humedad).
- Al día siguiente, retire los medios en las placas y agregue 8 ml de KSFM-scm precalentados. Incubar a 37 ° C, 5% de CO2,95% de humedad. Re-alimentar las células con 12 ml de medio cada 3 días hasta un 70-80% de confluencia (Figura 4E).
6. Inmunofluorescencia y tinción de epidermósferas para marcadores de células madre basales
- Transfiera epidermósferas a fundas recubiertas con poli-lisina. Permita que SD-NHKc se propague hasta un 75% de confluente.
- Lave las células dos veces en PBS (4 °C) durante 5 minutos cada una.
- Fije las células con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 20 min a temperatura ambiente.
- Permeabilizar las células con 0,5% de Tritón X-100 en 1% de glicina. Bloquee usando 0.5% BSA y 5% de suero de cabra durante 30 min a temperatura ambiente.
- Incubar muestras con anticuerpos contra P63 (1:200) y citoqueratina 14 (1:200) en solución de bloqueo durante la noche a 4 °C.
- Lavar tres veces con PBS (4 °C) que contenga Tween 20 (PBST), seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados FITC y Alexa 568 (dilución 1:1000).
- Teñir núcleos con 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (dilución 1:5000) antes de montar células.
- Observe las células utilizando un microscopio con capacidad fluorescente con líneas láser FITC y PE (Figura 4F).
7. Análisis transcripcional de cultivos epidermósferos
- Establecer placas triplicadas de cultivos NHKc de paso bajo para aislar el ARN puede ser de cultivos monocapa, esferoides y derivados de esferoides de la misma línea celular autóloga.
- Pool 3-5 epidermósferas correspondientes en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cosecha por separado cultivos autólogos SD-NHKc y monocapa 2D.
- Aislar el ARN total de los tres grupos.
- Realizar transcripción inversa con 1 μg de ARN total.
- Utilizando cDNA, realizar PCR en tiempo real, utilizando GAPDH como control interno (Tabla 1).
- Valide el tamaño del producto de amplicón mediante electroforesis en gel de agarosa (2% v/v).
NOTA: Para el perfil transcriptómico de cultivos de epidermosfera utilizando el análisis de microarrays de genoma completo, aísle el ARN total de cultivos masivos de un solo donante de NHKc y el correspondiente SD-NHKc del mismo donante, en seis réplicas cada uno. - Evalúe la calidad del ARN utilizando un bioanalizador para lograr números de integridad de ARN (RIN) que van desde al menos 9.0 a 9.1.
- Realizar experimentos de microarrays amplificando y biotinilando muestras de ARN total.
- Transcribir inversamente 100 ng de ARN total por muestra en ds-cDNA utilizando cebadores aleatorios de NNN que contienen una secuencia promotora de ARN polimerasa T7.
- Agregue la ARN polimerasa T7 a las muestras de ADNc para amplificar el ARN, luego copie el ARN a ss-cDNA. Degradar el exceso de ARN mediante el uso de RNasa H.
- Fragmente las moléculas de sscDNA y etiquete con biotina.
- Amplificar las muestras etiquetadas durante 16 h a 45 °C.
- Hibridar muestras utilizando un horno de hibridación y un kit de lavado y tinción.
- Lavar y teñir matrices hibridadas.
- Analice matrices utilizando un sistema y una estación de trabajo informática.
- Después de completar los escaneos de la matriz, importe los archivos de intensidad de celda de sonda (CEL) en el software de la consola de expresión y procese a nivel genético utilizando el archivo de biblioteca y el algoritmo de análisis multichip robusto (RMA) para generar archivos CHP.
- Después de confirmar la calidad de los datos en Expression Console, importe archivos CHP que contengan señales de expresión log2 para cada sonda en un software de análisis de transcriptoma para analizar las respuestas transcripcionales específicas del tipo de célula mediante el análisis unidireccional de la varianza entre sujetos.
8. Evaluación de la eficiencia de formación de colonias SD-NHKc
- Aspirar medios de placas cuando las células alcanzan el 70-80% de confluencia. Lave las células tres veces en PBS (4 °C) durante 5 minutos cada una.
