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Biology

3 डी बायोरिएक्टर कल्चर द्वारा श्लेष द्रव मेसेनकाइमल स्टेम सेल-व्युत्पन्न एक्सोसोम की बड़े पैमाने पर तैयारी

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/62221
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,3
1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

Summary

यहां, हम 3 डी बायोरिएक्टर का उपयोग करके श्लेष द्रव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से बड़ी संख्या में जीएमपी-ग्रेड एक्सोसोम का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) द्वारा स्रावित एक्सोसोम को उपास्थि की चोटों और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस उपचार के लिए आशाजनक उम्मीदवारों के रूप में सुझाया गया है। नैदानिक अनुप्रयोग के लिए एक्सोसोम को बड़े पैमाने पर उत्पादन की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, मानव श्लेष द्रव एमएससी (एचएसएफ-एमएससी) को माइक्रोकैरियर मोतियों पर उगाया गया था, और फिर एक गतिशील तीन-आयाम (3 डी) संस्कृति प्रणाली में सुसंस्कृत किया गया था। 3 डी गतिशील संस्कृति का उपयोग करने के माध्यम से, इस प्रोटोकॉल ने सफलतापूर्वक एसएफ-एमएससी संस्कृति सुपरनैटेंट से बड़े पैमाने पर एक्सोसोम प्राप्त किए। एक्सोसोम को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया था और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप, नैनोपार्टिकल ट्रांसमिशन परख और पश्चिमी सोख्ता द्वारा सत्यापित किया गया था। इसके अलावा, एक्सोसोम की सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा का पता लगाया गया था। एक्सोसोम का पता लगाने के परिणाम बताते हैं कि यह दृष्टिकोण बड़ी संख्या में अच्छी विनिर्माण प्रथाओं (जीएमपी) ग्रेड एक्सोसोम का उत्पादन कर सकता है। इन एक्सोसोम का उपयोग एक्सोसोम जीव विज्ञान अनुसंधान और नैदानिक पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस उपचार में किया जा सकता है।

Introduction

ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए), संयुक्त उपास्थि और अंतर्निहित हड्डी के टूटने के परिणामस्वरूप, विकलांगता 1,2 के लिए एक गंभीर चुनौती बनी हुई है। रक्त और तंत्रिका आपूर्ति के बिना, उपास्थि आत्म-उपचार क्षमता एक बार घायल होने के बाद न्यूनतम होती है 3,4. पिछले दशकों में, ऑटोलॉगस चोंड्रोसाइट्स प्रत्यारोपण (एसीआई) पर आधारित उपचारों ने ओए उपचार 5 में कुछ प्रगति कीहै। चोंड्रोसाइट्स अलगाव और विस्तार के लिए, ओए संयुक्त के गैर-वजन वाले क्षेत्र से छोटे उपास्थि की कटाई आवश्यक है, जिससे उपास्थि को चोटें लगती हैं। इसके अलावा, विस्तारित चोंड्रोसाइट्स6 को प्रत्यारोपित करने के लिए प्रक्रिया को दूसरे ऑपरेशन की आवश्यकता होगी। इस प्रकार, उपास्थि की चोटों के बिना ओए उपचार के लिए एक-चरण उपचार व्यापक अन्वेषण के अधीन हैं।

मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) को ओए उपचार 7,8 के लिए आशाजनक विकल्प के रूपमें सुझाया गया है। कई ऊतकों से उत्पन्न, एमएससी विशिष्ट उत्तेजना के साथ चोंड्रोसाइट्स में अंतर कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, एमएससी एंटी-सूजन 9 के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं कोसंशोधित कर सकते हैं। इसलिए, एमएससी उपास्थि दोषों की मरम्मत और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करके ओए उपचार में महत्वपूर्ण लाभ रखते हैं, खासकर सूजन वातावरण में। ओए उपचार के लिए, श्लेष द्रव (एसएफ-एमएससी) से एमएससी ने हाल ही में अन्य एमएससी स्रोतों10,11 की तुलना में अपनी मजबूत चोंड्रोसाइट्स भेदभाव क्षमता के कारण बहुत ध्यान आकर्षित किया है। विशेष रूप से, आर्थोपेडिक क्लिनिक में, संयुक्त गुहा से भड़काऊ एसएफ का निष्कर्षण ओए रोगियों के दर्द लक्षण को दूर करने के लिए एक नियमित चिकित्सा है। निकाले गए भड़काऊ एसएफ को आमतौर पर चिकित्सा अपशिष्ट के रूप में निपटाया जाता है। रोगी और डॉक्टर दोनों भड़काऊ एसएफ से अलग ऑटोलॉगस एमएससी को बहुत कम नैतिक संघर्षों के साथ ओए उपचार के रूप में मानने के लिए तैयार हैं। हालांकि, एसएफ-एमएससी थेरेपी ट्यूमरोजेनिक जोखिमों, लंबे समय तक भंडारण और दूर के शिपमेंट बाधाओं के कारण समझौता किया जाता है।

