Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הכנה בקנה מידה גדול של אקסוזומים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי על ידי תרבית ביוריאקטור תלת-ממדית

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/62221
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,3
1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור מספר רב של אקסוזומים ברמת GMP מתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי באמצעות ביוריאקטור תלת-ממדי.

Abstract

אקסוזומים המופרשים על ידי תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הוצעו כמועמדים מבטיחים לפגיעות סחוס ולטיפול באוסטאוארתריטיס. אקסוזומים ליישום קליני דורשים ייצור בקנה מידה גדול. למטרה זו, MSCs של נוזל סינוביאלי אנושי (hSF-MSCs) גודלו על חרוזי מיקרו-קריין, ולאחר מכן גודלו בתרבית במערכת תרבותית דינמית תלת-ממדית (3D). באמצעות שימוש בתרבית דינמית תלת-ממדית, פרוטוקול זה השיג בהצלחה אקסוזומים בקנה מידה גדול מסופרנאטנטים של תרבית SF-MSC. אקסוזומים נקטפו על ידי אולטרה-צנטריפוגציה ואומתו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים משודר, בדיקת העברת ננו-חלקיקים וכתם מערבי. כמו כן, זוהתה הבטיחות המיקרוביולוגית של אקסוזומים. תוצאות של זיהוי אקסוזומים מצביעות על כך שגישה זו יכולה לייצר מספר רב של אקסוזומים ברמת GMP (תנאי ייצור נאותים). אקסוזומים אלה יכולים לשמש במחקר בביולוגיה של אקסוזומים ובטיפול קליני באוסטאוארתריטיס.

Introduction

דלקת מפרקים ניוונית (OA), הנובעת מסחוס המפרקים ומפירוק העצם הבסיסי, נותרה אתגר חמור המוביל לנכות 1,2. ללא אספקת דם ועצבים, יכולת הריפוי העצמי של הסחוס היא מינימלית לאחר שנפצע 3,4. בעשורים האחרונים, טיפולים המבוססים על השתלת כונדרוציטים אוטולוגית (ACI) התקדמו מעט בטיפול OA5. עבור בידוד והרחבה של כונדרוציטים, יש צורך בקצירת סחוס קטן מהאזור שאינו נושא משקל של מפרק ה-OA, מה שגורם לפציעות בסחוס. כמו כן, ההליך ידרוש פעולה שנייה להשתלת הכונדרוציטים המורחבים6. לפיכך, טיפולים חד-שלביים לטיפול ב-OA ללא פגיעות סחוס נמצאים תחת חקירה מקיפה.

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הוצעו כחלופות מבטיחות לטיפול ב-OA 7,8. MSCs, שמקורם ברקמות מרובות, יכולים להתמיין לכונדרוציטים עם גירוי ספציפי. חשוב לציין כי MSCs יכולים לווסת את התגובה החיסונית באמצעות נוגדי דלקת9. לכן, ל-MSCs יש יתרונות משמעותיים בטיפול ב-OA על ידי תיקון פגמים בסחוס וויסות התגובה החיסונית, במיוחד בסביבה הדלקתית. עבור טיפול OA, MSCs מנוזל סינוביאלי (SF-MSCs) משכו לאחרונה תשומת לב רבה בשל יכולת ההתמיינות החזקה יותר שלהם בכונדרוציטים בהשוואה למקורות MSCאחרים 10,11. יש לציין כי במרפאה האורתופדית, מיצוי SF דלקתי מחלל המפרק הוא טיפול שגרתי להקלה על תסמין הכאב של חולי OA. SF דלקתי מופק בדרך כלל מושלך כפסולת רפואית. הן המטופלים והן הרופאים מוכנים לשקול MSCs אוטולוגיים שבודדו מה- SF הדלקתי כטיפול OA עם מעט מאוד קונפליקטים אתיים. עם זאת, טיפול SF-MSC נפגע עקב סיכונים סרטניים, אחסון ארוך ומחסומי משלוח מרוחקים.

אקסוזומים, המופרשים על ידי סוגי תאים רבים, כולל MSCs, נושאים את רוב המידע הביולוגי של תא האב. הוא נחקר לעומק כטיפול ללא תאים12,13. על פי המשאבים המעודכנים הזמינים באתר ממשלת הניסויים הקליניים (ClinicalTrials.gov), מחקרים קליניים מקיפים יותר של אקסוזומים יוזמים ומתבצעים בתחומי המחקר של סרטן, יתר לחץ דם ומחלות נוירו-ניווניות. טיפול באקסוזום SF-MSC יכול להיות ניסוי מרגש ומאתגר להתמודדות עם OA. תנאי ייצור נאותים (GMP) וייצור אקסוזומים בקנה מידה גדול חיוניים לתרגום קליני. בידוד אקסוזומים בקנה מידה קטן בוצע באופן נרחב על בסיס תרבית תאים דו-ממדית (2D). עם זאת, אסטרטגיות ייצור אקסוזומים בקנה מידה גדול זקוקות לאופטימיזציה. במחקר זה פותחה שיטת ייצור אקסוזומים בקנה מידה גדול, המבוססת על תרבית SF-MSC מסיבית בתנאים נטולי קסנו. לאחר אולטרה-צנטריפוגה מתרביות-על של תרביות תאים, הבטיחות והתפקוד של האקסוזומים אומתו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה האנושית של בית החולים העממי השני של שנזן. דיאגרמה סכמטית של אקסוזומים שבודדו מפרוטוקול hSF-MSCs במבחנה מוצגת באיור 1.

1. תרבות וזיהוי SF-MSCs אנושיים

  1. קציר 20 מ"ל של SF באמצעות מזרק ומחט מחולי OA קליניים.
    1. יש לחטא את מפרק הברך של חולה ה-OA. לנקב מן הגיד femoris quadriceps מחוץ לפטלה לתוך חלל המפרקי עם מחט 7#.
    2. חלץ 10 מ"ל של נוזל המפרק. מכסים את אתר הנקב במקל העירוי ולוחצים במשך 5 דקות.
  2. השליכו את ה-SF supernatant לאחר צנטריפוגה ב-1,500 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. השהה את כדור התא עם 10 מ"ל של מלח 1x חיץ פוספט (PBS), צנטריפוגה ב 1,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C, ולהשליך את PBS.
  4. יש לתלות את הכדור ב-10 מ"ל של תרבית MSC אנושית בצפיפות תאים של 5 x 104 תאים /מ"ל (ראו טבלת חומרים), ולאחר מכן לצבוע את המתלה בצלחת של 100 מ"מ.
  5. דגירה של המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספרה המכילה 5% CO2.
  6. לאחר 48 שעות, הסר את התאים שאינם דבקים על ידי שינוי המדיום ושטוף עם 1x PBS. החלף את המדיום כל 3 ימים במשך שבועיים.
  7. לאסוף את תרביות התאים.
  8. זהה SF-MSCs באמצעות ציטומטריה של זרימה.
    1. לעכל את הדור השלישי (P3) של SF-MSCs, צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. השליכו את הסופר-נטנט ואספו את כדור התא.
      הערה: מעבר מוכר כתת-תרבית של התאים לצלחת תרבית אחרת. התאים הראשוניים שבודדו מ-SF ונזרעו על כלים מסומנים כאפס מעבר (P0). במפגש של כ-75%, התאים מתעכלים ומנותקים מהכלים, נזרעים בכלים אחרים ומסומנים כ-P1.
    2. הוסף 400 μL של מאגר חוסם (1% BSA ב- 1x PBS) לכדור התא (5 x 104) ואפשר לו לעמוד במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant, ו resument את הכדור ב 100 μL של 1x PBS.
    4. יש להוסיף 1 μL של CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, נוגדן פלואורסצנטי חד-שבטי HLA-DR (יחס דילול 1:100) (ראו טבלת חומרים) לכל שפופרת ולדגירה ב-RT למשך 30 דקות.
    5. יש לשטוף פעמיים עם PBS אחד ולהשליך את הסופר-נטנט. לאסוף את כדור התא ו resudate ב 100 μL של 1x PBS.
    6. זהה על גבי ציטומטר זרימה עד 10,000 תאים באמצעות מסננים של 525/50 ו- 585/40 כדי לזהות את הפלואורופורים.

2.3D תרבית תאים ביוריאקטור

  1. הכנת מיקרו-קרייר
    1. מנפחים את ה-0.75 גרם היבשים של המיקרו-קריינות (ראו טבלת חומרים) ומרטיבים לחות ב-1x ב-Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (50 מ"ל/גרם של מיקרו-קרקרים) למשך 3 שעות לפחות ב-RT.
    2. נטרלו את הסופר-נטרנט ושטפו את המיקרו-קרונות במשך 5 דקות ב-DPBS טרי (50 מ"ל/גרם של מיקרו-קרונות). השליכו את ה-PBS והחליפו אותו ב-DPBS 1x טרי (50 מ"ל/גרם של מיקרו-קרונות).
    3. לעקר את microcarriers על ידי autoclaving (121 מעלות צלזיוס, 15 דקות, 15 psi). אפשרו למיקרו-קרוואנים המעוקרים להתיישב, והניחו את הסופר-נטנט.
    4. שטפו לזמן קצר את המיקרו-קרקרים במדיום התרבית (50 מ"ל/גרם של מיקרו-קרקרים) ב-RT. אפשרו למיקרו-קרקרים להתיישב, השליכו את הסופר-נטר.
  2. ביוריאקטור פרפוזיה
    1. לעקר את הביוריאקטור על ידי אוטוקלאבינג (121 מעלות צלזיוס, 15 דקות, 15 psi).
    2. ספרו את מספר ה-SF-MSCs והקצו 2.5 x 107 SF-MSCs ומיקרו-נשאים לביוריאקטור המחובר למדיום תרבית MSC ברמת GMP (250 מ"ל).
    3. שים את הביוריאקטור באינקובטור עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס. סובב את הביוריאקטור במהירות של 15 סל"ד. שנה את מדיום התרבות כל 6 ימים.
    4. לאסוף את תרבית התאים supernatants ו microcarriers לניתוח נוסף לאחר תרבית במשך 14 ימים.

