Summary
Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von Maus-RPE-Zellen, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Das Verfahren dauert ca. 3 Stunden.
Abstract
Augenerkrankungen betreffen Millionen von Menschen weltweit, aber die begrenzte Verfügbarkeit von menschlichem Gewebe behindert ihre Studie. Mausmodelle sind mächtige Werkzeuge, um die Pathophysiologie von Augenkrankheiten aufgrund ihrer Ähnlichkeiten mit der menschlichen Anatomie und Physiologie zu verstehen. Veränderungen im retinalen Pigmentepithel (RPE), einschließlich Veränderungen in Morphologie und Funktion, sind häufige Merkmale, die von vielen Augenerkrankungen geteilt werden. Eine erfolgreiche Isolierung und Kultur der primären Maus-RPE-Zellen ist jedoch eine große Herausforderung. Dieses Papier ist eine aktualisierte audiovisuelle Version des Protokolls, das zuvor von Fernandez-Godino et al. im Jahr 2016 veröffentlicht wurde, um primäre Maus-RPE-Zellen effizient zu isolieren und zu kultivieren. Diese Methode ist sehr reproduzierbar und führt zu robusten Kulturen hochpolarisierter und pigmentierter RPE-Monolayer, die mehrere Wochen lang auf Transwells gepflegt werden können. Dieses Modell eröffnet neue Wege für die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die Augenkrankheiten zugrunde liegen. Darüber hinaus bietet es eine Plattform, um therapeutische Ansätze zu testen, die verwendet werden können, um wichtige Augenkrankheiten mit unerfüllten medizinischen Bedürfnissen zu behandeln, einschließlich vererbter Netzhauterkrankungen und Makuladegenerationen.
Introduction
Dieses Protokoll, das ursprünglich von Fernandez-Godino et al. im Jahr 20161berichtet wurde, beschreibt eine Methode zur effizienten Isolierung und Kultur von retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) der Maus, die innerhalb einer Woche auf Transwell-Platten eine funktionelle und polarisierte RPE-Monoschicht bilden. Die RPE ist eine Monoschicht im Auge zwischen der neuronalen Netzhaut und der Bruch-Membran. Diese einzelne Schicht besteht aus hochpolarisierten und pigmentierten Epithelzellen, die durch enge Kreuzungen verbunden sind und eine sechseckige Form aufweisen, die einer Wabe2ähnelt. Trotz dieser scheinbaren histologischen Einfachheit führt das RPE eine Vielzahl von Funktionen aus, die für die Netzhaut und den normalen visuellen Zyklus2,3,4entscheidend sind. Die Hauptfunktionen der RPE-Monoschicht sind Lichtabsorption, Ernährung und Erneuerung von Photorezeptoren, Entfernung von metabolischen Endprodukten, Kontrolle der Ionenhomöostase im subretinalen Raum und Aufrechterhaltung der Blut-Retina-Barriere2,3. Das RPE hat auch eine wichtige Rolle bei der lokalen Modulation des Immunsystems im Auge5,6,7,8,9,10,11. Degeneration und/oder Dysfunktion des RPE sind gemeinsame Merkmale von vielen Augenerkrankungen wie Retinitis pigmentosa, Leber angeborene Amaurose, Albinismus, diabetische Retinopathie, und Makuladegeneration12,13,14,15. Leider ist die Verfügbarkeit von menschlichem Gewebe begrenzt. Aufgrund ihrer hochkonservierten genetischen Homologie mit Menschen stellen Mausmodelle ein geeignetes und nützliches Werkzeug zum Studium von Augenerkrankungendar 16,17,18,19. Darüber hinaus bietet die Verwendung von kultivierten primären RPE-Zellen Vorteile wie genetische Manipulation und Arzneimitteltests, die die Entwicklung neuer Therapien für diese sehbedrohlichen Erkrankungen beschleunigen können9,11.
Vorhandene Methoden, die für die RPE-Isolation und -Kultur der Maus verfügbar sind, fehlen reproduzierbar und rekapitulieren die RPE-Funktionen in vivo nicht mit ausreichender Zuverlässigkeit. Zellen neigen dazu, Pigmentierung, sechseckige Form und transepitheliale elektrische Beständigkeit (TER) innerhalb weniger Tage in Kultur13,20zu verlieren. Da die Etablierung dieser primären RPE-Zellkulturen von Mäusen ein anspruchsvoller Prozess ist, wurde dieses optimierte Protokoll auf der Grundlage anderer Protokolle erstellt, um RPE-Zellen von Ratten- und menschlichen Augen zu isolieren21,22,23, um die Mausaugen zu sezieren, die RPE zu sammeln und die Maus-RPE-Zellen in vitro zu kultivieren.
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Protocol
Die Richtlinien der ARVO-Erklärung zur Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung wurden befolgt.
HINWEIS: Diese Methode hat sich bei Mäusen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund bewährt, einschließlich C57BL/6J, B10. D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ und Albino-Mäuse in verschiedenen Altersgruppen. Verwenden Sie vorzugsweise 8 bis 12 Wochen alte Mäuse, um RPE-Zellen zu erhalten. RPE-Zellen von älteren Mäusen vermehren sich weniger in der Kultur und jüngere Mäuse haben weniger und kleinere Zellen, was erfordert, Dass Augen von verschiedenen Tieren zusammengepoolt werden, um lebensfähige Kulturen zu haben.
1. Herstellung von Reagenzien und Membraneinsätzen
- Bereiten Sie die folgenden Reagenzien vor.
- HBSS-H-H (HBSS ohne Kalzium, ohne Magnesiumpuffer + 10 mM HEPES) vorbereiten: 1 ml 1 M HEPES zu 99 ml HBSS- (ohne Ca/Mg) Puffer hinzufügen. Bei 4 °C bis 1 Monat lagern.
- HBSS-H+ (HBSS mit Kalzium, mit Magnesiumpuffer + 10 mM HEPES) vorbereiten: 1 ml 1 M HEPES zu 99 ml HBSS+ (mit Ca/Mg) Puffer hinzufügen. Bei 4 °C bis 1 Monat lagern.
- Hyaluronidase-Lösung (1 mg/ml) vorbereiten: 10 mg Hyaluronidase zu 10 ml HBSS-H- hinzufügen und mit einem 0,4 m-Sterilspritzenfilter mit einer 10 ml Spritze filtern. Vor Gebrauch frisch vorbereiten und bei Raumtemperatur (RT; 20-25 °C) lassen.
- FBS-Lösung vorbereiten: Mischen Sie 20% FBS mit HBSS-H+. Fügen Sie 2 ml FBS zu 8 ml HBSS-H+ hinzu. Vor Gebrauch frisch vorbereiten.
- RpE-Medium: N1 Medium Supplement 1/100 (v/v), Glutamin 1/100 (v/v), Penicillin-Streptomycin 1/100 (v/v) und nicht essentielle Aminosäurelösung 1/100 (v/100 (v/v), Hydrocortison (20 g/L), Taurin (250 mg/L) und Triiodo-Thyronin (0,013 g/l) in Alpha MEM + 5% FBS oder ohne FBS1,23,24. Auf Wunsch kann FBS wärmeinaktiviert werden; es wurden keine Unterschiede beobachtet. Bereiten Sie sich frisch auf die RPE-Isolierung vor. Für die Zellkulturpflege bei 4 °C bis 1 Monat lagern.
- Trypsin-EDTA vorbereiten: Vorbereiten kleiner Einweg-Aliquots (ca. 8 ml) frischer Trypsin-EDTA (0,25 %) und frieren Sie sie bei -20 oC ein. Tauen Sie sie bei RT vor jedem Gebrauch. Vermeiden Sie Gefrier-Tau-Zyklen.
- Bereiten Sie die Membraneinsätze (z. B. Transwell-Einsätze) vor.
- Equilibrate die 6,5-mm-Membraneinsätze mit RPE-Medium für mindestens 30 min bei37 °C, in einem 5% CO2-belüfteten Inkubator. Verwenden Sie einen Membraneinsatz, um RPE-Zellen von zwei Mausaugen auszusäen.
