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Biology

Préparation à grande échelle d’exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial par culture de bioréacteur 3D

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/62221
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,3
1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour produire un grand nombre d’exosomes de qualité GMP à partir de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial à l’aide d’un bioréacteur 3D.

Abstract

Les exosomes sécrétés par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été suggérés comme des candidats prometteurs pour les lésions cartilagineuses et le traitement de l’arthrose. Les exosomes pour application clinique nécessitent une production à grande échelle. À cette fin, des CSM du liquide synovial humain (hSF-MSC) ont été cultivées sur des billes microporteuses, puis cultivées dans un système de culture dynamique en trois dimensions (3D). En utilisant la culture dynamique 3D, ce protocole a réussi à obtenir des exosomes à grande échelle à partir de surnageants de culture SF-MSC. Les exosomes ont été récoltés par ultracentrifugation et vérifiés par un microscope électronique à transmission, un test de transmission de nanoparticules et un transfert Western. En outre, la sécurité microbiologique des exosomes a été détectée. Les résultats de la détection des exosomes suggèrent que cette approche peut produire un grand nombre d’exosomes de qualité Bonnes pratiques de fabrication (BPF). Ces exosomes pourraient être utilisés dans la recherche sur la biologie des exosomes et le traitement clinique de l’arthrose.

Introduction

L’arthrose, résultant du cartilage articulaire et de la dégradation osseuse sous-jacente, demeure un défi de taille menant à l’invalidité 1,2. Sans apport sanguin et nerveux, la capacité d’auto-guérison du cartilage est minime une fois blessé 3,4. Au cours des dernières décennies, les thérapies basées sur l’implantation de chondrocytes autologues (ICA) ont fait des progrès dans le traitement de l’arthrose5. Pour l’isolement et l’expansion des chondrocytes, il est nécessaire de prélever le petit cartilage de la zone non portante de l’articulation arthrose, ce qui provoque des lésions au cartilage. En outre, la procédure nécessitera une deuxième opération pour implanter les chondrocytes dilatés6. Ainsi, les thérapies en une étape pour le traitement de l’arthrose sans lésions cartilagineuses font l’objet d’une exploration approfondie.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été suggérées comme alternatives prometteuses pour le traitement de l’arthrose 7,8. Provenant de plusieurs tissus, les CSM peuvent se différencier en chondrocytes avec une stimulation spécifique. Il est important de noter que les CSM peuvent moduler les réponses immunitaires via un anti-inflammation9. Par conséquent, les CSM présentent des avantages significatifs dans le traitement de l’arthrose en réparant les défauts du cartilage et en modulant la réponse immunitaire, en particulier dans le milieu de l’inflammation. Pour le traitement de l’arthrose, les CSM du liquide synovial (SF-MSC) ont récemment attiré beaucoup d’attention en raison de leur capacité de différenciation des chondrocytes plus forte que les autres sources de CSM10,11. Notamment, à la clinique orthopédique, l’extraction de SF inflammatoire de la cavité articulaire est une thérapie de routine pour soulager le symptôme de douleur des patients atteints d’arthrose. Le SF inflammatoire extrait est généralement éliminé comme un déchet médical. Les patients et les médecins sont prêts à considérer les CSM autologues isolées du SF inflammatoire comme traitement de l’arthrose avec très peu de conflits éthiques. Cependant, le traitement SF-MSC est compromis en raison des risques tumorigènes, du stockage à long terme et des barrières d’expédition éloignées.

