Summary
Kwantificering van de maximale kracht van de knie-extensor is noodzakelijk om functionele aanpassingen aan veroudering, ziekte, letsel en revalidatie te begrijpen. We presenteren een nieuwe methode om herhaaldelijk in vivo knie-extensie isometrisch piek tetanisch koppel te meten.
Abstract
Skeletspierplasticiteit als reactie op talloze aandoeningen en stimuli bemiddelt gelijktijdige functionele aanpassing, zowel negatief als positief. In de kliniek en het onderzoekslaboratorium wordt de maximale spierkracht op grote schaal longitudinaal gemeten bij mensen, waarbij knie-extensormusculatuur de meest gerapporteerde functionele uitkomst is. Pathologie van het knie-extensor spiercomplex is goed gedocumenteerd bij veroudering, orthopedisch letsel, ziekte en onbruik; de sterkte van de knie-extensor hangt nauw samen met de functionele capaciteit en het blessurerisico, wat het belang van betrouwbare meting van de knie-extensorsterkte onderstreept. Herhaalbare, in vivo beoordeling van de knie-extensorsterkte in preklinische knaagdierstudies biedt waardevolle functionele eindpunten voor onderzoeken naar artrose of knieletsel. We rapporteren een in vivo en niet-invasief protocol om herhaaldelijk het isometrische piek tetanische koppel van de knie-extensoren bij muizen in de tijd te meten. We tonen consistentie aan met behulp van deze nieuwe methode om de knie-extensorsterkte te meten met herhaalde beoordeling bij meerdere muizen die vergelijkbare resultaten opleveren.
Introduction
Skeletspieren zijn een zeer aanpasbaar weefsel met compenserende veranderingen in massa en structuur als reactie op een groot aantal stimuli, zoals lichaamsbeweging, voeding, letsel, ziekte, veroudering en onbruik. Veel studies die de aanpassing van skeletspieren bij mensen onderzoeken, gebruiken methoden om zowel de grootte van de skeletspier als de impact op de functie te meten, omdat krachtbeoordelingen van de gouden standaard gemakkelijk herhaalbaar zijn bij menselijke proefpersonen.
In het bijzonder worden knie-extensor en flexorsterkte het meest beoordeeld in klinisch onderzoek. Veranderingen in de kracht van de knie-extensor zijn op grote schaal gemeld in menselijke studies van veroudering, lichaamsbeweging, orthopedisch letsel, knieartrose, chronische ziekte en onbruik1,2,3,4,5,6,7. Methoden om herhaaldelijk en niet-invasief de kracht van de knie-extensorspier (quadriceps) te analyseren in mechanistische knaagdierstudies zijn echter relatief beperkt. Een methode om in vivo quadriceps spiercontractiliteit bij ratten te bepalen werd eerder ontwikkeld8; uitgebreide constructie van niet-commercieel beschikbare apparatuur is echter vereist. Gezien de breedte van knaagdiermodellen die zijn ontwikkeld om musculoskeletale uitkomsten na knieletsel / artrose9,10,11,12,13 tebestuderen,bestaat er behoefte aan niet-invasieve beoordeling van de sterkte van quadriceps.
Bovendien maken knaagdierstudies die moleculaire mechanismen onderzoeken die ten grondslag liggen aan de aanpassing van skeletspieren vaak gebruik van muismodellen vanwege de eenvoud van genetische modificatie, net als veel farmacologische interventiestudies vanwege de verminderde financiële kosten die gepaard gaan met een lagere op gewicht gebaseerde dosering van een medicijn bij muizen in vergelijking met ratten. We rapporteren een niet-invasieve methode om herhaaldelijk de in vivo knie-extensorfunctie in dezelfde muis in de loop van de tijd te meten met behulp van commercieel beschikbare apparatuur met kleine wijzigingen, waardoor reproduceerbaarheid tussen verschillende laboratoria wordt vergemakkelijkt en een directere vergelijking met menselijke krachtresultaten wordt geboden.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de University of Kentucky Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Apparatuur instellen
- Controleer of machines zijn aangesloten volgens de specificaties van de fabrikant.
- Als deze nog niet op zijn plaats is, bevestigt u de 300D-305C-FP-motor met knieverlengingsapparaat aan het 809C-dierenplatform.
- Zet de waterpomp aan op 37 °C om te beginnen met het verwarmen van het platform.
- Als de computer nog niet is ingeschakeld, schakelt u de computer in, gevolgd door de High-Power Bi-Phase Stimulator en het 2-kanaals dual-mode leversysteem.
- Giet isofluraan in de verdamper tot een maximale vullijn.
2. Software instellen
- Open de software (details in tabel met materialen).
- Als u de functie Directe stimulatie in combinatie met Live Data Monitor wilt gebruiken om de plaatsing van de sonde te optimaliseren (stap 4), selecteert u Experiment voorbereiden gevolgd door Instant Stim configureren (Afbeelding 1). Stel de pulsfrequentie (Hz) in als 125, pulsbreedte (ms) als 0,2, aantal pulsen als 1, treinfrequentie (Hz) als 0,5 en looptijd (s) als 120.
- Selecteer Bestand en open Live Data Monitor.
- Om twitch-experimenten (stap 5) en koppelfrequentie-experimenten (stap 6) uit te voeren, selecteert u een eerder geprogrammeerde studie met geschikte twitch- en knieverlengingskoppelfrequentie-experimenten (hieronder beschreven in stap 5 en stap 6).
- Selecteer de juiste experimentele muis of Nieuw dier toevoegen en voer de bijbehorende muisinformatie in die moet worden opgeslagen met koppelgegevens.
- Selecteer Volgend experiment of Vorig experiment om over te schakelen van twitch-protocol naar koppelfrequentievolgorde.
3. Muis instellen
- Plaats de individuele muis in de verdovingskamer.
- Laat de klep van de zuurstoftank los en stel het zuurstofdebiet in op 1 l / min met 2,5% isofluraan.
- Zorg ervoor dat de muis in de kamer blijft met het deksel goed gesloten totdat hij volledig bewusteloos is. Bevestig volledig bewustzijnsverlies door afwezige voetreflex met teenknijpen.
- Plaats de verdoofde muis in rugligging met de kop in de neuskegel op het verwarmde platform met zuurstofdebiet van 1 l/min met 2,5% isofluraan.
- Scheer het haar van de rechter achterpoot met behulp van elektrische tondeuses. Verwijder het haar uit het geschoren gebied met een alcoholdoekje en een klein vacuüm. Reinig verwijderd haar weg van de achterpoot en het platform.
- Klem de bovenste achterpoot, achterste naar de knie (figuur 2) stevig vast.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het bewegingsbereik van de knie niet wordt belemmerd. - Plaats de onderste achterpoot in het knie-extensieapparaat waarbij het voorste scheenbeen lichtjes het verstelbare plastic stuk raakt (de force in-kanaallezing moet tussen 0 en -1,0 mN * m lezen). Afhankelijk van de grootte van de onderste achterpoot van de muis, kan chirurgische tape rond het onderste deel van het verstelbare plastic stuk worden gewikkeld om het been veilig te laten rusten.
OPMERKING: Gedetailleerde afbeeldingen en afmetingen van het op maat gemaakte plastic stuk zijn weergegeven in aanvullende figuur 1. - Stel de knoppen op het platform in om ervoor te zorgen dat de knie 60° wordt gebogen.
- Plaats lichtjes een stuk tape over de muisroo op het platform om compenserende bewegingen met maximale knieverlenging te voorkomen.
4. Plaatsing van de elektrode
- Plaats elektroden subcutaan 2-4 mm proximaal tot de knie direct boven de quadriceps/knie-extensorspieren(figuur 2). Elektroden moeten ongeveer 1-2 mm uit elkaar staan.
- Om de optimale plaatsing van elektroden te bepalen, gebruikt u de functie Instant Stimulation met Live Data Monitor. Stel de stroom/stroom in op 50 mA voor herhaalde spiertrekkingen om de knieverlenging te bevestigen (de knie-extensoren produceren een negatieve twitchcurve). Pas de sondes aan tijdens Instant Stimulation om een maximaal knieverlengingskoppel te bereiken, zoals gemeten in het Live Data Monitor-venster.
OPMERKING: Figuur 3 toont een representatieve Instant Stimulation-output, die de knie-extensie bevestigt. Aanvullende video 1 en aanvullende video 2 tonen real-time en slow-motion knie-extensortrekkingen zonder dat de motorarm op zijn plaats is, waardoor visuele bevestiging van knie-extensie mogelijk is. - Tijdens herhaalde spiertrekkingen met Instant Stimulationpalpeert u de kniebuigspieren met de wijsvinger om te bevestigen dat er geen activering van antagonistspieren is. Om knie-extensoren maximaal te stimuleren, kan sondeherpositionering nodig zijn, afhankelijk van de lichaamssamenstelling van de muis en kleine anatomische verschillen in de exacte locatie van het motorische punt van de heupzenuw en knie-extensorspieren.
OPMERKING: Een spiermotorisch punt is de locatie waar de motorische tak van een zenuw de spierbuik binnenkomt en is het punt met de minste weerstand tegen elektrische geleidbaarheid en vervolgens de hoogste responsiviteit op elektrischestimulatie 14,15. In klinische toepassingen met behulp van elektrische stimulatie wordt dit punt geïdentificeerd door te scannen met een penelektrode om de locatie boven de spier te vinden waar een spiertrekking optreedt met de laagst geïnjecteerde stroom14,15. Identificatie van het spiermotorische punt is essentieel om optimale neuromusculaire elektrische stimulatie tevergemakkelijken 15. In klinische onderzoeken bij mensen zijn spiermotorische punten voor quadricepsspieren geïdentificeerd in de distale helft van de spier14. Om optimale knie-extensorstimulatie bij muizen te bereiken, werd deze techniek samengevat met behulp van elektrodeplaatsing met Instant Stimulation om de spiermotorische puntlocaties die typisch worden aangetroffen in de distale helft van knie-extensoren het dichtst bij elkaar te benaderen. Er bestaat enige variabiliteit in de plaatsing van elektroden (van relatief oppervlakkig tot diep) die resulteert in een maximaal koppel, en de Instant Stimulation-functie vergemakkelijkt een optimale elektrodeplaatsing.
5. Bepaling van de optimale stroom
- Zodra de optimale plaatsing van de sonde is bepaald, voert u een reeks progressieve spiertrekkingen uit om de optimale stroom / stroom te bepalen die moet worden gebruikt voor het koppelfrequentie-experiment, met als doel de laagste stroom te bepalen om het maximale trekkoppel te bereiken. Begin met de huidige set op 50 mA en selecteer Experiment uitvoeren om een enkele twitch te produceren. Selecteer Resultaten analyseren om het koppelvermogen weer te geven. Noteer het twitch-koppel dat wordt weergegeven onder Max Force met basislijn afgetrokken.
OPMERKING: Selecteer de optie om het force-kanaal om te keren om metingen om te zetten van negatief koppel naar positief. - Verhoog de stroom tot 60-70 mA en herhaal het twitch-experiment. Noteer het twitch-koppel dat wordt weergegeven onder Max Force met basislijn afgetrokken.
- Ga op deze manier verder met een reeks twitch-experimenten (waarbij ongeveer 10-20 mA toeneemt met elke progressie) totdat het twitch-koppel niet langer toeneemt (plateaus of begint af te nemen). Voorbeeld van twitch-series is weergegeven in tabel 1.
- Registreer de laagste stroom waarbij het hoogste twitchkoppel werd bereikt. Deze stroom zal worden gebruikt en constant blijven tijdens het komende krachtfrequentie-experiment. Figuur 4 toont een representatieve piektrekking.
6. Koppelfrequentie-experiment om piek isometrisch tetanisch koppel te bepalen
- Selecteer in de software (zie Materiaaltabel) het voorgeprogrammeerde koppelfrequentie-experiment voor knie-extensie en zorg voor de volgende instelling. Stimulusduur: 0,35 s, Frequentievolgorde: 10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz, Rustperiode tussen pulsen/weeën: 120 s
OPMERKING: De bemonsteringsfrequentie is 10.000 Hz (standaardinstelling). - Voer Experiment uit, analyseer resultatenen noteer handmatig het koppel dat wordt weergegeven onder Max Force met basislijn afgetrokken (zorg ervoor dat het krachtkanaal omgekeerd is, omdat knie-extensorcontractie negatief koppel zal produceren) op elke frequentie. Let op de hoogste Max Force-waarde als het piek isometrische tetanische koppel. Het voorbeeld van koppelfrequentiegegevens wordt weergegeven in tabel 2 en figuur 5 toont een representatieve tetanuscurve voor het isometrische tetanische koppelvermogen dat wordt bereikt bij 120 Hz.
7. Beëindiging van het experiment
- Na voltooiing van het koppelfrequentie-experiment voert u een vervolgtrekking uit en vergelijkt u met de initiële piektrekking bij dezelfde stroom om schade / vermoeidheid te beoordelen.
OPMERKING: In sommige modellen van letsel en ziekte wordt een verhoogde vermoeibaarheid van de skeletspieren verwacht en vormt geen probleem met de experimentele opstelling of de muis. - Wanneer alle koppelmetingen zijn voltooid, verwijdert u voorzichtig elektrodesondes en maakt u de knie los.
- Schakel isofluraan uit en verwijder de muis van de neuskegel.
- Plaats de muis terug in een geschikte kooi die bovenop een warmhoudkussen is geplaatst. Controleer hoe de muis herstelt en weer bij bewustzijn komt.
OPMERKING: De muis moet binnen 2-3 minuten bij bewustzijn zijn en bewegen.
8. Data-analyse
- Extraheer gegevens na het experiment uit analysesoftware (zie Tabel met materialen).
- Open analysesoftware.