- Ersetzen Sie nach der Inkubation das Medium des unteren Fachs durch 700 l PBS.
- Entfernen Sie das Medium aus dem oberen Fach und beschichten Sie den Membraneinsatz mit 100 l von 10 g/ml Mauslaminin (in PBS) für mindestens 2 h bei RT (kürzere Inkubationen können zu einer schlechten Befestigung der Zellen an der Einlage führen).
- Mantel Sie einen zusätzlichen Membraneinsatz, um als Rohling für TER-Messungen zu verwenden.
2. Zerlegung und Enukleation der Mausaugen
- Euthanisieren Sie die Mäuse durchCO2-Erstickung, indem Sie sie in eineCO2-Kammer legen und CO2 langsam mit einer Füllrate von 30-70% des Kammervolumens pro Minute freisetzen.
- Legen Sie die abgewinkelten, gezackten Spitzen von Mikrozangen auf jeder Seite des Mausauges und drücken Sie vorsichtig, um den Augapfel zu proptosisieren (Enukleation).
- Schließen Sie die Zange um den Augapfel platziert. Ziehen Sie dann sanft, während Sie sich vorwärts und rückwärts bewegen, um das ganze Auge mit dem Sehnerv von den Augenmuskeln zu lösen, um sicherzustellen, dass kein Bindegewebe an der Sklera befestigt bleibt.
- Spülen Sie den enukleierten Augapfel in 70% Ethanol, bevor Sie ihn in einen Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte mit 3 ml HBSS-H- auf Eis legen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2 bis 2.4, um das zweite Mausauge zu entfernen. Fahren Sie innerhalb von 30 min mit den nächsten Schritten fort.
HINWEIS: Es wird empfohlen, nur zwei Augen gleichzeitig zu enuclieren/zu sezieren, bis etwas Erfahrung gesammelt wird.
3. Sammlung des RPE
HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen in einer laminaren Durchflusshaube aus. Um ausgedehnte Inkubationen auf Eis zu vermeiden, die zum Tod von RPE-Zellen führen können, sammeln Sie nicht mehr als zwei Augen gleichzeitig.
- Verwenden Sie ein sezierendes Stereomikroskop, Dumont #5 Zangen und eine abgewinkelte Schere, um das gesamte Bindegewebe, das Blut und die Muskeln, die am Augapfel befestigt sind, sorgfältig zu reinigen, ohne dass die Sklera geschnitten wird. Ändern Sie den 3 ml HBSS-H-Puffer bei Bedarf regelmäßig, um das Auge frisch und sauber zu halten und die Kontamination der RPE-Kulturen zu vermeiden.
- Verwenden Sie den Sehnerv als Griff, um den Augapfel zu halten und ein Loch in der Mitte der Hornhaut mit einem scharfen Carbon-Stahl-#11 Klinge zu machen.
- Verwenden Sie Dumont #5 Schere, um drei Einschnitte in der Hornhaut durch das oben genannte Loch zu machen, um sicherzustellen, dass genügend Platz vorhanden ist, um die Linse zu entfernen.
- Halten Sie den Sehnerv und üben Sie leichten Druck auf die Ora serrata mit der Basis der abgewinkelten Schere, bis die Linse vollständig herauskommt. Lassen Sie das Irisepithel an Ort und Stelle, um die Ablösung der neuronalen Netzhaut und RPE während der Inkubation zu verhindern. Legen Sie das Auge in den HBSS-H-Puffer.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.4, um das zweite Auge zu sezieren.
- Inkubieren Sie die Augen ohne Linsen in Hyaluronidase-Lösung in einer 12-Well-Platte bei37 °C für 45 min in einem 5% CO2-belüfteten Inkubator (1,5 ml/well), um die neuronale Netzhaut vom RPE zu lösen.
- Legen Sie jedes Auge in einen neuen Brunnen und inkubieren Sie es auf Eis für 30 min mit 1,5 ml kalten HBSS-H+ Puffer pro Brunnen, um die Hyaluronidase Aktivität zu stoppen. Verlängern Sie die Inkubation nicht länger als 45 min.