Les exosomes, sécrétés par de nombreux types de cellules, y compris les CSM, transportent la plupart des informations biologiques de la cellule mère. Il a été étudié en profondeur en tant que thérapie acellulaire12,13. Selon les ressources mises à jour disponibles sur le site Web du gouvernement des essais cliniques (ClinicalTrials.gov), des études cliniques plus approfondies sur les exosomes sont lancées et entreprises dans les domaines de recherche du cancer, de l’hypertension et des maladies neurodégénératives. Le traitement par exosomes SF-MSC pourrait être un essai passionnant et difficile pour faire face à l’arthrose. Les bonnes pratiques de fabrication (BPF) et la production d’exosomes à grande échelle sont essentielles pour la traduction clinique. L’isolement d’exosomes à petite échelle a été largement réalisé sur la base d’une culture cellulaire bidimensionnelle (2D). Cependant, les stratégies de production d’exosomes à grande échelle doivent être optimisées. Une méthode de fabrication d’exosomes à grande échelle a été développée dans cette étude, basée sur une culture massive de SF-MSC dans des conditions sans xéno. Après ultracentrifugation à partir de surnageants de culture cellulaire, l’innocuité et la fonction des exosomes ont été validées.

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Protocol

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique humaine du deuxième hôpital populaire de Shenzhen. Un diagramme schématique des exosomes isolés à partir du protocole in vitro hSF-MSCs est présenté à la figure 1.

1. Culture et identification des SF-MSC humaines

  1. Prélever 20 mL de SF à l’aide d’une seringue et d’une aiguille provenant de patients atteints d’arthrose clinique.
    1. Désinfecter l’articulation du genou du patient atteint d’arthrose. Ponction du tendon du quadriceps fémoral à l’extérieur de la rotule dans la cavité articulaire avec une aiguille 7#.
    2. Extraire 10 mL du liquide articulaire. Couvrir le site de ponction avec le bâtonnet de transfusion et appuyer pendant 5 min.
  2. Éliminer le surnageant SF après centrifugation à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
  3. Resuspendre la pastille cellulaire avec 10 mL de 1x solution saline tampon phosphate (PBS), centrifuger à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C et jeter le PBS.
  4. Remettez la pastille en suspension avec 10 mL de milieu de culture CSM humain à une densité cellulaire de 5 x 104 cellules/mL (voir le tableau des matériaux), puis plaquez la suspension dans une boîte de 100 mm.
  5. Incuber la capsule à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
  6. Après 48 h, retirez les cellules non adhérentes en changeant le milieu et lavez avec 1x PBS. Remplacez le milieu tous les 3 jours pendant 2 semaines.
  7. Recueillir les surnageants de culture cellulaire.
  8. Identifier les SF-MSC à l’aide de la cytométrie en flux.
    1. Digérer la troisième génération (P3) de SF-MSC, centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant et recueillez la pastille de cellule.
      NOTE: Un passage est reconnu comme la sous-culture des cellules vers une autre boîte de culture. Les cellules primaires isolées de SF et ensemencées sur des boîtes sont étiquetées comme passage zéro (P0). À environ 75% de confluence, les cellules sont digérées et détachées des plats, ensemencées sur d’autres plats et étiquetées comme P1.
    2. Ajouter 400 μL de tampon bloquant (1% BSA dans 1x PBS) à la pastille de cellule (5 x 104) et laisser reposer pendant 15 min à température ambiante (RT).
    3. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de 1x PBS.
    4. Ajouter 1 μL d’anticorps fluorescents monoclonaux CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (rapport de dilution de 1:100) (voir le tableau des matières) par tube et incuber à TA pendant 30 min.
    5. Laver deux fois avec 1x PBS et jeter le surnageant. Recueillir la pastille de cellule et la remettre en suspension dans 100 μL de 1x PBS.
    6. Détecter sur un cytomètre en flux jusqu’à 10 000 cellules à l’aide de filtres de 525/50 et 585/40 pour détecter les fluorophores.

2.3D culture cellulaire de bioréacteur

  1. Préparation des microporteurs
    1. Gonfler les 0,75 g secs de microtransporteurs (voir le tableau des matériaux) et hydrater dans 1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) (50 mL/g de microporteurs) pendant au moins 3 h à TA.
    2. Décanter le surnageant et laver les microporteurs pendant 5 min dans du DPBS frais (50 mL/g de microporteurs). Jetez le PBS et remplacez-le par 1x DPBS frais (50 mL/g de microsupports).
    3. Stériliser les microporteurs par autoclavage (121 °C, 15 min, 15 psi). Laissez les microporteurs stérilisés s’installer, décanter le surnageant.
    4. Rincer brièvement les microporteurs dans le milieu de culture (50 mL/g de microporteurs) à TA. Laisser les microporteurs s’installer, jeter le surnageant.
  2. Bioréacteur de perfusion
    1. Stériliser le bioréacteur par autoclavage (121 °C, 15 min, 15 psi).
    2. Compter le nombre de CSF-CSF et allouer 2,5 x 107 CSF-CSF et microporteurs au bioréacteur perfusé avec un milieu de culture MSC de qualité GMP (250 mL).
    3. Placer le bioréacteur dans un incubateur contenant 5% de CO2 à 37 °C. Faire pivoter le bioréacteur à une vitesse de 15 tr/min. Changez le milieu de culture tous les 6 jours.
    4. Recueillir les surnageants de culture cellulaire et les microporteurs pour une analyse plus approfondie après la culture pendant 14 jours.

3. Identification des exosomes et détection de sécurité

  1. Ultracentrifugation
    1. centrifuger le surnageant de culture cellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant; Jetez les débris cellulaires.
    2. Centrifuger les surnageants à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant; jeter les plus grandes vésicules (corps apoptotiques et certaines microvésicules plus grandes).
    3. Centrifuger à nouveau le surnageant à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour enlever les vésicules plus grosses; recueillir les granulés et les remettre en suspension dans 40 ml de 1x PBS.
    4. Centrifuger les pastilles en suspension à 120 000 x g pendant 70 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles contenant des exosomes dans 500 μL de 1x PBS.
  2. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
    REMARQUE : Pour chaque passage, 500 μL de l’échantillon ont été injectés dans la chambre à un débit de 30 μL/min. Effectuer l’analyse à 24,4 °C-24,5 °C.
    1. Diluer les échantillons d’exosomes fraîchement isolés avec 1x PBS stérile à 1 mL contenant 107-10 9 /mL de particules et les injecter dans le système d’analyse de suivi des nanoparticules (voir le tableau des matériaux).
    2. Réglez manuellement le système de capture et d’analyse selon le protocole du fabricant. Visualisez les particules par diffusion laser de la lumière et capturez leur mouvement brownien sur vidéo numérique.
    3. Analysez les bandes vidéo enregistrées à l’aide d’un logiciel (voir le tableau des matériaux) en suivant au moins 200 particules individuelles par exécution.
  3. Microscopie électronique à transmission
    1. Fixer les exosomes dans 4% de paraformaldéhyde (dans froid 1x DPBS) pendant 5 min.
    2. Monter 5 μL des exosomes sur des grilles de cuivre. Dans cette expérience, la concentration d’exosomes est de 1 mg/mL quantifiée par un kit de dosage des protéines (voir Tableau des matériaux).
    3. Incorporer les exosomes dans de l’acide phosphotungstique à 3% pendant 10 minutes sur de la glace. Retirer l’excès d’acide et sécher les échantillons à TA.
    4. Imager les échantillons d’exosomes par un TEM à une tension d’accélération de 100 kV.
  4. Western blotting
    1. Ajouter 300 μL de tampon de lyse (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) et cocktail d’inhibiteurs de protéase (voir Tableau des matériaux) aux exosomes.
    2. Mélangez les exosomes dans le tampon de lyse en pipetant de haut en bas et laissez-le reposer sur la glace pendant 20 minutes.
    3. Centrifuger le mélange à 9 391 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant. Mesurer la concentration en protéines à l’aide d’une trousse d’analyse des protéines (voir le tableau des matériaux).
    4. Ajouter 100 μL de tampon de charge protéique 4x et chauffer à 100 °C pendant 10 min.
    5. Charge de 15 μL de protéines à une concentration de 10 mg/mL et fonctionnement par électrophorèse sur gel (120 V, 70 min) et électrobuvardage à 100 V, 60 min à 4 °C.
    6. Détecter les marqueurs non spécifiques aux exosomes (calnexine) et les biomarqueurs exosomiques (CD9, CD63 et CD81) par transfert Western fluorescent (voir le tableau des matériaux).
  5. Test de sécurité
    1. Pour la détection des bactéries, des champignons et de Mycobacterium tuberculosis , suivez les étapes 3.5.2 à 3.5.5.
    2. Ensemencer 100 μL de la solution d’exosomes (1 mg/mL) sur une plaque de culture de gélose au sang (voir le tableau des matières) et incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 24 h.
    3. Ensemencer 100 μL de la solution d’exosomes (1 mg/mL) sur une plaque de sabouraud gélose moyenne (voir tableau des matières) et incuber à 35 °C pendant 48 h.
    4. Ensemencer 100 μL de la solution d’exosomes (1 mg/mL) sur une plaque de milieu de culture Lowenstein-Jensen (voir le tableau des matières) et incuber à 37 °C pendant 3 semaines.
    5. Détecter l’apparition de bactéries, de champignons et de colonies de Mycobacterium tuberculosis par observation macroscopique.
      NOTE: Les critères d’évaluation de l’innocuité des exosomes sont l’absence de micro-organismes sur la plaque de culture.
    6. Pour la détection des mycoplasmes, suivez les étapes 3.5.7 à 3.5.9.
    7. Resuspendre les exosomes dans 50 μL de solution tampon incluse dans le kit et chauffer à 95 °C pendant 3 min.
    8. Amplifier le mycoplasme dans une solution d’exosomes à l’aide d’un kit de détection de mycoplasmes PCR (voir le tableau des matériaux).
    9. Détecter les produits PCR sur électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5% (30 min, 120 V).

4. Détection in vitro de la fonction exosome

  1. Marquage des exosomes
    1. Étiqueter 100 μL d’exosomes (1 mg/mL) avec 1 mM Dil (1000x) (voir le tableau des matières) et incuber à TA pendant 30 min.
    2. Récupérer les exosomes par ultracentrifugation à 100 000 x g pendant 70 min. Remettez la pastille en suspension dans 500 μL de 1x PBS.
  2. Chargement de mimères Cy3-miR-140 dans des exosomes
    1. Mélanger 1 μg/μL de protéine exosomale et 5 μmol/mL de Cy3-miR-140 dans un volume final de 400 μL de tampon d’électroporation (1,15 mM de phosphate de potassium (pH 7,2), 25 mM de chlorure de potassium et 21 % (v/v) (voir le tableau des matières).
    2. Transférer le mélange dans des cuvettes d’électroporation froides de 0,4 cm et électropoter à une capacité de 300 V/100 μF à l’aide d’un système de transfection génique (voir Tableau des matériaux).
    3. Immédiatement après l’électroporation, maintenir le mélange à TA pendant 30 minutes pour s’assurer que la membrane exosomique est complètement restaurée.
    4. Traiter les mélanges avec une unité de RNase A (voir le tableau des matières) pendant 20 minutes pour éliminer les imitations miARN à l’extérieur des exosomes.
    5. Ultracentrifuger le mélange d’exosomes à 120 000 x g pendant 90 min, jeter le surnageant et remettre les exosomes en suspension dans 500 μL de 1x PBS.
  3. Dosage de l’absorption des exosomes
    1. Ensemencer les chondrocytes (1 x 107) dans des boîtes confocales de 35 mm avec 1 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS.
    2. Après 24 h, traiter les chondrocytes avec des exosomes marqués DiI (100 ng / mL) ou des exosomes chargés de cy3-miR-140 (100 ng / mL) pendant 1 h.
    3. Laver avec 1x PBS trois fois, puis étiqueter avec DAPI (10 ng / mL) pendant 10 minutes à TA.
    4. Enregistrer le signal de fluorescence en microscopie confocale à fluorescence à balayage laser (CLSM) à l’aide des filtres appropriés (voir le tableau des matériaux).