एमएससी सहित कई सेल प्रकारों द्वारा स्रावित एक्सोसोम, अधिकांश मूल सेल जैव-जानकारी ले जाते हैं। सेल-फ्री थेरेपी12,13 के रूप में इसकी गहराई से जांच की गई है। नैदानिक परीक्षण सरकार (ClinicalTrials.gov) की वेबसाइट पर उपलब्ध अद्यतन संसाधनों के अनुसार, कैंसर, उच्च रक्तचाप और न्यूरो-डीजेनेरेटिव रोगों के अनुसंधान क्षेत्रों में अधिक व्यापक एक्सोसोम नैदानिक अध्ययन शुरू किए गए हैं और किए गए हैं। एसएफ-एमएससी एक्सोसोम उपचार ओए से निपटने के लिए एक रोमांचक और चुनौतीपूर्ण परीक्षण हो सकता है। नैदानिक अनुवाद के लिए अच्छा विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी)-ग्रेड और बड़े पैमाने पर एक्सोसोम उत्पादन आवश्यक हैं। दो-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति के आधार पर छोटे पैमाने पर एक्सोसोम अलगाव व्यापक रूप से किया गया है। हालांकि, बड़े पैमाने पर एक्सोसोम उत्पादन रणनीतियों को अनुकूलन की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन में एक बड़े पैमाने पर एक्सोसोम विनिर्माण विधि विकसित की गई थी, जो क्सीन-मुक्त परिस्थितियों में बड़े पैमाने पर एसएफ-एमएससी संस्कृति पर आधारित थी। सेल कल्चर सुपरनैटेंट से अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एक्सोसोम सुरक्षा और कार्य को मान्य किया गया था।

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Protocol

इस अध्ययन को शेन्ज़ेन सेकंड पीपुल्स हॉस्पिटल की मानव आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। विट्रो प्रोटोकॉल में एचएसएफ-एमएससी से अलग एक्सोसोम का एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1 में दिखाया गया है।

1. मानव एसएफ-एमएससी संस्कृति और पहचान

  1. नैदानिक ओए रोगियों से सिरिंज और सुई का उपयोग करके एसएफ के 20 एमएल की कटाई करें।
    1. ओए रोगी के घुटने के जोड़ को कीटाणुरहित करें। पेटेला के बाहर क्वाड्रिसेप्स फेमोरिस टेंडन से 7 # सुई के साथ आर्टिकुलर गुहा में पंचर।
    2. संयुक्त तरल पदार्थ के 10 एमएल निकालें। पंचर साइट को ट्रांसफ्यूजन स्टिक से कवर करें और 5 मिनट के लिए दबाएं।
  2. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एसएफ सुपरनैटेंट को 1,500 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  3. सेल पेलेट को 10 एमएल 1x फॉस्फेट बफर सेलाइन (पीबीएस) के साथ पुन: निलंबित करें, सेंट्रीफ्यूज को 1,500 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और पीबीएस को छोड़ दें।
  4. 5 x 104 कोशिकाओं / एमएल ( सामग्री की तालिका देखें) के सेल घनत्व पर मानव एमएससी कल्चर माध्यम के 10 एमएल के साथ गोली को फिर से निलंबित करें, और फिर 100 मिमी डिश में निलंबन को प्लेट करें।
  5. डिश को 5% सीओ2 वाले वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 48 घंटे के बाद, माध्यम बदलकर गैर-अनुयायी कोशिकाओं को हटा दें और 1x PBS के साथ धो लें। 2 सप्ताह के लिए हर 3 दिन में माध्यम बदलें।
  7. सेल कल्चर सुपरनैटेंट एकत्र करें।
  8. फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके एसएफ-एमएससी की पहचान करें।
    1. एसएफ-एमएससी की तीसरी पीढ़ी (पी 3) को पचाएं, सेंट्रीफ्यूज 1,000 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और सेल गोली एकत्र करें।
      नोट: एक मार्ग को कोशिकाओं की उप-संस्कृति के रूप में पहचाना जाता है। एसएफ से अलग और व्यंजनों पर बीज ति प्राथमिक कोशिकाओं को मार्ग शून्य (पी 0) के रूप में लेबल किया जाता है। लगभग 75% संगम पर, कोशिकाओं को पचाया जाता है और व्यंजनों से अलग किया जाता है, अन्य व्यंजनों पर बीज दिया जाता है, और पी 1 के रूप में लेबल किया जाता है।
    2. सेल पेलेट (5 x 10 4) में ब्लॉकिंग बफर (1x PBS में 1% बीएसए) के400 μL जोड़ें और इसे कमरे के तापमान (RT) पर 15 मिनट तक खड़े रहने दें।
    3. सेंट्रीफ्यूज 1,000 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए, सतह पर तैरने वाला छोड़ दें, और 1x PBS के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    4. प्रति ट्यूब CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR मोनोक्लोनल फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (तनुकरण अनुपात 1:100) ( सामग्री की तालिका देखें) का 1 μL जोड़ें और 30 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
    5. 1x PBS से दो बार धोएं और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। सेल पेलेट एकत्र करें और 1x PBS के 100 μL में पुन: निलंबित करें।
    6. फ्लोरोफोरे का पता लगाने के लिए 525/50 और 585/40 के फिल्टर का उपयोग करके 10,000 कोशिकाओं तक प्रवाह साइटोमीटर पर पता लगाएं।