- Fijar celdas con 3 mL de metanol al 100% (4 °C) durante 15 min. Lavar tres veces en PBS durante 5 min cada una.
- Tiñe las células en 3 mL de 10% Giemsa durante 30 min. Lavar tres veces en PBS durante 5 min cada una. Deje que las celdas se sequen al aire durante la noche.
- Analizar la formación de colonias al día siguiente y cuantificar el número de colonias obtenidas
9. Determinar la duplicación de la población SD-NHKc
- Pasaje SD-NHKc y correspondientes cultivos monocapa 2D autólogos mediante aspiración de medios viejos y lavado de células en PBS de 2mL. Retire el PBS y agregue 2 ml de tripsina-EDTA al 0,25% a las células lavadas. Incubar durante 5 min o hasta que todas las células se desprendan completamente (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).
- Agregue 2 ml de inhibidor de tripsina de soja a la placa y transfiera las células a un tubo de 15 ml.
- Centrífuga a 250 x g durante 5 min.
- Retire el sobrenadante y resuspenda el pellet en 12 ml de KSFM-scm.
- Células de semillas a baja densidad 1-2 x 104 NHKc en platos individuales de 10 cm e incubar durante la noche (37 °C, 5% CO2,95% de humedad).
- Placas de alimentación con 8 mL KSMF-scm al día siguiente. Alimente cada 4 días hasta al menos un 25% de confluente, luego alimente cada 2 días.
- Pasar en serie las celdas 1:5 en platos de 60 cm hasta agotar la capacidad de proliferación celular. Cuantificar la viabilidad celular mediante tinción de azul tripano. Determinar las duplicaciones de población en cada pasaje utilizando la fórmula: log(N/N0) / log2, donde N representa el número total de células obtenido en cada pasaje y N0 representa el número de células chapadas al comienzo del experimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Durante el ensayo de epidermosfera de la piel, los cultivos de NHKc se siembran en pozos recubiertos de agarosa de una placa de 96 pozos(Figura 1A). Las células formadoras de esferoides deben autoagregórse dentro de las 48 horas. La formación autónoma de esferoides se puede evaluar tan pronto como 24 h utilizando un microscopio estándar de contraste de fase invertido. La formación de la epidermosfera de la piel y el ensayo de re-recubrimiento modelan varias fases de la regeneración del tejido epidérmico(Figura 1B). La Figura 2 muestra imágenes de alta resolución de varias cepas de NHKc ensayadas para la capacidad de formación de esferoides epidérmicos en cultivo 3D. Es importante examinar las células para la agregación densa en forma de esfera, ya que este es un sello distintivo de la formación espontánea de esferoides. Encontramos necesario utilizar más de 2 x 104 células para asegurar una correcta agregación espontánea. La agregación celular no esférica, como se ve en las cepas Figura 2A,no se considera una formación adecuada de epidermosfera. El recubrimiento de suspensiones celulares no esferoides formadoras en cultivo monocapa 2D rara vez resulta en un crecimiento viable de células NHKc. Sin embargo, el recubrimiento de epidermosférmicas en cultivo 2D da como resultado la proliferación de NHKc viable de pequeño tamaño(Figura 3). Las imágenes de epidermósferas y SD-NHKc se pueden ver y monitorear utilizando un microscopio de contraste de fase invertido estándar. Es importante mantener estos cultivos por debajo del 100% de confluencia, ya que esto puede frenar considerablemente su crecimiento y estado de células madre en cultivo(Figura 3E-F). El proceso de formación de esferoides epidérmicos puede ser rastreado funcionalmente a nivel de una sola célula mediante la transfección de células con un reportero fluorescente (Figura 4A-C). En condiciones óptimas, la subpoblación de queratinocitos enriquecida principalmente en cultivos SD-NHKc son integrinaα6hi/EGFRlo células. Estas células generalmente constituyen alrededor del 25% de todos los cultivos SD-NHKc y pueden ser fácilmente aisladas por FACS(Figura 4D). Sin embargo, es importante establecer puertas de área de dispersión lateral delantera (FSC-A) y área de dispersión lateral (SSC-A) para excluir los dobletes(Figura 4D). Se puede lograr una caracterización adicional de esta subpoblación de queratinocitos similares al tallo mediante el análisis de tinción inmunofluorescente de la expresión de marcadores de células madre epidérmicas, como la citoqueratina basal 14 (K14) y la proteína tumoral 63 (P63) (Figura 4F; Tabla 2).
