Summary
Burada, bir 3D biyoreaktör kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden çok sayıda GMP sınıfı eksozom üretmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) tarafından salgılanan eksozomlar, kıkırdak yaralanmaları ve osteoartrit tedavisi için umut verici adaylar olarak önerilmiştir. Klinik uygulama için eksozomlar büyük ölçekli üretim gerektirir. Bu amaçla, insan sinovyal sıvı MSC'leri (hSF-MSC'ler) mikro taşıyıcı boncuklar üzerinde yetiştirildi ve daha sonra dinamik üç boyutlu (3D) bir kültür sisteminde kültürlendi. 3D dinamik kültürü kullanarak, bu protokol SF-MSC kültür süpernatantlarından büyük ölçekli eksozomları başarıyla elde etti. Eksozomlar ultrasantrifüjleme ile toplandı ve bir iletim elektron mikroskobu, nanopartikül iletim testi ve batı lekelenmesi ile doğrulandı. Ayrıca, eksozomların mikrobiyolojik güvenliği tespit edildi. Eksozom tespitinin sonuçları, bu yaklaşımın çok sayıda iyi üretim uygulamaları (GMP) sınıfı eksozom üretebileceğini düşündürmektedir. Bu eksozomlar ekzozom biyolojisi araştırmalarında ve klinik osteoartrit tedavisinde kullanılabilir.
Introduction
Eklem kıkırdağı ve altta yatan kemik parçalanmasından kaynaklanan osteoartrit (OA), sakatlığa yol açan ciddi bir zorluk olmaya devam etmektedir 1,2. Kan ve sinir kaynağı olmadan, kıkırdak kendi kendini iyileştirme yeteneği bir kez yaralandığında minimumdur 3,4. Son yıllarda, otolog kondrosit implantasyonuna (ACI) dayalı tedaviler OA tedavisinde bazı ilerlemeler kaydetmiştir5. Kondrosit izolasyonu ve genişlemesi için, OA ekleminin ağırlık taşımayan alanından küçük kıkırdak toplanması gereklidir ve bu da kıkırdakta yaralanmalara neden olur. Ayrıca, prosedür genişletilmiş kondrositleri implante etmek için ikinci bir operasyon gerektirecektir6. Bu nedenle, kıkırdak yaralanmaları olmadan OA tedavisi için tek aşamalı tedaviler kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır.
Mezenkimal kök hücreler (MSC) OA tedavisinde umut verici alternatifler olarak önerilmiştir 7,8. Birden fazla dokudan kaynaklanan MSC'ler, spesifik stimülasyonla kondrositlere farklılaşabilir. Önemli olarak, MSC'ler anti-inflamasyon9 yoluyla bağışıklık tepkilerini modüle edebilir. Bu nedenle MSC'ler OA tedavisinde kıkırdak defektlerini onararak ve özellikle inflamasyon ortamında immün yanıtı modüle ederek önemli avantajlar sağlamaktadır. OA tedavisi için, sinovyal sıvıdan (SF-MSC'ler) MSC'ler, diğer MSC kaynaklarından daha güçlü kondrosit farklılaşma yetenekleri nedeniyle son zamanlarda çok dikkat çekmiştir10,11. Özellikle, ortopedik klinikte, eklem boşluğundan enflamatuar SF'nin çıkarılması, OA hastalarının ağrı semptomunu hafifletmek için rutin bir tedavidir. Ekstrakte edilen inflamatuar SF genellikle tıbbi atık olarak bertaraf edilir. Hem hastalar hem de doktorlar, inflamatuar SF'den izole edilen otolog MSC'leri çok az etik çatışma ile OA tedavisi olarak düşünmeye hazırdır. Bununla birlikte, SF-MSC tedavisi tümörojenik riskler, uzun süreli depolama ve uzak sevkiyat engelleri nedeniyle tehlikeye girmektedir.
MSC'ler de dahil olmak üzere birçok hücre tipi tarafından salgılanan eksozomlar, ana hücre biyo-bilgisinin çoğunu taşır. Hücresiz tedavi olarak derinlemesine araştırılmıştır12,13. Klinik araştırma hükümeti (ClinicalTrials.gov) web sitesinde bulunan güncellenmiş kaynaklara göre, kanser, hipertansiyon ve nöro-dejeneratif hastalıkların araştırma alanlarında daha kapsamlı eksozom klinik çalışmaları başlatılmakta ve üstlenilmektedir. SF-MSC eksozom tedavisi, OA ile başa çıkmak için heyecan verici ve zorlu bir çalışma olabilir. İyi üretim uygulamaları (GMP) sınıfı ve büyük ölçekli eksozom üretimi klinik çeviri için gereklidir. Küçük ölçekli eksozom izolasyonu, iki boyutlu (2D) hücre kültürüne dayanarak yaygın olarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, büyük ölçekli eksozom üretim stratejilerinin optimizasyona ihtiyacı vardır. Bu çalışmada, ksenosuz koşullarda masif SF-MSC kültürüne dayanan büyük ölçekli bir eksozom üretim yöntemi geliştirilmiştir. Hücre kültürü süpernatantlarından ultrasantrifüjlemeden sonra, eksozom güvenliği ve fonksiyonu doğrulandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma Shenzhen İkinci Halk Hastanesi İnsan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. hSF-MSC'lerden izole edilen eksozomların şematik diyagramı in vitro protokolde Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. İnsan SF-MSC'lerinin kültürü ve tanımlanması
- Klinik OA hastalarından bir şırınga ve iğne kullanarak 20 mL SF hasat edin.
- OA hastasının diz eklemini dezenfekte edin. Kuadriseps femoris tendonundan patellanın dışından 7 # iğne ile eklem boşluğuna delinme.
- Eklem sıvısının 10 mL'sini çıkarın. Delinme bölgesini transfüzyon çubuğu ile örtün ve 5 dakika boyunca bastırın.
- SF süpernatantını 1.500 x g'de santrifüjlemeden sonra 4 °C'de 10 dakika boyunca atın.
- Hücre peletini 10 mL 1x fosfat tampon salin (PBS) ile yeniden askıya alın, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın ve PBS'yi atın.
- Peleti 10 mL insan MSC kültür ortamı ile 5 x 104 hücre/mL hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından süspansiyonu 100 mm'lik bir tabakta plakalayın.
- Çanağı% 5 CO 2 içeren bir atmosferde 37 ° C'deinkübe edin.
- 48 saat sonra, ortamı değiştirerek yapışkan olmayan hücreleri çıkarın ve 1x PBS ile yıkayın. Ortamı 2 hafta boyunca her 3 günde bir değiştirin.
- Hücre kültürü süpernatantlarını toplayın.
- Akış sitometrisini kullanarak SF-MSC'leri tanımlayın.
- SF-MSC'lerin üçüncü neslini (P3) sindirin, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletini toplayın.
NOT: Bir pasaj, hücrelerin başka bir kültür kabına alt kültürü olarak kabul edilir. SF'den izole edilen ve bulaşıklara tohumlanan birincil hücreler geçiş sıfırı (P0) olarak etiketlenir. Yaklaşık% 75 birleşmede, hücreler sindirilir ve bulaşıklardan ayrılır, diğer yemeklere ekilir ve P1 olarak etiketlenir. - Hücre peletine (5 x 104) 400 μL bloke tampon (1x PBS'de% 1 BSA) ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika bekletin.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın, süpernatanı atın ve peleti 100 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.
- Tüp başına 1 μL CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR monoklonal floresan antikoru (seyreltme oranı 1:100) ekleyin ( bakınız Malzeme Tablosu) ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
- 1x PBS ile iki kez yıkayın ve süpernatanı atın. Hücre peletini toplayın ve 100 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.
- Floroforları tespit etmek için 525/50 ve 585/40 filtrelerini kullanarak bir akış sitometresinde 10.000 hücreye kadar tespit edin.
- SF-MSC'lerin üçüncü neslini (P3) sindirin, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletini toplayın.
2.3D biyoreaktör hücre kültürü
- Mikrotaşıyıcı hazırlama
- Kuru 0.75 g mikrotaşıyıcıyı şişirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve RT'de en az 3 saat boyunca 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) (50 mL / g mikrotaşıyıcı) içinde nemlendirin.
- Süpernatantı boşaltın ve mikro taşıyıcıları taze DPBS'de (50 mL / g mikro taşıyıcılar) 5 dakika boyunca yıkayın. PBS'yi atın ve yeni 1x DPBS (50 mL/g mikro taşıyıcı) ile değiştirin.
- Mikrotaşıyıcıları otoklavlama ile sterilize edin (121 °C, 15 dk, 15 psi). Sterilize edilmiş mikro taşıyıcıların yerleşmesine izin verin, süpernatanı boşaltın.
- Mikro taşıyıcıları RT'de kültür ortamında (50 mL / g mikro taşıyıcılar) kısaca durulayın. mikro taşıyıcıların yerleşmesine izin verin, süpernatanı atın.
- Perfüzyon biyoreaktörü
- Biyoreaktörü otoklavlama ile sterilize edin (121 °C, 15 dk, 15 psi).
- SF-MSC'lerin sayısını sayın ve GMP sınıfı MSC kültür ortamı (250 mL) ile perfüze edilen biyoreaktöre 2,5 x 107 SF-MSC ve mikro taşıyıcı tahsis edin.
- Biyoreaktörü 37 °C'de %5 CO2 olan bir inkübatöre koyun. Biyoreaktörü 15 rpm hızında döndürün. Kültür ortamını her 6 günde bir değiştirin.
- 14 gün boyunca kültürden sonra daha fazla analiz için hücre kültürü süpernatantlarını ve mikro taşıyıcılarını toplayın.
3. Eksozom tanımlama ve güvenlik tespiti
- Ultrasantrifüjleme
- Hücre kültürü süpernatantını 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı toplayın; hücresel kalıntıları atın.
- Süpernatantları 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı toplayın; daha büyük vezikülleri (apoptotik cisimler ve bazı daha büyük mikro-parçacıklar) atın.
- Daha büyük vezikülleri çıkarmak için süpernatantı 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10.000 x g'de tekrar santrifüj yapın; peletleri toplayın ve 40 mL 1x PBS'de askıya alın.
- Askıya alınmış peletleri 4 ° C'de 70 dakika boyunca 120.000 x g'de santrifüj edin, süpernatanı atın ve eksozom içeren peletleri 500 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.
- Nanopartikül izleme analizi (NTA)
NOT: Her çalıştırma için, numunenin 500 μL'si odaya 30 μL/dak akış hızında enjekte edildi. Analizi 24,4 °C-24,5 °C'de gerçekleştirin.- Yeni izole edilmiş eksozom numunelerini, 107-10 9 / mL parçacık içeren steril 1x PBS ila 1 mL ile seyreltin ve bunları nanopartikül izleme analiz sistemine enjekte edin (bkz.
- Yakalama ve analiz sistemini üreticinin protokolüne göre manuel olarak ayarlayın. Lazer ışık saçılmasıyla parçacıkları görselleştirin ve dijital videoda Brownian hareketlerini yakalayın.
- Kaydedilen video kasetleri, çalışma başına en az 200 ayrı parçacığı izlemeye dayalı olarak yazılım kullanarak analiz edin (bkz.
- Transmisyon elektron mikroskobu
- Eksozomları 5 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (soğuk 1x DPBS içinde) içinde sabitleyin.
- Eksozomların 5 μL'sini bakır ızgaralara monte edin. Bu deneyde, eksozomların konsantrasyonu bir protein tahlil kiti tarafından ölçülen 1 mg / mL'dir (bakınız Malzeme Tablosu).
- Eksozomları buz üzerinde 10 dakika boyunca% 3 fosfotungstik asit içine yerleştirin. Fazla asidi çıkarın ve numuneleri RT'de kurutun.
- Eksozom örneklerini 100 kV'luk bir hızlanma voltajında bir TEM ile görüntüleyin.
- Batı lekelenmesi
- Eksozomlara 300 μL lizis tamponu (%1 Triton X-100, %0,1 SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) ve proteaz inhibitörleri kokteyli (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
- Lizis tamponundaki eksozomları yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve 20 dakika boyunca buz üzerinde durmasına izin verin.
- Karışımı 4 ° C'de 10 dakika boyunca 9.391 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı toplayın. Bir protein tahlil kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün (bakınız Malzeme Tablosu).
- 100 μL 4x protein yükleme tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca 100 ° C'de ısıtın.
- 10 mg / mL'lik bir konsantrasyonda 15 μL protein yükleyin ve jel elektroforezi (120 V, 70 dakika) ve 100 V'da elektroblotlama ile çalıştırın, 4 ° C'de 60 dakika.
- Eksozom-spesifik olmayan belirteçleri (kalneksin) ve ekzozomal biyobelirteçleri (CD9, CD63 ve CD81) floresan batı lekelemesi ile tespit edin (bkz.
- Güvenlik testi
- Bakteri, mantar ve Mycobacterium tuberculosis tespiti için 3.5.2-3.5.5 adımlarını izleyin.
- Bir kan agar kültür plakası üzerinde eksozom çözeltisinin (1 mg / mL) 100 μL'sini tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kültür plakasını 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Bir sabouraud agar orta plaka üzerinde eksozom çözeltisinin (1 mg / mL) 100 μL'sini tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 48 saat boyunca 35 ° C'de inkübe edin.
- Bir Lowenstein-Jensen kültürü orta plakası üzerinde eksozom çözeltisinin (1 mg / mL) 100 μL'sini tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3 hafta boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Makroskopik gözlem ile bakteri, mantar ve Mycobacterium tuberculosis kolonilerinin görünümünü tespit edin.
NOT: Eksozomların güvenliğini değerlendirme kriterleri, kültür plakasında mikroorganizmaların bulunmamasıdır. - Mikoplazma algılaması için 3.5.7-3.5.9 arasındaki adımları izleyin.
- Eksozomları kitte bulunan 50 μL tampon çözeltisinde yeniden askıya alın ve 3 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın.
- Bir PCR Mycoplasma tespit kiti kullanarak eksozom çözeltisindeki Mycoplasma'yı yükseltin (bakınız Malzeme Tablosu).
- PCR ürünlerini %1,5 agaroz jel elektroforezinde (30 dk, 120 V) tespit edin.
4. In vitro eksozom fonksiyon tespiti
- Eksozom etiketleme
- 100 μL eksozomları (1 mg/mL) 1 mM Dil (1000x) ile etiketleyin ( bakınız Malzeme Tablosu) ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Eksozomları 70 dakika boyunca 100.000 x g'de ultrasantrifüjleme ile geri kazanın. Peleti 500 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.
- Cy3-miR-140 taklitlerinin eksozomlara yüklenmesi
- 1 μg/μL ekzozomal protein ve 5 μmol/mL Cy3-miR-140'ı 400 μL elektroporasyon tamponunun (1.15 mM potasyum fosfat (pH 7.2), 25 mM potasyum klorür ve% 21'inin (v/v) son hacminde karıştırın (bkz.
- Karışımı soğuk 0,4 cm elektroporasyon küvetlerine ve bir gen transfeksiyon sistemi kullanarak 300 V / 100 μF kapasitansta elektroporata aktarın (bkz.
- Elektroporasyondan hemen sonra, eksozom membranının tamamen restore edildiğinden emin olmak için karışımı RT'de 30 dakika tutun.
- Eksozomların dışındaki miRNA taklitlerini ortadan kaldırmak için karışımları bir birim RNaz A ile ( Malzeme Tablosuna bakınız) 20 dakika boyunca tedavi edin.
- Eksozom karışımını 90 dakika boyunca 120.000 x g'de ultracentrifugate, süpernatantı atın ve eksozomları 500 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.
- Eksozom alım testi
- Kondrositleri (1 x 107) 35 mm konfokal kaplarda% 10 FBS içeren 1 mL DMEM / F12 ile tohumlayın.
