Summary
Descrevemos um protocolo rápido e robusto para enriquecer células T (iNKT) invariantes do assassino natural do baço do rato e expandi-las in vitro para números adequados para estudos in vitro e in vivo.
Abstract
As células T (iNKT) invariantes são linfócitos T inatas que expressam um receptor de células T semi-invariante (TCR) conservado específico para antígenos lipídicos auto ou microbianos apresentados pela molécula não polimórfica relacionada ao MHC CD1d. Estudos pré-clínicos e clínicos apoiam um papel para células iNKT em câncer, autoimunidade e doenças infecciosas. As células iNKT são muito conservadas em todas as espécies e sua investigação foi facilitada por modelos de camundongos, incluindo camundongos deficientes de CD1d ou deficientes em INKT, e a possibilidade de detectá-las inequivocamente em camundongos e homens com tetramers CD1d ou mAbs específicos para o TCR semi-invariante. No entanto, as células iNKT são raras e precisam ser expandidas para alcançar números gerenciáveis para qualquer estudo. Como a geração da linha celular iNKT primária do mouse in vitro tem se mostrado difícil, criamos um protocolo robusto para purificar e expandir células iNKT esplênicas a partir dos camundongos transgênicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg), nos quais as células iNKT são 30 vezes mais frequentes. Mostramos aqui que as células iVα14Tg iNKT primárias podem ser enriquecidas através de um processo de separação imunomagnética, produzindo cerca de 95-98% de células iNKT puras. As células iNKT purificadas são estimuladas por contas anti-CD3/CD28 mais IL-2 e IL-7, resultando em expansão de 30 vezes até o dia +14 da cultura com 85-99% de pureza. As células iNKT expandidas podem ser facilmente manipuladas geneticamente, fornecendo uma ferramenta inestimável para dissecar mecanismos de ativação e função in vitro e, mais importante, também após transferência adotiva in vivo.
Introduction
Invariantes Células T assassinas naturais (células iNKT) são linfócitos T inatas que expressam um receptor de células αβ T semi-invariante (TCR), formado em camundongos por uma cadeia vα14-Jα18 inata emparelhada com um conjunto limitado de diversas cadeias Vβ1, que é específica para antígenos lipídicos apresentados pela molécula de classe I da MHC CD1d2. as células iNKT passam por um programa de seleção agonista, resultando na aquisição de um fenótipo ativado/inato do efeito ou do tímumo, que ocorre através de várias etapas de maturação3,4, produzindo um cd4+ e um subconjunto CD4. Através deste programa, as células iNKT adquirem fenótipos de efeito t (TH) distintos, ou seja, TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) e TH17 (iNKT17), identificáveis pela expressão dos fatores de transcrição T-bet, GATA3, PLZF e RORγt,respectivamente 5. As células iNKT reconhecem uma gama de lipídios microbianos, mas também são auto-reativas contra lipídios endógenos que são regulados no contexto de situações patológicas de estresse celular e danos teciduais, como câncer e autoimunidade2. Após a ativação, as células iNKT modulam as funções de outras células inatas e adaptativas do efeito imunológico através do contato direto e da produção de citocinas2.
As investigações das células iNKT foram facilitadas por modelos de camundongos, incluindo camundongos deficientes de CD1d ou Jα18 deficientes, e pela produção de tetramers CD1d carregados de antígeno mais a geração de anticorpos monoclonais (mAbs) específicos para o TCR semi-invariante humano. No entanto, a geração da linha celular iNKT do mouse primário tem se mostrado difícil. Para caracterizar melhor as funções antitumorais das células iNKT e utilizá-las para a terapia celular adotiva, criamos um protocolo para purificar e expandir células esfécnicas iNKT de camundongos transgênicos iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, em que as células iNKT são 30 vezes mais frequentes do que em camundongos do tipo selvagem.
Células iNKT expandidas podem ser exploradas para ensaios in vitro, e in vivo após transferência de volta para camundongos. Neste cenário, por exemplo, mostramos seus potentes efeitos anti-tumor7. Além disso, as células iNKT expandidas in vitro são favoráveis à modificação funcional via transferência ou edição de genes antes de sua injeção in vivo8, permitindo uma análise funcional perspicaz das vias moleculares, bem como abrindo caminho para terapias celulares avançadas.
