Summary
Diz ekstensor maksimal gücünün ölçülmesi yaşlanma, hastalık, yaralanma ve rehabilitasyona fonksiyonel adaptasyonları anlamak için zorunludur. In vivo diz uzatma izometrik tepe tetanik tork tekrar tekrar ölçmek için yeni bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Sayısız durum ve uyaranlara yanıt olarak iskelet kası plastisitesi, hem olumsuz hem de pozitif olarak eşzamanlı fonksiyonel adaptasyona aracılık eder. Klinikte ve araştırma laboratuvarında, maksimum kas gücü insanlarda uzunlamasına olarak ölçülür ve diz ekstansor kas yapısı en çok bildirilen fonksiyonel sonuçtur. Diz ekstansör kas kompleksinin patolojisi yaşlanma, ortopedik yaralanma, hastalık ve disuse'da iyi belgelenmiştir; diz ekstansör gücü fonksiyonel kapasite ve yaralanma riski ile yakından ilgilidir ve diz ekstansör gücünün güvenilir ölçümünün öneminin altını çizmektedir. Klinik öncesi kemirgen çalışmalarında diz ekstansör gücünün tekrarlanabilir, in vivo değerlendirilmesi, osteoartrit veya diz yaralanmasını araştıran çalışmalar için değerli fonksiyonel uç noktalar sunar. Farelerde diz ekstansörlerinin izometrik tepe tetanik torkunun zaman içinde tekrar tekrar ölçülmesi için in vivo ve non-invaziv bir protokol bildiriyoruz. Benzer sonuçlar üreten birden fazla farede tekrarlanan değerlendirme ile diz ekstansör gücünü ölçmek için bu yeni yöntemi kullanarak tutarlılık gösteriyoruz.
Introduction
İskelet kası, egzersiz, beslenme, yaralanma, hastalık, yaşlanma ve disuse gibi sayısız uyarana yanıt olarak kütle ve yapıda telafi edici değişikliklere sahip son derece uyarlanabilir bir dokudur. İnsanlarda iskelet kas adaptasyonunu araştıran birçok çalışma, altın standart kuvvet değerlendirmeleri insan deneklerde kolayca tekrarlanabildiği için hem iskelet kası boyutunu hem de fonksiyon üzerindeki etkisini ölçmek için yöntemler kullanmaktadır.
Özellikle diz ekstensörü ve fleksör gücü klinik araştırmalarda en çok değerlendirilmektedir. Diz ekstansör gücünde değişiklikler, yaşlanma, egzersiz, ortopedik yaralanma, diz osteoartrit, kronik hastalık ve disuse 1 , 2 , 3,4,5,6,7insan çalışmalarında yaygın olarak bildirilmiştir. Bununla birlikte, mekanistik kemirgen çalışmalarında diz ekstensor kas (kuadriseps) gücünü tekrar tekrar ve invaziv olmayan analiz etme yöntemleri nispeten sınırlı olmuştur. Sıçanlarda in vivo kuadriseps kas kontrtinaklığını belirlemek için bir yöntem daha önce geliştirilmiştir8; ancak, piyasada bulunmayan ekipmanların kapsamlı bir şekilde inşası gereklidir. Diz yaralanması / osteoartrit 9 , 10, 11,12,13'ten sonra kas-iskelet sonuçlarını incelemek için geliştirilen kemirgen modellerinin genişliği göz önünealındığında,kuadriseps gücünün invaziv olmayan değerlendirilmesine ihtiyaç vardır.
Ayrıca, iskelet kası adaptasyonunu destekleyen moleküler mekanizmaları araştıran kemirgen çalışmaları, farelerde bir ilacın farelere kıyasla daha düşük ağırlık bazlı dozajı ile ilişkili finansal giderin azalması nedeniyle birçok farmakolojik müdahale çalışması gibi, genetik modifikasyonun basitliği nedeniyle fare modellerini sıklıkla kullanır. Küçük modifikasyonlarla ticari olarak mevcut ekipmanları kullanarak, farklı laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği kolaylaştırarak ve insan gücü sonuçlarıyla daha doğrudan karşılaştırma sağlayarak in vivo diz ekstensör fonksiyonunu zaman içinde aynı farede tekrar tekrar ölçmek için invaziv olmayan bir yöntem bildiriyoruz.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Ekipman kurulumu
- Makinelerin üretici belirtimlerine göre bağlı olduğunu onaylayın.
- Henüz yerinde değilse, diz uzatma aparatına sahip 300D-305C-FP motoru 809C hayvan platformuna takın.
- Platformu ısıtmaya başlamak için su pompasını 37 °C'ye açın.
- Bilgisayar henüz açık değilse, bilgisayarı açın ve ardından Yüksek Güçlü çift fazlı uyarıcı ve 2 Kanallı Çift Modlu Kol Sistemi'ni açın.
- Maksimum dolum hattına buharlaştırıcıya izofluran dökün.
2. Yazılım kurulumu
- Yazılımı açın (Ayrıntılar Malzeme Tablosunda verilmiştir).