Figura 1: Cultivo de epidermósferas NHKc en suspensión 3D. (A) Representación esquemática del ensayo de re-recubrimiento de esferoides epidérmicos adaptado de 11. (B) Imágenes representativas de contraste de fase de cultivos de NHKc, esferoides epidérmicos y SD-NHKc en cada paso secuencial del ensayo de re-recubrimiento de esferoides epidérmicos. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:Evaluación del crecimiento de la epidermosfera cutánea. (A) Imágenes de seis cepas NHKc individuales no formadoras y (B) formadoras de esferoides en suspensión 3D flotante. (C) Epidermósferas obtenidas utilizando varias cantidades de NHKc. (D) Cuantificación del tamaño medio de la epidermosfera obtenida utilizando diferentes cantidades de NHKc en cultivo de suspensión 3D flotante. Las barras indican la desviación estándar. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cultivos derivados de esferoides en crecimiento. (A) Imágenes de contraste de fase de curso temporal de cultivos monocapa SD-NHKc que se propagan desde una epidermosfera adjunta 24 h, (B) 48 h, (C) 72 h y (D) 96 h después del rechapado en cultivo plástico 2D. (E) Cultivos SD-NHKc al 80% de confluencia y (F) 100% de confluencia 15 y 20 días después del replatado en cultivo plástico 2D, respectivamente. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Caracterización de subalternes derivadas de esferoides (DE). (A) Representación esquemática del ensayo de seguimiento celular 3D de epidermósferas in vitro descrito por Woappi et al. 202012. (B) Epidermósferas que expresan EGFP 2 h y (C) 24 h después de la siembra en cultivo 3D. (D) Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de subpoblaciones SD-NHKc. Aproximadamente 1/4de todas las células deben ser integrinaα6hi/EGFRlo. (E) Integrinα6hi/EGFRlo subpoblaciones producen holoclones de queratinocitos. (F) Análisis de tinción inmunofluorescente de la expresión de marcadores de células madre epiteliales basales en células Integrinα6hi/EGFRlo. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Secuencia de imprimación (5'-3') | ||
| Nombre del gen | Cartilla delantera | Imprimación inversa |
| ALDH1 | GCACGCCAGACTTACCTGTC | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG |
| EGFR | AGGCACGAGTAACAAGCTCAC | ATGAGGACATAACCAGCCACC |
| GAPDH | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| K14 | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | GATGACTGCGATCCAGAGGA |
| KI-67 | ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA |
| KLF4 | CCCACATGAAGCGACTTCCC | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA |
| TP63 | GGACCAGCAGATTCAGAACGG | AGGACACGTCGAAACTGTGC |
| β-Actina | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAAACAATGCC | CAGGCATGGCACGGATAAC |
Tabla 1. Describe las secuencias de cebadores de PCR utilizadas para la detección de genes seleccionados implicados en la plasticidad de los queratinocitos neonatales.
| Condición de cultivo | Apariencia de contraste de fase | Inmunotinción | Análisis FACS | Firma transcriptómica | |
| Mantenimiento homeostático | Monocapa 2D | Células de tamaño pequeño < 30 μm | K14, P63 | ITGα6med/EGFPmed | Mantenimiento epidérmico (K14, P63, IVL, K10) |
| Diferenciación halt/reversal | Esferoide 3D | Agregado multicelular compacto > 50 μm | K14, P63, Ki-67 | N/A | Desdiferenciación: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| Movilidad del linaje del estrés | Conexión esferoide 3D a 2D | Difusión de células de pequeño tamaño (< 20 μm) desde el borde esferoide | K14, P63, Ki-67 | ITGα6hi/EGFPmed | Proliferación de células de la piel: K14, K16, K17, Ki-67 |
| Restauración de tejidos | Monocapa de esferoides 3D a 2D | Propagación de células de pequeño tamaño < 20 μm | K14, P63, IVL | ITGα6hi/EGFPlo e ITGα6hi/EGFPhi | Formación de epidermis: K14, IVL, FLG |
Tabla 2. Estrategias para la caracterización fenotípica y molecular del ensayo de replatación de esferoides epidérmicos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El uso de sistemas de cultivo de esferoides 3D ha tenido una amplia utilidad en la evaluación de la madre celular. Se ha demostrado que estos sistemas mejoran el enriquecimiento de las células madre tisulares13, sin embargo, su utilidad para el estudio de las células madre epidérmicas humanas se ha explorado de manera limitada. Aquí, describimos una estrategia para enriquecer las células madre de queratinocitos humanos utilizando técnicas de cultivo 3D. En este sistema, los NHKc se cultivan como suspensiones de esferoides multicelulares autoensamblantes, compuestas por varios subtipos de queratinocitos suspendidos sobre lechos de agarosa que contienen KSFM-scm. La configuración de este protocolo es sensible al tiempo, ya que el agar se polimeriza rápidamente a temperatura ambiente. El precalentamiento de las pipetas serológicas, las puntas de micropipeta y el tubo de mezcla de agar / célula, así como el medio a 42 ° C, pueden reducir drásticamente la polimerización prematura. Observamos que colocar la placa de 96 pozos en 4 °C poco después de agregar mezcla de agar /medio a los pozos puede acelerar considerablemente la polimerización y garantizar que el cojín de agar sea lo suficientemente firme para la siembra posterior de células. Es importante mantener el nivel de placa en todo momento durante el proceso de polimerización, ya que la polimerización deficiente de la mezcla de agar / medio dará como resultado que las células se sierguen o crezcan dentro del agar blando, anulando el ensayo.
También descrito en este protocolo, presentamos una estrategia para propagar epidermósferas en cultivo monocapa 2D para generar células derivadas de esferoides similares a tallos. El ensayo de re-recubrimiento de esferoides epidérmicos enriquece para una subpoblación similar a una célula madre de integrinα6hi/ EGFRlo queratinocitos. Estas células se pueden utilizar para estudiar la reconstrucción epidérmica, la psoriasis o la neoplasia celular11,12,14. Integrinα6hi/ EGFRlo queratinocitos también pueden ser fácilmente aislados por FACS y caracterizados por tinción inmunofluorescente. Al realizar tales experimentos, encontramos útil usar células monocapa 2D autólogas sin clasificar como controles., las líneas celulares SCC de piel son una buena alternativa si no están disponibles.
En resumen, este informe demuestra que el re-recubrimiento de esferoides epidérmicos humanos modela la plasticidad regenerativa de queratinocitos in vitro,ya que captura cada una de las cuatro fases de la regeneración: mantenimiento homeostático, inversión de la diferenciación, movilidad del linaje de estrés y restauración de tejidos. Sin embargo, una limitación del autoensamblaje de esferoides a base de agar es que no todas las tinciones de NHKc son capaces de formar espontáneamente esferoides. El método de la gota colgante15 es una buena estrategia alternativa para superar este desafío y forzar la formación de esferoides multicelulares. Este ensayo también se puede multiplexar con células musculares, estromales o inmunes para obtener más información sobre la contribución de varias poblaciones celulares a la regeneración epidérmica. sería interesante explorar si la adición de Matrigel en el agar podría mejorar la supervivencia y la potencia de la epidermosfera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen relaciones financieras que revelar.
Acknowledgments
El UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) proporcionó acceso a equipos de clasificación de imágenes y células y asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención 1R21CA201853. El MCF y el IRF reciben apoyo parcial de la subvención P20GM103499 de los NIH, SC INBRE. El MCF también recibe apoyo de la subvención P20GM109091 de los NIH. Yvon Woappi fue apoyado en parte por las subvenciones de los NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) y R25GM076277 (IMSD), y por una beca del Programa de Profesores Grace Jordan McFadden en UofSC. Geraldine Ezeka y Justin Vercellino fueron apoyados por las subvenciones de los NIH 2R25GM066526-10A1 (PREP) en UofSC. Sean M. Bloos fue apoyado por el Magellan Scholar Award 2016 en la UofSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