2.3D बायोरिएक्टर सेल कल्चर

  1. माइक्रोकैरियर की तैयारी
    1. सूखे 0.75 ग्राम माइक्रोकैरियर ( सामग्री की तालिका देखें) को छानें और आरटी पर कम से कम 3 घंटे के लिए 1x Dulbecco के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (DPBS) (माइक्रोकैरियर के 50 एमएल / जी) में हाइड्रेट करें।
    2. सुपरनैटेंट को डिकैंटिन करें और ताजा डीपीबीएस (50 एमएल / जी माइक्रोकैरियर) में 5 मिनट के लिए माइक्रोकैरियर को धोएं। पीबीएस को छोड़ दें और इसे ताजा 1x DPBS (माइक्रोकैरियर के 50 mL / g) के साथ बदलें।
    3. ऑटोक्लेविंग (121 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट, 15 पीएसआई) द्वारा माइक्रोकैरियर को निष्फल करें। निष्फल माइक्रोकैरियर को बसने दें, सुपरनैटेंट को अलग करें।
    4. संक्षेप में सूक्ष्मवाहकों को RT पर संस्कृति माध्यम (माइक्रोकैरियर के 50 mL/g) में कुल्ला करें। माइक्रोकैरियर को बसने की अनुमति दें, सुपरनैटेंट को त्याग दें।
  2. छिड़काव बायोरिएक्टर
    1. ऑटोक्लेविंग (121 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट, 15 पीएसआई) द्वारा बायोरिएक्टर को निष्फल करें।
    2. एसएफ-एमएससी की संख्या की गणना करें और जीएमपी-ग्रेड एमएससी संस्कृति माध्यम (250 एमएल) के साथ संक्रमित बायोरिएक्टर को 2.5 x 107 एसएफ-एमएससी और माइक्रोकैरियर आवंटित करें।
    3. बायोरिएक्टर को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ एक इनक्यूबेटर में रखें। बायोरिएक्टर को 15 आरपीएम की गति से घुमाएं। संस्कृति माध्यम को हर 6 दिन में बदलें।
    4. 14 दिनों के लिए संस्कृति के बाद आगे के विश्लेषण के लिए सेल कल्चर सुपरनैटेंट और माइक्रोकैरियर एकत्र करें।