- Araştırma yerleşimini optimize etmek için Canlı Veri İzleyicisi ile birlikte Hızlı Uyarım özelliğini kullanmak için (adım 4), Denemeyi Hazırla'yı ve ardından Anında Uyarıyı Yapılandır 'ı seçin (Şekil 1). Darbe Frekansını (Hz) 125, Darbe Genişliğini (ms) 0,2, Darbe Sayısını 1, Tren Frekansını (Hz) 0,5 ve Çalışma Süresini (ler) 120 olarak ayarlayın.
- Dosya'yı seçin ve Canlı Veri İzleyicisi 'niaçın.
- Twitch (adım 5) ve tork frekansı (Adım 6) deneyleri yapmak için, uygun seğirme ve diz uzatma tork frekansı deneylerini içeren daha önce programlanmış bir çalışma seçin (aşağıda 5. adım ve adım 6'da ayrıntılı olarak verilmiştir).
- Uygun deneysel fareyi seçin veya Yeni Hayvan Ekle ve tork verileriyle depolanacak ilgili fare bilgilerini girin.
- Twitch protokolünden tork frekansı dizisine geçiş yapmak için Sonraki Deneme veya Önceki Deneme'yi seçin.
3. Fare kurulumu
- Tek tek fareyi anestezi odasına yerleştirin.
- Oksijen tankı vanasını bırakın ve oksijen akış hızını % 2,5 izofluran ile 1 L / dk olarak ayarlayın.
- Farenin, kapağı tamamen bilinçsiz olana kadar güvenli bir şekilde kapalı olacak şekilde haznede kaldığından emin olun. Ayak parmağı sıkışması ile ayak refleksi olmadan tam bilinç kaybını onaylayın.
- Uyuşturulma faresini% 2,5 izofluran ile 1 L / dk oksijen akış hızı ile ısıtılmış platformda burun kafesinde baş ile bir destek pozisyonuna yerleştirin.
- Elektrikli makas kullanarak sağ arka uzuvdan saç tıraşı. Saçları tıraş edilen bölgeden alkol mendili ve küçük bir vakumla çıkarın. Temizlenen saçları arka uzuvdan ve platformdan uzaklaştırın.
- Üst arka uzvu, arka kısmı dizine güvenli bir şekilde kenetleyin (Şekil 2).
NOT: Diz hareket aralığının engellenmediğinden emin olun. - Alt arka uzvu, ön kaval kemiği ayarlanabilir plastik parçaya hafifçe dokunarak diz uzatma aparatına yerleştirin (Kanal okuma kuvveti 0 ile -1,0 mN * m arasında okunmalıdır). Farenin alt arka uzvunun büyüklüğüne bağlı olarak, bacağın güvenli bir şekilde dinlenmesini sağlamak için ayarlanabilir plastik parçanın alt kısmına cerrahi bant sarılabilir.
NOT: Özel olarak imal edilmiş plastik parçanın ayrıntılı görüntüleri ve boyutları Ek Şekil 1'degösterilmiştir. - Diz 60° bükülecek şekilde platformdaki düğmeleri ayarlayın.
- Maksimum diz uzatma ile telafi edici hareketi önlemek için fare gövdesinin üzerine hafifçe bir bant yerleştirin.
4. Elektrot yerleşimi
- Elektrotları deri altı 2-4 mm proksimal olarak diz için kuadriseps/diz ekstansör kaslarının tam üstüne yerleştirin (Şekil 2). Elektrotlar yaklaşık 1-2 mm aralıklı olmalıdır.
- Elektrotların en uygun yerleşimini belirlemek için Canlı Veri Monitörüile Anında Stimülasyon işlevini kullanabilirsiniz. Diz uzantısını onaylamak için tekrarlanan seğirmeler için amperajı / akımı 50 mA'da ayarlayın (diz ekstensörleri negatif bir seğirme eğrisi üretecektir). Canlı Veri Monitörü penceresinde ölçülen maksimum diz uzatma seğirme torku elde etmek için Anında Uyarım sırasında probları ayarlayın.
NOT: Şekil 3, diz uzantısını onaylayan temsili bir Anında Stimülasyon çıkışını gösterir. Ek Video 1 ve Tamamlayıcı Video 2, motor kolu yerinde olmadan gerçek zamanlı ve ağır çekim diz ekstensör seğirmelerini gösterir ve diz uzantısının görsel olarak onaylanmasını sağlar. - Instant Stimulationile tekrarlanan seğirmeler sırasında, antagonist kasların aktivasyonunu onaylamak için diz fleksör kaslarını işaret parmağı ile palpate edin. Diz ekstensörlerini maksimum düzeyde uyarmak için, farenin vücut kompozisyonuna ve femoral sinir ve diz ekstensör kaslarının motor noktasının tam konumundaki hafif anatomik farklılıklara bağlı olarak prob yeniden konumlandırması gerekebilir.