- Selecteer Gegevens ophalen uit de software.
- Selecteer Datum waarop het experiment is uitgevoerd en de juiste muiscode.
- Selecteer de frequentie van interesse (alle twitch-experimenten en elke frequentie van het koppelfrequentie-experiment worden weergegeven).
- Selecteer Spieranalyse.
- Controleer of Basislijncorrectie gebruiken is ingeschakeld.
OPMERKING: Het basiskoppel wordt door de software berekend als het gemiddelde van de eerste 100 bemonsterde punten en afgetrokken van de absolute maximale koppelwaarde. - Noteer de koppelwaarde die wordt vermeld onder Maximum.
OPMERKING: De hier gepresenteerde gegevens zijn ongefilterd; indien gewenst kan echter een filter in de software worden geselecteerd.
- Als alternatief, zoals hierboven beschreven in stap 6.2, registreert u handmatig de koppeluitvoer die wordt weergegeven onder Max Force in realtime op elk koppelfrequentiepunt / contractie via het venster Resultaten analyseren.
- Controleer of de basislijn is afgetrokken en het krachtkanaal is omgekeerd.
- Voer gegevens in een spreadsheet in voor berekeningen van het lichaamsgewicht (koppel / lichaamsgewicht in grammen) en grafieken en statistische analyses van belang. Statistische software werd gebruikt voor het in kaart brengen van koppelfrequentiecurven en het berekenen van het gebied onder de curve.
OPMERKING: Koppelgegevens worden gemeten in mN.m (milliNewton.meters).
- Om tetanuscurven te genereren, exporteert u volledige gegevens van elke frequentie uit de analysesoftware.
- Herhaal stap 8.1.1-8.1.4 hierboven.
- Selecteer Gegevens exporteren.
- Selecteer Onbewerkte gefilterde gegevens en sla op de gewenste locatie op. MATLAB kan worden gebruikt om tetanuscurven te genereren uit het geëxporteerde tekstbestand en/of voor verdere analyse.
OPMERKING: MATLAB-code om tetanuscurve uit tekstbestand te genereren is op aanvraag beschikbaar.
9. Kalibratie van het dual-mode hefboomsysteem
- Kalibreer het systeem vóór het eerste gebruik om nauwkeurige en betrouwbare gegevens te garanderen en herhaal de kalibratie periodiek met behulp van de software voor gegevensverzameling en bekende gewichten.
- Open dataverzamelingssoftware.
- Klik op het tabblad Instellingen en selecteer Kanaalinstellingen.
- Selecteer 305C-FP onder Mijn instrumenten.
- Klik op Selectie kalibreren om het venster Kalibratie-editor te openen.
- Om de lengte te kalibreren, voert u een reeks testspanningen in, waaronder zowel negatieve als positieve spanningen (bijv. -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V).
- Klik op Instellen voor de eerste regel.
- Klik op Lezen.
- Meet de exacte lengte van de hendelarm in millimeters en voer deze in de bijbehorende doos in.
- Herhaal dit voor de volgende spanning.
- Klik bij het registreren van alle spanningen op Cal-factoren berekenen (geregistreerd in mm/volt).
- Om kracht in te kalibreren, gebruikt u een reeks bekende gewichten die toenemen in een lineaire progressie.
- Stel de motor zo in dat deze op de rand van de bank of tafel rust met de hendelarm evenwijdig aan het tafelblad en over de rand hangt om het gewicht te laten hangen.
- Hang het eerste gewicht aan de hefboomarm met behulp van een elastiekje. Voer onder Toegepaste krachthet bekende gewicht in grammen in dat rekening moet houden met de massa van het elastiekje.
- Selecteer Lezen.
- Herhaal dit gedurende ten minste 3 bekende gewichten.
- Selecteer Cal-factor berekenen.
- Als u de berekening wilt controleren, kunt u kalibratiegegevens en curve passen door Plot Calte selecteren.
- Om de kracht te kalibreren, voert u kalibratiespanningen in (tot 10 volt)
- Klik op Instellen direct naast de kalibratiespanning.
- Herhaal dit voor elke spanningslijn.
- Oefen voorzichtig druk uit op de hefboomarm met een vinger totdat de Force Out ophoudt te veranderen en de motorarm begint te bewegen.
- Handhaaf deze positie. Selecteer Lezen.
- Herhaal dit voor elke spanningslijn.
- Selecteer Cal-factor berekenen.