3. एक्सोसोम पहचान और सुरक्षा का पता लगाना

  1. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन
    1. सेल कल्चर सुपरनैटेंट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट एकत्र करें; सेलुलर मलबे को छोड़ दें।
    2. सुपरनैटेंट को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट एकत्र करें; बड़े पुटिकाओं (एपोप्टोटिक निकायों और कुछ बड़े माइक्रोवेसिकल्स) को छोड़ दें।
    3. बड़े पुटिकाओं को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 10,000 x g पर फिर से सतह पर तैरने वाले को सेंट्रीफ्यूज करें; छर्रों को इकट्ठा करें और 1x PBS के 40 एमएल में पुन: निलंबित करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 120,000 x g पर पुन: निलंबित छर्रों को सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, और 1x PBS के 500 μL में एक्सोसोम वाले छर्रों को फिर से निलंबित करें।
  2. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA)
    नोट: प्रत्येक रन के लिए, नमूने के 500 μL को कक्ष में 30 μL / min की प्रवाह दर पर इंजेक्ट किया गया था। विश्लेषण 24.4 डिग्री सेल्सियस-24.5 डिग्री सेल्सियस पर करें।
    1. बाँझ 1x PBS के साथ ताजा पृथक एक्सोसोम नमूनों को 1 mL तक पतला करें जिसमें 107-10 9 / mL कण होते हैं और उन्हें नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण प्रणाली में इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. मैन्युअल रूप से निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कैप्चर और विश्लेषण प्रणाली सेट करें। लेजर प्रकाश प्रकीर्णन द्वारा कणों की कल्पना करें और डिजिटल वीडियो पर उनकी ब्राउनियन गति को कैप्चर करें।
    3. प्रति रन कम से कम 200 व्यक्तिगत कणों को ट्रैक करने के आधार पर सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके रिकॉर्ड किए गए वीडियोटेप का विश्लेषण करें।
  3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी
    1. एक्सोसोम को 5 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (ठंडे 1x DPBS में) में ठीक करें।
    2. कॉपर ग्रिड पर एक्सोसोम का माउंट 5 μL। इस प्रयोग में, एक्सोसोम की एकाग्रता एक प्रोटीन परख किट द्वारा निर्धारित 1 मिलीग्राम / एमएल है ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. बर्फ पर 10 मिनट के लिए एक्सोसोम को 3% फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड में एम्बेड करें। अतिरिक्त एसिड को हटा दें और आरटी पर नमूने सुखाएं।
    4. 100 केवी के त्वरण वोल्टेज पर टीईएम द्वारा एक्सोसोम नमूने को चित्रित करें।
  4. पश्चिमी सोख्ता
    1. एक्सोसोम में लाइसिस बफर (1% ट्राइटन एक्स -100, 0.1% एसडीएस, 0.1 एम ट्रिस एचसीएल, पीएच 7) और प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल ( सामग्री की तालिका देखें) के 300 μL जोड़ें।
    2. लाइसिस बफर में एक्सोसोम को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं और इसे 20 मिनट के लिए बर्फ पर खड़े होने दें।
    3. मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 9,391 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट एकत्र करें। प्रोटीन परख किट का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. 4x प्रोटीन लोडिंग बफर के 100 μL जोड़ें और 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    5. 10 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर प्रोटीन के 15 μL लोड करें और जेल वैद्युतकणसंचलन (120 V, 70 मिनट) द्वारा चलाया जाता है और 100 V पर इलेक्ट्रोब्लोटिंग, 4 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट।
    6. फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा गैर-एक्सोसोम-विशिष्ट मार्करों (कैलनेक्सिन) और एक्सोसोमल बायोमाकर्स (सीडी 9, सीडी 63 और सीडी 81) का पता लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  5. सुरक्षा परीक्षण
    1. बैक्टीरिया, कवक और माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस का पता लगाने के लिए चरण 3.5.2-3.5.5 का पालन करें।
    2. रक्त एगर कल्चर प्लेट पर एक्सोसोम घोल (1 मिलीग्राम / एमएल) का 100 μL बीज लें और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    3. एक सबौरौद आगर मध्यम प्लेट पर एक्सोसोम घोल (1 मिलीग्राम / एमएल) का 100 μL बीज लें और 48 घंटे के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. लोवेनस्टीन-जेन्सेन कल्चर मीडियम प्लेट ( सामग्री की तालिका देखें) पर एक्सोसोम घोल (1 मिलीग्राम / एमएल) का बीज 100 μL और 3 सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. मैक्रोस्कोपिक अवलोकन द्वारा बैक्टीरिया, कवक और माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस कॉलोनियों की उपस्थिति का पता लगाएं।
      नोट: एक्सोसोम की सुरक्षा का मूल्यांकन करने के लिए मानदंड संस्कृति प्लेट पर सूक्ष्मजीवों की अनुपस्थिति है।
    6. माइकोप्लाज्मा का पता लगाने के लिए, चरण 3.5.7-3.5.9 का पालन करें।
    7. किट में शामिल बफर घोल के 50 μL में एक्सोसोम को पुन: निलंबित करें और 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    8. पीसीआर माइकोप्लाज्मा डिटेक्शन किट का उपयोग करके एक्सोसोम समाधान में माइकोप्लाज्मा को बढ़ाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    9. 1.5% अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (30 मिनट, 120 वी) पर पीसीआर उत्पादों का पता लगाएं।