- 24 saatten sonra, kondrositleri 1 saat boyunca DiI etiketli eksozomlarla (100 ng / mL) veya cy3-miR-140 yüklü eksozomlarla (100 ng / mL) tedavi edin.
- 1x PBS ile üç kez yıkayın ve ardından RT'de 10 dakika boyunca DAPI (10 ng/mL) ile etiketleyin.
- Floresan sinyalini uygun filtreleri kullanarak konfokal lazer taramalı floresan mikroskobuna (CLSM) kaydedin (bkz.
5. İstatistiksel analiz
- Uygun istatistiksel yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın.
NOT: Her bir şekildeki temsili veriler, SD ± ortalaması olarak ifade edilmiştir. İstatistik yazılımı kullanılarak iki grubun karşılaştırılmasında Student t-testi kullanılmıştır. Birden fazla grup arasında karşılaştırma yapılması durumunda Tukey'in multiplini takip eden tek yönlü bir ANOVA gerçekleştirildi. P değerleri <0,05 (*), <0,01 (**) veya <0,001 (***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SF-MSC'lerin yüzey belirteçlerini tanımlamak için akım sitometrisi, Uluslararası Hücresel Terapi Derneği14,15 tarafından önerilen insan MSC'lerini tanımlamak için minimum kriterlere göre kullanılmıştır. Akım sitometri analizi, bu çalışmada kültüre alınan SF-MSC'lerin MSC'lerin tanımlama kriterlerini karşıladığını ortaya koymuştur. CD34, CD45 ve HLA-DR (%3'ün altında) için negatif ve CD73, CD90 ve CD105 (%95'in üzerinde) için pozitifti (Şekil 2).
Ters mikroskopi altında, SF-MSC'lerin mikrotaşıyıcılar üzerinde çoğaldığı fark edildi (Şekil 3A). Hücreler sindirildikten ve 2D kültür plakasından ve 3D kültür mikro taşıyıcılarından yıkandıktan sonra, hücre sayısı sayıldı. 2D kültürle karşılaştırıldığında, 3D kültür SF-MSC'nin 6 günden itibaren daha hızlı çoğalmasını sağlamıştır (Şekil 3B). Üç bağımsız deneyin sonuçları sunulmuştur.
2D ve 3D kültürün SF-MSC'lerinden eksozomları (Exos) tanımlamak için, eksozom ile ilişkili proteinler (CD63, CD9 ve CD81) ve negatif protein (calnexin) batı lekelenmesi kullanılarak tespit edildi. Sonuçlar, 2D-Exos ve 3D-Exos'un CD63, CD9 ve CD81'i eksprese ettiğini, ancak kalneksin için negatif olduklarını ortaya koymuştur (Şekil 4A). Ayrıca eksozom çapı ve morfolojisi NTA ve TEM kullanılarak test edildi. Nanosight analizi, 2D-Exos (Şekil 4B) ve 3D-Exos (Şekil 4D) çapının yaklaşık 120 nm olduğunu göstermiştir. İletim elektronik mikroskop analizi, kabaca küresel vezikülleri gösteren 2D-Exos ve 3D-Exos'un morfolojisini ortaya koymuştur (Şekil 4C, E).
3D kültürden sonra, 30-160 nm boyutlu parçacıkların parçacık konsantrasyonu, NTA kullanılarak analiz edilen mL başına 4.0 x 106'dır . Bununla birlikte, 2D kültürden sonra, 30-160 nm parçacıkların parçacık konsantrasyonu mL başına 2.5 x 106'dır (Şekil 5A). Ortamdaki eksozom protein verimini hesaplarken, 3D kültür, 2D kültürden daha fazla eksozom proteini üretti (Şekil 5B). Böylece, 2D kültürle karşılaştırıldığında, 3D kültür eksozom verimini önemli ölçüde artırdı.
Eksozomlar ilk önce Dil ile etiketlendi ve daha sonra eksozomların in vitro primer kondrositlere girip giremeyeceğini incelemek için 1 saat, 2 saat ve 3 saat boyunca kondrositlerle 10 μg / mL'lik bir konsantrasyonda inkübe edildi. Dil-etiketli eksozomlar primer kondrositlere girdi ve zirve 3 saatte görüldü (Şekil 6).
Eksozomların nanotaşıyıcılar olarak işlevini tespit etmek için, eksozomlar elektroporasyon yoluyla Cy3 etiketli miR-140 ile yüklendi ve daha sonra 3 saat boyunca 10 μg / mL'lik bir konsantrasyonda kondrositlerle muamele edildi. Sonuçlar, eksozomların miR-140'ı kondrositlere verebileceğini göstermiştir (Şekil 7). Tüm sonuçlar spesifikasyonları karşıladı; tüm örnekler steril ve Mikoplazma için negatifti.
Şekil 1: in vitro hSF-MSC'lerden izole edilen eksozomların şematik diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SF-MSC'lerin akış sitometrisi ile tanımlanması. Akım sitometrisi, hSF-MSC'lerin pozitif veya negatif immünofenotipini gösterir. (A) Bir IgG1 izotip kontrol antikoru ile etiketleme. (B) CD73 pozitiftir ve CD34 negatiftir. (C) CD90 pozitiftir ve CD45 negatiftir. (D) CD105 pozitiftir ve HLA-DR negatiftir, MSC belirteçleri olarak bilinir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: SF-MSC büyüme eğrisi. (A) Ters mikroskopi altında mikro taşıyıcılar üzerinde SF-MSC'leri (kırmızı oklar) gösteren temsili görüntüler (ölçek çubuğu = 100 μm). (B) SF-MSC'nin 2D ve 3D kültürü altındaki büyüme eğrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Eksozomların tanımlanması . (A) 2D-Exos ve 3D-Exos'un Batı lekelenme sonuçları. (B) 2D-Exos ve 3D-Exos çapının nanosight analizi. (C) 2D-Exos ve 3D-Exos morfolojisinin TEM tespiti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 3D biyoreaktör kültürü ile eksozom üretiminin artmış verimi . (A) NTA tarafından analiz edilen eksozom boyutunun temsili sonuçları. (B) Protein verimi = ekzozomal protein (μg)/şartlandırılmış ortam (mL). Grafikler her yöntemin verimini ve tüm ölçümlerin ortalama ± SD'sini gösterir (** p < 0.01). İstatistiksel karşılaştırmalar, post-hoc Bonferroni'nin düzeltmesi ve Student'ın t-testi ile tek yönlü ANOVA ile yapıldı. ** p < 0.01 anlamlı bir fark olarak kabul edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6 Dil etiketli eksozomların primer kondrositler tarafından içselleştirilmesini gösteren temsili görüntüler. Kondrositler 1 saat, 2 saat ve 3 saat boyunca Dil-etiketli eksozomlarla inkübe edildi. Eksozomlar Dil (kırmızı) ile etiketlendi ve çekirdekler Hoechst (mavi) ile etiketlendi. Örnekler 60x büyütmede tespit edildi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: MSC eksozomları ile miR-140'ın in vitro olarak verilmesi. SF-MSC'lerden türetilmiş eksozomlarda kapsüllenen Cy3 etiketli miR-140'ı aldıktan sonra, kondrositler görüntülendi. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mezenkimal kök hücreler, kendini yenilemeleri, özel fonksiyonlara sahip doku hücrelerine farklılaşmaları ve parakrin etkileri nedeniyle rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılmaktadır16,17. Özellikle, eksozomlar tarafından uygulanan parakrin etkiler çok dikkat çekmiştir18. Eksozomlar, MSC'lerin biyo-bilgilerini taşır ve biyolojik işlevlerini yerine getirir ve zahmetli depolama ve sevkiyat gibi MSC eksikliklerinin üstesinden gelir. Bu nedenle, MSC'lerden türetilen eksozomlar, OA terapisinde en çok dikkat çeken terapötik müdahaleler için kullanılmıştır.
Şu anda, MSC'leri yaymak için iki yöntem vardır: 2B kültür ve üç boyutlu (3B) kültür19. 2D kültür, düşük maliyetlerle in vitro çalışmalar için MSC'leri kültürlemenin geleneksel bir yoludur. Bununla birlikte, zaman alıcıdır ve ölçek potansiyeli sınırlıdır. Ayrıca, 2D mikro ortamdaki MSC yayılımı, MSC'lerin en kritik özelliklerinden biri olan 20,21 sapını hızla çıkarır. Bu nedenle, 2D kültürü MSC tedavisinin gerekliliklerini yerine getiremez. Bu çalışmada, OA terapisinde SF-MSC'lerin amacına uygun olarak, biyolojik mikro çevreyi daha doğru bir şekilde taklit edebilen bir 3D biyoreaktörün kültürünü kullanarak SF-MSC özelliklerini korumaya çalışıyoruz. Son zamanlarda, diğer araştırmacılar MSC'leri kültüre almak için iskeleler veya mikrotaşıyıcı tabanlı 3D kullandılar. 3D kollajen iskelelerinin, insan kemik iliği kaynaklı MSC'ler tarafından üretilen daha konsantre eksozomlara 2D kültür23'ten daha fazla izin verdiğini bulduk.
Eksozomlar, MSC'lerin bazı eksikliklerinden kaçınırken MSC fonksiyonunun büyük bir bölümünü yerine getirebildiğinden, OA tedavisi için eksozomlar üretmeyi amaçlıyoruz. Bu çalışma ayrıca, 3D kültürün MSC yayılımının büyük miktarına ve yüksek kalitesine dayanan bu sistemi kullanarak eksozom üretim ve dağıtım fonksiyonunu tespit etti. Döner Hücre Kültürü Sistemi (RCCS), büyük ölçekli MSC yayılımından eksozomlar üretmek için 3D kültür için kullanıldı. Geleneksel 2D şişe kültürüyle karşılaştırıldığında, bu 3D kültür sistemi, tekrarlanan ortam değişiminden ve hücre geçişinden kaynaklanan kontaminasyonu önleyebilir. Daha da önemlisi, bu çalışma bir 3D biyoreaktörün klinik çalışma gereksinimlerini karşılamak için eksozom üretimini artırabileceğini göstermiştir. Not olarak, 3D kültür süpernatantlarından izole edilen eksozomlar, miRNA'ları hücrelere iletebilir, bu da 3D kültürün eksozom fonksiyonuna müdahale etmediğini düşündürür. Mikrobiyal ve endotoksin tespiti sonuçları, bu çalışmanın biyolojik olarak güvenli ve OA tedavisi için umut verici olan eksozomlar üretebilecek bir protokol oluşturduğunu daha da desteklemektedir. Şu anda, bu çalışmada üretilen eksozom miktarı ticari ihtiyaçları karşılayamamaktadır. Bu nedenle, muazzam miktarda eksozom üretimi için stratejilerin geliştirilmesi gerekmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81972116, No. 81972085, No. 81772394); Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı Anahtar Programı (No.2018B0303110003); Guangdong Uluslararası İşbirliği Projesi (No.2021A0505030011); Shenzhen Bilim ve Teknoloji Projeleri (Hayır. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (No.2020M682907); Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (No.2021A1515010985); Shenzhen'de Sanming Tıp Projesi (SZSM201612079); Guangdong Eyaletinde Üst Düzey Hastanelerin İnşaatı için Özel Fonlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
- Cross, M., et al. The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive. Science. 338 (6109), 917-921 (2012).
- Lu, J., et al. Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration. Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).
- Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI. American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).
- Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future. Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).
- McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).
- Jo, C. H., et al. Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial. Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).
- Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives. Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).
- Neybecker, P., et al. In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329 (2018).
- Jia, Z., et al. Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).
- Phinney, D. G., Pittenger, M. F. Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).
- Phan, J., et al. Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236 (2018).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Lv, F. -J., et al. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).
- Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), (2019).
- Zhang, G., et al. Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model. Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).
- Zhou, P., et al. Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).
- Zhang, Y., et al. Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury. Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).
- Cao, J., et al. Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206 (2020).