3. זיהוי אקסוזום וזיהוי בטיחות

  1. אולטרה-צנטריפוגציה
    1. צנטריפוגה של תרבית התאים supernatant ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant; השליכו את הפסולת התאית.
    2. צנטריפוגות של סופרנאטנטים ב 2,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant; יש להשליך את הבועיות הגדולות יותר (גופים אפופטוטיים וכמה מיקרו-ווסיקלים גדולים יותר).
    3. צנטריפוגה supernatant שוב ב 10,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר שלפוחית גדולה יותר; לאסוף את גלולות resuce ב 40 מ"ל של 1x PBS.
    4. צנטריפוגה את הכדורים המחודשים ב 120,000 x גרם במשך 70 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant, ולתלות מחדש את הכדורים המכילים exosomes ב 500 μL של 1x PBS.
  2. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA)
    הערה: עבור כל ריצה, 500 μL של הדגימה הוזרקו לתוך התא בקצב זרימה של 30 μL / min. בצע את הניתוח ב 24.4 °C-24.5 °C.
    1. לדלל את דגימות האקסוזום שבודדו זה עתה עם PBS סטרילי 1x עד 1 מ"ל המכיל 107-10 9 /mL של חלקיקים ולהזריק אותם למערכת ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (ראו טבלת חומרים).
    2. הגדר ידנית את מערכת הלכידה והניתוח בהתאם לפרוטוקול היצרן. דמיינו את החלקיקים על ידי פיזור אור לייזר ולכדו את התנועה הבראונית שלהם בווידאו דיגיטלי.
    3. נתח את קלטות הווידאו המוקלטות באמצעות תוכנה (ראה טבלת חומרים) בהתבסס על מעקב אחר לפחות 200 חלקיקים בודדים בכל ריצה.
  3. מיקרוסקופיית אלקטרונים
    1. לתקן את האקסוזומים ב 4% paraformaldehyde (בקור 1x DPBS) במשך 5 דקות.
    2. הר 5 μL של האקסוזומים על רשתות נחושת. בניסוי זה, ריכוז האקסוזומים הוא 1 מ"ג/מ"ל המכומת על ידי ערכת בדיקת חלבונים (ראו טבלת חומרים).
    3. הטמע את האקסוזומים בחומצה פוספוטונגסטית 3% למשך 10 דקות על קרח. הסר את החומצה העודפת וייבש את הדגימות ב- RT.
    4. צלם את דגימות האקסוזום על ידי TEM במתח תאוצה של 100 kV.
  4. כתם מערבי
    1. הוסיפו 300 μL של מאגר ליזה (1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.1 M Tris HCl, pH 7) וקוקטייל מעכבי פרוטאז (ראו טבלת חומרים) לאקסוזומים.
    2. מערבבים את האקסוזומים במאגר הליזיס על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ומאפשרים לו לעמוד על הקרח במשך 20 דקות.
    3. צנטריפוגה את התערובת ב 9,391 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבונים (ראה טבלת חומרים).
    4. יש להוסיף 100 μL של מאגר העמסת חלבונים פי 4 ולחמם בטמפרטורה של 100°C למשך 10 דקות.
    5. יש לטעון 15 μL של חלבונים בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל ולהפעיל באמצעות אלקטרופורזה בג'ל (120 וולט, 70 דקות) ואלקטרובלוט ב-100 וולט, 60 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    6. זהה את הסמנים הלא ספציפיים לאקסוזומים (calnexin) ואת הסמנים הביולוגיים האקסוזומליים (CD9, CD63 ו-CD81) על-ידי כתם מערבי פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים).
  5. בדיקת בטיחות
    1. עבור חיידקים, פטריות וזיהוי שחפת Mycobacterium בצע את השלבים 3.5.2-3.5.5.
    2. זרעו 100 מיקרוליטר מתמיסת האקסוזומים (1 מ"ג/מ"ל) על צלחת תרבית אגר דם (ראו טבלת חומרים) ודגרו על צלחת התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    3. יש לזרוע 100 מיקרוליטר של תמיסת האקסוזומים (1 מ"ג/מ"ל) על צלחת בינונית של sabouraud agar (ראו טבלת חומרים) ולדגור בטמפרטורה של 35°C למשך 48 שעות.
    4. יש לזרוע 100 מיקרוליטר של תמיסת האקסוזומים (1 מ"ג/מ"ל) על צלחת בינונית בתרבית לוונשטיין-ג'נסן (ראו טבלת חומרים) ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שבועות.
    5. לזהות את המראה של חיידקים, פטריות, ומושבות שחפת Mycobacterium על ידי תצפית מקרוסקופית.
      הערה: קריטריונים להערכת הבטיחות של אקסוזומים הם היעדר מיקרואורגניזמים על צלחת התרבית.
    6. לזיהוי מיקופלסמה, בצע את השלבים 3.5.7-3.5.9.
    7. יש להשעות את האקסוזומים ב-50 מיקרו-ליטר של תמיסת חיץ הכלולה בערכה ולחמם בטמפרטורה של 95°C למשך 3 דקות.
    8. הגבר את המיקופלסמה בתמיסת אקסוזום באמצעות ערכת זיהוי מיקופלסמה PCR (ראה טבלת חומרים).
    9. זהה את מוצרי ה-PCR על אלקטרופורזה בג'ל אגרוז 1.5% (30 דקות, 120 וולט).

4. זיהוי פונקציית אקסוזום במבחנה

  1. תיוג אקסוזום
    1. יש לסמן 100 מיקרו-ליטר של אקסוזומים (1 מ"ג/מ"ל) עם דיל של 1 מ"מ (1000x) (ראו טבלת חומרים) ולדגור ב-RT למשך 30 דקות.
    2. שחזר את האקסוזומים על ידי אולטרה-צנטריפוגציה ב-100,000 x גרם למשך 70 דקות. יש להשעות את הכדור ב-500 μL של PBS אחד.
  2. טעינה של Cy3-miR-140 מחקה לאקסוזומים
    1. יש לערבב 1 מיקרוגרם/μL של חלבון אקסוזומלי ו-5 מיקרומול/מ"ל של Cy3-miR-140 בנפח סופי של 400 μL של חיץ אלקטרופורציה (1.15 mM אשלגן פוספט (pH 7.2), 25 mM אשלגן כלורי ו-21% (v/v) (ראו טבלת חומרים).
    2. מעבירים את התערובת לקיבוצי אלקטרופורציה קרים בקוטר 0.4 ס"מ ולאלקטרופוראט בקיבוליות של 300 V/100 μF באמצעות מערכת העברת גנים (ראו טבלת חומרים).
    3. מיד לאחר האלקטרופורציה, יש לשמור על התערובת ב-RT למשך 30 דקות כדי להבטיח שהממברנה האקסוזומית תשוחזר במלואה.
    4. טפלו בתערובות עם יחידה אחת של RNase A (ראו טבלת חומרים) במשך 20 דקות כדי לחסל את חיקויי ה-miRNA מחוץ לאקסוזומים.
    5. Ultracentrifugate את תערובת האקסוזום ב 120,000 x גרם במשך 90 דקות, להשליך את supernatant ולהחיות את האקסוזומים ב 500 μL של 1x PBS.
  3. בדיקת קליטה אקסוזומית
    1. זרעו את הכונדרוציטים (1 x 107) בכלים קונפוקליים בקוטר 35 מ"מ עם 1 מ"ל של DMEM/F12 המכיל 10% FBS.
    2. לאחר 24 שעות, יש לטפל בכונדרוציטים באמצעות אקסוזומים בעלי תווית DiI (100 ננוגרם/מ"ל) או אקסוזומים טעונים cy3-miR-140 (100 ננוגרם/מ"ל) למשך שעה אחת.
    3. יש לשטוף עם PBS אחד שלוש פעמים, ולאחר מכן להוסיף תווית עם DAPI (10 ננוגרם/מ"ל) למשך 10 דקות ב-RT.
    4. הקלט את אות הפלואורסצנציה במיקרוסקופיית לייזר קונפוקלית (CLSM) באמצעות המסננים המתאימים (ראה טבלת חומרים).

5. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה.
    הערה: נתונים מייצגים בכל איור בוטאו כממוצע ± SD. מבחן t של סטודנט שימש להשוואה בין שתי קבוצות באמצעות תוכנת סטטיסטיקה. ANOVA חד-כיווני ואחריו המכפלה של טוקי בוצעו במקרה של השוואות בין מספר קבוצות. ערכי P <0.05 (*), <0.01 (**) או <0.001 (***).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ציטומטריה של זרימה שימשה לזיהוי סמני פני השטח של SF-MSCs, על פי הקריטריונים המינימליים להגדרת MSCs אנושיים שהומלצו על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי14,15. ניתוח ציטומטריה של זרימה גילה כי SF-MSCs שגודלו במחקר זה עמדו בקריטריוני הזיהוי של MSCs. הם היו שליליים עבור CD34, CD45 ו-HLA-DR (מתחת ל-3%) וחיוביים עבור CD73, CD90 ו-CD105 (מעל 95%) (איור 2).

תחת מיקרוסקופיה הפוכה, הבחין כי SF-MSCs מתרבים על מיקרו-קרונות (איור 3A). לאחר שהתאים עוכלו ונשטפו מצלחת התרבית הדו-ממדית ומהמיקרו-קרונות התרבית התלת-ממדית, מספר התא נספר. בהשוואה לתרבית דו-ממדית, תרבית תלת-ממדית גרמה ל-SF-MSC להתרבות מהר יותר מ-6 ימים ואילך (איור 3B). הוצגו תוצאות של שלושה ניסויים בלתי תלויים.

כדי לזהות את האקסוזומים (Exos) מ-SF-MSCs של תרבית דו-ממדית ותלת-ממדית, זוהו החלבונים הקשורים לאקסוזומים (CD63, CD9 ו-CD81) והחלבון השלילי (קלנקסין) באמצעות כתם מערבי. התוצאות גילו כי ה-2D-Exos וה-3D-Exos מבטאים CD63, CD9 ו-CD81, בעוד שהם שליליים עבור קלנקסין (איור 4A). כמו כן, קוטר האקסוזום והמורפולוגיה נבדקו באמצעות NTA ו- TEM. ניתוח ננו-ראייה הראה כי הקוטר של דו-ממד-אקסוס (איור 4B) ותלת-ממד-אקסוס (איור 4D) הוא כ-120 ננומטר. ניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של שידור חשף את המורפולוגיה של 2D-Exos ו-3D-Exos, והראה בערך שלפוחיות כדוריות (איור 4C,E).

לאחר תרבית תלת-ממדית, ריכוז החלקיקים של חלקיקים בגודל 30-160 ננומטר הוא 4.0 x 106 למ"ל שנותחו באמצעות NTA. עם זאת, לאחר התרבית הדו-ממדית, ריכוז החלקיקים של חלקיקים בגודל 30-160 ננומטר הוא 2.5 x 106 למ"ל (איור 5A). כאשר מחשבים את תפוקת החלבון האקסוזום בתווך, תרבית תלת-ממדית ייצרה יותר חלבון אקסוזום מאשר תרבית דו-ממדית (איור 5B). לכן, בהשוואה לתרבית דו-ממדית, תרבות התלת-ממד שיפרה משמעותית את תפוקת האקסוזומים.

האקסוזומים סומנו תחילה עם דיל, ולאחר מכן דגרו בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל עם הכונדרוציטים במשך שעה, שעתיים ו-3 שעות כדי לבחון אם אקסוזומים יכולים להיכנס לכונדרוציטים ראשוניים במבחנה. אקסוזומים עם תווית דיל נכנסו לכונדרוציטים ראשוניים, כאשר השיא נראה במרחק של 3 שעות (איור 6).

כדי לזהות את תפקודם של אקסוזומים כננו-נשאים, הועמסו אקסוזומים ב-miR-140 עם תווית Cy3 באמצעות אלקטרופורציה, ולאחר מכן טופלו בכונדרוציטים בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל במשך 3 שעות. התוצאות הראו כי אקסוזומים יכולים להעביר miR-140 לכונדרוציטים (איור 7). כל התוצאות עמדו במפרט; כל הדגימות היו סטריליות ושליליות עבור מיקופלסמה.

Figure 1
איור 1: דיאגרמה סכמטית של אקסוזומים שבודדו מ-hSF-MSCs במבחנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: זיהוי של SF-MSCs על-ידי ציטומטריה של זרימה. ציטומטריה של זרימה מראה את האימונופנוטיפ החיובי או השלילי של hSF-MSCs. (A) תיוג עם נוגדן בקרת איזוטיפ IgG1. (B) CD73 הוא חיובי, ו-CD34 הוא שלילי. (C) CD90 הוא חיובי, ו-CD45 הוא שלילי. (D) CD105 הוא חיובי, ו-HLA-DR הוא שלילי, המכונה סמני MSC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: עקומת הצמיחה של SF-MSC. (A) תמונות מייצגות המציגות SF-MSCs (חיצים אדומים) על מיקרו-קרונות תחת מיקרוסקופיה הפוכה (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). (B) עקומת הצמיחה של SF-MSC תחת תרבות דו-ממדית ותלת-ממדית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: זיהוי אקסוזומים . (A) תוצאות הכתם המערבי של הדו-ממד והתלת-ממד-אקסוס. (B) אנליזה ננו-ויזואלית של הקוטר של דו-ממד ותלת-ממד-אקסוס. (C) זיהוי TEM של המורפולוגיה של 2D-Exos ו- 3D-Exos. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: התפוקה המשופרת של ייצור אקסוזומים על-ידי תרבית ביוריאקטור תלת-ממדית . (A) תוצאות מייצגות של גודל אקסוזומים שנותחו על ידי NTA. (B) תפוקת חלבון = חלבון אקסוזומלי (מיקרוגרם)/מדיום מותנה (מ"ל). מגרשים מראים תפוקה עבור כל שיטה והממוצע ± SD של כל המדידות (** p < 0.01). ההשוואות הסטטיסטיות בוצעו על ידי ANOVA חד-כיוונית עם התיקון של בונפרוני לאחר הוק ועל ידי מבחן t של סטודנט. ** p < 0.01 נחשב להבדל משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6 תמונות מייצגות המציגות את ההפנמה של אקסוזומים המסומנים בדיל על-ידי כונדרוציטים ראשוניים. כונדרוציטים דוגרו עם אקסוזומים מסומנים בדיל במשך שעה, שעתיים ו-3 שעות. אקסוזומים סומנו בדיל (באדום), וגרעינים סומנו ב-Hoechst (כחול). דגימות זוהו בהגדלה של 60x. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: העברה חוץ-גופית של miR-140 על-ידי אקסוזומים של MSC. לאחר נטילת Cy3 עם התווית miR-140 שנעטפה באקסוזומים שמקורם ב-SF-MSCs, הודגמו כונדרוציטים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תאי הגזע המזנכימליים נמצאים בשימוש נרחב ברפואה רגנרטיבית בשל ההתחדשות העצמית שלהם, התמיינות לתאי רקמה עם פונקציות מיוחדות, ואפקטים פרקריניים16,17. יש לציין כי ההשפעות הפראקריניות המופעלות על ידי אקסוזומים משכו תשומת לב רבה18. אקסוזומים נושאים את המידע הביולוגי של MSCs ומבצעים את תפקידם הביולוגי ומתגברים על חסרונות MSC, כגון אחסון ומשלוח בעייתיים. לפיכך, אקסוזומים שמקורם ב- MSCs שימשו להתערבויות טיפוליות, אשר משכו את תשומת הלב הרבה ביותר בטיפול OA.

נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות להפיץ MSCs, תרבות 2D ותרבות תלת מימדית (3D)19. תרבית דו-ממדית היא דרך קונבנציונלית לתרבת MSCs עבור מחקרים במבחנה עם עלויות נמוכות. עם זאת, זה גוזל זמן ומוגבל בפוטנציאל קנה המידה. כמו כן, התפשטות MSC במיקרו-סביבה הדו-ממדית מסיקה במהירות את הגבעול20,21, אחד המאפיינים הקריטיים ביותר של MSCs. לפיכך, תרבות 2D לא יכול למלא את הדרישות לטיפול MSC. במחקר זה, במטרה של SF-MSCs בטיפול OA, אנו משתדלים לשמור על מאפייני SF-MSC באמצעות תרבית של ביוריאקטור תלת-ממדי, שיכול לחקות בצורה מדויקת יותר את המיקרו-סביבה הביולוגית. לאחרונה, חוקרים אחרים השתמשו בפיגומים או בתלת-ממד מבוסס מיקרו-קרייר כדי לתרבת MSCs. מצאנו כי פיגומי הקולגן התלת-ממדיים אפשרו אקסוזומים מרוכזים יותר המיוצרים על-ידי MSCs שמקורם במח עצם אנושי מאשר תרבית דו-ממדית23.

מכיוון שאקסוזומים יכולים לבצע חלק גדול מתפקוד MSC תוך הימנעות מחסרונות מסוימים של MSCs, אנו שואפים לייצר אקסוזומים לטיפול ב- OA. מחקר זה זיהה עוד יותר את פונקציית הייצור והאספקה של אקסוזומים באמצעות מערכת זו בהתבסס על הכמות הגדולה והאיכות הגבוהה של התפשטות MSC של תרבית תלת-ממד. מערכת תרבית התאים הסיבוביים (RCCS) שימשה לתרבית תלת-ממדית כדי לייצר אקסוזומים מהתפשטות MSC בקנה מידה גדול. בהשוואה לתרביית בקבוקון דו-ממדית מסורתית, מערכת תרבית תלת-ממדית זו עשויה למנוע זיהום כתוצאה משינויים חוזרים ונשנים במדיום וממעבר תאים. חשוב מכך, מחקר זה הראה כי ביוריאקטור תלת-ממדי יכול לשפר את ייצור האקסוזומים כדי לעמוד בדרישות המחקר הקליני. יש לציין כי אקסוזומים שבודדו מתרביות-על תלת-ממדיות יכולים להעביר miRNAs לתאים, מה שמרמז על כך שתרבית תלת-ממדית אינה מפריעה לתפקוד האקסוזומים. תוצאות זיהוי מיקרוביאליות ואנדוטוקסינים תומכות עוד יותר בכך שמחקר זה קבע פרוטוקול שיכול לייצר אקסוזומים, שהם בטוחים ביולוגית ומבטיחים לטיפול ב- OA. נכון לעכשיו, הכמות האקסוזומית המיוצרת במחקר זה אינה יכולה לספק צרכים מסחריים. לפיכך, יש לפתח אסטרטגיות לכמות עצומה של ייצור אקסוזומים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81972116, מס' 81972085, מס' 81772394); תוכנית המפתח של הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מס '2018B0303110003); פרויקט שיתוף הפעולה הבינלאומי של גואנגדונג (מס '2021A0505030011); שנזן פרויקטים של מדע וטכנולוגיה (לא. GJHZ20200731095606019, לא. JCYJ20170817172023838, לא. JCYJ20170306092215436, לא. JCYJ20170413161649437); קרן סין למדע בתר-דוקטוריאלי (No.2020M682907); קרן המחקר הבסיסי והיישומי של גואנגדונג (No.2021A1515010985); פרויקט סאנמינג לרפואה בשנג'ן (SZSM201612079); כספים מיוחדים לבניית בתי חולים ברמה גבוהה במחוז גואנגדונג.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA assay kit ThermoFisher 23227 Protein concentration assay
Blood agar plate Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. P0903 Bacteria culture
CD105 antibody Elabscience E-AB-F1243C Flow cytometry
CD34 antibody Elabscience E-AB-F1143C Flow cytometry
CD45 antibody BD Bioscience 555483 Flow cytometry
CD63 antibody Abclonal  A5271 Western blotting
CD73 antibody Elabscience E-AB-F1242C Flow cytometry
CD81 antibody ABclonal  A5270 Western blotting
CD9 antibody Abclonal  A1703 Western blotting
CD90 antibody Elabscience E-AB-F1167C Flow cytometry
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810R
CO2 incubator Thermo Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy ZEISS LSM 800
Cytodex GE Healthcare Microcarrier
Dil ThermoFisher D1556 Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit BI 20-700-20 Mycoplasma detection
Flowcytometry Beckman MSC identification
Gene Pulser II System Bio-Rad Laboratories 1652660 Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2 GraphPad Software, Inc. Version 8.0.2
HLA-DR antibody Elabscience E-AB-F1111C Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. T0573 Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro StemRD MGro-500 MSC culture
Nanosight NS300 Malvern Nanosight NS300 Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software Malvern Data analysis
Odyssey FC Gene Company Limited Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer Sigma D3911 Gene transfection
Protease inhibitors cocktail Sigma P8340 Proteinase inhibitor
RNase A Qiagen 158924 Removal of RNA
Sabouraud agar plate Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. P0919 Fungi culture
TEM JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-4HD 3D culture
Ultracentrifuge Beckman Optima XPN-100 Exosome centrifuge

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
  2. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  3. Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
  4. Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
  5. Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
  6. Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
  7. McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
  8. Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
  9. Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
  10. Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
  11. Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
  12. Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
  13. Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
  14. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  15. Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
  16. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  17. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
  18. Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
  19. Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
  20. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  21. Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
  22. Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
  23. Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 185 אקסוזום נוזל סינוביאלי תאי גזע מזנכימליים תרבית תלת-ממדית
הכנה בקנה מידה גדול של אקסוזומים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים של נוזל סינוביאלי על ידי תרבית ביוריאקטור תלת-ממדית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Duan, L., Li, X., Xu, X., Xu, L.,… More

Duan, L., Li, X., Xu, X., Xu, L., Wang, D., Ouyang, K., Liang, Y. Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture. J. Vis. Exp. (185), e62221, doi:10.3791/62221 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter