Summary
Hier presenteren we een protocol om een groot aantal GMP-grade exosomen te produceren uit synoviale vloeistof mesenchymale stamcellen met behulp van een 3D-bioreactor.
Abstract
Exosomen uitgescheiden door mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn gesuggereerd als veelbelovende kandidaten voor kraakbeenletsels en artrosebehandeling. Exosomen voor klinische toepassing vereisen grootschalige productie. Daartoe werden menselijke synoviale vloeistof-MSC's (hSF-MSC's) gekweekt op microcarrierparels en vervolgens gekweekt in een dynamisch driedimensionaal (3D) kweeksysteem. Door gebruik te maken van 3D dynamische cultuur, heeft dit protocol met succes grootschalige exosomen verkregen uit SF-MSC-cultuursupernatanten. Exosomen werden geoogst door ultracentrifugatie en geverifieerd door een transmissie-elektronenmicroscoop, nanodeeltjestransmissietest en western blotting. Ook werd de microbiologische veiligheid van exosomen gedetecteerd. Resultaten van exosoomdetectie suggereren dat deze aanpak een groot aantal good manufacturing practices (GMP)-grade exosomen kan produceren. Deze exosomen kunnen worden gebruikt in exosoombiologisch onderzoek en klinische artrosebehandeling.
Introduction
Artrose (OA), als gevolg van gewrichtskraakbeen en onderliggende botafbraak, blijft een ernstige uitdaging die leidt tot invaliditeit 1,2. Zonder bloed- en zenuwtoevoer is het zelfgenezend vermogen van kraakbeen minimaal als het eenmaal gewond isgeraakt 3,4. In de afgelopen decennia hebben therapieën op basis van autologe chondrocytenimplantatie (ACI) enige vooruitgang geboekt bij de behandeling van artrose5. Voor chondrocytenisolatie en -uitbreiding is het oogsten van klein kraakbeen uit het niet-gewichtdragende gebied van het OA-gewricht noodzakelijk, waardoor verwondingen aan het kraakbeen ontstaan. Ook vereist de procedure een tweede operatie om de uitgebreide chondrocyten te implanteren6. Zo worden eenstapstherapieën voor artrosebehandeling zonder kraakbeenletsels uitgebreid onderzocht.
Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn voorgesteld als veelbelovende alternatieven voor behandeling met artrose 7,8. Afkomstig van meerdere weefsels, kunnen MSC's differentiëren in chondrocyten met specifieke stimulatie. Belangrijk is dat MSC's immuunresponsen kunnen moduleren via anti-ontsteking9. Daarom hebben MSC's aanzienlijke voordelen bij de behandeling van artrose door kraakbeendefecten te repareren en de immuunrespons te moduleren, vooral in het ontstekingsmilieu. Voor de behandeling van artrose hebben MSC's uit synoviale vloeistof (SF-MSC's) onlangs veel aandacht getrokken vanwege hun sterkere chondrocytendifferentiatievermogen dan andere MSC-bronnen10,11. Met name in de orthopedische kliniek is de extractie van inflammatoire SF uit de gewrichtsholte een routinetherapie om het pijnsymptoom van OA-patiënten te verlichten. Geëxtraheerde inflammatoire SF wordt meestal weggegooid als medisch afval. Zowel patiënten als artsen zijn klaar om autologe MSC's geïsoleerd uit de inflammatoire SF te beschouwen als OA-behandeling met zeer weinig ethische conflicten. SF-MSC-therapie is echter gecompromitteerd als gevolg van tumorogene risico's, langdurige opslag en verre verzendbarrières.