Representative Results
De koppelfrequentiecurve maakt gebruik van lagere frequenties om meerdere geïsoleerde isometrische spiertrekkingen van relatief laag koppel te produceren en vordert door steeds hogere frequenties, wat resulteert in fusie van spiertrekkingen voor een isometrische tetanuscontractie waarbij piek tetanisch koppel wordt verkregen. Het gepresenteerde protocol voor knieverlenging piek tetanisch koppel de kracht-frequentie curve initieert bij 10 Hz die 3 geïsoleerde spiertrekkingen uitlokt. Gedeeltelijke fusie van spiertrekkingen vindt plaats bij 40 Hz en het piekkoppel van het tetanische koppel wordt bereikt tussen 120-180 Hz(figuur 5).
Figuur 6 illustreert representatieve knieverlenging koppelfrequentiecurven van vrouwelijke C57BL/6 muizen. Drie afzonderlijke muizen werden getest bij baseline en het experiment werd 2 weken later in elke muis herhaald voor vergelijking om de reproduceerbaarheid te beoordelen. Koppelfrequentiecurven worden weergegeven met ruwe koppelwaarden(figuur 6A),evenals ruwe koppelwaarden genormaliseerd naar het lichaamsgewicht van de muis(figuur 6B). Herhaalde observaties tonen vergelijkbare resultaten bij alle 3 muizen met een rustperiode van 2 weken tussen de experimenten. Lichaamsgewicht genormaliseerde koppelgegevens moeten worden overwogen naast het ruwe koppel, omdat kleine schommelingen in gewicht van invloed kunnen zijn op het functionele vermogen en niet alleen met ruw koppel worden overwogen. Bovendien vergemakkelijken lichaamsgewicht genormaliseerde koppelgegevens de vergelijking van muizen van verschillende groottes. Koppel kan ook worden genormaliseerd tot spier nat gewicht of myofiber dwarsdoorsnede gebied, zoals we eerder hebben aangetoond16.
Figuur 7A toont het gebied onder de curve met behulp van lichaamsgewicht genormaliseerde isometrische koppelgegevens van volledige koppelfrequentie-experimenten (10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz) voor 4 afzonderlijke C57BL / 6-muizen, met de nadruk op vergelijkbare totale koppeloutput en variatiecoëfficiënten tussen 5,6% en 8,8% met herhaalde experimenten binnen dezelfde muizen. Gegevens worden het eenvoudigst gerapporteerd als piek tetanisch koppel (figuur 7B), wat de maximale koppelwaarde is van de herhaalde tetanus isometrische contracties van 120-200 Hz. De piek tetanische koppeloutput is vergelijkbaar bij 6-8 maanden oude vrouwelijke C57BL/6-muizen (figuur 7B) met variatiecoëfficiënten tussen 4,8% en 8,7% met longitudinale beoordeling binnen dezelfde muizen. Het piekkoppel van tetanen is het meest vergelijkbaar met de goudstandaard sterktebeoordeling in menselijke studies: maximale isometrische toque.
Bovendien is het knie-extensor peak tetanic torque protocol een handig hulpmiddel om sterkteverschillen in meerdere muismodellen te detecteren. Figuur 8 toont het schril contrast tussen knie-extensorsterkte bij een niet-gewonde, gezonde 6 maanden oude C57BL/6 vrouwelijke muis (zwarte lijn) en een transgeen muismodel van suprafysiologische hypertrofie waarbij myostatine/GDF8 wordt uitgeschakeld (blauwe lijn). We tonen ook een piek tetanuscurve van een C57BL/6-muis 7 dagen na chirurgische transsectie van de voorste kruisband (ACL-T) (rode lijn), wat een afname van bijna 50% in piekkoppel na letsel aantoont, wat ver buiten de variatiecoëfficiënten ligt die worden waargenomen bij herhaalde tests van niet-gewonde muizen. Gelijktijdig met menselijke gegevens17,18, is de sterkte aanzienlijk verminderd met ACL-T. Alle muizen zijn vrouwelijk en van vergelijkbare leeftijd (6-8 maanden).
| Twitch-experiment | Stroom/Stroom (mA) | Koppel (mN•m) |
| 1 | 50 | 1.279 |
| 2 | 70 | 1.341 |
| 3 | 90 | 1.36 |
| 4 | 110 | 1.362 |
| 5 | *130 | 1.449 |
| 6 | 150 | 1.436 |
| 7 | 140 | 1.333 |
Tabel 1: Voorbeeld van twitch-series. * geeft optimale stroom/stroom aan.
| Frequentie (Hz) | Koppel (mN • m) |
| 10 | 1.385 |
| 40 | 1.869 |
| 120 | *18.765 |
| 150 | 18.375 |
| 180 | 17.97 |
| 200 | 17.548 |
Tabel 2: Voorbeeld van gegevens over de koppelfrequentiecurve. * geeft het piek tetanische koppel aan.
Figuur 1: Software-installatie van gegevensverzameling. Illustratie van de installatie van software voor gegevensverzameling met Live Data Monitor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Muisopstelling en elektrodeplaatsing. (A-B) Liggende positie van de muis die anesthesie ontvangt via een neuskegel op het verwarmde platform. Bovenste achterste ledemaat is stevig geklemd, achterste aan de knie om onbeperkte beweging bij het kniegewricht mogelijk te maken. De motorarm is zo afgesteld dat de knie ongeveer 60° wordt gebogen. Het femorale zenuwmotorische punt wordt gestimuleerd door naaldelektroden om samentrekking van knie-extensoren te activeren. De muisopstelling wordt weergegeven vanuit een zijaanzicht (A) en bovenaanzicht (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bepaling van de optimale plaatsing van de elektrode om isometrische knieverlenging te bereiken. Weergave van herhaalde negatieve spiertrekkingen gestimuleerd met 50 mA met behulp van de Instant Stimulation-functie en bekeken in de Live Data Monitor. Rode pijlen geven de eerste drie knieverlengingstrekkingen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve twitch om de optimale stroomag te bepalen. De laagste stroomkracht om het hoogste twitch-isometrische koppel op te wekken, moet voor het krachtfrequentie-experiment worden bepaald door herhaalde twitch-experimenten met progressief verhoogde stroomafvoer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve tetanische koppelkrommen gedurende een koppelfrequentie-experiment voor dezelfde muis. (A) Submaximaal isometrisch tetanisch koppel geproduceerd bij 10 Hz. (B) Submaximaal isometrisch tetanisch koppel bij 40 Hz. (C) Piek isometrisch tetanisch koppel bij 120 Hz. (D) Isometrisch tetanisch koppel bij 150 Hz. (E) Isometrisch tetanisch koppel bij 180 Hz. (F) Isometrisch tetanisch koppel bij 200 Hz. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Representatieve gegevens van de koppelfrequentiecurve ( A-B). Koppelfrequentiecurve op 2 verschillende tijdstippen (week 1 en 3) in 3 afzonderlijke muizen, gepresenteerd als ruw piekkoppel (A) en ruw piekkoppel genormaliseerd naar lichaamsgewicht (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Representatieve oppervlakte onder de curve (AUC) en piek tetanische koppelgegevens. (A) AUC voor 4 afzonderlijke muizen, gepresenteerd als ruw koppel genormaliseerd naar lichaamsgewicht. (B)Piek tetanisch koppel voor dezelfde 4 muizen, gepresenteerd als ruwe piek tetanische koppel genormaliseerd naar lichaamsgewicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Piek tetanisch koppel van knie-extensoren in meerdere muismodellen. Representatieve piekkoppel tetanuscurves voor een openlijk hypertrofie transgeen muismodel (GDF8 KO), een ongedeerde gezonde C57BL/6 muis (muis 2) en een C57BL/6 muis 7 dagen na voorste kruisbandtranssectie (ACL-T). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Afmetingen van op maat gemaakte kunststof. Inzet in rood toont dimensie van diepte. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video 1: Real-time knie-extensor twitch zonder motorarm. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 2: Slow-motion knie-extensor twitch zonder motorische arm. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
Meting en analyse van de spierfunctie in knaagdiermodellen is noodzakelijk om translationele en zinvolle gevolgtrekkingen te maken met betrekking tot histologische en moleculaire skeletspieraanpassingen waargenomen bij inspanning, letsel, ziekte en therapeutische behandeling. We demonstreren een methode om de maximale sterkte van de knie-extensor betrouwbaar en herhaaldelijk te beoordelen bij muizen met behulp van in de handel verkrijgbare apparatuur, waarbij het verstelbare plastic stuk om de onderste achterpoot bij het voorste scheenbeen vast te houden het enige op maat gemaakte onderdeel is dat kan worden gerepliceerd.
Gemeenschappelijke functionele beoordelingstools zijn op grote schaal gebruikt om de fysieke prestaties binnen dezelfde muis herhaaldelijk te evalueren, zoals loopbandlopen tot vrijwillige vermoeidheid, rotarod-prestatietest, omgekeerde vershoudtest en gripsterktetest. Hoewel informatief, omvatten deze beoordelingen cardiopulmonale en gedragscomponenten, die de ondervraging van de neuromusculaire functie in verband met deze fysieke prestatiemetingen kunnen verdoezelen. Bovendien zijn elementen van uithoudingsvermogen, coördinatie en balans aanwezig in veel van deze functionele beoordelingen tot verschillende niveaus, waardoor een duidelijke interpretatie met betrekking tot spierkracht wordt beperkt. Het krachtproducerend vermogen van knaagdierspier(en) kan in vitro, in situ of in vivo worden gemeten. Elke aanpak heeft relatieve voordelen en beperkingen. In het bijzonder wordt bij in vitro beoordeling de spier volledig geïsoleerd en verwijderd uit het lichaam van het dier, zodat er geen invloed is van perfusie of innervatie19. Dit levert een goed gecontroleerde omgeving op om het contractiel vermogen vast te stellen, maar beperkt de grootte van de spier die wordt bestudeerd door afhankelijkheid van passieve diffusie van zuurstof en voedingsstoffen tijdens het testen. In situ testen handhaaft de innervatie en bloedtoevoer van de spier, maar is beperkt tot een enkelvoudige terminale beoordeling, zoals bij in vitro testen20. Ten slotte is in vivo testen het minst invasief, waarbij de spier in zijn oorspronkelijke omgeving blijft met percutane elektroden die in de buurt van de motorische zenuw worden ingebracht om de spier elektrisch te stimuleren. Een kracht van de in vivo benadering is het potentieel voor longitudinale testen in de tijd21,22,23.
In vivo evaluatie van piekspiercontractiliteit meet optimaal de maximale sterkte, omdat de normale anatomie en fysiologie van de muis intact blijft en de methode op dezelfde muis kan worden herhaald voor en na een interventie of gedurende de hele levensduur. In het bijzonder is in vivo meting van de knie-extensorsterkte bij muizen de beoordeling van de murinesterkte met de grootste translationele relevantie voor menselijke studies, omdat het maximale knie-extensiekoppel gewoonlijk wordt gemeten en beschouwd als de gouden standaard sterktetest bij mensen met correlatie met verschillende functionele en gezondheidsresultaten24,25,26,27 . Bovendien wordt knie-extensorpathologie waargenomen bij veroudering en een groot aantal verwondingenen ziekten1,2,4,5,6,maar het beoordelen van de impact van deze aandoeningen op de kracht van de knie-extensor in de lengterichting bij muizen is niet gemakkelijk haalbaar geweest.
Hoewel deze methode nut biedt om het piekkoppel van de knie-extensor op een longitudinale manier te bepalen, moeten bepaalde beperkingen van het protocol worden overwogen. Lagere frequenties tussen 40 Hz en 120 Hz werden weggelaten uit het koppelfrequentieprotocol, wat de mogelijkheid kan beperken om links- of rechtswaartse verschuivingen in de koppelfrequentiecurve te detecteren met letsel of ziekte. Met behulp van dit koppelfrequentieprotocol hebben we echter veranderingen in het piektetanische koppel kunnen detecteren in een ACL-letselmodel en tussen C56BL / 6 wildtype muizen en een transgeen muismodel van suprafysiologische spiermassa (figuur 8). We merken op dat het nuttig kan zijn om de elektroden vast te zetten met helpende handen of soortgelijke apparaten, omdat spiercontracties elektroden enigszins kunnen bewegen. We merkten geen duidelijke verplaatsing van elektroden met progressieve contracties op; de mogelijkheid van lichte beweging van de elektroden kan echter niet worden uitgesloten, wat van invloed kan zijn op spierstimulatie. Bovendien werd intramusculaire elektromyografie (EMG) niet uitgevoerd in combinatie met het stimulusprotocol; het opnemen van EMG-maatregelen kan echter haalbaar zijn, indien gewenst en geschikt voor het experimentele model van belang.
Beoordeling van de knie-extensorsterkte in muizenmodellen van orthopedisch letsel en ziekte zal preklinisch onderzoek vergemakkelijken met zinvolle translationele relevantie voor klinische sterktemetingen. Ons protocol maakt een nauwkeurige en herhaalde beoordeling van de maximale knie-extensorsterkte mogelijk bij muizen met in de handel verkrijgbare apparatuur die toegankelijk is voor elk laboratorium.
Disclosures
Matthew Borkowski is in dienst van Aurora Scientific Inc., een bedrijf dat mogelijk kan profiteren van de onderzoeksresultaten en is ook een leidinggevende van het bedrijf.
Acknowledgments
We willen Rosario Maroto bedanken voor de technische assistentie. Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health onder awardnummer R01 AR072061 (CSF). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse | Aurora Scientific Incorporated | 300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus | |
| 6100 Dynamic Muscle Control LabBook software | Aurora Scientific Incorporated | DMC v6.000 | |
| 611A Dynamic Muscle Analysis | Aurora Scientific Incorporated | DMA v5.501 | |
| BravMini hair clippers | Wahl Clipper Corporation | ASIN: B00IN24ILE | |
| Eye Lube | Optixcare | Item Number: 142422 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | Item Number: 901806 | |
| Prism 8 | GraphPad Software, LLC | Version 8.3.0 (328) |
References
- Brightwell, C. R., et al. Moderate-intensity aerobic exercise improves skeletal muscle quality in older adults. Translational Sports Medicine. 2 (3), 109-119 (2019).
- Moro, T., et al. Muscle protein anabolic resistance to essential amino acids does not occur in healthy older adults before or after resistance exercise training. Journal of Nutrition. 148 (6), 900-909 (2018).
- Angelozzi, M., et al. Rate of force development as an adjunctive outcome measure for return-to-sport decisions after anterior cruciate ligament reconstruction. Journal of Orthopedic Sports Physical Therapy. 42 (9), 772-780 (2012).
- Kalyani, R. R., et al. Quadriceps strength, quadriceps power, and gait speed in older U.S. adults with diabetes mellitus: results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2002. Journal of American Geriatric Society. 61 (5), 769-775 (2013).
- Culvenor, A. G., Ruhdorfer, A., Juhl, C., Eckstein, F., Øiestad, B. E. Knee extensor strength and risk of structural, symptomatic, and functional decline in knee osteoarthritis: A systematic review and meta-analysis. Arthritis Care Res (Hoboken). 69 (5), 649-658 (2017).
- Abramowitz, M. K., et al. Skeletal muscle fibrosis is associated with decreased muscle inflammation and weakness in patients with chronic kidney disease. American Journal of Physiology and Renal Physiology. 315 (6), 1658-1669 (2018).
- Arentson-Lantz, E. J., English, K. L., Paddon-Jones, D., Fry, C. S. Fourteen days of bed rest induces a decline in satellite cell content and robust atrophy of skeletal muscle fibers in middle-aged adults. Journal of Applied Physiology. 120 (1985), 965-975 (2016).
- Pratt, S. J. P., Lovering, R. M. A stepwise procedure to test contractility and susceptibility to injury for the rodent quadriceps muscle. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Kwok, J., et al. Histopathological analyses of murine menisci: implications for joint aging and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 24 (4), 709-718 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
- Wurtzel, C. N., et al. Pharmacological inhibition of myostatin protects against skeletal muscle atrophy and weakness after anterior cruciate ligament tear. Journal of Orthopedic Research. 35 (11), 2499-2505 (2017).
- Botter, A., et al. Atlas of the muscle motor points for the lower limb: implications for electrical stimulation procedures and electrode positioning. European Journal of Applied Physiology. 111 (10), 2461-2471 (2011).
- Gobbo, M., Maffiuletti, N. A., Orizio, C., Minetto, M. A. Muscle moter point identification is essential for optimizing neuromuscular electrical stimulation use. Journal of Neuroengineering and Rehabililitation. 11, 17 (2014).
- Neelakantan, H., et al. Small molecule nicotinamide N-methyltransferase inhibitor activates senescent muscle stem cells and improves regenerative capacity of aged skeletal muscle. Biochemical Pharmacology. 163, 481-492 (2019).
- Kline, P. W., Morgan, K. D., Johnson, D. L., Ireland, M. L., Noehren, B. Impaired quadriceps rate of torque development and knee mechanics after anterior cruciate ligament reconstruction with patellar tendon autograft. American Journal of Sports Medicine. 43 (10), 2553-2558 (2015).
- Hiemstra, L. A., Webber, S., MacDonald, P. B., Kriellaars, D. J. Knee strength deficits after hamstring tendon and patellar tendon anterior cruciate ligament reconstruction. Medicine and Science in Sports and Exercise. 32 (8), 1472-1479 (2000).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
- MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. Journal of Visualized Experiments. (56), e3167 (2011).
- Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskeletal Disorder. 12, 246 (2011).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
- Davis, C. C., Ellis, T. J., Amesur, A. K., Hewett, T. E., Di Stasi, S. Improvements in knee extension strength are associated with improvements in self-reported hip function following arthroscopy for femoroacetabular impingement syndrome. International Journal of Sports Physical Therapy. 11 (7), 1065-1075 (2016).
- Omori, G., et al. Quadriceps muscle strength and its relationship to radiographic knee osteoarthritis in Japanese elderly. Journal of Orthopedic Science. 18 (4), 536-542 (2013).
- Wilk, K. E., Romaniello, W. T., Soscia, S. M., Arrigo, C. A., Andrews, J. R. The relationship between subjective knee scores, isokinetic testing, and functional testing in the ACL-reconstructed knee. Journal of Orthopedic Sports and Physical Therapy. 20 (2), 60-73 (1994).
- Bobowik, P., Wiszomirska, I. Diagnostic dependence of muscle strength measurements and the risk of falls in the elderly. Internation Journal of Rehabilitation Research. 43 (4), 330-336 (2020).