4. इन विट्रो एक्सोसोम फ़ंक्शन डिटेक्शन

  1. एक्सोसोम लेबलिंग
    1. एक्सोसोम (1000x) के साथ एक्सोसोम (1 mg/mL) के 100 μL लेबल करें ( सामग्री की तालिका देखें) और 30 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
    2. 70 मिनट के लिए 100,000 x g पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एक्सोसोम को पुनर्प्राप्त करें। 1x PBS के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. Cy3-mir-140 का लोडिंग एक्सोसोम में नकल करता है
    1. इलेक्ट्रोपोरेशन बफर (1.15 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट (पीएच 7.2), 25 एमएम पोटेशियम क्लोराइड और 21% (वी /वी) की अंतिम मात्रा में एक्सोसोमल प्रोटीन के 1 μg/μL और Cy3-mir-140 के 5 μmol/mL को मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. जीन अभिकर्मक प्रणाली का उपयोग करके मिश्रण को ठंडे 0.4 सेमी इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें और 300 वी / 100 μF धारिता पर इलेक्ट्रोपोरेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. इलेक्ट्रोपोरेशन के तुरंत बाद, एक्सोसोम झिल्ली को पूरी तरह से बहाल करने के लिए 30 मिनट के लिए आरटी पर मिश्रण बनाए रखें।
    4. एक्सोसोम के बाहर मिआरएनए मिमिक को खत्म करने के लिए मिश्रण को 20 मिनट के लिए आरएनएस ए ( सामग्री की तालिका देखें) की एक इकाई के साथ इलाज करें।
    5. एक्सोसोम मिश्रण को 90 मिनट के लिए 120,000 x g पर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनैटेंट को छोड़ दें और एक्सोसोम को 1x PBS के 500 μL में पुन: निलंबित करें।
  3. एक्सोसोम अपटेक परख
    1. चोंड्रोसाइट्स (1 x 107) को 35 मिमी कॉन्फोकल व्यंजनों में 1 एमएल डीएमईएम / एफ 12 के साथ बीज दें जिसमें 10% एफबीएस होता है।
    2. 24 घंटे के बाद, चोंड्रोसाइट्स को 1 घंटे के लिए डीआईआई-लेबल एक्सोसोम (100 एनजी / एमएल) या साइ3-एमआईआर -140 लोडेड एक्सोसोम (100 एनजी / एमएल) के साथ इलाज करें।
    3. 1x PBS से तीन बार धोएं, और फिर RT पर 10 मिनट के लिए DAPI (10 ng/ mL) के साथ लेबल करें।
    4. उचित फिल्टर का उपयोग करके कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) में फ्लोरेसेंस सिग्नल रिकॉर्ड करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
    नोट: प्रत्येक आंकड़े में प्रतिनिधि डेटा एसडी के औसत के रूप में व्यक्त ± गया था। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग सांख्यिकी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके दो समूहों की तुलना के लिए किया गया था। कई समूहों के बीच तुलना के मामले में टुकी के मल्टीपल के बाद एक-तरफ़ा एनोवा का प्रदर्शन किया गया था। P मान <0.05 (*), <0.01 (*),या <0.001 (***).

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Representative Results

इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर सेलुलर थेरेपी14,15 द्वारा अनुशंसित मानव एमएससी को परिभाषित करने के लिए न्यूनतम मानदंडों के अनुसार, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग एसएफ-एमएससी के सतह मार्करों की पहचान करने के लिए किया गया था। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण से पता चला है कि इस अध्ययन में संवर्धित एसएफ-एमएससी एमएससी के पहचान मानदंडों को पूरा करते हैं। वे सीडी 34, सीडी 45, और एचएलए-डीआर (3% से नीचे) के लिए नकारात्मक थे और सीडी 73, सीडी 90 और सीडी 105 (95% से ऊपर) के लिए सकारात्मक थे (चित्रा 2)।

उल्टे माइक्रोस्कोपी के तहत, यह देखा गया कि एसएफ-एमएससी माइक्रोकैरियर (चित्रा 3 ए) पर प्रसार करते हैं। कोशिकाओं को पचाने और 2 डी संस्कृति प्लेट और 3 डी कल्चर माइक्रोकैरियर से धोने के बाद, सेल नंबर की गणना की गई थी। 2 डी संस्कृति की तुलना में, 3 डी संस्कृति ने एसएफ-एमएससी को 6 दिनों के बाद से अधिक तेज़ी से प्रसार करने के लिए प्रेरित किया (चित्रा 3 बी)। तीन स्वतंत्र प्रयोगों के परिणाम प्रस्तुत किए गए थे।

2 डी और 3 डी कल्चर के एसएफ-एमएससी से एक्सोसोम (एक्सोस) की पहचान करने के लिए, एक्सोसोम से जुड़े प्रोटीन (सीडी 63, सीडी 9, और सीडी 81) और नकारात्मक प्रोटीन (कैलनेक्सिन) का पता पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके लगाया गया था। परिणामों से पता चला कि 2 डी-एक्सोस और 3 डी-एक्सोस सीडी 63, सीडी 9 और सीडी 81 को व्यक्त करते हैं, जबकि वे कैलनेक्सिन (चित्रा 4 ए) के लिए नकारात्मक हैं। इसके अलावा, एक्सोसोम व्यास और आकृति विज्ञान को एनटीए और टीईएम का उपयोग करके परख लिया गया था। नैनोसाइट विश्लेषण से पता चला है कि 2 डी-एक्सोस (चित्रा 4 बी) और 3 डी-एक्सोस (चित्रा 4 डी) का व्यास लगभग 120 एनएम है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोप विश्लेषण ने 2 डी-एक्सोस और 3 डी-एक्सोस की आकृति विज्ञान का खुलासा किया, जो मोटे तौर पर गोलाकार पुटिकाओं (चित्रा 4 सी, ई) को दर्शाता है।

3 डी संस्कृति के बाद, 30-160 एनएम आकार के कणों की कण एकाग्रता 4.0 x 106 प्रति एमएल है जिसका एनटीए का उपयोग करके विश्लेषण किया गया है। हालांकि, 2 डी संस्कृति के बाद, 30-160 एनएम कणों की कण एकाग्रता 2.5 x 106 प्रति एमएल (चित्रा 5 ए) है। माध्यम में एक्सोसोम प्रोटीन उपज की गणना करते समय, 3 डी संस्कृति ने 2 डी संस्कृति (चित्रा 5 बी) की तुलना में अधिक एक्सोसोम प्रोटीन का उत्पादन किया। इस प्रकार, 2 डी संस्कृति की तुलना में, 3 डी संस्कृति ने एक्सोसोम उपज में काफी वृद्धि की।

एक्सोसोम को पहले दिल के साथ लेबल किया गया था, और फिर 1 घंटे, 2 घंटे और 3 घंटे के लिए चोंड्रोसाइट्स के साथ 10 μg / mL की एकाग्रता पर इनक्यूबेट किया गया था ताकि यह जांचा जा सके कि क्या एक्सोसोम विट्रो में प्राथमिक चोंड्रोसाइट्स में प्रवेश कर सकते हैं। दिल-लेबल एक्सोसोम ने प्राथमिक चोंड्रोसाइट्स में प्रवेश किया, जिसमें शिखर 3 घंटे (चित्रा 6) पर देखा गया।

नैनोकैरियर के रूप में एक्सोसोम के कार्य का पता लगाने के लिए, एक्सोसोम को इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से Cy3-लेबल MIR-140 के साथ लोड किया गया था, और फिर 3 घंटे के लिए 10 μg / mL की एकाग्रता पर चोंड्रोसाइट्स के साथ इलाज किया गया था। परिणामों से पता चला कि एक्सोसोम एमआईआर -140 को चोंड्रोसाइट्स (चित्रा 7) तक पहुंचा सकते हैं। सभी परिणाम विनिर्देशों को पूरा करते हैं; सभी नमूने माइकोप्लाज्मा के लिए बाँझ और नकारात्मक थे।

Figure 1
चित्र 1: विट्रो में hSF-MSCs से पृथक एक्सोसोम का योजनाबद्ध आरेख. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एसएफ-एमएससी की पहचान। फ्लो साइटोमेट्री एचएसएफ-एमएससी के सकारात्मक या नकारात्मक इम्यूनोफेनोटाइप को दर्शाता है। (ए) आईजीजी 1 आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग। (बी) सीडी 73 सकारात्मक है, और सीडी 34 नकारात्मक है। (C) CD90 सकारात्मक है, और CD45 नकारात्मक है। (डी) सीडी 105 सकारात्मक है, और एचएलए-डीआर नकारात्मक है, जिसे एमएससी मार्कर के रूप में जाना जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: SF-MSC विकास वक्र. (A) उलटा माइक्रोस्कोपी (स्केल बार = 100 μm) के तहत माइक्रोकैरियर पर SF-MSCs (लाल तीर) दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां। (बी) 2 डी और 3 डी संस्कृति के तहत एसएफ-एमएससी की वृद्धि वक्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एक्सोसोम की पहचान। (ए) 2 डी-एक्सोस और 3 डी-एक्सोस के पश्चिमी सोख्ता परिणाम। (बी) 2 डी-एक्सोस और 3 डी-एक्सोस के व्यास का नैनोसाइट विश्लेषण। (सी) 2 डी-एक्सोस और 3 डी-एक्सोस की आकृति विज्ञान का टीईएम पता लगाना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: 3डी बायोरिएक्टर कल्चर द्वारा एक्सोसोम उत्पादन की बढ़ी हुई उपज। (ए) एनटीए द्वारा विश्लेषण किए गए एक्सोसोम आकार के प्रतिनिधि परिणाम। (बी) प्रोटीन उपज = एक्सोसोमल प्रोटीन (μg)/वातानुकूलित माध्यम (mL)। प्लॉट प्रत्येक विधि के लिए उपज और सभी मापों के एसडी ± औसत दिखाते हैं (** पी < 0.01)। सांख्यिकीय तुलना एक तरफ़ा एनोवा द्वारा पोस्ट-हॉक बोनफेरोनी के सुधार और छात्र के टी-टेस्ट द्वारा की गई थी। ** पी < 0.01 को एक महत्वपूर्ण अंतर माना जाता था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6 प्रतिनिधि छवियां प्राथमिक चोंड्रोसाइट्स द्वारा दिल-लेबल एक्सोसोम के आंतरिककरण को दिखाती हैं। चोंड्रोसाइट्स को 1 घंटे, 2 घंटे और 3 घंटे के लिए दिल-लेबल एक्सोसोम के साथ इनक्यूबेट किया गया था। एक्सोसोम को दिल (लाल) के साथ लेबल किया गया था, और नाभिक को होचस्ट (नीले) के साथ लेबल किया गया था। नमूने 60x आवर्धन पर पाए गए थे। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: एमएससी एक्सोसोम द्वारा एमआईआर -140 का इन विट्रो वितरण। Cy3-लेबल MIR-140 को लेने के बाद, जिसे SF-MSCs-व्युत्पन्न एक्सोसोम में समझाया गया था, चोंड्रोसाइट्स को चित्रित किया गया था। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का व्यापक रूप से पुनर्योजी चिकित्सा में उनके आत्म-नवीकरण के कारण उपयोग किया जाता है, विशेष कार्यों के साथ ऊतक कोशिकाओं में विभेदित किया जाता है, और पैराक्रिन प्रभाव16,17। विशेष रूप से, एक्सोसोम द्वारा लगाए गए पैराक्राइन प्रभावों ने बहुत ध्यान आकर्षितकिया है। एक्सोसोम एमएससी की जैव-जानकारी लेते हैं और अपना जैविक कार्य करते हैं और एमएससी कमियों को दूर करते हैं, जैसे कि परेशानी भंडारण और शिपमेंट। इस प्रकार, एमएससी से प्राप्त एक्सोसोम का उपयोग चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए किया गया है, जिसने ओए थेरेपी में सबसे अधिक ध्यान आकर्षित किया है।

वर्तमान में, एमएससी का प्रचार करने के दो तरीके हैं, 2 डी संस्कृति और त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति19। 2 डी संस्कृति कम लागत के साथ इन विट्रो अध्ययनों के लिए एमएससी की संस्कृति का एक पारंपरिक तरीका है। हालांकि, यह समय लेने वाला है और पैमाने की क्षमता में सीमित है। इसके अलावा, 2 डी माइक्रोएन्वायरमेंट में एमएससी प्रसार जल्दी से स्टेमनेस20,21 को कम करता है, जो एमएससी की सबसे महत्वपूर्ण विशेषताओं में से एक है। इस प्रकार, 2 डी संस्कृति एमएससी चिकित्सा के लिए आवश्यकताओं को पूरा नहीं कर सकती है। इस अध्ययन में, ओए थेरेपी में एसएफ-एमएससी के उद्देश्य से, हम 3 डी बायोरिएक्टर की संस्कृति का उपयोग करके एसएफ-एमएससी विशेषताओं को बनाए रखने का प्रयास करते हैं, जो जैविक माइक्रोएन्वायरमेंट की अधिक सटीक नकल कर सकता है। हाल ही में, अन्य शोधकर्ताओं ने एमएससी को कल्चर करने के लिए मचानों या माइक्रोकैरियर-आधारित 3 डी का उपयोग किया है। हमने पाया कि 3 डी कोलेजन स्काफोल्ड्स ने 2 डी कल्चर23 की तुलना में मानव अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी द्वारा उत्पादित अधिक केंद्रित एक्सोसोम की अनुमति दी।

चूंकि एक्सोसोम एमएससी की कुछ कमियों से बचते हुए एमएससी फ़ंक्शन का एक बड़ा हिस्सा कर सकते हैं, इसलिए हम ओए थेरेपी के लिए एक्सोसोम का उत्पादन करने का लक्ष्य रखते हैं। इस अध्ययन ने 3 डी संस्कृति के एमएससी प्रसार की बड़ी मात्रा और उच्च गुणवत्ता के आधार पर इस प्रणाली का उपयोग करके एक्सोसोम उत्पादन और वितरण समारोह का पता लगाया। रोटरी सेल कल्चर सिस्टम (आरसीसीएस) का उपयोग 3 डी संस्कृति के लिए बड़े पैमाने पर एमएससी प्रसार से एक्सोसोम का उत्पादन करने के लिए किया गया था। पारंपरिक 2 डी फ्लास्क संस्कृति की तुलना में, यह 3 डी संस्कृति प्रणाली बार-बार मध्यम परिवर्तन और सेल मार्ग से संदूषण से बच सकती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस अध्ययन से पता चला है कि एक 3 डी बायोरिएक्टर नैदानिक अध्ययन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एक्सोसोम उत्पादन को बढ़ा सकता है। ध्यान दें, 3 डी कल्चर सुपरनैटेंट से अलग एक्सोसोम कोशिकाओं में एमआईआरएनए पहुंचा सकते हैं, यह सुझाव देते हुए कि 3 डी संस्कृति एक्सोसोम फ़ंक्शन में हस्तक्षेप नहीं करती है। माइक्रोबियल और एंडोटॉक्सिन का पता लगाने के परिणाम आगे समर्थन करते हैं कि इस अध्ययन ने एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है जो एक्सोसोम का उत्पादन कर सकता है, जो जैविक रूप से सुरक्षित और ओए थेरेपी के लिए आशाजनक हैं। वर्तमान में, इस अध्ययन में उत्पादित एक्सोसोम मात्रा वाणिज्यिक आवश्यकताओं को पूरा नहीं कर सकती है। इसलिए, एक्सोसोम उत्पादन की भारी मात्रा के लिए रणनीतियों को विकसित करने की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

चीन का राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 81972116, नंबर 81972085, नंबर 81772394); गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन का प्रमुख कार्यक्रम (संख्या 2018 बी 0303110003); गुआंग्डोंग अंतर्राष्ट्रीय सहयोग परियोजना (संख्या 2021 ए0505030011); शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजनाएं (सं। GJHZ20200731095606019, सं. JCYJ20170817172023838, सं. JCYJ20170306092215436, सं. JCYJ20170413161649437); चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (संख्या 2020 एम 682907); गुआंग्डोंग बेसिक और एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (संख्या 2021 ए 1515010985); शेन्ज़ेन में चिकित्सा की संमिंग परियोजना (एसजेडएसएम 201612079); गुआंग्डोंग प्रांत में उच्च स्तरीय अस्पतालों के निर्माण के लिए विशेष निधियां।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA assay kit ThermoFisher 23227 Protein concentration assay
Blood agar plate Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. P0903 Bacteria culture
CD105 antibody Elabscience E-AB-F1243C Flow cytometry
CD34 antibody Elabscience E-AB-F1143C Flow cytometry
CD45 antibody BD Bioscience 555483 Flow cytometry
CD63 antibody Abclonal  A5271 Western blotting
CD73 antibody Elabscience E-AB-F1242C Flow cytometry
CD81 antibody ABclonal  A5270 Western blotting
CD9 antibody Abclonal  A1703 Western blotting
CD90 antibody Elabscience E-AB-F1167C Flow cytometry
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810R
CO2 incubator Thermo Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy ZEISS LSM 800
Cytodex GE Healthcare Microcarrier
Dil ThermoFisher D1556 Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit BI 20-700-20 Mycoplasma detection
Flowcytometry Beckman MSC identification
Gene Pulser II System Bio-Rad Laboratories 1652660 Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2 GraphPad Software, Inc. Version 8.0.2
HLA-DR antibody Elabscience E-AB-F1111C Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. T0573 Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro StemRD MGro-500 MSC culture
Nanosight NS300 Malvern Nanosight NS300 Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software Malvern Data analysis
Odyssey FC Gene Company Limited Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer Sigma D3911 Gene transfection
Protease inhibitors cocktail Sigma P8340 Proteinase inhibitor
RNase A Qiagen 158924 Removal of RNA
Sabouraud agar plate Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. P0919 Fungi culture
TEM JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-4HD 3D culture
Ultracentrifuge Beckman Optima XPN-100 Exosome centrifuge

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References

  1. Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
  2. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  3. Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
  4. Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
  5. Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
  6. Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
  7. McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
  8. Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
  9. Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
  10. Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
  11. Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
  12. Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
  13. Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  15. Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
  16. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  17. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  18. Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
  19. Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
  22. Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
  23. Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).

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3 डी बायोरिएक्टर कल्चर द्वारा श्लेष द्रव मेसेनकाइमल स्टेम सेल-व्युत्पन्न एक्सोसोम की बड़े पैमाने पर तैयारी
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Duan, L., Li, X., Xu, X., Xu, L., Wang, D., Ouyang, K., Liang, Y. Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture. J. Vis. Exp. (185), e62221, doi:10.3791/62221 (2022).

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