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Protocol
Os procedimentos aqui descritos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) (nº 1048) do Instituto Científico de San Raffaele.
NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis. Todos os reagentes utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Processamento de baço
- Eutanize os camundongos iVα14-Jα18 por inalação de CO2 de acordo com a política institucional.
NOTA: os camundongos iVα14-Jα18 devem ter 8 semanas ou mais. Para evitar a rejeição das células da transferência in vivo das células, considere que as células isoladas de camundongos fêmeas podem ser transferidas de forma adotiva tanto em receptores masculinos quanto femininos, enquanto as células isoladas de camundongos machos só podem ser transferidas em receptores masculinos. Para experimentos in vitro, nenhum viés de gênero deve ser considerado. Mais camundongos podem ser agrupados para obter mais células. - Disseca o baço do rato e esmague-o através de um coador de células de 70 nm para obter uma suspensão unicelular em 10 mL de soro salino tamponado fosfato (PBS) com 2% de soro bovino fetal (FBS).
- Centrifugar a 300 x g por 5 min.
- Remova o supernatante por inversão e processe com tampão de lise eritrócito. Resuspenque a pelota celular com 1 mL de ACK (Amônio-Cloreto-Potássio) Tampão de lise, incubar por 3 minutos à temperatura ambiente e bloquear com 5 mL de PBS com 2% de FBS. Centrifugar a 300 x g por 5 min.
NOTA: A ACK está disponível comercialmente; consiste em uma solução de 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3e 0,1 mM Na2EDTA (ácido etilenodiaminetetraacético) dissolvido em H2O bidistilled, pH 7.2-7.4. Se for caseiro, esterilize por filtragem com um filtro de 0,22 μm. - Remova o supernatante por inversão. Resuspense a pelota celular em 3 mL de PBS com 2% de FBS e remova resíduos de gordura por pipetação. Se necessário, acumule as células provenientes de diferentes camundongos.
- Conte as células e mantenha 50 μL para análise facs.
2. Enriquecimento celular T
NOTA: Para os passos de enriquecimento, trabalhe rápido, mantenha as células frias e use soluções pré-refresadas a 4 °C durante a noite e depois mantidas no gelo
- Centrifugar a 300 x g por 5 min.
- Resuspende todas as células na quantidade apropriada de PBS com 2% de FBS (500 μL para 107 células) e bloqueador de Fc (2,5 μL x 107 células); incubar por 15 min a temperatura ambiente (RT).
- Lave com 1-2 mL de tampão de separação MACS (MB) por 107 células totais e centrífuga a 300 x g por 10 min.
NOTA: O buffer MACS está disponível comercialmente. É composto por PBS pH 7.2, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM EDTA. Se for caseiro, esterilize por filtragem com um filtro de 0,22 μm. - Remova o supernatante por inversão e colora as células com CD19-FITC e H2(IAb)-FITC (use 5 μL x 107 células em 100 μL de MB). Misture bem e incubar por 15 min no escuro a 4-8 °C.
- Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.
- Pipeta fora do supernante completamente e resuspensar a pelota celular em 90 μL de MB por 107 células totais. Adicione 10 μL de MicroEsferas Anti-FITC por 107 células totais. Misture bem e incubar por 15 min no escuro a 4-8 °C.
- Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.
- Pipeta fora do supernasceto completamente e resuspend até 1,25 x 108 células em 500 μL de MB.
- Coloque uma coluna LD no campo magnético do separador MACS para prosseguir com o esgotamento. Para evitar entupimento, aplique um filtro de pré-separação na coluna LD e enxágue com 2 mL de MB.
- Quando o reservatório da coluna estiver vazio, aplique a suspensão da célula no filtro. Colete as células sem rótulo que passam pela coluna.
- Lave 3 vezes com 1 mL de MB, somente quando o reservatório da coluna estiver vazio. Recolhe o efluente total, que será enriquecido em células T, e conte as células. Mantenha sempre 50 μL para análise FACS.
3. enriquecimento celular iNKT
- Centrifugar a 300 x g por 5 min e remover o supernatante por inversão.
- Colorisse as células com CD1d-tetramer-PE (mouse PBS57-CD1d-tetramer), de acordo com a titulação de anticorpos em 50 μL de MB por 106 células. Misture bem e incubar por 30 minutos no escuro no gelo.
NOTA: O procedimento também pode ser realizado com tetramers mCD1d rotulados pela APC e contas anti-APC; ajustando os fluorochromes utilizados nas seguintes manchas em conformidade. No presente protocolo, utilizamos mouse PBS-57-CD1d-tetramers fornecidos pelo NIH. αgalactosylceramida (αGal-Cer) é o antígeno prototípico reconhecido pelas células iNKT; PBS-57 é um análogo de αGal-Cer com solubilidade melhorada9; a NiH Tetramer Facility fornece ligantes PBS-57 complexos para tetramers CD1d. No entanto, outros dimers CD1d/tetramers/dextramers estão comercialmente disponíveis e podem ser carregados com um antígeno lipídico como αGal-Cer. Prevemos a possibilidade de ajustar o protocolo para seu uso. - Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.
- Pipeta fora do supernante completamente e resuspensar a pelota celular em 80 μL de MB por 107 células totais. Adicione 20 μL de MicroEsferas Anti-PE por 107 células totais. Misture bem e incubar por 15 min no escuro a 4-8 °C.
- Lave as células adicionando 1-2 mL de MB por 107 células e centrífuga a 300 x g por 10 min.
- Pipeta fora do supernasceto completamente e resuspend até 108 células em 500 μL de MB. Caso contrário, se as células excederem10 8,ajuste o volume de acordo.
- De acordo com a contagem de células, coloque uma coluna LS (até 108) ou MS (até 107) no campo magnético do separador MACS. Enxágüe a coluna com MB (3 mL para LS, 500 μL para MS).
- Aplique a suspensão do celular na coluna.
- Colete células sem rótulo que passam. Lave a coluna 3 vezes adicionando a quantidade apropriada de MB (3 x 3 mL para a coluna LS, 3 x 500 μL para coluna MS) somente quando o reservatório da coluna estiver vazio. O efluente total é a fração negativa.
- Remova a coluna do campo magnético e coloque-a em um novo tubo de coleta.
- Pipeta MB na coluna (5 mL para coluna LS ou 1 mL para coluna MS); empurre o êmbolo fornecido para dentro da coluna e limpe a fração positiva (enriquecida em células iNKT).
- Para aumentar ainda mais a recuperação da célula iNKT, centrifugar a fração negativa em 300 x g por 10 min e repetir passos 3.6-3.7 com uma nova coluna LS ou MS. Acumule as frações positivas e determine a contagem de células. Mantenha 50 μL de frações positivas e negativas para análise FACS.
- Verifique as etapas de Purificação pela análise FACS. As amostras incluem: ex-vivo do baço, fração enriquecida com células T, fração positiva iNKT e fração negativa iNKT. Colorique as células com: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC e DAPI.
NOTA: A recuperação esperada de um mouse iVα14-Jα18 é de células 2x106 iNKT .
4. ativação e expansão de células iNKT
- Ative células magnéticas iNKT purificadas com o ativador T do mouse anti-CD3/CD28 em uma proporção de 1:1.
- Centrifugar a fração positiva da célula iNKT a 300 x g por 5 min.
- Enquanto isso, transfira o volume apropriado de contas magnéticas anti-CD3/CD28 para um tubo e adicione um volume igual de PBS, vórtice por 5 segundos. Coloque o tubo em um ímã por 1 minuto e descarte o supernatante.
- Remova o tubo do ímã e resuspenque as contas magnéticas lavadas no volume adequado de RPMI completo (meio RPMI 1640, FCS inativado por calor de 10%, 1 mM piruvato de sódio, 1% aminoácidos não essenciais, penicílina de 10 U/ml e estreptomicina, 50 μM β-Mercaptoethanol) para ter 5 x 105 células iNKT em 1 mL. Use esta suspensão para resuspensar a fração positiva iNKT centrifusada.
- Placa 1 mL da suspensão celular (5 x 10células iNKT) e contas magnéticas anti-CD3/CD28 em uma placa de 48 poços com 20 U/mL IL-2 e incubar a 37 °C.
- Após 5 dias, adicione 10 ng/mL IL-7.
- Divida as células 1:2 quando atingirem 80-90% de confluência, adicione sempre 20U/mL IL-2 e 10 ng/mL IL-7. Nessas condições, as células iNKT podem ser expandidas por até 15 dias.
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Representative Results
O protocolo descrito neste manuscrito permite enriquecer células iNKT do baço de camundongos transgênicos iVa14-Ja18 através de um processo de separação imunomagnética resumido na Figura 1A. As células T do baço total são primeiramente selecionadas negativamente pelo esgotamento das células B e monócitos, seguidas pela classificação imunomagnética positiva da célula iNKT com tetramers CD1d carregados de antígeno lipídico PBS-57, que permitem manchar especificamente apenas células iNKT. Este protocolo rende cerca de 2 x 106 de células iNKT 95-98% puras do baço de um único mouse iVa14-Ja18 Tg. Não ou realmente poucas células iNKT podem ser detectadas na fração negativa(Figura 1B).
Após o enriquecimento, as células iVa14 iNKT podem ser expandidas com contas anti-CD3/CD28 mais IL-2 e IL-7(Figura 2A),resultando em expansão de 30 vezes em média pelo dia +14 da cultura, como mostrado na Figura 2B.
A Figura 3A mostra a pureza celular iNKT juntamente com a expansão in vitro e a expressão da molécula cd4. Observamos uma diminuição na porcentagem de células TCRβ+ CD1d-tetramer+ dupla positiva: a forte ativação com contas anti-CD3/CD28 está induzindo a redução da expressão TCR celular iNKT na superfície celular, e uma população dupla negativa está aparecendo. A maioria das células iNKT expandidas foram CD4-. A Figura 3B mostra uma caracterização da expressão dos fatores de transcrição específicos da linhagem PLZF e RORγt em células iNKT enriquecidas nos dias 0 e 14 após a expansão. Esta coloração permite identificar os fenótipos NKT1 (PLZFlow RORγt-), NKT2 (PLZFhigh RORγt-) e NKT17 (PLZFint RORγt+) fenótipos. Sendo principalmente NKT1 e NKT2, as células enriquecidas iNKT mostram um fenótipo de efeitos tipo TH0. Este fenótipo é conservado após 14 dias de expansão, conforme confirmado pela secreção tanto do IFN-γ quanto do IL-4 após a estimulação da PMA/Ionomicina mostrada na Figura 3C.
Figura 1: enriquecimento celular iNKT. A) Representação esquemática do protocolo de separação imunomagnética. B) Análise da citometria de fluxo de cada etapa de enriquecimento. A porcentagem de frequências de células T são mostradas nos lotes superiores, fechadas em linfócitos viáveis. Enquanto a porcentagem de frequências celulares iNKT ao longo de cada etapa são mostradas nas parcelas inferiores, fechadas em linfócitos viáveis de CD19- TCRβ+ linfócitos. Coloração em CD19 viável- Linfócitos TCRβ+ com tetramer CD1d descarregado permitem desenhar corretamente o portão de célula iNKT. Um experimento representativo é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: expansão in vitro da célula iNKT. A) iNKT conta ao longo da expansão celular iNKT. Três experimentos representativos e independentes são mostrados. B) Aumento do fold no número de células iNKT nos dias 7 e 14 após a purificação e ativação. Significa ± SD são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização expandida da célula iNKT. A) Análise da citometria de fluxo do percentual de células iNKT e expressão CD4 ao longo do período de expansão. Os lotes superiores são fechados em linfócitos viáveis. Parcelas inferiores são fechadas em células iNKT (cd1d-tetramerviável + linfócitos TCRβ+). B) Caracterização fenotípica de células enriquecidas (dia 0) e expandidas (dia 14) iNKT. As parcelas são fechadas em células iNKT (CD1d-tetramerviável + linfócitos TCRβ+). As células foram manchadas intranuclearmente para fatores de transcrição com o Conjunto de Buffer de Manchas do Fator de Transcrição Foxp3. Foram identificados subconjuntos NKT1 (PLZFlow RORγt-), NKT2 (PLZFhigh RORγt-),e NKT17 (PLZFint RORγt+) subconjuntos são mostrados em porcentagem. C) Produção de citocinas por células iNKT expandidas no dia 14. As parcelas são fechadas em células iNKT (CD1d-tetramerviável + linfócitos TCRβ+). As células foram estimuladas durante 4 horas com PMA 25 ng/mL/Ionomicina 1 μg/mL, na presença das últimas 2 horas de Brefeldin A 10 μg/mL. As células foram então fixadas com PFA 2%, permeabilizadas com Permwash e, em seguida, intracelularmente manchadas para a produção de citocinas. A estratégia de gating foi definida no controle não ativado, painel esquerdo. Um experimento representativo é mostrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui mostramos um protocolo reprodutível e viável para obter milhões de células iNKT prontas para uso. Devido à escassez dessas células in vivo, um método para expandi-las era altamente necessário. O protocolo que propomos não requer uma instrumentação específica nem um alto número de ratos. Exploramos camundongos transgênicos iVα14-Jα18 de propósito para reduzir o número de camundongos necessários para o procedimento.
Outro protocolo bem sucedido para expansão celular iNKT a partir de camundongos transgênicos iVα14-Jα18 está disponível na literatura10. Este protocolo envolve a geração, 6 dias antes da purificação celular iNKT, de células dendríticas derivadas da medula óssea frescas, então carregadas com α-galactosylceramida e irradiadas, além de IL-2 e IL-7. Consideramos a redução do número de camundongos envolvidos no procedimento uma grande vantagem do protocolo. Também é poupador de tempo, já que a criação da cultura celular dura um único dia em vez de uma semana. Uma possível limitação da reprodutibilidade do protocolo atual poderia ser a disponibilidade de camundongos transgênicos iVα14-Jα18, que no entanto estão disponíveis comercialmente. Na ausência desses camundongos, prevemos a possibilidade de usar um grande número de camundongos WT, mas o protocolo precisa ser configurado de acordo devido à escassez de células iNKT em camundongos WT.
Durante a cultura celular, geralmente verificamos a pureza e o fenótipo das células iNKT expandidas. A diminuição da porcentagem de células TCRβ+ CD1d-tetramer+ dupla positiva (Figura 3A) pode ser explicada por uma redução natural da célula NKT invariante TCR da superfície celular após a ativação. Além disso, a maioria das células iNKT expandidas não expressou CD4 (Figura 3A): isso pode representar uma vantagem no contexto de uma terapia celular adotiva, uma vez que as células CD4- iNKT foram consideradas as mais eficazes no controle da progressão do tumor11. Além disso, o fenótipo de efeitos TH0 observado (Figura 3C) é inteiramente coerente com o observado em células humanas iNKT após expansão in vitro e restimulação8,12,13,14,15. As células expandidas são altamente reativas in vivo e in vitro, assim úteis em contextos de imunoterapias adotivas baseadas em células iNKT. A transferência adotiva de células iNKT não manipuladas ou expandidas previne ou ameniza a doença aguda do enxerto contra hospedeiro (aGVHD) deixando sem danos o efeito enxerto versus leucemia16,17,18,19. As células humanas iNKT transferidas adotivamente expandidas in vitro com αGal-Cer aliviam a aGVHD xenogênica e esse efeito é mediado por CD4- mas não células CD4+ 20. Além disso, dado que as células iNKT não causam aGVHD, elas constituem as células ideais para a imunoterapia car sem necessidade de exclusão de seu TCR e provaram ter atividade antitumoral prolongada in vivo8,15. as células iNKT são atualmente exploradas em ensaios clínicos contínuos e concluídos21,22,23,24.
Em conclusão, o protocolo descrito é rápido, simples e permite um aumento de 30x no número de células iNKT recuperadas de um baço de camundongos(Figura 3B). Essas células podem ser facilmente exploradas para ensaios de reconhecimento in vitro, sistemas de cocultura ou terapia celular adotiva em estudos pré-clínicos. As células iNKT, de fato, desempenham um papel crítico na vigilância imunológica do tumor, doenças infecciosas e autoimunidade. Nesses contextos, as células iNKT podem representar uma ferramenta poderosa, sendo uma alternativa atraente às células T convencionais desprovidas da restrição do MHC. A rápida geração de grandes quantidades dessas células e a possibilidade de manipulá-las in vitro podem levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas sem precedentes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Paolo Dellabona e Giulia Casorati pelo apoio científico e leitura crítica do manuscrito. Agradecemos também ao NIH Tetramer Core Facility pelo tetramer CD1d do mouse. O estudo foi financiado pela fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (para m.F.) e associação italiana de pesquisa do câncer (AIRC) bolsa 2019-22604 (para G.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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