Exosomen, uitgescheiden door vele celtypen, waaronder MSC's, dragen het grootste deel van de bio-informatie van de moedercel. Het is diepgaand onderzocht als een celvrije therapie12,13. Volgens de bijgewerkte bronnen die beschikbaar zijn op de website van de overheid van klinische studies (ClinicalTrials.gov), worden uitgebreidere exosoom klinische studies geïnitieerd en uitgevoerd op het gebied van kanker, hypertensie en neurodegeneratieve ziekten. SF-MSC exosoombehandeling kan een spannende en uitdagende studie zijn om met artrose om te gaan. Good manufacturing practice (GMP)-grade en grootschalige exosoomproductie zijn essentieel voor klinische vertaling. Kleinschalige exosoomisolatie is op grote schaal uitgevoerd op basis van tweedimensionale (2D) celcultuur. Grootschalige exosoomproductiestrategieën moeten echter worden geoptimaliseerd. In deze studie werd een grootschalige productiemethode voor exosomen ontwikkeld, gebaseerd op massale SF-MSC-cultuur in xenovrije omstandigheden. Na ultracentrifugatie van celkweeksupernatanten werden de veiligheid en functie van exosoom gevalideerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de Human Ethics Committee van Shenzhen Second People's Hospital. Een schematisch diagram van exosomen geïsoleerd uit het hSF-MSCs in vitro protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Menselijke SF-MSC's cultuur en identificatie
- Oogst 20 ml SF met behulp van een spuit en naald van klinische artrosepatiënten.
- Desinfecteer het kniegewricht van de artrosepatiënt. Punctie van de quadriceps femoris pees buiten de patella in de gewrichtsholte met een 7 # naald.
- Extraheer 10 ml van de gewrichtsvloeistof. Bedek de prikplaats met de transfusiestok en druk gedurende 5 minuten aan.
- Gooi het SF-supernatant na centrifugeren bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C weg.
- Resuspendeer de celpellet met 10 ml 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS), centrifugeer bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi de PBS weg.
- Resuspendeer de pellet met 10 ml humaan MSC-kweekmedium bij een celdichtheid van 5 x 104 cellen /ml (zie materiaaltabel) en plaats de suspensie vervolgens in een schaal van 100 mm.
- Incubeer het gerecht bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2.
- Verwijder na 48 uur de niet-hechtende cellen door het medium te vervangen en was met 1x PBS. Vervang het medium elke 3 dagen gedurende 2 weken.
- Verzamel de celkweek supernatanten.
- Identificeer SF-MSC's met behulp van flowcytometrie.
- Vergist de derde generatie (P3) SF-MSC's, centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en verzamel de celpellet.
OPMERKING: Een passage wordt herkend als de subcultuur van de cellen naar een ander kweekgerecht. De primaire cellen geïsoleerd uit SF en gezaaid op gerechten worden gelabeld als passage nul (P0). Bij ongeveer 75% samenvloeiing worden de cellen verteerd en losgemaakt van de gerechten, gezaaid op andere gerechten en geëtiketteerd als P1. - Voeg 400 μL blokkeerbuffer (1% BSA in 1x PBS) toe aan de celpellet (5 x 104) en laat deze 15 minuten staan bij kamertemperatuur (RT).
- Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 100 μL 1x PBS.
- Voeg 1 μL CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR monoklonaal fluorescerend antilichaam (verdunningsverhouding 1:100) (zie Materiaaltabel) per buis toe en incubeer bij RT gedurende 30 minuten.
- Was twee keer met 1x PBS en gooi het supernatant weg. Verzamel de celpellet en resuspendeer in 100 μL 1x PBS.
- Detecteer op een flowcytometer tot 10.000 cellen met behulp van filters van 525/50 en 585/40 om de fluoroforen te detecteren.
- Vergist de derde generatie (P3) SF-MSC's, centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en verzamel de celpellet.
2.3D bioreactor celcultuur
- Microcarrier voorbereiding
- Zwol de droge 0,75 g microdragers op (zie materiaaltabel) en hydrateer in 1x Dulbecco's Fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) (50 ml/g microdragers) gedurende ten minste 3 uur bij RT.
- Decanteer het supernatant en was de microdragers gedurende 5 minuten in verse DPBS (50 ml/g microdragers). Gooi de PBS weg en vervang deze door verse 1x DPBS (50 ml/g microdragers).
- Steriliseer de microdragers door autoclaveren (121 °C, 15 min, 15 psi). Laat de gesteriliseerde microdragers bezinken, decanteer het supernatant.
- Spoel de microdragers kort af in het kweekmedium (50 ml /g microdragers) bij RT. Laat de microdragers bezinken, gooi het supernatant weg.
- Perfusie bioreactor
- Steriliseer de bioreactor door autoclaveren (121 °C, 15 min, 15 psi).
- Tel het aantal SF-MSC's en wijs 2,5 x 107 SF-MSC's en microdragers toe aan de bioreactor doordrenkt met GMP-grade MSC kweekmedium (250 ml).
- Zet de bioreactor in een incubator met 5% CO2 bij 37 °C. Draai de bioreactor met een snelheid van 15 rpm. Verander het cultuurmedium elke 6 dagen.
- Verzamel de celkweek supernatanten en microdragers voor verdere analyse na kweek gedurende 14 dagen.
3. Exosoomidentificatie en veiligheidsdetectie
- Ultracentrifugatie
- Centrifugeer het celkweeksupernatant bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatant; gooi het cellulaire vuil weg.
- Centrifugeer de supernatanten bij 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatant; gooi de grotere blaasjes (apoptotische lichamen en enkele grotere microvesicles) weg.
- Centrifugeer het supernatant opnieuw bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om grotere blaasjes te verwijderen; verzamel de pellets en resuspendeer in 40 ml 1x PBS.
- Centrifugeer de geresuspendeerde pellets bij 120.000 x g gedurende 70 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellets die exosomen bevatten in 500 μL van 1x PBS.
- Analyse van nanodeeltjes (NTA)
OPMERKING: Voor elke run werd 500 μL van het monster in de kamer geïnjecteerd met een stroomsnelheid van 30 μL/min. Voer de analyse uit bij 24,4 °C-24,5 °C.- Verdun de vers geïsoleerde exosoommonsters met steriele 1x PBS tot 1 ml met 107-10 9 / ml deeltjes en injecteer ze in het analysesysteem voor het volgen van nanodeeltjes (zie materiaaltabel).
- Stel het opname- en analysesysteem handmatig in volgens het protocol van de fabrikant. Visualiseer de deeltjes door laserlichtverstrooiing en leg hun Brownse beweging vast op digitale video.
- Analyseer de opgenomen videobanden met behulp van software (zie Materiaaltabel) op basis van het volgen van ten minste 200 individuele deeltjes per run.
- Transmissie-elektronenmicroscopie
- Bevestig de exosomen in 4% paraformaldehyde (in koude 1x DPBS) gedurende 5 min.
- Monteer 5 μL van de exosomen op koperen roosters. In dit experiment is de concentratie van exosomen 1 mg/ml gekwantificeerd door een eiwittestkit (zie materiaaltabel).
- Integreer de exosomen in 3% fosfotungsticzuur gedurende 10 minuten op ijs. Verwijder het overtollige zuur en droog de monsters bij RT.
- Beeld de exosoommonsters af met een TEM bij een acceleratiespanning van 100 kV.
- Western blotting
- Voeg 300 μL lysisbuffer (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) en proteaseremmerscocktail (zie Materiaaltabel) toe aan de exosomen.
- Meng de exosomen in de lysisbuffer door op en neer te pipetteren en laat het 20 minuten op ijs staan.
- Centrifugeer het mengsel bij 9,391 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verzamel het supernatant. Meet de eiwitconcentratie met behulp van een eiwittestkit (zie Materiaaltabel).
- Voeg 100 μL 4x eiwitlaadbuffer toe en verwarm gedurende 10 min bij 100 °C.
- Laad 15 μL eiwitten in een concentratie van 10 mg/ml en laat het uitvoeren door gel-elektroforese (120 V, 70 min) en elektroblotting bij 100 V, 60 min bij 4 °C.
- Detecteer de niet-exosoomspecifieke markers (calnexin) en exosomale biomarkers (CD9, CD63 en CD81) door fluorescerende western blotting (zie Materiaaltabel).
- Veiligheidstest
- Voor de detectie van bacteriën, schimmels en Mycobacterium tuberculosis volgt u de stappen 3.5.2-3.5.5.
- Zaai 100 μL van de exosoomoplossing (1 mg/ml) op een bloedagagplaat (zie materiaaltabel) en incubeer de kweekplaat bij 37 °C gedurende 24 uur.
- Zaad 100 μL van de exosoomoplossing (1 mg/ml) op een sabouraud agar medium plaat (zie materiaaltabel) en incubeer bij 35 °C gedurende 48 uur.
- Zaai 100 μL van de exosoomoplossing (1 mg/ml) op een Lowenstein-Jensen kweekmediumplaat (zie Materiaaltabel) en incubeer bij 37 °C gedurende 3 weken.
- Detecteer het verschijnen van bacteriën, schimmels en Mycobacterium tuberculosis kolonies door macroscopische observatie.
OPMERKING: Criteria voor het evalueren van de veiligheid van exosomen zijn de afwezigheid van micro-organismen op de kweekplaat. - Volg voor mycoplasmadetectie de stappen 3.5.7-3.5.9.
- Resuspensie de exosomen in 50 μL bufferoplossing in de kit en verwarm bij 95 °C gedurende 3 minuten.
- Versterk het Mycoplasma in exosoomoplossing met behulp van een PCR Mycoplasma-detectiekit (zie Materiaaltabel).
- Detecteer de PCR-producten op 1,5% agarose gel-elektroforese (30 min, 120 V).
4. In vitro exosoom functie detectie
- Exosoom labeling
- Etiketteer 100 μL exosomen (1 mg/ml) met 1 mM Dil (1000x) (zie Materiaaltabel) en incubeer bij RT gedurende 30 min.
- Herstel de exosomen door ultracentrifugatie bij 100.000 x g gedurende 70 minuten. Resuspendeer de pellet in 500 μL van 1x PBS.
- Laden van Cy3-miR-140 bootst na in exosomen
- Meng 1 μg/μL exosomaal eiwit en 5 μmol/ml Cy3-miR-140 in een eindvolume van 400 μL elektroporatiebuffer (1,15 mM kaliumfosfaat (pH 7,2), 25 mM kaliumchloride en 21% (v/v) (zie Materiaaltabel).
- Breng het mengsel over in koude elektroporatiecuvetten van 0,4 cm en elektroporaat met een capaciteit van 300 V/100 μF met behulp van een gentransfectiesysteem (zie materiaaltabel).
- Houd het mengsel onmiddellijk na elektroporatie gedurende 30 minuten op RT om ervoor te zorgen dat het exosoommembraan volledig is hersteld.
- Behandel de mengsels met één eenheid RNase A (zie Materiaaltabel) gedurende 20 minuten om de miRNA-nabootsingen buiten de exosomen te elimineren.
- Ultracentrifurk het exosoommengsel op 120.000 x g gedurende 90 minuten, gooi het supernatant weg en resuspenseer de exosomen in 500 μL van 1x PBS.
- Exosoom opname assay
- Zaai de chondrocyten (1 x 107) in 35 mm confocale gerechten met 1 ml DMEM/F12 met 10% FBS.
- Behandel de chondrocyten na 24 uur met DiI-gelabelde exosomen (100 ng/ml) of cy3-miR-140 geladen exosomen (100 ng/ml) gedurende 1 uur.
- Was drie keer met 1x PBS en label vervolgens met DAPI (10 ng/ml) gedurende 10 minuten op RT.
- Registreer het fluorescentiesignaal in confocale laserscanfluorescentiemicroscopie (CLSM) met behulp van de juiste filters (zie Materiaaltabel).
5. Statistische analyse
- Voer statistische analyses uit met behulp van geschikte statistische software.
OPMERKING: Representatieve gegevens in elk cijfer werden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD. De Student's t-test werd gebruikt voor de vergelijking van twee groepen met behulp van statistische software. Een one-way ANOVA gevolgd door Tukey's multiple werd uitgevoerd in het geval van vergelijkingen tussen meerdere groepen. P-waarden <0,05 (*), <0,01 (**) of <0,001 (***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Flowcytometrie werd gebruikt om de oppervlaktemarkers van SF-MSC's te identificeren, volgens de minimale criteria om menselijke MSC's te definiëren die worden aanbevolen door de International Society for Cellular Therapy14,15. Flowcytometrie-analyse toonde aan dat SF-MSC's gekweekt in deze studie voldeden aan de identificatiecriteria van MSC's. Ze waren negatief voor CD34, CD45 en HLA-DR (minder dan 3%) en positief voor CD73, CD90 en CD105 (boven 95%) (figuur 2).
Onder omgekeerde microscopie werd opgemerkt dat de SF-MSC's zich verspreiden op microdragers (figuur 3A). Nadat cellen waren verteerd en gewassen van de 2D-kweekplaat en 3D-cultuurmicrodragers, werd het celnummer geteld. In vergelijking met de 2D-cultuur zorgde de 3D-cultuur ervoor dat de SF-MSC zich vanaf 6 dagen sneller verspreidde (figuur 3B). Resultaten van drie onafhankelijke experimenten werden gepresenteerd.