5. Analyse statistique

  1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel statistique approprié.
    NOTA : Les données représentatives de chaque figure ont été exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. Le test t de Student a été utilisé pour comparer deux groupes à l’aide d’un logiciel de statistiques. Une ANOVA unidirectionnelle suivie du multiple de Tukey a été réalisée dans le cas de comparaisons entre plusieurs groupes. P valeurs <0,05 (*), <0,01 (**) ou <0,001 (***).

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Representative Results

La cytométrie en flux a été utilisée pour identifier les marqueurs de surface des SF-MSC, selon les critères minimaux pour définir les CSM humaines recommandés par l’International Society for Cellular Therapy14,15. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que les CSF-CSF cultivées dans cette étude répondaient aux critères d’identification des CSM. Ils étaient négatifs pour CD34, CD45 et HLA-DR (inférieurs à 3 %) et positifs pour CD73, CD90 et CD105 (supérieurs à 95 %) (figure 2).

En microscopie inversée, on a remarqué que les SF-MSC prolifèrent sur les microporteurs (Figure 3A). Après que les cellules ont été digérées et lavées de la plaque de culture 2D et des microporteurs de culture 3D, le nombre de cellules a été compté. Par rapport à la culture 2D, la culture 3D a induit le SF-MSC à proliférer plus rapidement à partir de 6 jours (Figure 3B). Les résultats de trois expériences indépendantes ont été présentés.

Pour identifier les exosomes (Exos) des SF-MSC de culture 2D et 3D, les protéines associées aux exosomes (CD63, CD9 et CD81) et les protéines négatives (calnexine) ont été détectées par transfert Western. Les résultats ont révélé que les 2D-Exos et les 3D-Exos expriment CD63, CD9 et CD81, alors qu’ils sont négatifs pour la calnexine (Figure 4A). De plus, le diamètre et la morphologie des exosomes ont été dosés à l’aide de NTA et de MET. L’analyse nanovisuelle a démontré que le diamètre des 2D-Exos (Figure 4B) et des 3D-Exos (Figure 4D) est d’environ 120 nm. L’analyse au microscope électronique à transmission a révélé la morphologie de 2D-Exos et 3D-Exos, montrant des vésicules grossièrement sphéroïdales (Figure 4C,E).

Après culture 3D, la concentration de particules de 30 à 160 nm est de 4,0 x 106 par mL analysée à l’aide de NTA. Cependant, après la culture 2D, la concentration de particules de 30 à 160 nm est de 2,5 x 106 par mL (Figure 5A). Lors du calcul du rendement en protéines exosomiques dans le milieu, la culture 3D a produit plus de protéines exosomiques que la culture 2D (Figure 5B). Ainsi, par rapport à la culture 2D, la culture 3D a considérablement amélioré le rendement des exosomes.

Les exosomes ont d’abord été marqués avec Dil, puis incubés à une concentration de 10 μg / mL avec les chondrocytes pendant 1 h, 2 h et 3 h pour examiner si les exosomes peuvent pénétrer dans les chondrocytes primaires in vitro. Les exosomes marqués par le dil sont entrés dans les chondrocytes primaires, avec un pic observé à 3 h (Figure 6).

Pour détecter la fonction des exosomes en tant que nanoporteurs, les exosomes ont été chargés de miR-140 marqué au Cy3 par électroporation, puis traités avec des chondrocytes à une concentration de 10 μg / mL pendant 3 h. Les résultats ont démontré que les exosomes pouvaient délivrer miR-140 aux chondrocytes (Figure 7). Tous les résultats répondaient aux spécifications; tous les échantillons étaient stériles et négatifs pour Mycoplasma.

Figure 1
Figure 1 : Diagramme schématique des exosomes isolés in vitro des CSM-hSF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Identification des CSF-CSM par cytométrie en flux. La cytométrie en flux montre l’immunophénotype positif ou négatif des CSM-hSF. (A) Marquage avec un anticorps témoin d’isotype IgG1. (B) CD73 est positif et CD34 est négatif. (C) CD90 est positif et CD45 est négatif. (D) CD105 est positif et HLA-DR est négatif, connu sous le nom de marqueurs MSC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Courbe de croissance SF-MSC. (A) Images représentatives montrant des SF-MSC (flèches rouges) sur des microporteuses en microscopie inversée (barre d’échelle = 100 μm). (B) La courbe de croissance de SF-MSC sous culture 2D et 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Identification des exosomes. (A) Résultats du Western blot des 2D-Exos et 3D-Exos. (B) Analyse nanovisuelle du diamètre des 2D-Exos et 3D-Exos. (C) Détection TEM de la morphologie des 2D-Exos et 3D-Exos. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Amélioration du rendement de la production d’exosomes par culture de bioréacteur 3D. (A) Résultats représentatifs de la taille des exosomes analysés par la NTA. (B) Rendement protéique = protéine exosomale (μg)/milieu conditionné (mL). Les graphiques indiquent le rendement pour chaque méthode et la moyenne ± écart-type de toutes les mesures (** p < 0,01). Les comparaisons statistiques ont été effectuées par ANOVA unidirectionnelle avec la correction de Bonferroni post-hoc et par le test t de Student. ** p < 0,01 a été considéré comme une différence significative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 Images représentatives montrant l’internalisation des exosomes marqués par Dil par les chondrocytes primaires. Les chondrocytes ont été incubés avec des exosomes marqués par Dil pendant 1 h, 2 h et 3 h. Les exosomes ont été marqués avec Dil (rouge), et les noyaux ont été marqués avec Hoechst (bleu). Les échantillons ont été détectés à un grossissement de 60x. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Administration in vitro de miR-140 par les exosomes MSC. Après avoir absorbé le miR-140 marqué au Cy3 qui a été encapsulé dans des exosomes dérivés de SF-MSCs, les chondrocytes ont été imagés. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les cellules souches mésenchymateuses ont été largement utilisées en médecine régénérative en raison de leur auto-renouvellement, différenciées en cellules tissulaires ayant des fonctions spécialisées et des effets paracrines16,17. Notamment, les effets paracrines exercés par les exosomes ont attiré beaucoup d’attention18. Les exosomes transportent la bio-information des CSM et remplissent leur fonction biologique et surmontent les lacunes des CSM, telles que le stockage et l’expédition gênants. Ainsi, les exosomes dérivés des CSM ont été utilisés pour des interventions thérapeutiques, qui ont attiré le plus d’attention dans le traitement de l’arthrose.

Actuellement, il existe deux méthodes pour propager les CSM, la culture 2D et la culture tridimensionnelle (3D)19. La culture 2D est un moyen conventionnel de cultiver des CSM pour des études in vitro à faible coût. Cependant, cela prend du temps et son potentiel d’échelle est limité. De plus, la propagation des CSM dans le microenvironnement 2D en déduit rapidement la souche20,21, l’une des caractéristiques les plus critiques des CSM. Ainsi, la culture 2D ne peut pas répondre aux exigences de la thérapie MSC. Dans cette étude, dans le but des SF-MSC dans la thérapie de l’arthrose, nous nous efforçons de maintenir les caractéristiques SF-MSC en utilisant la culture d’un bioréacteur 3D, qui peut imiter plus précisément le microenvironnement biologique. Récemment, d’autres chercheurs ont utilisé des échafaudages ou de la 3D à base de microtransporteurs pour cultiver des CSM. Nous avons constaté que les échafaudages de collagène 3D permettaient plus d’exosomes concentrés produits par les CSM dérivées de la moelle osseuse humaine que la culture2D 23.

Comme les exosomes peuvent effectuer une grande partie de la fonction MSC tout en évitant certaines lacunes des MSC, nous visons à produire des exosomes pour le traitement de l’arthrose. Cette étude a également détecté la fonction de production et de livraison d’exosomes à l’aide de ce système basé sur la grande quantité et la haute qualité de propagation MSC de la culture 3D. Le système de culture cellulaire rotative (RCCS) a été utilisé pour la culture 3D afin de produire des exosomes à partir de la propagation à grande échelle des CSM. Par rapport à la culture de flacon 2D traditionnelle, ce système de culture 3D peut éviter la contamination par des changements répétés de milieu et le passage cellulaire. Plus important encore, cette étude a montré qu’un bioréacteur 3D pouvait améliorer la production d’exosomes pour répondre aux exigences de l’étude clinique. Il convient de noter que les exosomes isolés à partir de surnageants de culture 3D peuvent délivrer des miARN dans les cellules, ce qui suggère que la culture 3D n’interfère pas avec la fonction des exosomes. Les résultats de la détection microbienne et endotoxine confirment que cette étude a établi un protocole qui pourrait produire des exosomes, qui sont biologiquement sûrs et prometteurs pour le traitement de l’arthrose. À l’heure actuelle, la quantité d’exosomes produite dans cette étude ne peut satisfaire les besoins commerciaux. Par conséquent, des stratégies pour une énorme quantité de production d’exosomes doivent être développées.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81972116, n° 81972085, n° 81772394); Programme clé de la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (n ° 2018B0303110003); Projet de coopération internationale du Guangdong (No.2021A0505030011); Projets scientifiques et technologiques de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Fondation chinoise des sciences postdoctorales (No.2020M682907); Fondation pour la recherche fondamentale et appliquée du Guangdong (n° 2021A1515010985); Projet Sanming de médecine à Shenzhen (SZSM201612079); Fonds spéciaux pour la construction d’hôpitaux de haut niveau dans la province du Guangdong.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCA assay kit ThermoFisher 23227 Protein concentration assay
Blood agar plate Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. P0903 Bacteria culture
CD105 antibody Elabscience E-AB-F1243C Flow cytometry
CD34 antibody Elabscience E-AB-F1143C Flow cytometry
CD45 antibody BD Bioscience 555483 Flow cytometry
CD63 antibody Abclonal  A5271 Western blotting
CD73 antibody Elabscience E-AB-F1242C Flow cytometry
CD81 antibody ABclonal  A5270 Western blotting
CD9 antibody Abclonal  A1703 Western blotting
CD90 antibody Elabscience E-AB-F1167C Flow cytometry
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5810R
CO2 incubator Thermo Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy ZEISS LSM 800
Cytodex GE Healthcare Microcarrier
Dil ThermoFisher D1556 Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit BI 20-700-20 Mycoplasma detection
Flowcytometry Beckman MSC identification
Gene Pulser II System Bio-Rad Laboratories 1652660 Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2 GraphPad Software, Inc. Version 8.0.2
HLA-DR antibody Elabscience E-AB-F1111C Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. T0573 Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro StemRD MGro-500 MSC culture
Nanosight NS300 Malvern Nanosight NS300 Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software Malvern Data analysis
Odyssey FC Gene Company Limited Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer Sigma D3911 Gene transfection
Protease inhibitors cocktail Sigma P8340 Proteinase inhibitor
RNase A Qiagen 158924 Removal of RNA
Sabouraud agar plate Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. P0919 Fungi culture
TEM JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-4HD 3D culture
Ultracentrifuge Beckman Optima XPN-100 Exosome centrifuge

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References

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Biologie numéro 185 exosome liquide synovial cellules souches mésenchymateuses culture 3D
Préparation à grande échelle d’exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial par culture de bioréacteur 3D
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Duan, L., Li, X., Xu, X., Xu, L.,… More

Duan, L., Li, X., Xu, X., Xu, L., Wang, D., Ouyang, K., Liang, Y. Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture. J. Vis. Exp. (185), e62221, doi:10.3791/62221 (2022).

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