Summary
Aquí, presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D.
Abstract
Los exosomas secretados por las células madre mesenquimales (MSC) se han sugerido como candidatos prometedores para las lesiones del cartílago y el tratamiento de la osteoartritis. Los exosomas para aplicación clínica requieren una producción a gran escala. Con este objetivo, las MSC de líquido sinovial humano (hSF-MSC) se cultivaron en perlas de microportadores y luego se cultivaron en un sistema de cultivo dinámico de tres dimensiones (3D). Mediante la utilización de la cultura dinámica 3D, este protocolo obtuvo con éxito exosomas a gran escala a partir de sobrenadantes de cultivo SF-MSC. Los exosomas se cosecharon por ultracentrifugación y se verificaron mediante un microscopio electrónico de transmisión, un ensayo de transmisión de nanopartículas y Western blotting. Además, se detectó la seguridad microbiológica de los exosomas. Los resultados de la detección de exosomas sugieren que este enfoque puede producir un gran número de exosomas de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP). Estos exosomas podrían utilizarse en la investigación de la biología de exosomas y el tratamiento clínico de la osteoartritis.
Introduction
La osteoartritis (OA), resultante del cartílago articular y la descomposición ósea subyacente, sigue siendo un desafío grave que conduce a la discapacidad 1,2. Sin suministro de sangre y nervios, la capacidad de autocuración del cartílago es mínima una vez lesionado 3,4. En las últimas décadas, las terapias basadas en la implantación autóloga de condrocitos (ACI) han progresado en el tratamiento de la OA5. Para el aislamiento y la expansión de los condrocitos, es necesario extraer cartílago pequeño del área que no soporta peso de la articulación OA, causando lesiones en el cartílago. Además, el procedimiento requerirá una segunda operación para implantar los condrocitos expandidos6. Por lo tanto, las terapias de un solo paso para el tratamiento de la OA sin lesiones del cartílago están bajo una exploración exhaustiva.
Las células madre mesenquimales (CMM) han sido sugeridas como alternativas prometedoras para el tratamiento de la OA 7,8. Originadas en múltiples tejidos, las MSC pueden diferenciarse en condrocitos con estimulación específica. Es importante destacar que las MSC pueden modular las respuestas inmunes a través de la antiinflamación9. Por lo tanto, las MSC tienen ventajas significativas en el tratamiento de la OA al reparar defectos del cartílago y modular la respuesta inmune, especialmente en el entorno inflamatorio. Para el tratamiento de la OA, las MSC del líquido sinovial (SF-MSC) han atraído recientemente mucha atención debido a su capacidad de diferenciación de condrocitos más fuerte que otras fuentes de MSC10,11. En particular, en la clínica ortopédica, la extracción de SF inflamatorio de la cavidad articular es una terapia de rutina para aliviar el síntoma de dolor de los pacientes con OA. El SF inflamatorio extraído generalmente se elimina como desechos médicos. Tanto los pacientes como los médicos están listos para considerar las CMM autólogas aisladas del SF inflamatorio como tratamiento de OA con muy pocos conflictos éticos. Sin embargo, la terapia SF-MSC se ve comprometida debido a los riesgos tumorigénicos, el almacenamiento prolongado y las barreras de envío distantes.
Los exosomas, secretados por muchos tipos de células, incluidas las MSC, llevan la mayor parte de la bioinformación de las células madre. Ha sido investigado en profundidad como terapia libre de células12,13. De acuerdo con los recursos actualizados disponibles en el sitio web del gobierno de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov), se inician y realizan estudios clínicos de exosomas más extensos en los campos de investigación del cáncer, la hipertensión y las enfermedades neurodegenerativas. El tratamiento con exosomas SF-MSC podría ser un ensayo emocionante y desafiante para hacer frente a la OA. La producción de exosomas a gran escala y de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP) es esencial para la traducción clínica. El aislamiento de exosomas a pequeña escala se ha realizado ampliamente en base al cultivo celular bidimensional (2D). Sin embargo, las estrategias de producción de exosomas a gran escala necesitan optimización. En este estudio se desarrolló un método de fabricación de exosomas a gran escala, basado en el cultivo masivo de SF-MSC en condiciones libres de xeno. Después de la ultracentrifugación de sobrenadantes de cultivo celular, se validó la seguridad y la función del exosoma.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana del Segundo Hospital Popular de Shenzhen. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático de exosomas aislados del protocolo in vitro hSF-MSC.