Om de exosomen (Exos) van SF-MSC's van 2D- en 3D-cultuur te identificeren, werden de exosoom-geassocieerde eiwitten (CD63, CD9 en CD81) en negatief eiwit (calnexin) gedetecteerd met behulp van western blotting. Uit de resultaten bleek dat de 2D-Exos en 3D-Exos CD63, CD9 en CD81 uitdrukken, terwijl ze negatief zijn voor calnexin (figuur 4A). Ook werden de exosoomdiameter en morfologie getest met behulp van NTA en TEM. Nanosight-analyse toonde aan dat de diameter van 2D-Exos (Figuur 4B) en 3D-Exo's (Figuur 4D) ongeveer 120 nm is. Transmissie elektronische microscoopanalyse onthulde de morfologie van 2D-Exos en 3D-Exos, met ruwweg sferoïdale blaasjes (figuur 4C, E).
Na 3D-cultuur is de deeltjesconcentratie van deeltjes van 30-160 nm 4,0 x 106 per ml geanalyseerd met behulp van NTA. Na de 2D-cultuur is de deeltjesconcentratie van 30-160 nm deeltjes echter 2,5 x 106 per ml (figuur 5A). Bij het berekenen van de exosoomeiwitopbrengst in het medium produceerde 3D-cultuur meer exosoomeiwit dan 2D-cultuur (figuur 5B). Dus, in vergelijking met 2D-cultuur, verbeterde 3D-cultuur de exosoomopbrengst aanzienlijk.
De exosomen werden eerst gelabeld met Dil en vervolgens geïncubeerd in een concentratie van 10 μg / ml met de chondrocyten gedurende 1 uur, 2 uur en 3 uur om te onderzoeken of exosomen in vitro primaire chondrocyten kunnen binnendringen. Exosomen met het label Dil kwamen in primaire chondrocyten terecht, waarbij de piek werd waargenomen na 3 uur (figuur 6).
Om de functie van exosomen als nanodragers te detecteren, werden exosomen geladen met Cy3-gelabelde miR-140 door middel van elektroporatie en vervolgens behandeld met chondrocyten in een concentratie van 10 μg / ml gedurende 3 uur. De resultaten toonden aan dat exosomen miR-140 konden leveren aan chondrocyten (figuur 7). Alle resultaten voldeden aan de specificaties; alle monsters waren steriel en negatief voor Mycoplasma.
Figuur 1: Schematisch diagram van exosomen geïsoleerd uit hSF-MSC's in vitro. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Identificatie van SF-MSC's door middel van flowcytometrie. Flowcytometrie toont het positieve of negatieve immunofenotype van hSF-MSC's. (A) Etikettering met een IgG1 isotype controle antilichaam. (B) CD73 is positief en CD34 is negatief. (C) CD90 is positief en CD45 is negatief. (D) CD105 is positief en HLA-DR is negatief, bekend als MSC-markers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: SF-MSC groeicurve. (A) Representatieve beelden van SF-MSC's (rode pijlen) op microdragers onder omgekeerde microscopie (schaalbalk =100 μm). (B) De groeicurve van SF-MSC onder 2D- en 3D-cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Identificatie van exosomen. (A) Western blotting resultaten van de 2D-Exos en 3D-Exos. (B) Nanosight analyse van de diameter van 2D-Exos en 3D-Exos. (C) TEM detectie van de morfologie van 2D-Exos en 3D-Exos. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: De verhoogde opbrengst van exosoomproductie door 3D-bioreactorcultuur. (A) Representatieve resultaten van exosoomgrootte geanalyseerd door NTA. (B) Eiwitopbrengst = exosomaal eiwit (μg)/geconditioneerd medium (ml). De waarnemingspunten tonen de opbrengst voor elke methode en de gemiddelde ± SD van alle metingen (** p < 0,01). Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd door eenrichtings-ANOVA met post-hoc Bonferroni's correctie en door Student's t-test. ** p < 0,01 werd als een significant verschil beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6 Representatieve beelden die de internalisatie van Dil-gelabelde exosomen door primaire chondrocyten laten zien. Chondrocyten werden geïncubeerd met Dil-gelabelde exosomen gedurende 1 uur, 2 uur en 3 uur. Exosomen werden gelabeld met Dil (rood) en kernen werden gelabeld met Hoechst (blauw). Monsters werden gedetecteerd bij 60x vergroting. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: In vitro toediening van miR-140 door MSC exosomen. Na het opnemen van Cy3-gelabelde miR-140 die was ingekapseld in sf-MSC's-afgeleide exosomen, werden chondrocyten in beeld gebracht. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mesenchymale stamcellen zijn op grote schaal gebruikt in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun zelfvernieuwing, gedifferentieerd tot weefselcellen met gespecialiseerde functies en paracriene effecten16,17. Met name de paracriene effecten van exosomen hebben veel aandacht getrokken18. Exosomen dragen de bio-informatie van MSC's en vervullen hun biologische functie en overwinnen MSC-tekortkomingen, zoals problematische opslag en verzending. Exosomen afgeleid van MSC's zijn dus gebruikt voor therapeutische interventies, die de meeste aandacht hebben getrokken in OA-therapie.
Momenteel zijn er twee methoden om MSC's te propageren, 2D-cultuur en driedimensionale (3D) cultuur19. 2D-cultuur is een conventionele manier om MSC's te kweken voor in vitro studies met lage kosten. Het is echter tijdrovend en beperkt in schaalpotentieel. Ook leidt msc-vermeerdering in de 2D-micro-omgeving snel de stamheid20,21 af, een van de meest kritische kenmerken van MSC's. De 2D-cultuur kan dus niet voldoen aan de vereisten voor MSC-therapie. In deze studie, met het doel van SF-MSC's in OA-therapie, streven we ernaar om SF-MSC-kenmerken te behouden met behulp van de cultuur van een 3D-bioreactor, die de biologische micro-omgeving nauwkeuriger kan nabootsen. Onlangs hebben andere onderzoekers steigers of op microdragers gebaseerde 3D gebruikt om MSC's te kweken. We ontdekten dat de 3D-collageensteigers meer geconcentreerde exosomen toelieten die werden geproduceerd door van het menselijk beenmerg afgeleide MSC's dan 2D-cultuur23.
Omdat exosomen een groot deel van de MSC-functie kunnen uitvoeren en tegelijkertijd enkele tekortkomingen van MSC's kunnen vermijden, streven we ernaar exosomen te produceren voor OA-therapie. Deze studie detecteerde verder de exosoomproductie- en leveringsfunctie met behulp van dit systeem op basis van de grote kwantiteit en hoge kwaliteit van MSC-propagatie van 3D-cultuur. Het Rotary Cell Culture System (RCCS) werd gebruikt voor 3D-kweek om exosomen te produceren uit grootschalige MSC-vermeerdering. In vergelijking met traditionele 2D-kolfcultuur kan dit 3D-kweeksysteem besmetting door herhaalde mediumverandering en celpassage voorkomen. Wat nog belangrijker is, deze studie toonde aan dat een 3D-bioreactor de exosoomproductie kon verbeteren om aan de vereisten van de klinische studie te voldoen. Van belang is dat exosomen geïsoleerd uit 3D-cultuursupernatanten miRNA's in cellen kunnen afleveren, wat suggereert dat 3D-cultuur de exosoomfunctie niet verstoort. Microbiële en endotoxine detectieresultaten ondersteunen verder dat deze studie een protocol heeft opgesteld dat exosomen kan produceren, die biologisch veilig en veelbelovend zijn voor OA-therapie. Op dit moment kan de exosoomhoeveelheid die in dit onderzoek wordt geproduceerd, niet voldoen aan commerciële behoeften. Daarom moeten strategieën voor een enorme hoeveelheid exosoomproductie worden ontwikkeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
National Natural Science Foundation of China (nr. 81972116, nr. 81972085, nr. 81772394); Key Program of Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (No.2018B0303110003); Guangdong Internationaal Samenwerkingsproject (Nr.2021A0505030011); Shenzhen Wetenschaps- en Technologieprojecten (Nr. GJHZ20200731095606019, Nr. JCYJ20170817172023838, Nr. JCYJ20170306092215436, Nr. JCYJ20170413161649437); China Postdoctoral Science Foundation (Nr.2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Nr.2021A1515010985); Sanming Project van Geneeskunde in Shenzhen (SZSM201612079); Speciale fondsen voor de bouw van ziekenhuizen op hoog niveau in de provincie Guangdong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