NOT: Bir kas motor noktası, bir sinirin motor dalının kas göbeğine girdiği yerdir ve elektrik iletkenliğine karşı en az direnç gösteren ve daha sonra elektriksel uyarılmaya en yüksek yanıt veren noktadır14,15. Elektriksel stimülasyon kullanan klinik uygulamalarda, bu nokta, en düşük enjekte edilen akım14,15ile bir kas seğirmesinin meydana geldiği kasın üzerindeki yeri bulmak için bir kalem elektrot ile taranarak tanımlanır. Kas motor noktasının tanımlanması, optimal nöromüsküler elektriksel stimülasyonu kolaylaştırmak için gereklidir15. İnsan klinik deneylerinde, kasın distal yarısında kuadriseps kasları için kas motor noktaları tanımlanmıştır14. Farelerde optimal diz ekstansör stimülasyonu elde etmek için, bu teknik, tipik olarak diz ekstansörlerinin distal yarısında bulunan en yakın kas motor noktası konumlarına Instant Stimulation ile elektrot yerleşimi kullanılarak yeniden düzenlendi. Elektrot yerleşiminde (nispeten yüzeyselden derine) maksimum torkla sonuçlanan bazı değişkenlikler vardır ve Anında Stimülasyon işlevi optimum elektrot yerleşimini kolaylaştırır.
5. Optimum akımın belirlenmesi
- Optimum prob yerleşimi belirlendikten sonra, maksimum seğirme tork çıkışını elde etmek için en düşük akımı belirlemek amacıyla tork frekansı deneyi için kullanılacak optimum amper/akımı belirlemek için bir dizi aşamalı seğirme gerçekleştirin. 50 mA'da akım kümesiyle başlayın ve tek bir seğirme oluşturmak için Denemeyi Çalıştır'ı seçin. Tork çıkışını görüntülemek için Sonuçları Analiz Et'i seçin. Max Force altında görüntülenen seğirme torkını taban çizgisi çıkarılarak kaydedin.
NOT: Ölçümleri negatif torktan pozitife dönüştürmek için Kuvvet kanalını ters çevirme seçeneğini belirleyin. - Akımı 60-70 mA'ya çıkarın ve twitch deneyini tekrarlayın. Max Force altında görüntülenen seğirme torkını taban çizgisi çıkarılarak kaydedin.
- Seğirme torku artık artmayana (platolar veya azalmaya başlayana kadar) bu şekilde bir dizi seğirme deneyine devam edin (her ilerlemede yaklaşık 10-20 mA'yı artırmak). Twitch serisi örneği Tablo 1'de gösterilmiştir.
- En yüksek seğirme torklarının elde edildiği en düşük akımı kaydedin. Bu akım kullanılacak ve yaklaşan kuvvet frekansı deneyi sırasında sabit kalacaktır. Şekil 4 temsili bir tepe seğirmesini göstermektedir.
6. Tepe izometrik tetanik torku belirlemek için tork frekansı deneyi
- Yazılımda (bkz. Malzeme Tablosu),aşağıdaki ayarı sağlamak için diz uzatma için önceden programlanmış tork frekansı deneyini seçin. Uyaran süresi: 0.35 s, Frekans sırası: 10 Hz, 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz, Darbeler/ kasılmalar arasında dinlenme süresi: 120 s
NOT: Örnekleme hızı 10.000 Hz'dir (varsayılan ayar). - Deneyi Çalıştırın, Sonuçları Analiz Edinve Max Force altında görüntülenen torku taban çizgisi çıkarılarak manuel olarak kaydedin (diz ekstensör kasılması negatif tork üreteceğinden kuvvet kanalının ters çevrilmiş olduğundan emin olun). En yüksek izometrik tetanik tork olarak en yüksek Max Force değerine dikkat edin. Tork frekansı verileri örneği Tablo 2'de gösterilmiştir ve Şekil 5, 120 Hz'de elde edilen pik izometrik tetanik tork çıkışı için temsili bir tetanoz eğrisi gösterir.
7. Deneyin sonlandırılması
- Tork frekansı denemesi tamamlandıktan sonra, bir takip seğirmesi gerçekleştirin ve hasarı / yorgunluğu değerlendirmek için aynı akımdaki ilk tepe seğirmesi ile karşılaştırın.
NOT: Bazı yaralanma ve hastalık modellerinde iskelet kasının yağlanabilirliğinin artması beklenir ve deneysel kurulum veya fare ile ilgili bir sorun oluşturmaz. - Tüm tork ölçümleri tamamlandığında, elektrot problarını nazikçe çıkarın ve dizi çıkarın.
- Isoflurane'yi kapatın ve fareyi burun konisinden çıkarın.
- Fareyi tekrar ısınma yastığının üzerine yerleştirilmiş uygun bir kafese yerleştirin. Fare iyileştikçe ve bilinci yerine geldikçe izleyin.
NOT: Fare bilinçli olmalı ve 2-3 dakika içinde hareket etmelidir.
8. Veri analizi
- Analiz yazılımından denemeden sonra verileri ayıklayın (bkz. Malzeme Tablosu).
- Açık analiz yazılımı.
- Yazılımdan Veri Al'ı seçin.
- Denemenin gerçekleştirildiği tarih ve uygun fare kodu'nu seçin.