- Waschen und jedes Auge in ein 35-mm-Kulturgericht mit frischem HBSS-H+ Puffer geben und die Hornhaut durch die ursprünglichen Schnitte schneiden, bis sie mit einer 8-cm-Vannas-Schere die Oraserrata erreichen. Dann unter die Ora serrata schneiden, um das Irisepithel und die Hornhaut zu entfernen.
- Halten Sie die Augenmuschelkante/Ora serrata mit einer gekrümmten Pinzette und ziehen Sie mit abgewinkelten Mikrozangen die neuronale Netzhaut weg, um sicherzustellen, dass die RPE-Schicht nicht geschnitten wird. Schneiden Sie dann die innere Befestigung am Sehnerv. Wenn einige RPE-Zellen an der neuronalen Netzhaut befestigt bleiben, verlängern Sie die Inkubationszeit, aber nicht mehr als 45 min insgesamt.
- Schneiden Sie den Sehnerv und übertragen Sie jede Augentasse auf eine andere 12-Well-Platte mit 1,5 ml frischem Trypsin-EDTA pro Brunnen. Stellen Sie sicher, dass die Augenmuscheln geöffnet bleiben und vollständig in das Trypsin eingetaucht sind. Inkubieren Sie die Augenmuscheln bei 37 °C für 45 min in einem 5% CO2-Inkubator.
- Sammeln Sie jede Augenmuschel zusammen mit allen RPE-Platten, die während der Trypsin-Inkubation abgenommen wurden, und übertragen Sie sie in eine 12-Well-Platte, die 1,5 ml FBS-Lösung pro Brunnen enthält. Wenn RPE-Platten in der Trypsin-Lösung verbleiben, verwenden Sie eine Mikropipette, um sie mit fbS-Lösung in den Brunnen zu übertragen.
4. Isolierung der primären Maus-RPE-Zellen
- Halten Sie jede Augenmuschel am Sehnerv fest und schütteln Sie sie mit dem Gesicht nach unten in die 12-Well-Platte mit 1,5 ml 20% FBS in HBSS-H+ bis die vollständige Ablösung der RPE-Platten erreicht ist.
- Sammeln Sie alle RPE-Platten und RPE-Cluster mit einer Mikropipette und legen Sie sie in ein 15-ml-Rohr. Vermeiden Sie weiße Stücke von Sklera oder Aderhaut, die die Kulturen kontaminieren könnten. Pool zwei Augen von der gleichen Maus in einem Rohr.
- Zentrifugieren Sie die Mischung bei 340 x g für 2 min bei RT und entsorgen Sie den Überstand.
- Das RPE-Pellet vorsichtig in 1 ml Trypsin-EDTA (0,25%) und inkubieren Sie das Gemisch 1 min in einem Wasserbad bei 37 °C, um die RPE-Platten in einzelne Zellen zu zerlegen. Nach der Inkubation, sanft nach oben und unten 10x mit einer Mikropipette, Vermeidung von Blasenbildung beim Pipetieren.
- Fügen Sie 9 ml frisch zubereitetes RPE-Medium hinzu, um das Trypsin zu verdünnen und die Mischung bei 340 x g für 2 min bei RT zu zentrieren.
- Den Überstand ansaugen und das Zellpellet in 150 l RPE-Medium mit 5% FBS vorsichtig wieder aufsetzen, indem man eine Mikropipette verwendet, um sicherzustellen, dass die Zellen homogen resuspendiert werden und Blasenbildung während der Pipettierung vermieden wird.
- Nehmen Sie den lamininbeschichteten Membraneinsatz aus Schritt 1.2, entfernen Sie PBS aus der unteren Kammer und fügen Sie 700 L RPE-Medium hinzu.
- Entfernen Sie das Laminin aus der oberen Kammer des Membraneinsatzes und verteilen Sie die RPE-Zellsuspension tropfenweise und gleichmäßig auf die Mitte der Kammer, wodurch Blasenbildung beim Pipetieren vermieden wird.
- Den Membraneinsatz bei 37 °C in einen 5% CO2-Inkubator geben und mindestens 24 h ungestört lassen.
- Überprüfen Sie nach 24 h den Membraneinsatz unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die meisten RPE-Zellen am Einsatz befestigt sind und der Zusammenfluss mindestens 50 % beträgt (Abbildung 1A). Es ist wichtig, die Medien während der ersten 72 h nicht zu wechseln.
5. Kultur polarisierter RPE-Monolayer
- Bewahren Sie die isolierten RPE-Zellen in kultur für mindestens 72 h auf, bevor Sie das RPE-Medium aktualisieren, um eine Zellbindung zu ermöglichen. Ein Zellzusammenfluss von 50% oder mehr bei der Aussaat ist für die Bildung einer geeigneten polarisierten RPE-Monoschicht von grundlegender Bedeutung.
- Ändern Sie das Kulturmedium zweimal pro Woche mit frischem und vorgewärmten RPE-Medium (Schritt 1.1.5), nachdem die Zellen angeschlossen sind. Serum kann nach den ersten 72 h aus dem Kulturmedium entfernt werden.
HINWEIS: Nach einer Woche in der Kultur sollten Zellen konfluent, sechseckig, binukleiert, pigmentiert und polarisiert sein(Abbildung 1B), wobei die erwarteten Zellzahlen etwa 50.000 Zellen pro 6,5 mm Transwell-Einsatz betragen. Nach zwei Wochen in der Kultur werden RPE-Monolayer beobachtet, die aus gesunden Zellen bestehen. RPE-Kulturen zeigen apikale Mikrovilli, Basalfalten und enge Knoten (Abbildung 1C).
6. TER-Messung
HINWEIS: Führen Sie TER-Messungen der RPE-Zellen nach mindestens 4 Tagen in kultur durch, um eine gute Integrität und Polarisation der RPE-Monoschicht zu gewährleisten.
- Reinigen Sie die Elektroden des Voltohmmeters mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie sorgfältig.
- Nehmen Sie die Transwells aus dem Inkubator und führen Sie TER-Messungen innerhalb von 3 min durch, um Änderungen aufgrund von Temperaturschwankungen zu vermeiden. Um TER zu messen, tauchen Sie die kurze Elektrode des Voltohmmeters in die obere Kammer und die lange Elektrode in die Unterkammer des Membraneinsatzes ein. Vermeiden Sie den Kontakt mit der RPE-Monoschicht, um eine Zellablösung zu verhindern.
- Um TER zu berechnen, ziehen Sie den Wert des Rohlings (Membraneinsatz mit Laminin ohne Zellen beschichtet) aus der Probe ab. Dann multiplizieren Sie den erhaltenen Wert (in Ohm) mit der Oberfläche des Membraneinsatzes (0,33 cm2 bei 6,5-mm-Membraneinsatz). Das Produkt sollte mindestens 200 Ω x cm2 nach 72 h in Kultur sein. DIE TER-Werte sollten nach zwei Wochen über 400 Ω x cm2 messen. VERwerfen Sie RPE-Kulturen mit niedrigen TER-Werten.
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Representative Results
Dieses Protokoll wurde verwendet, um RPE-Zellen von genetisch veränderten Mäusen zu isolieren und zu kultivieren1. Es wurden keine Unterschiede zwischen Mausstämmen oder Geschlecht beobachtet. Die Ergebnisse haben dazu beigetragen, einige wichtige Aspekte des Mechanismus zu verstehen, der Augenerkrankungen zugrunde liegt, wie z. B. die altersbedingte Makuladegeneration, die die häufigste Ursache für Sehverlust bei älteren Menschen ist9. RPE-Zellen, die nach diesem Protokoll isoliert wurden, wurden 24 Stunden nach der Aussaat vollständig an den Membraneinsatz angeschlossen und zeigten die typische RPE-Größe, Morphologie und Pigmentierung nach 72 h1. Nach einer Woche wurde eine hochpolarisierte RPE-Monoschicht durch sechseckig pigmentierte RPE-Zellen mit zwei Kernen gebildet, die durch enge Knoten verbunden sind, die ZO-1 exdrücken (Abbildungen 1C, 2). Transmissionselektronenmikroskopie zeigt das Vorhandensein von apikalen Mikrovilli und Basalfalten (Abbildung 1C). Die Polarisation der RPE-Monoschicht wurde durch TER-Werte mit einem Durchschnitt von mehr als 200 Ω x cm2bestätigt, die im Laufe der Zeit stabil blieben (Abbildung 2).
