Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/62228
Automatic Translation
1, 1, 1
1Ocular Genomics Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

Summary

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

Abstract

הפרעות עיניים משפיעות על מיליוני אנשים ברחבי העולם, אבל הזמינות המוגבלת של רקמות אנושיות מעכבת את המחקר שלהם. מודלים עכבר הם כלים רבי עוצמה כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות עיניים בגלל הדמיון שלהם עם אנטומיה אנושית ופיזיולוגיה. שינויים באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), כולל שינויים במורפולוגיה ובתפקוד, הם תכונות נפוצות המשותפות להפרעות עיניים רבות. עם זאת, בידוד ותרבות מוצלחים של תאי RPE של העכבר הראשי הוא מאתגר מאוד. מאמר זה הוא גרסה אורקולית מעודכנת של הפרוטוקול שפורסם בעבר על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 2016 כדי לבודד ביעילות ותרבות תאי RPE העכבר הראשי. שיטה זו היא מאוד לשחזור ותוצאות תרבויות חזקות של מונוליירים RPE מקוטב מאוד פיגמנטים שניתן לשמור במשך מספר שבועות על Transwells. מודל זה פותח אפיקים חדשים לחקר המנגנונים המולקולריים והתאית שבבסיס מחלות עיניים. יתר על כן, הוא מספק פלטפורמה לבדיקת גישות טיפוליות שניתן להשתמש בהן לטיפול במחלות עיניים חשובות עם צרכים רפואיים בלתי פוסקים, כולל הפרעות רשתית תורשתיות וניוונות מקולריים.

Introduction

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות עכבר רשתית פיגמנט תאים (RPE), אשר יוצרים מונולאייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על צלחות Transwell. RPE הוא מונולייר הממוקם בעין בין הרשתית העצבית לקרום של ברוך. שכבה אחת זו מורכבת מתאי אפיתל מקוטבים ופיגמנטיים מאוד אליהם מצטרפים צמתים הדוקים, המציגים צורה משושה הדומה חלת דבש2. למרות הפשטות ההיסטולוגית לכאורה, RPE מבצע מגוון רחב של פונקציות קריטיות הרשתית ואת מחזור הראייה הרגיל2,3,4. הפונקציות העיקריות של המונולאייר RPE כוללות ספיגת אור, הזנה וחידוש של פוטורצפטורים, הסרת מוצרי קצה מטבוליים, שליטה על הומאוסטזיס יון בחלל subretinal ותחזוקה של מחסום רשתית הדם2,3. RPE יש גם תפקיד חשוב אפנון מקומי של המערכת החיסונית בעין5,6,7,8,9,10,11. ניוון ו/או תפקוד לקוי של RPE הם תכונות נפוצות המשותפות להפרעות עיניים רבות כגון רטיניטיס פיגמנטוזה, לאבר אמורוזיס מולד, לבקנות, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי12,13,14,15. למרבה הצער, הזמינות של רקמות אנושיות מוגבלת. בהתחשב בהומולוגיה הגנטית השמורה ביותר שלהם עם בני אדם, מודלים של עכברים מייצגים כלי מתאים ושימושי לחקר הפרעות עיניים16,17,18,19. יתר על כן, השימוש בתאי RPE ראשוניים תרבותיים מספק יתרונות כגון מניפולציה גנטית ובדיקות סמים שיכולים להאיץ את הפיתוח של טיפולים חדשים עבור הפרעות אלה מאיים ראייה9,11.

שיטות קיימות הזמינות עבור בידוד RPE העכבר ותרבות חסרים לשכפל ולא לשחזר את תכונות RPE ב vivo עם אמינות מספיק. תאים נוטים לאבד פיגמנטציה, צורה משושה והתנגדות חשמלית transepithelial (TER) בתוך כמה ימים בתרבות13,20. מאז הקמת אלה תרביות תא RPE העיקרי מעכברים הוא תהליך מאתגר, פרוטוקול זה אופטימיזציה נוצרה בהתבסס על פרוטוקולים אחרים כדי לבודד תאי RPE מחולשה ועיניים אנושיות21,22,23 כדי לנתח את עיני העכבר, לאסוף את RPE ותרבות תאי RPE העכבר במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ההנחיות של הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון בוצעו.