- İlgi sıklığını seçin (tüm seğirme deneyleri ve tork frekansı deneyinin her frekansı listelenir).
- Kas Analizi 'niseçin.
- Temel Düzeltme Kullan'ın işaretli olduğunu onaylayın.
NOT: Temel tork, yazılım tarafından mutlak maksimum tork değerinden örneklenen ve çıkarılan ilk 100 noktanın ortalaması olarak hesaplanır. - Maksimum altında listelenen tork değerini kaydedin.
NOT: Burada sunulan veriler filtrelenmemiştir; ancak, istenirse yazılımda bir filtre seçilebilir.
- Alternatif olarak, yukarıda 6.2 adımında açıklandığı gibi, Max Force altında görüntülenen tork çıkışını Analiz Sonuçları penceresinden her tork frekansı noktasında / daralmasında gerçek zamanlı olarak manuel olarak kaydedin.
- Taban çizgisinin sürülmüş olduğunu ve kuvvet kanalının ters çevrildiğini onaylayın.
- Vücut ağırlığı normalleştirme hesaplamaları (gram olarak tork/vücut ağırlığı) ve ilginin grafik ve istatistiksel analizleri için verileri bir elektronik tabloya girin. Tork frekans eğrilerinin grafiklendirilmesi ve eğrinin altındaki alanın hesaplanması amacıyla istatistiksel yazılım kullanılmıştır.
NOT: Tork verileri mN.m (miliNewton.metre) cinsinden ölçülür.
- Tetanoz eğrileri oluşturmak için, analiz yazılımından her frekanstan tam verileri dışa aktarın.
- Yukarıdaki 8.1.1-8.1.4 adımlarını yineleyin.
- Verileri Dışarı Aktar 'ıseçin.
- Ham Filtre Uygulanmış Veriler'i seçin ve istediğiniz konuma kaydedin. MATLAB, dışa aktarılan metin dosyasından tetanoz eğrileri oluşturmak ve/veya daha fazla analiz için kullanılabilir.
NOT: Metin dosyasından tetanoz eğrisi oluşturmak için MATLAB kodu istek üzerine kullanılabilir.
9. Çift modlu kol sistemi kalibrasyonu
- Doğru ve güvenilir veriler sağlamak için sistemi ilk kullanımdan önce kalibre edin ve veri toplama yazılımını ve bilinen ağırlıkları kullanarak kalibrasyonu periyodik olarak tekrarlayın.
- Veri toplama yazılımını açın.
- Kur sekmesini tıklatın ve Kanal Kurulumu 'nuseçin.
- Araçlarım altında listelenen 305C-FP 'yiseçin.
- Kalibrasyon Düzenleyicisi penceresini açmak için Seçili Ayarı Ayarla'yı tıklatın.
- Uzunluğu kalibre etmek için, hem negatif hem de pozitif voltajlar (örneğin, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3 V) dahil olmak üzere bir dizi test voltajı girin.
- İlk satır için Ayarla'ya tıklayın.
- Oku 'yutıklatın.
- Kol kolunun tam uzunluğunu milimetre cinsinden ölçün ve ilgili kutuya girin.
- Bir sonraki voltaj için tekrarlayın.
- Tüm voltajların kaydedilerek, Cal Faktörlerini Hesapla'yı (mm/volt olarak kaydedilir) tıklatın.
- Kuvveti kalibre etmek için doğrusal bir ilerlemede artan bilinen ağırlıklar kümesini kullanın.
- Motoru, kolu tezgah tepesine paralel olarak ve ağırlığın sarkmasını sağlamak için kenara asılı olacak şekilde, tezgah veya masanın kenarında dinecek şekilde ayarlayın.
- İlk ağırlığı bir lastik bant kullanarak kol kolundan asın. Uygulamalı Kuvvetaltında, bilinen ağırlığı kauçuk bandın kütlesini oluşturan gram olarak girin.
- Oku 'yaseçin.
- Bilinen en az 3 ağırlık için tekrarlayın.
- Cal Faktörünü Hesapla 'yıseçin.
- Hesaplamayı doğrulamak için, Çiz Cal'yi seçerek kalibrasyon verilerini ve eğriyi çizin.
- Kuvveti kalibre etmek için kalibrasyon voltajlarını girin (10 volta kadar)
- Kalibrasyon voltajı yanında Ayarla'yı tıklatın.
- Her gerilim hattı için tekrarlayın.
- Kuvvet Değişimi sona erene ve motor kolu hareket etmeye başlayana kadar bir parmak kullanarak kol koluna hafifçe basınç uygulayın.
- Bu pozisyonu koruyun. Oku 'yaseçin.
- Her gerilim hattı için tekrarlayın.
- Cal Faktörünü Hesapla 'yıseçin.