1. Cultura e identificación de SF-MSCs humanas
- Recolectar 20 ml de SF usando una jeringa y una aguja de pacientes clínicos con OA.
- Desinfecte la articulación de la rodilla del paciente con OA. Punción del tendón femoral cuádriceps fuera de la rótula en la cavidad articular con una aguja 7#.
- Extraer 10 mL del líquido articular. Cubra el sitio de punción con la varilla de transfusión y presione durante 5 min.
- Desechar el sobrenadante SF después de la centrifugación a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C.
- Resuspender el pellet celular con 10 ml de solución salina tampón fosfato 1x (PBS), centrifugar a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C y desechar el PBS.
- Resuspender el pellet con 10 ml de medio de cultivo de MSC humano a una densidad celular de 5 x 104 células/ml (ver Tabla de materiales) y luego colocar la suspensión en una placa de 100 mm.
- Incubar el plato a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2.
- Después de 48 h, retire las células no adherentes cambiando el medio y lave con 1x PBS. Reemplace el medio cada 3 días durante 2 semanas.
- Recoger los sobrenadantes de cultivo celular.
- Identificar SF-MSCs mediante citometría de flujo.
- Digerir la tercera generación (P3) de SF-MSC, centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y recoja el pellet celular.
NOTA: Un pasaje se reconoce como el subcultivo de las células a otra placa de cultivo. Las células primarias aisladas de SF y sembradas en platos se etiquetan como paso cero (P0). En aproximadamente un 75% de confluencia, las células se digieren y se separan de los platos, se siembran en otros platos y se etiquetan como P1. - Añadir 400 μL de tampón de bloqueo (1% BSA en 1x PBS) a la célula granulada (5 x 104) y dejar reposar durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
- Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 μL de 1x PBS.
- Añadir 1 μL de CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, anticuerpos fluorescentes monoclonales HLA-DR (relación de dilución 1:100) (ver Tabla de materiales) por tubo e incubar a RT durante 30 min.
- Lave dos veces con 1x PBS y deseche el sobrenadante. Recoger el pellet celular y resuspender en 100 μL de 1x PBS.
- Detecte en un citómetro de flujo hasta 10.000 células utilizando filtros de 525/50 y 585/40 para detectar los fluoróforos.
- Digerir la tercera generación (P3) de SF-MSC, centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y recoja el pellet celular.
2.3D cultivo celular de biorreactor
- Preparación de microportadores
- Hinche los 0,75 g secos de microportadores (ver Tabla de materiales) e hidrátese en 1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (50 ml / g de microportadores) durante al menos 3 h en RT.
- Decantar el sobrenadante y lavar los microportadores durante 5 min en DPBS frescos (50 mL/g de microportadores). Deseche el PBS y reemplácelo con 1x DPBS nuevo (50 ml / g de microportadores).
- Esterilizar los microportadores en autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi). Permita que los microportadores esterilizados se asienten, decanten el sobrenadante.
- Enjuague brevemente los microportadores en el medio de cultivo (50 ml / g de microportadores) en RT. Deje que los microportadores se asienten, deseche el sobrenadante.
- Biorreactor de perfusión
- Esterilizar el biorreactor en autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi).
- Contar el número de SF-MSCs y asignar 2.5 x 107 SF-MSCs y microportadores al biorreactor perfundido con medio de cultivo MSC de grado GMP (250 mL).