הערה: שיטה זו הוכחה כמוצלחת עם עכברים מרקעים גנטיים שונים, כולל C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/ oSnJ, ועכברים לבקנים, בגילאים שונים. עדיף להשתמש בעכברים בני 8 עד 12 שבועות כדי להשיג תאי RPE. תאי RPE מעכברים מבוגרים מתרבים פחות בתרבות ועכברים צעירים יותר מכילים פחות ויותר תאים קטנים יותר, מה שדורש איגום עיניים מבעלי חיים שונים כדי שיהיו להם תרבויות בנות קיימא.

1. הכנת ריאגנטים ותוספות הממברנה

  1. הכן את ריאגנטים הבאים.
    1. הכן HBSS-H- (HBSS ללא סידן, ללא מאגר מגנזיום + 10 מ"מ HEPES): הוסף 1 מ"ל של 1 M HEPES ל 99 מ"ל של HBSS- (ללא Ca / Mg) מאגר. יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד חודש.
    2. הכן HBSS-H+ (HBSS עם סידן, עם מאגר מגנזיום + 10 מ"מ HEPES): הוסף 1 מ"ל של 1 M HEPES ל 99 מ"ל של HBSS + (עם Ca / Mg) מאגר. יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד חודש.
    3. הכן פתרון hyaluronidase (1 מ"ג / מ"ל): להוסיף 10 מ"ג של hyaluronidase ל 10 מ"ל של HBSS-H- ולסנן אותו עם מסנן מזרק סטרילי 0.4 מיקרומטר באמצעות מזרק 10 מ"ל. היכונו טרי לפני השימוש והשאירו אותו בטמפרטורת החדר (RT; 20-25 מעלות צלזיוס).
    4. הכנת פתרון FBS: ערבבו 20% FBS עם HBSS-H+. הוסף 2 מ"ל של FBS ל 8 מ"ל של HBSS-H +. היכונו טריים לפני השימוש.
    5. הכן RPE בינוני: N1 תוסף בינוני 1/100 (v/v), גלוטמין 1/100 (v/v), פניצילין-סטרפטומיצין 1/100 (v/v) ותמיסת חומצת אמינו לא חיונית 1/100 (v/v), הידרוקורטיזון (20 מיקרוגרם/ל'), טאורין (250 מ"ג/ל') וטריודו-תירונין (0.013 מיקרוגרם/ל') באלפא MEM + 5% FBS או ללא FBS1,23,24. אם תרצה, FBS עשוי להיות מומת בחום; לא נצפו הבדלים. היכונו טריים לבידוד RPE. לתחזוקת תרבות התא, יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד חודש.
    6. הכן טריפסין-EDTA: הכן aliquots חד פעמי קטן (~ 8 מ"ל) של טריפסין-EDTA טרי (0.25%) ולהקפיא אותם ב-20 oC. להפשיר אותם ב RT לפני כל שימוש. הימנעו ממחזורי הפשרה בהקפאה.
  2. הכן את מוסיף הממברנה (למשל, מוסיף טרנסוול).
    1. השווה את 6.5 מ"מ ממברנה מוסיף עם מדיום RPE לפחות 30 דקות ב 37 °C (67 °F), ב 5% CO2-aeratedאינקובטור. השתמש מוסיף קרום אחד לתאי RPE זרע משתי עיני עכבר.
    2. לאחר הדגירה, להחליף את המדיום של התא התחתון עם 700 μL של PBS.
    3. הסר את המדיום מהתא העליון וציפוי תוסף הממברנה עם 100 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל עכבר למינצין (ב- PBS) לפחות 2 שעות ב- RT (דגירות קצרות יותר עלולות להוביל לחיבור לקוי של התאים לתוספת).
    4. מצפה תוספת קרום נוספת לשימוש כריק למדידות TER.