Representative Results
Tork frekans eğrisi, nispeten düşük torkun birden fazla izole izometrik seğirmesini üretmek için daha düşük frekanslar kullanır ve giderek daha yüksek frekanslarda ilerler, bu da en yüksek tetanik torkun elde edildiği izometrik bir tetanoz kasılması için seğirmelerin füzyonu ile sonuçlanır. Diz uzatma tepe tetanik torku için sunulan protokol kuvvet frekansı eğrisi 10 Hz'de başlatılır ve bu da 3 izole seğirme ortaya çıkarır. Seğirmelerin kısmi füzyonu 40 Hz'de gerçekleşir ve 120-180 Hz arasında tepe tetanik torka ulaşılır (Şekil 5).
Şekil 6, dişi C57BL/6 farelerden gelen temsili diz uzatma tork frekans eğrilerini göstermektedir. Temel olarak üç ayrı fare test edildi ve deney 2 hafta sonra tekrarlanabilirliği değerlendirmek için karşılaştırma için her farede tekrarlandı. Tork frekans eğrileri ham tork değerleri (Şekil 6A) ve fare gövdesi ağırlığına normalleştirilmiş ham tork değerleri ile gösterilir (Şekil 6B). Tekrarlanan gözlemler, deneyler arasında 2 haftalık dinlenme süresi olan 3 farede de karşılaştırılabilir sonuçlar göstermektedir. Ağırlıktaki küçük dalgalanma fonksiyonel çıkışı etkileyebileceği ve sadece ham tork ile dikkate alınmadığı için ham torka ek olarak vücut ağırlığı normalleştirilmiş tork verileri de göz önünde bulundurulmalıdır. Ayrıca, vücut ağırlığı normalleştirilmiş tork verileri, farklı boyutlardaki farelerin karşılaştırılmasını kolaylaştırır. Tork ayrıca daha önce gösterdiğimiz gibi kas ıslak ağırlığına veya myofiber kesit alanınanormalleştirilebilir.
Şekil 7A, tam tork frekansı deneylerinden vücut ağırlığı normalleştirilmiş izometrik tork verilerini kullanarak eğrinin altındaki alanı gösterir (10 Hz, 4 ayrı C57BL/6 fare için 40 Hz, 120 Hz, 150 Hz, 180 Hz, 200 Hz), aynı fareler içinde tekrarlanan deneylerle benzer toplam tork çıkışını ve %5,6 ila %8,8 arasındaki değişim katsayılarını vurgular. Veriler en basit şekilde 120-200 Hz arasında tekrarlanan tetanoz izometrik kasılmalardan maksimum tork değeri olan tepe tetanik torku (Şekil 7B)olarak bildirilmektedir. 6-8 aylık dişi C57BL/6 farelerde(Şekil 7B)en yüksek tetanik tork çıkışı, aynı fareler içinde boyuna değerlendirme ile% 4.8 ila% 8.7 arasında değişim katsayıları ile karşılaştırılabilir. Tepe tetanik torku, insan çalışmalarındaki altın standart mukavemet değerlendirmesiyle en karşılaştırılabilir: maksimum izometrik toque.
Ayrıca, diz ekstansör tepe tetanik tork protokolü, birden fazla fare modelinde mukavemet farklılıklarını tespit etmek için kullanışlı bir araçtır. Şekil 8, yaralanmamış, sağlıklı 6 aylık C57BL/6 kadın farede (siyah çizgi) diz ekstansör mukavemeti ile miyostatin/GDF8'in nakavt edildiği transgenik bir suprafiyolojik hipertrofi fare modeli (mavi çizgi) arasındaki keskin kontrastı göstermektedir. Ayrıca, ön çapraz bağın (ACL-T) (kırmızı çizgi) cerrahi transeksiyonundan 7 gün sonra bir C57BL/ 6 faresinden bir tepe tetanoz eğrisi gösteriyoruz ve yaralanmadan sonra pik torkta yaklaşık% 50'lik bir düşüş gösteriyoruz, bu da yaralanmamış farelerin tekrar test edilmesiyle gözlenen varyasyon katsayılarının çok dışında. İnsan verileri ile eşzamanlı17,18, ACL-T ile güç belirgin bir şekilde azalır. Tüm fareler dişi ve benzer yaştadır (6-8 ay).
| Twitch deneyi | Amper/Akım (mA) | Tork (mN•m) |
| 1 | 50 | 1.279 |
| 2 | 70 | 1.341 |
| 3 | 90 | 1.36 |
| 4 | 110 | 1.362 |
| 5 | *130 | 1.449 |
| 6 | 150 | 1.436 |
| 7 | 140 | 1.333 |
Tablo 1: Twitch serisi örneği. * optimum amperaj/akım gösterir.
| Frekans (Hz) | Tork(mN•m) |
| 10 | 1.385 |
| 40 | 1.869 |
| 120 | *18.765 |
| 150 | 18.375 |
| 180 | 17.97 |
| 200 | 17.548 |
Tablo 2: Tork frekans eğrisi verisi örneği. * en yüksek tetanik torku gösterir.
Şekil 1: Veri toplama yazılımı kurulumu. Canlı Veri İzleyicisi ile veri toplama yazılımı kurulumunun çizimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Fare kurulumu ve elektrot yerleşimi. (A-B) Isıtılmış platformda burun konisi yoluyla anestezi alan farenin supine pozisyonu. Üst arka uzuv, diz ekleminde sınırsız harekete izin vermek için diz için güvenli bir şekilde kenetlenir, arka plan. Motor kol, diz yaklaşık 60° bükülecek şekilde ayarlanır. Femoral sinir motor noktası, diz ekstensörlerinin kasılmasını etkinleştirmek için iğne elektrotları ile uyarılır. Fare kurulumu yan görünümden (A) ve tepegöz görünümünden (B) gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İzometrik diz uzatması elde etmek için optimum elektrot yerleşiminin belirlenmesi. Anında Stimülasyon işlevi kullanılarak 50 mA ile uyarılan ve Canlı Veri Monitörü'nde görüntülenen tekrarlanan negatif seğirmelerin temsili. Kırmızı oklar ilk üç diz uzatma seğirmesini gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Optimum amperajı belirlemek için temsili seğirme. En yüksek seğirme izometrik tork elde etmek için en düşük amper, kuvvet frekansı deneyi için kademeli olarak artan amper ile tekrarlanan seğirme deneyleri ile belirlenmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Aynı fare için bir tork frekansı deneyi boyunca temsili tetanik tork eğrileri. (A) 10 Hz'de üretilen submaksimal izometrik tetanik tork(B) 40 Hz'de alt doksimal izometrik tetanik tork. (C) 120 Hz'de pik izometrik tetanik tork çıkışı. (D) 150 Hz'de izometrik tetanik tork. (E) 180 Hz'de izometrik tetanik tork (F) 200 Hz'de izometrik tetanik tork. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Temsili tork frekans eğrisi verileri. (A-B). 3 ayrı farede 2 farklı zaman noktasında (1. ve 3. hafta) tork frekans eğrisi, ham tepe torku (A) ve ham tepe torku vücut ağırlığına normalleştirilmiş(B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Eğrinin altındaki temsili alan (AUC) ve tepe tetanik tork verileri. (A) Vücut ağırlığına normalleştirilmiş ham tork olarak sunulan 4 ayrı fare için AUC. (B) Aynı 4 fare için tepe tetanik torku, vücut ağırlığına normalleştirilmiş ham tepe tetanik tork olarak sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Birden fazla fare modelinde diz ekstansörlerinin tepe tetanik torku. Aşırı hipertrofi transgenik fare modeli (GDF8 KO), yaralanmamış sağlıklı bir C57BL/6 fare (fare 2) ve ön çapraz bağ transeksiyondan (ACL-T) 7 gün sonra C57BL/6 fare için temsili tepe torku tetanoz eğrileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Özel fabrikasyon plastiğin boyutları. Kırmızı içe derinlik boyutunu gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Video 1: Motor kolu olmadan gerçek zamanlı diz ekstensör seğirmesi. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Video 2: Motor kolu olmadan ağır çekim diz ekstensör seğirmesi. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Kemirgen modellerinde kas fonksiyonunun ölçülmesi ve analizi, egzersiz, yaralanma, hastalık ve terapötik tedavi ile gözlenen histolojik ve moleküler iskelet kası adaptasyonları ile ilgili çevirisel ve anlamlı çıkarımlar yapmak için zorunludur. Diz ekstensör maksimal mukavemetini güvenilir ve tekrar tekrar değerlendirmek için bir yöntem gösteriyoruz, ticari olarak mevcut ekipmanı kullanan farelerde, ön kaval kemiğindeki alt arka uzvu tutmak için ayarlanabilir plastik parça çoğaltılabilen tek özel fabrikasyon parçadır.
Yaygın fonksiyonel değerlendirme araçları, aynı fare içindeki fiziksel performansı tekrar tekrar değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmıştır, örneğin iradesel yorgunluğa koşan koşu bandı, rotarod performans testi, ters yapışma testi ve kavrama gücü testi gibi. Bununla birlikte, bilgilendirici olmakla birlikte, bu değerlendirmeler, bu fiziksel performans önlemleriyle ilişkili nöromüsküler fonksiyonun sorgulanabilmesini karartabilen kardiyopulmoner ve davranışsal bileşenleri içerir. Ayrıca, bu fonksiyonel değerlendirmelerin çoğunda, kas gücüne göre net yorumlamayı sınırlayan farklı düzeylerde dayanıklılık, koordinasyon ve denge unsurları mevcuttur. Kemirgen kaslarının (lar)ın yeteneğini üreten kuvvet in vitro, in situ veya in vivo olarak ölçülebilir. Her yaklaşımın göreceli avantajları ve sınırlamaları vardır. Özellikle, in vitro değerlendirme ile kas tamamen izole edilir ve hayvanın vücudundan çıkarılır, böylece perfüzyon veya innervasyondan etkilenmez19. Bu, kontrtilasyon yeteneğini belirlemek için iyi kontrol edilen bir ortam sağlar, ancak test sırasında oksijen ve besinlerin pasif difüzyona bağımlılığı yoluyla incelenen kasın boyutunu sınırlar. Yerinde test, kasın innervasyon ve kan akışını korur, ancak in vitro test20gibi tekil bir terminal değerlendirmesi ile sınırlıdır. Son olarak, in vivo test, kası elektriksel olarak uyarmak için motor sinirin yanına yerleştirilen perkütan elektrotlarla kendi ortamında kalan kas ile en az invazivdir. In vivo yaklaşımın bir gücü, zaman 21,22,23boyunca boyuna test potansiyelidir.
Tepe kas kontritasyonunun in vivo değerlendirilmesi, farenin normal anatomisi ve fizyolojisi bozulmadan kaldığı ve yöntem bir müdahaleden önce ve sonra veya yaşam süresi boyunca aynı fare üzerinde tekrarlanabileceği için maksimum gücü en iyi şekilde ölçer. Özellikle, farelerde diz ekstensör gücünün in vivo ölçümü, insan çalışmalarına en büyük çevirisel ilgisi olan murin mukavemet değerlendirmesidir, çünkü maksimum diz uzatma torku yaygın olarak ölçülür ve insanlarda çeşitli fonksiyonel ve sağlık sonuçlarıyla korelasyon ile altın standart mukavemet testi olarak kabul edilir24,25,26,27 . Ayrıca, diz ekstansör patolojisi yaşlanmanın yanı sıra sayısız yaralanma ve hastalık 1 ,2,4,5,6ile gözlenir, ancak bu durumların farelerde diz ekstansör gücü üzerindeki etkisini uzunlamasına değerlendirmek kolayca elde edilemez.
Bu yöntem diz ekstansör tepe torkunun uzunlamasına bir şekilde belirlenmesi için yardımcı program sunsa da, protokolün belirli sınırlamaları göz önünde bulundurulmalıdır. Tork frekansı protokolünden 40 Hz ile 120 Hz arasındaki daha düşük frekanslar atlandı, bu da tork frekansı eğrisinde yaralanma veya hastalıkla sola veya sağa kaymaları tespit etme yeteneğini sınırlayabilir. Bununla birlikte, bu tork frekansı protokolünü kullanarak, bir ACL yaralanma modelinde ve C56BL / 6 vahşi tip fareler ile suprafizyolojik kas kütlesinin transgenik fare modeli arasında tetanik torku zirveye çıkarmak için değişiklikler tespit edebildik (Şekil 8). Kas kasılmaları elektrotları hafifçe hareket ettirebileceği için elektrotların yardım elleriyle veya benzer aparatlarla sabitlenmenin faydalı olabileceğini belirtiyoruz. elektrotların ilerleyici kasılmalarla belirgin bir yer değiştirme olduğunu not etmedik; bununla birlikte, elektrotların hafif hareket etme olasılığı göz ardı edilemez, bu da kas stimülasyonunu etkileyebilir. Ek olarak, intramüsküler elektromiyografi (EMG) uyaran protokolü ile birlikte yapılmamıştır; ancak, emg önlemlerinin dahil edilmesi, istenirse ve deneysel ilgi modeli için uygunsa mümkün olabilir.
Ortopedik yaralanma ve hastalığın murine modellerinde diz ekstensör gücünün değerlendirilmesi, klinik güç önlemlerine anlamlı çevirisel alaka ile klinik öncesi araştırmaları kolaylaştıracaktır. Protokolümüz, herhangi bir laboratuvar tarafından erişilebilen ticari ekipmanlarla farelerde maksimum diz ekstensör gücünün hassas ve tekrarlanan bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Disclosures
Matthew Borkowski, araştırma sonuçlarından potansiyel olarak yararlanabilecek bir şirket olan Aurora Scientific Inc. tarafından istihdam edilmektedir ve aynı zamanda şirketin yöneticisidir.
Acknowledgments
Rosario Maroto'ya teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından R01 AR072061 (CSF) Ödül Numarası altında desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System- Mouse | Aurora Scientific Incorporated | 300D-305C-FP: dual-mode motor with custom knee extension apparatus, 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition and Analysis System, 701C: Electrical Stimulator, 809C: in-situ Mouse Apparatus | |
| 6100 Dynamic Muscle Control LabBook software | Aurora Scientific Incorporated | DMC v6.000 | |
| 611A Dynamic Muscle Analysis | Aurora Scientific Incorporated | DMA v5.501 | |
| BravMini hair clippers | Wahl Clipper Corporation | ASIN: B00IN24ILE | |
| Eye Lube | Optixcare | Item Number: 142422 | |
| Isoflurane | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | Item Number: 901806 | |
| Prism 8 | GraphPad Software, LLC | Version 8.3.0 (328) |
References
- Brightwell, C. R., et al. Moderate-intensity aerobic exercise improves skeletal muscle quality in older adults. Translational Sports Medicine. 2 (3), 109-119 (2019).
- Moro, T., et al. Muscle protein anabolic resistance to essential amino acids does not occur in healthy older adults before or after resistance exercise training. Journal of Nutrition. 148 (6), 900-909 (2018).
- Angelozzi, M., et al. Rate of force development as an adjunctive outcome measure for return-to-sport decisions after anterior cruciate ligament reconstruction. Journal of Orthopedic Sports Physical Therapy. 42 (9), 772-780 (2012).
- Kalyani, R. R., et al. Quadriceps strength, quadriceps power, and gait speed in older U.S. adults with diabetes mellitus: results from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999-2002. Journal of American Geriatric Society. 61 (5), 769-775 (2013).
- Culvenor, A. G., Ruhdorfer, A., Juhl, C., Eckstein, F., Øiestad, B. E. Knee extensor strength and risk of structural, symptomatic, and functional decline in knee osteoarthritis: A systematic review and meta-analysis. Arthritis Care Res (Hoboken). 69 (5), 649-658 (2017).
- Abramowitz, M. K., et al. Skeletal muscle fibrosis is associated with decreased muscle inflammation and weakness in patients with chronic kidney disease. American Journal of Physiology and Renal Physiology. 315 (6), 1658-1669 (2018).
- Arentson-Lantz, E. J., English, K. L., Paddon-Jones, D., Fry, C. S. Fourteen days of bed rest induces a decline in satellite cell content and robust atrophy of skeletal muscle fibers in middle-aged adults. Journal of Applied Physiology. 120 (1985), 965-975 (2016).
- Pratt, S. J. P., Lovering, R. M. A stepwise procedure to test contractility and susceptibility to injury for the rodent quadriceps muscle. Journal of Biological Methods. 1 (2), (2014).
- Kamekura, S., et al. Osteoarthritis development in novel experimental mouse models induced by knee joint instability. Osteoarthritis Cartilage. 13 (7), 632-641 (2005).
- Kwok, J., et al. Histopathological analyses of murine menisci: implications for joint aging and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 24 (4), 709-718 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Christiansen, B. A., et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 20 (7), 773-782 (2012).
- Wurtzel, C. N., et al. Pharmacological inhibition of myostatin protects against skeletal muscle atrophy and weakness after anterior cruciate ligament tear. Journal of Orthopedic Research. 35 (11), 2499-2505 (2017).
- Botter, A., et al. Atlas of the muscle motor points for the lower limb: implications for electrical stimulation procedures and electrode positioning. European Journal of Applied Physiology. 111 (10), 2461-2471 (2011).
- Gobbo, M., Maffiuletti, N. A., Orizio, C., Minetto, M. A. Muscle moter point identification is essential for optimizing neuromuscular electrical stimulation use. Journal of Neuroengineering and Rehabililitation. 11, 17 (2014).
- Neelakantan, H., et al. Small molecule nicotinamide N-methyltransferase inhibitor activates senescent muscle stem cells and improves regenerative capacity of aged skeletal muscle. Biochemical Pharmacology. 163, 481-492 (2019).
- Kline, P. W., Morgan, K. D., Johnson, D. L., Ireland, M. L., Noehren, B. Impaired quadriceps rate of torque development and knee mechanics after anterior cruciate ligament reconstruction with patellar tendon autograft. American Journal of Sports Medicine. 43 (10), 2553-2558 (2015).
- Hiemstra, L. A., Webber, S., MacDonald, P. B., Kriellaars, D. J. Knee strength deficits after hamstring tendon and patellar tendon anterior cruciate ligament reconstruction. Medicine and Science in Sports and Exercise. 32 (8), 1472-1479 (2000).
- Park, K. H., et al. Ex vivo assessment of contractility, fatigability and alternans in isolated skeletal muscles. Journal of Visualized Experiments. (69), e4198 (2012).
- MacIntosh, B. R., Esau, S. P., Holash, R. J., Fletcher, J. R. Procedures for rat in situ skeletal muscle contractile properties. Journal of Visualized Experiments. (56), e3167 (2011).
- Chiu, C. S., et al. Non-invasive muscle contraction assay to study rodent models of sarcopenia. BMC Musculoskeletal Disorder. 12, 246 (2011).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of in vivo functional testing of the rat tibialis anterior for evaluating tissue engineered skeletal muscle repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Gerlinger-Romero, F., et al. Non-invasive assessment of dorsiflexor muscle function in mice. Journal of Visualized Experiments. (143), e58696 (2019).
- Davis, C. C., Ellis, T. J., Amesur, A. K., Hewett, T. E., Di Stasi, S. Improvements in knee extension strength are associated with improvements in self-reported hip function following arthroscopy for femoroacetabular impingement syndrome. International Journal of Sports Physical Therapy. 11 (7), 1065-1075 (2016).
- Omori, G., et al. Quadriceps muscle strength and its relationship to radiographic knee osteoarthritis in Japanese elderly. Journal of Orthopedic Science. 18 (4), 536-542 (2013).
- Wilk, K. E., Romaniello, W. T., Soscia, S. M., Arrigo, C. A., Andrews, J. R. The relationship between subjective knee scores, isokinetic testing, and functional testing in the ACL-reconstructed knee. Journal of Orthopedic Sports and Physical Therapy. 20 (2), 60-73 (1994).
- Bobowik, P., Wiszomirska, I. Diagnostic dependence of muscle strength measurements and the risk of falls in the elderly. Internation Journal of Rehabilitation Research. 43 (4), 330-336 (2020).