Die funktionelle Validierung dieser Methode wurde durch Phagozytose-Assays durchgeführt. Maus-RPE-Zellen wurden auf Membraneinsätzen kultiviert und mit FITC-markiertem Rinder-POS gefüttert. POS-Einschleusung und Verdauung wurden durch fluoreszierende Mikroskopie demonstriert (Abbildung 3).
Abbildung 1. RPE-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten. (A) 10x Hellfeld-Mikrographien von RPE-Zellen 24 h nach der Aussaat auf den Membraneinsätzen und (B) nach einer Woche. (C) Transmissionselektronenmikroskope zeigen für zwei Wochen apikale Mikrovilli, Basalinfoldings und Melaninpigmente (schwarze Flecken) des RPE, die auf den Membraneinsätzen kultiviert sind. Maßstabsbalken: A, B: 100 m, C: 2 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. TER im Laufe der Zeit. Der transepitheliale elektrische Widerstand (TER) von 60 primären Maus-RPE-Zellkulturen auf Membraneinsätzen wurde nach 0,5 (n=33), 1 (n=58), 1,5 (n=54) und 2 (n=60) Wochen gemessen. TER erreicht über 200 Ω x cm2 x 72 Stunden und bleibt mindestens zwei Wochen stabil. Daten, die als Einzelwerte mit durchschnittlichen ± SD dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3. Phagozytose-Assays. 40x fluoreszierende Mikrographien von primären Maus-RPE-Kulturen, die zwei Stunden lang mit FITC-markiertem Rinder-POS (grün) gefüttert und mit Methanol25fixiert wurden. Kleinere Fragmente entsprechen dem verdauten POS im Zytoplasma der Zelle. Die Visualisierung enger Knoten (rot) wurde durch Immunfärbung mit Antikörpern gegen ZO1 wie zuvor beschrieben1,9erleichtert. DAPI (blau) wurde verwendet, um Kerne zu färben. Typische Maus-RPE-Zellen mit zwei Kernen können in der Mitte des Bildes beobachtet werden. Maßstabsleiste: 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Während mehrere Methoden für die Mürmaus-RPE-Zellisolierung und -kultur vor1,13,20,22,26,27entwickelt worden waren, verwendete Fernandez-Godinos Methode erstmals Membraneinsätze, die das effiziente Wachstum der RPE-Zellen in kultur für Wochen1 ,9ermöglichten. Eine weitere wichtige Änderung in ihrem Protokoll1,9 war die Verwendung von enzymatischen Lösungen anstelle von mechanischem Peeling, um die RPE-Zellen1,13,20,26zu dissoziieren. Die Linsen wurden durch einen Schnitt in der Hornhaut entfernt, so dass das Irisepithel intakt blieb und die Integrität der Netzhaut während der ersten Inkubation erhalten blieb. Die schonende Isolierung der RPE-Zellen in Kombination mit der Verwendung von Membraneinsätzen und spezifischem RPE-Medium23 führt zu einem verbesserten Zellüberleben, was die Bildung einer funktionellen konfluenten Monoschicht verbessert, die die physiologischen Bedingungen des RPE innerhalb weniger Tage in Kultur2imitiert. In der Regel zeigen primäre Maus-RPE-Zellen, die mit dieser Methode kultiviert werden, sechseckige Morphologie, Polarisation, Pigmentierung, Barriereeigenschaften und Proliferation. Darüber hinaus kann das RPE in Abwesenheit von Serum vom dritten Tag bis zu mehreren Wochen kultiviert werden, was wichtig ist, um komplementierte RPE-Pathologien zu untersuchen9.
Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass primäre Maus-RPE-Zellen, die auf Membraneinsätzen kultiviert werden, nicht erweitert werden können. Die Passaging primäre Maus RPE-Zellen mit enzymatischen Lösungen oder kultivieren sie für eine lange Zeit führt zu Verlust der Pigmentierung, De-Differenzierung, und verringert TER, wodurch die Eigenschaften, die in vivo-Eigenschaften ähneln verlieren. Die begrenzte Menge an RPE-Zellen, die von einem Tier gewonnen wird, verpflichtet sich, Proben von verschiedenen Tieren für transkriptomische und proteomische Analysen zu bündeln, bei denen relativ große Mengen an Ausgangsmaterial erforderlich sind. Es wird nicht empfohlen, die RPE-Kulturen zu vergrößern, indem mehr Augen in einen größeren Membraneinsatz gebündelt werden, da dies zu einem höheren Prozentsatz des Zelltodes und mehrschichtigen RPE-Kulturen führen kann.
Es gibt auch einige wichtige Schritte für das Protokoll. Nicht mehr als zwei Augen sollten gleichzeitig geerntet werden, bis etwas Erfahrung gemacht wird, da eine längere Sezierzeit zu einem höheren Prozentsatz des Zelltodes führt. Der Sehnerv darf erst vor der Inkubation mit Trypsin abgeschnitten werden. Es ist wichtig, die Augenmuschel zu behandeln, ohne die RPE-Zellen zu stören, aber der Sehnerv wird durch Trypsin verdaut, was zu Verunreinigungen in den RPE-Kulturen führt. Das Abschälen der Augenmuskeln muss mit Vorsicht durchgeführt werden. Wenn die Sklera perforiert ist und die neuronale Netzhaut herausspringt, muss das Auge verworfen werden, da die RPE-Zellen beschädigt werden und nicht überleben. Es sollte ein minimaler Druck ausgeübt werden, um die Linsen zu entfernen. Es ist vorzuziehen, einen größeren Hornhautschnitt durchzuführen. Es ist wichtig, dass die Augenmuschel offen ist und vollständig in Trypsin getaucht ist, so dass alle RPE-Zellen der Lösung ausgesetzt sind. Die RPE-Zellen müssen durch sanftes Schütteln der Augentasse und niemals durch Sprühen von Medien oder mechanisches Peeling gesammelt werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Ocular Genomics Institute in Massachusetts Eye and Ear unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable | BD Biosciences | 309604 | |
| 15 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-103 | |
| 50 ml centrifuge tube | VWR International | 21008-951 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | M4526-500ML | |
| Angled micro forceps | WPI | 501727 | |
| Bench-top centrifuge | any | ||
| CO2 incubator | Thermo | HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V | |
| Dissecting microscope | Any | ||
| Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length | WPI | 14101 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm | BD Biosciences | 353001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Heat inactivated. |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red | Life Technologies | 14175095 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6 | Life Technologies | 14025092 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630106 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H-3506 1G | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-0396 | |
| Laminar flow hood | Thermo | CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA | |
| Laminin 1mg/ml | Sigma-Aldrich | L2020-1 MG | Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml |
| McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long | WPI | 503216 | |
| Non-essential amino acids 100X | Gibco | 11140050 | |
| N1 Supplement 100X | Sigma-Aldrich | N6530-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-148 | |
| Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11 | Fisher-Scientific | 08-914B | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-0625 | |
| Tissue culture treated 12-well plates | Fisher-Scientific | 08-772-29 | |
| Tissue culture treated 6-well plates | Fisher-Scientific | 14-832-11 | |
| Transwell supports 6.5 mm | Sigma-Aldrich | CLS3470-48EA | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T-5516 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips | WPI | 500232 | |
| Vannas Scissors 8cm long, stainless steel | WPI | 501790 | |
| Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size | Fisher-Scientific | 6780-2504 |
References
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