2. ניתוח והתעצמות של עיני העכבר

  1. המתת חסד לעכברים על ידיחנק CO 2 על ידי הצבתם בתא CO2 ושחרור איטי CO2 בקצב מילוי של 30-70% מנפח התא לדקה.
  2. מניחים את הקצות הזוויתיות והמשוננות של מיקרו-מלקחיים בכל צד של עין העכבר ולחץ בעדינות כדי להניע את גלגל העין (ההסתבכות).
  3. סגור את המלקחיים שהונחו סביב גלגל העין. לאחר מכן, משוך בעדינות תוך כדי תנועה קדימה ואחורה כדי לנתק את כל העין עם עצב הראייה משרירי העין, להבטיח כי אין רקמת חיבור נשאר מחובר סקלרה.
  4. יש לשטוף את גלגל העין המוקצה ב-70% אתנול לפני שמכניסים אותם לבאר אחת של צלחת שש בארות עם 3 מ"ל של HBSS-H על קרח.
  5. חזור על שלבים 2.2 עד 2.4 כדי להסיר את העין השנייה של העכבר. המשך בצעדים הבאים תוך 30 דקות.
    הערה: מומלץ לאחסן/לנתח רק שתי עיניים בכל פעם עד לקבלת ניסיון כלשהו.

3. אוסף RPE

הערה: בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים במכסה המנוע של זרימה למינארית. כדי למנוע דגירה ממושכת על קרח, אשר יכול לגרום למוות תא RPE, לא לאסוף יותר משתי עיניים בכל פעם.

  1. השתמש סטריאומיקרוסקופ לנתח, Dumont #5 מלקחיים, ומספריים זוויתיים כדי לנקות בזהירות את כל רקמת החיבור, הדם והשרירים שנותרו מחוברים לגלגל העין מבלי לבצע חתכים בסקלרה. לשנות את 3 מ"ל של HBSS-H- חיץ באופן קבוע, לפי הצורך, כדי לשמור על העין רעננה ונקייה, ולמנוע זיהום של תרבויות RPE.
  2. השתמש בעצב הראייה כמו ידית להחזיק את גלגל העין ולעשות חור במרכז הקרנית עם להב חד #11 פחמן פלדה.
  3. השתמש Dumont #5 מספריים לעשות שלושה חתכים בקרנית דרך החור הנ"ל, להבטיח כי יש מספיק מקום כדי להסיר את העדשה.
  4. החזק את עצב הראייה ולהחיל לחץ קל על אורה serrata עם הבסיס של המספריים זוויתי עד העדשה יוצא לחלוטין. השאירו את אפיתל הקשתית במקום כדי למנוע ניתוק של הרשתית העצבית RPE במהלך הדגירה. הנח את העין במאגר HBSS-H.
  5. חזור על שלבים 3.1-3.4 כדי לנתח את העין השנייה.
  6. דגירה את העיניים ללא עדשות בתמיסת hyaluronidase בצלחת 12-באר ב 37 °C (70 °F) במשך 45 דקות ב 5% CO2-aerated אינקובטור (1.5 mL / well) כדי לנתק את הרשתית העצבית מן RPE.
  7. מניחים כל עין בבאר חדשה ומדגרים אותה על קרח במשך 30 דקות עם 1.5 מ"ל של חיץ HBSS-H+ קר לכל באר כדי לעצור את פעילות היאלורונידז. אין להאריך את הדגירה למשך יותר מ-45 דקות.
  8. לשטוף, ומניחים כל עין לתוך צלחת תרבות 35 מ"מ עם חיץ HBSS-H + טרי לחתוך את הקרנית דרך החתכים המקוריים עד להגיע סראטה אורה באמצעות מספריים Vannas 8 ס"מ. לאחר מכן, לחתוך מתחת אורה serrata כדי להסיר את אפיתל הקשתית וקרנית.
  9. החזק את קצה העין / אורה סראטה עם פינצטה מעוגלת, באמצעות microforceps זוויתי, למשוך את הרשתית העצבית לוודא כי שכבת RPE לא נחתך. לאחר מכן, לחתוך את ההחזקה הפנימית לעצב הראייה. אם תאי RPE מסוימים נשארים מחוברים לרשתית העצבית, להאריך את זמן הדגירה אבל לא יעלה על 45 דקות בסך הכל.
  10. חותכים את עצב הראייה ומעבירים כל עיקול לצלחת שונה של 12 באר המכילה 1.5 מ"ל של טריפסין-EDTA טרי לבאר. ודא כי גלגלי העיניים נשארים פתוחים שקועים לחלוטין בנסיון. דגירה את העיניים ב 37 °C (69 °F) במשך 45 דקות ב 5% CO2 חממה.
  11. לאסוף כל eyecup יחד עם כל יריעות RPE מנותק במהלך הדגירה טריפסין ולהעביר אותם לתוך צלחת 12-well המכיל 1.5 מ"ל של פתרון FBS לכל באר. אם גליונות RPE נשארים בתמיסת הנסיון, השתמש במיקרופיפט כדי להעביר אותם לבאר עם פתרון FBS.