- Poner el biorreactor en una incubadora con 5% deCO2 a 37 °C. Gire el biorreactor a una velocidad de 15 rpm. Cambiar el medio de cultivo cada 6 días.
- Recolectar los sobrenadantes y microportadores del cultivo celular para su posterior análisis después del cultivo durante 14 días.
3. Identificación de exosomas y detección de seguridad
- Ultracentrifugación
- Centrifugar el sobrenadante de cultivo celular a 300 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante; Deseche los desechos celulares.
- Centrifugar los sobrenadantes a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante; Deseche las vesículas más grandes (cuerpos apoptóticos y algunas microvesículas más grandes).
- Centrifugar de nuevo el sobrenadante a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C para eliminar vesículas más grandes; recoger los pellets y resuspender en 40 mL de 1x PBS.
- Centrifugar los pellets resuspendidos a 120.000 x g durante 70 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender los pellets que contienen exosomas en 500 μL de 1x PBS.
- Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
NOTA: Para cada corrida, se inyectaron 500 μL de la muestra en la cámara a un caudal de 30 μL/min. Realice el análisis a 24,4 °C-24,5 °C.- Diluir las muestras de exosomas recién aisladas con 1x PBS estéril a 1 ml que contenga 107-10 9 / ml de partículas e inyectarlas en el sistema de análisis de seguimiento de nanopartículas (ver Tabla de materiales).
- Configure manualmente el sistema de captura y análisis de acuerdo con el protocolo del fabricante. Visualice las partículas mediante la dispersión de la luz láser y capture su movimiento browniano en video digital.
- Analice las cintas de video grabadas utilizando software (consulte la Tabla de materiales) basándose en el seguimiento de al menos 200 partículas individuales por ejecución.
- Microscopía electrónica de transmisión
- Fijar los exosomas en paraformaldehído al 4% (en frío 1x DPBS) durante 5 min.
- Monte 5 μL de los exosomas en rejillas de cobre. En este experimento, la concentración de exosomas es de 1 mg/ml cuantificada por un kit de ensayo de proteínas (ver Tabla de materiales).
- Incrustar los exosomas en ácido fosfotúngstico al 3% durante 10 minutos en hielo. Retire el exceso de ácido y seque las muestras en RT.
- Imagen de las muestras de exosomas por un TEM a una tensión de aceleración de 100 kV.
- Western blot
- Agregue 300 μL de tampón de lisis (1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.1 M Tris HCl, pH 7) y cóctel de inhibidores de proteasa (ver Tabla de materiales) a los exosomas.
- Mezcle los exosomas en el tampón de lisis pipeteando hacia arriba y hacia abajo y déjelo reposar sobre hielo durante 20 minutos.
- Centrifugar la mezcla a 9.391 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Mida la concentración de proteína usando un kit de ensayo de proteínas (consulte la Tabla de materiales).
- Añadir 100 μL de tampón de carga de proteínas 4x y calentar a 100 °C durante 10 min.
- Cargar 15 μL de proteínas a una concentración de 10 mg/ml y funcionar mediante electroforesis en gel (120 V, 70 min) y electroblotting a 100 V, 60 min a 4 °C.
- Detectar los marcadores no exosomas específicos (calnexina) y los biomarcadores exosomales (CD9, CD63 y CD81) mediante Western Blot fluorescente (consulte la Tabla de materiales).
- Prueba de seguridad
- Para la detección de bacterias, hongos y Mycobacterium tuberculosis , siga los pasos 3.5.2-3.5.5.
- Sembrar 100 μL de la solución del exosoma (1 mg/ml) en una placa de cultivo de agar sangre (ver Tabla de materiales) e incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 24 h.
- Sembrar 100 μL de la solución del exosoma (1 mg/ml) en una placa mediana de agar sabouraud (ver tabla de materiales) e incubar a 35 °C durante 48 h.
- Sembrar 100 μL de la solución del exosoma (1 mg/ml) en una placa de medio de cultivo de Lowenstein-Jensen (ver Tabla de materiales) e incubar a 37 °C durante 3 semanas.
- Detectar la aparición de bacterias, hongos y colonias de Mycobacterium tuberculosis mediante observación macroscópica.
NOTA: Los criterios para evaluar la seguridad de los exosomas son la ausencia de microorganismos en la placa de cultivo. - Para la detección de micoplasma, siga los pasos 3.5.7-3.5.9.
- Resuspender los exosomas en 50 μL de solución tampón incluida en el kit y calentar a 95 °C durante 3 min.
- Amplificar el micoplasma en solución de exosomas utilizando un kit de detección de micoplasma por PCR (consulte la Tabla de materiales).
- Detectar los productos de PCR en electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (30 min, 120 V).
4. Detección in vitro de la función del exosoma
- Etiquetado de exosomas
- Marcar 100 μL de exosomas (1 mg/ml) con 1 mM Dil (1000x) (ver Tabla de materiales) e incubar a RT durante 30 min.
- Recuperar los exosomas por ultracentrifugación a 100.000 x g durante 70 min. Resuspender el pellet en 500 μL de 1x PBS.
- Carga de imitadores Cy3-miR-140 en exosomas
- Mezclar 1 μg/μL de proteína exosomal y 5 μmol/mL de Cy3-miR-140 en un volumen final de 400 μL de tampón de electroporación (1,15 mM fosfato de potasio (pH 7,2), 25 mM de cloruro de potasio y 21% (v/v) (ver Tabla de materiales).
- Transfiera la mezcla a cubetas de electroporación frías de 0,4 cm y electroporate a capacitancia de 300 V/100 μF utilizando un sistema de transfección génica (ver Tabla de materiales).
- Inmediatamente después de la electroporación, mantenga la mezcla en RT durante 30 minutos para asegurarse de que la membrana del exosoma esté completamente restaurada.
- Tratar las mezclas con una unidad de RNasa A (ver Tabla de materiales) durante 20 minutos para eliminar los imitadores de miRNA fuera de los exosomas.
- Ultracentrifugar la mezcla de exosomas a 120.000 x g durante 90 min, desechar el sobrenadante y resuspender los exosomas en 500 μL de 1x PBS.
- Ensayo de captación de exosomas
- Sembrar los condrocitos (1 x 107) en placas confocales de 35 mm con 1 mL de DMEM/F12 que contenga 10% de FBS.
- Después de 24 h, tratar los condrocitos con exosomas marcados con DiI (100 ng/ml) o exosomas cargados con cy3-miR-140 (100 ng/ml) durante 1 h.
- Lavar con 1x PBS tres veces, y luego etiquetar con DAPI (10 ng/mL) durante 10 min en RT.
- Registre la señal de fluorescencia en microscopía de fluorescencia de barrido láser confocal (CLSM) utilizando los filtros apropiados (consulte la Tabla de materiales).
5. Análisis estadístico
- Realizar análisis estadísticos utilizando el software estadístico apropiado.
NOTA: Los datos representativos de cada figura se expresaron como la media ± DE. Se utilizó la prueba t de Student para la comparación de dos grupos utilizando software de estadística. Se realizó un ANOVA unidireccional seguido del múltiple de Tukey en el caso de las comparaciones entre múltiples grupos. Valores de p <0,05 (*), <0,01 (**) o <0,001 (***).
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Representative Results
La citometría de flujo fue utilizada para identificar los marcadores de superficie de las SF-MSCs, de acuerdo con los criterios mínimos para definir las MSCs humanas recomendados por la International Society for Cellular Therapy14,15. El análisis de citometría de flujo reveló que las SF-MSCs cultivadas en este estudio cumplieron con los criterios de identificación de las MSCs. Fueron negativos para CD34, CD45 y HLA-DR (por debajo del 3%) y positivos para CD73, CD90 y CD105 (por encima del 95%) (Figura 2).
Bajo microscopía invertida, se observó que las SF-MSCs proliferan en microportadores (Figura 3A). Después de digerir y lavar las células de la placa de cultivo 2D y los microportadores de cultivo 3D, se contó el número de células. En comparación con el cultivo 2D, el cultivo 3D indujo al SF-MSC a proliferar más rápidamente a partir de los 6 días (Figura 3B). Se presentaron los resultados de tres experimentos independientes.
Para identificar los exosomas (Exos) de SF-MSCs de cultivo 2D y 3D, se detectaron las proteínas asociadas al exosoma (CD63, CD9 y CD81) y la proteína negativa (calnexina) mediante western blotting. Los resultados revelaron que los 2D-Exos y 3D-Exos expresan CD63, CD9 y CD81, mientras que son negativos para calnexina (Figura 4A). Además, el diámetro y la morfología del exosoma se analizaron mediante NTA y TEM. El análisis de nanosight demostró que el diámetro de 2D-Exos (Figura 4B) y 3D-Exos (Figura 4D) es de aproximadamente 120 nm. El análisis del microscopio electrónico de transmisión reveló la morfología de 2D-Exos y 3D-Exos, mostrando vesículas aproximadamente esferoidales (Figura 4C, E).
Después del cultivo 3D, la concentración de partículas de tamaño 30-160 nm es de 4.0 x 106 por ml analizada usando NTA. Sin embargo, después del cultivo 2D, la concentración de partículas de 30-160 nm es de 2,5 x 106 por ml (Figura 5A). Al calcular el rendimiento de proteína del exosoma en el medio, el cultivo 3D produjo más proteína exosómica que el cultivo 2D (Figura 5B). Por lo tanto, en comparación con el cultivo 2D, el cultivo 3D mejoró significativamente el rendimiento del exosoma.
Los exosomas se marcaron primero con Dil y luego se incubaron a una concentración de 10 μg / ml con los condrocitos durante 1 h, 2 h y 3 h para examinar si los exosomas pueden ingresar a los condrocitos primarios in vitro. Los exosomas marcados con dil entraron en los condrocitos primarios, con el pico visto a las 3 h (Figura 6).
Para detectar la función de los exosomas como nanoportadores, los exosomas se cargaron con miR-140 marcado con Cy3 a través de electroporación, y luego se trataron con condrocitos a una concentración de 10 μg / ml durante 3 h. Los resultados demostraron que los exosomas podrían entregar miR-140 a los condrocitos (Figura 7). Todos los resultados cumplieron con las especificaciones; todas las muestras fueron estériles y negativas para Mycoplasma.
Figura 1: Diagrama esquemático de exosomas aislados de hSF-MSCs in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Identificación de SF-MSCs por citometría de flujo. La citometría de flujo muestra el inmunofenotipo positivo o negativo de las hSF-MSC. (A) Etiquetado con un anticuerpo de control del isotipo IgG1. (B) CD73 es positivo y CD34 es negativo. (C) CD90 es positivo y CD45 es negativo. (D) CD105 es positivo, y HLA-DR es negativo, conocido como marcadores MSC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Curva de crecimiento SF-MSC. (A) Imágenes representativas que muestran SF-MSCs (flechas rojas) en microportadores bajo microscopía invertida (barra de escala = 100 μm). (B) La curva de crecimiento de SF-MSC bajo cultivo 2D y 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Identificación de exosomas . (A) Resultados de Western blotting de 2D-Exos y 3D-Exos. (B) Análisis nanosight del diámetro de 2D-Exos y 3D-Exos. (C) Detección TEM de la morfología de 2D-Exos y 3D-Exos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El rendimiento mejorado de la producción de exosomas por cultivo de biorreactores 3D . (A) Resultados representativos del tamaño del exosoma analizados por NTA. (B) Rendimiento proteico = proteína exosomal (μg)/medio condicionado (mL). Las gráficas muestran el rendimiento para cada método y la media ± DE de todas las mediciones (** p < 0,01). Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional con corrección de Bonferroni post-hoc y por prueba t de Student. ** p < 0,01 se consideró una diferencia significativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 Imágenes representativas que muestran la internalización de exosomas marcados con Dil por condrocitos primarios. Los condrocitos se incubaron con exosomas marcados con Dil durante 1 h, 2 h y 3 h. Los exosomas fueron marcados con Dil (rojo), y los núcleos fueron etiquetados con Hoechst (azul). Las muestras se detectaron con un aumento de 60x. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Entrega in vitro de miR-140 por exosomas MSC. Después de tomar miR-140 marcado con Cy3 que se encapsuló en exosomas derivados de SF-MSC, se obtuvieron imágenes de los condrocitos. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las células madre mesenquimales han sido ampliamente utilizadas en medicina regenerativa debido a su autorrenovación, diferenciadas en células tisulares con funciones especializadas y efectos paracrinos16,17. Cabe destacar que los efectos paracrinos ejercidos por los exosomas han atraído mucha atención18. Los exosomas transportan la bioinformación de las MSC y realizan su función biológica y superan las deficiencias de MSC, como el almacenamiento y el envío problemáticos. Por lo tanto, los exosomas derivados de las MSC se han utilizado para intervenciones terapéuticas, que han atraído la mayor atención en la terapia de OA.
Actualmente, existen dos métodos para propagar MSCs, cultivo 2D y cultivo tridimensional (3D)19. El cultivo 2D es una forma convencional de cultivar MSC para estudios in vitro con bajos costos. Sin embargo, consume mucho tiempo y tiene un potencial de escala limitado. Además, la propagación de MSC en el microambiente 2D deduce rápidamente el tallo20,21, una de las características más críticas de las MSC. Por lo tanto, la cultura 2D no puede cumplir con los requisitos para la terapia MSC. En este estudio, con el objetivo de SF-MSCs en la terapia de OA, nos esforzamos por mantener las características de SF-MSC utilizando el cultivo de un biorreactor 3D, que puede imitar con mayor precisión el microambiente biológico. Recientemente, otros investigadores han utilizado andamios o 3D basados en microportadores para cultivar MSC. Encontramos que los andamios de colágeno 3D permitieron exosomas más concentrados producidos por MSC derivadas de médula ósea humana que el cultivo2D 23.
Como los exosomas pueden realizar una gran parte de la función de MSC al tiempo que evitan algunas deficiencias de las MSC, nuestro objetivo es producir exosomas para la terapia de OA. Este estudio detectó además la función de producción y entrega de exosomas utilizando este sistema basado en la gran cantidad y alta calidad de propagación MSC del cultivo 3D. El sistema de cultivo celular rotativo (RCCS) se utilizó para el cultivo 3D para producir exosomas a partir de la propagación de MSC a gran escala. En comparación con el cultivo tradicional de matraces 2D, este sistema de cultivo 3D puede evitar la contaminación por cambios repetidos de medio y paso celular. Más importante aún, este estudio mostró que un biorreactor 3D podría mejorar la producción de exosomas para cumplir con los requisitos del estudio clínico. Cabe destacar que los exosomas aislados de sobrenadantes de cultivo 3D pueden administrar miARN en las células, lo que sugiere que el cultivo 3D no interfiere con la función del exosoma. Los resultados de la detección de microbios y endotoxinas respaldan aún más que este estudio ha establecido un protocolo que podría producir exosomas, que son biológicamente seguros y prometedores para la terapia de OA. En la actualidad, la cantidad de exosomas producida en este estudio no puede satisfacer las necesidades comerciales. Por lo tanto, es necesario desarrollar estrategias para una enorme cantidad de producción de exosomas.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81972116, Nº 81972085, Nº 81772394); Programa clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (No.2018B0303110003); Proyecto de Cooperación Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Proyectos de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No.2020M682907); Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (SZSM201612079); Fondos especiales para la construcción de hospitales de alto nivel en la provincia de Guangdong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
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