4. בידוד של תאי RPE של העכבר הראשי

  1. החזק כל עיקור על ידי עצב הראייה ולנער אותו עם הפנים כלפי מטה לתוך צלחת 12-well המכיל 1.5 מ"ל של 20% FBS ב HBSS-H + עד ניתוק מלא של גיליונות RPE מושגת.
  2. לאסוף את כל יריעות RPE ואשכולות RPE עם micropipette ומניחים אותם בצינור 15 מ"ל. הימנע כל חתיכות לבנות של סקלרה או choroid, אשר יכול לזהם את התרבויות. בריכה שתי עיניים מאותו עכבר בצינור אחד.
  3. צנטריפוגה התערובת ב 340 x g במשך 2 דקות ב RT ולהשליך את supernatant.
  4. בעדינות resuspend גלולת RPE ב 1 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%) ולהדגיר את התערובת במשך 1 דקות באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס כדי לפזר את יריעות RPE לתאים בודדים. לאחר הדגירה, בעדינות צינור למעלה ולמטה 10x עם micropipette, הימנעות היווצרות בועה תוך pipetting.
  5. הוסף 9 מ"ל של מדיום RPE מוכן טרי כדי לדלל ולהשבית את טריפסין וצנטריפוגה התערובת ב 340 x g במשך 2 דקות ב RT.
  6. לשאוף את supernatant בזהירות resuspend גלולת התא ב 150 μL של מדיום RPE עם 5% FBS באמצעות micropipette, להבטיח כי התאים הם הומוגנית respended והימנעות היווצרות בועה תוך pipetting.
  7. קח תוספת קרום מצופה למין משלב 1.2, להסיר PBS מהתא התחתון ולהוסיף 700 μL של מדיום RPE.
  8. הסר את למינצין מן התא העליון של הכנס קרום ולהפיץ את ההשעיה תא RPE dropwise באופן אחיד למרכז התא, הימנעות היווצרות בועה תוך pipetting.
  9. מניחים את תוסף הממברנה באינקובטור CO2 5% ב 37 מעלות צלזיוס ולהשאיר באין מפריע לפחות 24 שעות.
  10. לאחר 24 שעות, בדוק את תוסף הממברנה מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שרוב תאי ה- RPE מחוברים לתוסף והמכנס הוא לפחות 50%(איור 1A). זה קריטי לא לשנות את המדיה במהלך 72 השעות הראשונות.

5. תרבות של מונוליירים RPE מקוטב

  1. שמור על תאי ה- RPE המבודדים בתרבות למשך 72 שעות לפחות לפני רענון מדיום ה- RPE כדי לאפשר חיבור לתא. מפגש תאים של 50% או יותר בזריעה הוא היסוד להיווצרות מונולאי RPE מקוטב מתאים.
  2. שנה את מדיום התרבות פעמיים בשבוע באמצעות מדיום RPE טרי ומחומם מראש (שלב 1.1.5) לאחר שהתאים מחוברים. סרום ניתן להסיר מן המדיום התרבותי לאחר 72 h הראשון.
    הערה: לאחר שבוע בתרבות, התאים צריכים להיות משולבים, משושים, דו-גרעיניים, פיגמנטיים ומקוטבים (איור 1B),כאשר מספרי התאים הצפויים הם סביב 50,000 תאים לכל הכנס טרנסוול 6.5 מ"מ. לאחר שבועיים בתרבות, מונוליירים RPE המרכיבים תאים בריאים נצפו. תרבויות RPE מציגות מיקרוווילי אפיקלי, פילינג בסיסי וצמתים הדוקים(איור 1C).

6. מדידת טר

הערה: בצע מדידות TER של תאי RPE לאחר מינימום של 4 ימים בתרבות כדי להבטיח שלמות טובה קיטוב של המונולאייר RPE.

  1. לנקות את האלקטרודות של voltohmmeter עם 70% אתנול ולייבש אותם בזהירות.
  2. קח את transwells מן החממה ולבצע מדידת TER בתוך 3 דקות, כדי למנוע שינויים עקב תנודות טמפרטורה. כדי למדוד TER, לטבול את האלקטרודה הקצרה של voltohmmeter בתא העליון ואת האלקטרודה הארוכה בתא התחתון של הכנס הממברנה. הימנע ממגע עם המונוליילר RPE כדי למנוע ניתוק תאים.
  3. כדי לחשב TER, לנכות את הערך של הריק (ממברנה להוסיף מצופה למינצין ללא תאים) מן המדגם. לאחר מכן הכפל את הערך המתקבל (ב- ohms) על-ידי שטח הפנים של תוסף הממברנה (0.33 ס"מ2 במקרה של הכנסת קרום 6.5 מ"מ). המוצר צריך להיות לפחות 200 Ω x ס"מ2 לאחר 72 שעות בתרבות. ערכי TER צריכים למדוד מעל 400 Ω x ס"מ2 לאחר שבועיים. בטל תרבויות RPE עם ערכי TER נמוכים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה שימש לבידוד ותרבות תאי RPE מעכברים מהונדסיםגנטית 1. לא נצפו הבדלים בין זני עכבר או מין. התוצאות עזרו להבין כמה היבטים חשובים של המנגנון שבבסיס מחלות עיניים כגון ניוון מקולרי הקשור לגיל, שהוא הגורם השכיח ביותר לאובדן ראייה בקרב קשישים9. תאי RPE מבודדים בעקבות פרוטוקול זה היו מחוברים לחלוטין לתוסף הממברנה 24 שעות לאחר הזריעה והראו את גודל RPE טיפוסי, מורפולוגיה ופיגמנטציה לאחר 72 שעות1. לאחר שבוע, מונולאי RPE מקוטב מאוד נוצר על ידי תאי RPE פיגמנט משושה עם שני גרעינים הצטרפו צמתים הדוקים המבטא ZO-1 (איורים 1C, 2). מיקרוגרפים של אלקטרוני שידור חושפים נוכחות של מיקרוווילי אפיקלי ופילינג בסיסי (איור 1C). הקיטוב של ה-RPE אושר על ידי ערכי TER עם ממוצע גבוה מ-200 Ω x ס"מ2, שנשאר יציב לאורך זמן (איור 2).

אימות תפקודי של שיטה זו בוצע למרות מבחני phagocytosis. תאי RPE של עכברים היו מתורבתים על מוסיף ממברנה והוזנו עם POS שור שכותרתו FITC. אפיפות POS ועיכול הוכחו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (איור 3).

Figure 1
איור 1. תאי RPE בנקודות זמן שונות. (A)10x מיקרוגרפים brightfield של תאי RPE 24 שעות פוסט זריעה על מוסיף הממברנה, ו - (B) לאחר שבוע. (C)מיקרוגרפים אלקטרונים הילוכים מציגים מיקרוווילי אפיקלי, פילינג בסיסי ופיגמנטים מלנין (כתמים שחורים) של RPE בתרבית על מוסיף הממברנה במשך שבועיים. סרגלי קנה מידה: A, B: 100 מיקרומטר, C: 2 מיקרומטר.

Figure 2
איור 2. טר לאורך זמן. ההתנגדות החשמלית transepithelial (TER) של ~ 60 תרביות תא RPE העכבר הראשי על מוסיף קרום נמדד לאחר 0.5 (n = 33), 1 (n = 58), 1.5 (n = 54), ו 2 (n = 60) שבועות. TER מגיע מעל 200 Ω x ס"מ2 על ידי 72 שעות ונשאר יציב לפחות שבועיים. נתונים המיוצגים כערכים בודדים עם ממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. מבחני פגוציטוזיס. מיקרוגרפים פלואורסצנטיים 40x של תרבויות RPE העכבר הראשי מוזן עם FITC שכותרתו BOVINE POS (ירוק) במשך שעתיים קבוע עם מתנול25. שברים קטנים יותר תואמים ל- POS מתעכל בתוך הציטופלסמה של התא. הדמיה של צמתים הדוקים (אדום) התאפשרה על ידי immunostaining עם נוגדנים נגד ZO1 כפי שתואר קודם לכן1,9. DAPI (כחול) שימש להכתמת גרעינים. תאים RPE עכבר טיפוסי עם שני גרעינים ניתן לראות במרכז התמונה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעוד מספר שיטות עבור העכבר RPE בידוד ותרבות התאים פותחו לפני1,13,20,22,26,27, השיטה של פרננדז-גודינו השתמשה לראשונה מוסיף ממברנה המאפשר צמיחה יעילה של תאי RPE בתרבות במשך שבועות1,9. שינוי משמעותי נוסף בפרוטוקול שלהם1,9 היה השימוש בפתרונות אנזימטיים במקום קילוף מכני כדי לנתק את תאי RPE1,13,20,26. העדשות הוסרו דרך חתך בקרנית, משאיר את אפיתל הקשתית שלם ושמירה על שלמות הרשתית במהלך הדגירה הראשונה. הבידוד העדין של תאי RPE בשילוב עם השימוש מוסיף ממברנה ובינוני RPE ספציפי23 תוצאות הישרדות התא משופרת, שיפור היווצרות של monolayer confluent פונקציונלי המחקה את התנאים הפיזיולוגיים של RPE בתוך ימים בתרבות2. בדרך כלל, תאי RPE של העכבר הראשי המחויבים בשיטה זו מציגים מורפולוגיה משושה, קיטוב, פיגמנטציה, מאפייני מחסום והתפשטות. יתר על כן, RPE יכול להיות תרבותי בהיעדר סרום מהיום השלישי עד מספר שבועות, אשר חשוב ללמוד משלים הקשורים RPE פתולוגיות9.

מגבלה של פרוטוקול זה היא שלא ניתן להרחיב תאי RPE של עכבר ראשי בתרבית על מוסיף ממברנה. העברת תאי RPE של העכבר הראשי עם פתרונות אנזימטיים או culturing אותם במשך זמן רב גורם לאובדן פיגמנטציה, דה בידול, ו ירד TER, ובכך לאבד את המאפיינים הדומים תכונות vivo. הכמות המוגבלת של תאי RPE המתקבלים מחיה אחת מחייבת לאגור דגימות מבעלי חיים שונים לצורך ניתוחים תמלולומיים ופרוטאומיים, שבהם נדרשות כמויות גדולות יחסית של חומר התחלתי. לא מומלץ להגדיל את תרביות RPE על ידי איגום עיניים יותר לתוך הכנס קרום גדול יותר, כפי שהוא יכול לגרום אחוז גבוה יותר של מוות תאי ותרביות RPE רב שכבתיות.

יש גם כמה שלבים קריטיים לפרוטוקול. לא יותר משתי עיניים יש לקצור בו זמנית עד ניסיון כלשהו הוא aquired, שכן זמן ניתוח ממושך גורם אחוז גבוה יותר של מוות תאי. יש לחתוך את עצב הראייה רק לפני הדגירה עם טריפסין. זה קריטי כדי להתמודד עם eyecup מבלי להפריע לתאי RPE, אבל עצב הראייה מתעכל על ידי טריפסין, מה שמוביל זיהומים בתרבויות RPE. קילוף את שרירי העין חייב להתבצע בזהירות. אם הסקלרה מחוררת והרשתית העצבית קופצת החוצה, יש להשליך את העין מכיוון שתאי ה- RPE ייפגעו ולא ישרדו. לחץ מינימלי צריך להיות מיושם כדי להסיר את העדשות. עדיף לבצע חתך קרנית גדול יותר. זה קריטי כי eyecup פתוח שקוע לחלוטין טריפסין, כך שכל תאי RPE נחשפים לפתרון. יש לאסוף את תאי ה- RPE באמצעות טלטול עדין של העין, ולעולם לא על ידי ריסוס מדיה או קילוף מכני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מכון גנומיקה עינית במסצ'וסטס עין ואוזן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable BD Biosciences 309604
15 ml centrifuge tube VWR International 21008-103
50 ml centrifuge tube VWR International 21008-951
Alpha Minimum Essential Medium Sigma-Aldrich M4526-500ML
Angled micro forceps WPI 501727
Bench-top centrifuge any
CO2 incubator Thermo HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium Gibco 14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length WPI 14101
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm BD Biosciences 353001
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red Life Technologies 14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 Life Technologies 14025092
HEPES 1M Gibco 15630106
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H-3506 1G
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H-0396
Laminar flow hood Thermo CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml Sigma-Aldrich L2020-1 MG Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long WPI 503216
Non-essential amino acids 100X Gibco 11140050
N1 Supplement 100X Sigma-Aldrich N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 Fisher-Scientific 08-914B
Taurine Sigma-Aldrich T-0625
Tissue culture treated 12-well plates Fisher-Scientific 08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates Fisher-Scientific 14-832-11
Transwell supports 6.5 mm Sigma-Aldrich CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin Sigma-Aldrich T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips WPI 500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel WPI 501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size Fisher-Scientific 6780-2504

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
  2. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  3. Konari, K., et al. Development of the blood-retinal barrier in vitro: Formation of tight junctions as revealed by occludin and ZO-1 correlates with the barrier function of chick retinal pigment epithelial cells. Experimental Eye Research. 61 (1), 99-108 (1995).
  4. Kay, P., Yang, Y. C., Paraoan, L. Directional protein secretion by the retinal pigment epithelium: Roles in retinal health and the development of age-related macular degeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 833-843 (2013).
  5. Johnson, L. V., Leitner, W. P., Staples, M. K., Anderson, D. H. Complement activation and inflammatory processes in drusen formation and age related macular degeneration. Experimental Eye Research. 73 (6), 887-896 (2001).
  6. Hageman, G. S., et al. An integrated hypothesis that considers drusen as biomarkers of immune-mediated processes at the RPE-Bruch's membrane interface in aging and age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (6), 705-732 (2001).
  7. Lommatzsch, A., et al. Are low inflammatory reactions involved in exudative age-related macular degeneration. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (6), 803-810 (2008).
  8. Bandyopadhyay, M., Rohrer, B. Matrix metalloproteinase activity creates pro-angiogenic environment in primary human retinal pigment epithelial cells exposed to complement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (4), 1953-1961 (2012).
  9. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. A local complement response by RPE causes early-stage macular degeneration. Human Molecular Genetics. 24 (19), 5555-5569 (2015).
  10. Fernandez-Godino, R., Bujakowska, K. M., Pierce, E. A. Changes in extracellular matrix cause RPE cells to make basal deposits and activate the alternative complement pathway. Human Molecular Genetics. 27 (1), 147-159 (2018).
  11. Fernandez-Godino, R., Pierce, E. A. C3a triggers formation of sub-retinal pigment epithelium deposits via the ubiquitin proteasome pathway. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  12. Farkas, M. H., et al. Mutations in Pre-mRNA processing factors 3, 8, and 31 cause dysfunction of the retinal pigment epithelium. American Journal of Pathology. 184 (10), 2641-2652 (2014).
  13. Geisen, P., Mccolm, J. R., King, B. M., Hartnett, E. Characterization of Barrier Properties and Inducible VEGF Expression of Several Types of Retinal Pigment Epithelium in Medium-Term Culture. Current Eye Research. 31, 739 (2006).
  14. Schütze, C., et al. Retinal pigment epithelium findings in patients with albinism using wide-field polarization-sensitive optical coherence tomography. Retina. 34 (11), 2208-2217 (2014).
  15. Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).
  16. Garland, D. L., et al. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 23 (1), 52-68 (2014).
  17. Fu, L., et al. The R345W mutation in EFEMP1 is pathogenic and causes AMD-like deposits in mice. Human Molecular Genetics. 16 (20), 2411-2422 (2007).
  18. Greenwald, S. H., et al. Mouse Models of NMNAT1-Leber Congenital Amaurosis (LCA9) Recapitulate Key Features of the Human Disease. American Journal of Pathology. 186 (7), 1925-1938 (2016).
  19. Gupta, P. R., et al. Ift172 conditional knock-out mice exhibit rapid retinal degeneration and protein trafficking defects. Human Molecular Genetics. 27 (11), 2012-2024 (2018).
  20. Gibbs, D., Williams, D. S. Isolation and culture of primary mouse retinal pigmented epithelial cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 533, 347-352 (2003).
  21. Bonilha, V. L., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. Ezrin promotes morphogenesis of apical microvilli and basal infoldings in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Biology. 147 (7), 1533-1547 (1999).
  22. Nandrot, E. F., et al. Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking αvβ5 integrin. Journal of Experimental Medicine. 200 (12), 1539-1545 (2004).
  23. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  24. Maminishkis, A., Miller, S. S. Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology. Journal of Visualized Experiments. (45), (2010).
  25. Brydon, E. M., et al. AAV-Mediated Gene Augmentation Therapy Restores Critical Functions in Mutant PRPF31+/− iPSC-Derived RPE Cells. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 15, 392-402 (2019).
  26. Shang, P., Stepicheva, N. A., Hose, S., Zigler, J. S., Sinha, D. Primary cell cultures from the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Visualized Experiments. 2018 (133), (2018).
  27. Bonilha, V. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. Clinical Ophthalmology. 2 (2), 413 (2008).

Tags

ביולוגיה גיליון 168 עכבר RPE RPE ראשי תרבויות RPE בידוד RPE הפרעות עיניים RPE מקוטב RPE על Transwells ניתוח עין העכבר
ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chinchilla, B., Getachew, H.,… More

Chinchilla, B., Getachew, H., Fernandez-Godino, R. Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (168), e62228, doi:10.3791/62228 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter