ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Protokollen som presenteres her gir en trinnvis tilnærming for isolering av hjertebeboermakrofager fra sinoatrialnoden (SAN) og atrioventrikulære node (AVN) -regionen av musehjerter.
Abstract
Resident hjerte makrofager har vist seg å lette den elektriske ledningen i hjertet. Den fysiologiske hjerterytmen initieres av elektriske impulser generert i sinoatrialnoden (SAN) og ledes deretter til ventrikler via atrioventrikulær node (AVN). For å studere rollen som bosatt makrofager i hjerteledningssystemet, er det nødvendig med en skikkelig isolasjon av bosatte makrofager fra SAN og AVN, men det er fortsatt utfordrende. Her gir vi en protokoll for pålitelig mikrodisseksjon av SAN og AVN i murine hjerter etterfulgt av isolasjon og kultur av bosatt makrofager.
Både SAN som ligger i krysset mellom crista terminalis og den overlegne vena cava, og AVN som ligger på toppen av trekanten Koch, er identifisert og mikrodissekert. Korrekt plassering bekreftes ved histologisk analyse av vevet utført med Massons trikrome flekk og ved anti-HCN4.
Mikrodissected vev blir deretter enzymatisk fordøyd for å oppnå enkeltcellesuspensjoner etterfulgt av inkubasjon med et spesifikt panel av antistoffer rettet mot celle-type spesifikke overflatemarkører. Dette gjør det mulig å identifisere, telle eller isolere forskjellige cellepopulasjoner ved fluorescerende aktivert cellesortering. For å skille hjertebeboermakrofager fra andre immunceller i myokardiet, spesielt rekrutterte monocyttavledede makrofager, er det nødvendig med en delikat utviklet gatingstrategi. For det første oppdages lymfoide avstamningsceller og utelukkes fra videre analyse. Deretter identifiseres myeloide celler med bosatte makrofager som bestemmes ved høyt uttrykk av både CD45 og CD11b, og lavt uttrykk for Ly6C. Med cellesortering kan isolerte hjertemakrofager deretter dyrkes in vitro over flere dager for videre undersøkelse. Vi beskriver derfor en protokoll for å isolere hjertebeboermakrofager lokalisert i hjertets ledningssystem. Vi diskuterer fallgruver i mikrodissekering og fordøyelse av SAN og AVN, og gir en gating-strategi for pålitelig å identifisere, telle og sortere hjertemakrofager ved fluorescensaktivert cellesortering.
Introduction
Den sinoatriale knuten (SAN) initierer fysiologisk den elektriske impulsen og er derfor den primære pacemakeren i hjertet. Den atrioventrikulære knuten (AVN) utfører den elektriske impulsen fra atriene til ventriklene og fungerer også som en subsidiær pacemaker1. Generelt er generering og ledning av elektriske impulser en kompleks prosess som kan moduleres av ulike faktorer2, inkludert bosatt makrofag i SAN / AVN-regioner. En nylig studie av Hulsmans og medarbeidere demonstrerer en spesifikk populasjon av hjertebeboermakrofager som er beriket i AVN og fungerer som nøkkelspillere for å holde et jevnt hjerteslag3. De fant at makrofager er elektrisk koblet til kardiomyocytter og kan endre de elektriske egenskapene til koblede kardiomyocytter. Forfatterne bemerker også at slike ledende celler som går sammen med makrofager, også er tilstede i andre komponenter i hjerteledningssystemet, som SAN.
Foreløpig er det ikke fullt kjent om fenotypen av bosatte hjertemakrofager varierer mellom hjerteregionene. Det er imidlertid vist at vevsmikromiljøet kan påvirke transkripsjon og proliferativ fornyelse av vevsmakrofager4. Videre, siden kardiomyocyttfenotypen har vist seg å være forskjellig mellom regioner, kan de funksjonelle effektene av makrofager på kardiomyocytter også være regionspesifikke, selv om makrofagfenotypen i seg selv kan være den samme. Derfor er det behov for ytterligere studier på spesifikke hjerteregioner.
Nylige studier har vist at ved steady state etableres vevsbeboermakrofagene prenatalt, som oppstår uavhengig av definitiv hematopoiesis, og vedvarer inn i voksen alder5. Etter uttømming av makrofag eller under hjertebetennelse bidrar imidlertid Ly6c hi-monocytter til å fylle opp hjertemakrofagpopulasjonen6. Studier som involverte genetisk avstamningssporing, parabiose, skjebnekartlegging og cellesporing viste sameksistensen av en rekke populasjoner av vevsboende makrofager i organer og vev, og også forskjellig cellulær oppførsel av makrofagundergrupper som potensielt er forbundet med deres ontogeni 7,8,9.
Karakterisering av bosatte hjertemakrofager har hatt nytte av bruk av magnetisk aktivert cellesortering (MACS) og fluorescerende aktivert cellesortering. Disse metodene er spesielt nyttige for å isolere spesifikke cellepopulasjoner fra flere vevsfraksjoner ved å merke dem med deres celleoverflatemarkører. Dette fører ikke bare til en høyere renhet av den isolerte immuncelletypen, men tillater også fenotypisk analyse. Her presenterer vi en protokoll som inkluderer magnetiske perlebelagte celler etterfulgt av fluorescerende aktivert cellesortering for anrikning av hjerteboende makrofager spesielt isolert fra SAN- og AVN-regionen.
For å utforske egenskapene til hjertebeboermakrofager i ledningssystemet og deres funksjon for hjerteledning og arytmogenese, er presis lokalisering og disseksjon av SAN og AVN kritisk. For mikrodisseksjon av SAN og AVN brukes anatomiske landemerker for regionidentifikasjon10. Kort sagt, SAN ligger i krysset mellom den overlegne vena cava og høyre atrium. AVN ligger innenfor trekanten Koch, som er fremre avgrenset av septalbrosjyren til tricuspidventilen, og bakre av senen til Todaro11. Vi tilbyr også en nøyaktig mikrodisseksjonsprosedyre for SAN og AVN hos mus som bekreftes av histologi og immunfluorescensfarging.
Isolerte bosatt makrofager kan brukes til videre eksperimenter som RNA-sekvensering eller kan gjenopprettes og dyrkes i mer enn to uker slik at ulike in vitro-eksperimenter kan gjenopprettes. Derfor beskriver vår protokoll en svært verdifull prosedyre for immuno-rytologen. Tabell 1 viser sammensetningen av alle løsningene som trengs, figur 1 viser mikrodisseksjonslandemerkene for SAN og AVN. Figur 2 er skjematisk illustrasjon av SAN- og AVN-lokalisering. Figur 3 viser histologisk farging av SAN og AVN (Massons trikrom- og immunfluorescensfarging). Figur 4 viser en trinnvis gatingstrategi for å isolere hjertebeboermakrofager ved fluorescensaktivert cellesortering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrepleie og alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med retningslinjene fra Animal Care and Ethics committee ved Universitetet i München, og alle prosedyrene som ble utført på mus ble godkjent av regjeringen i Bayern, München, Tyskland. C57BL6/J-mus ble kommersielt oppnådd.
1. Forberedelser
- Klargjør cellesorteringsbuffer (tabell 1) og oppbevar ved 4 °C.
MERK: Under hele eksperimentprosedyren skal cellesorteringsbufferen alltid være på is. - Forbered fordøyelsesbuffer (tabell 1) kort tid før fordøyelsen, da aktiviteten til kollagenase bare kunne oppdages i noen timer ved romtemperatur.
- Se tidligere publisert protokoll for fremstilling av disseksjonsrett10. Kort sagt, tilsett 30 ml agarosegel (3% -4%) i en petriskål med diameter på 100 mm og avkjøl ved romtemperatur.
2. Dyreofring og hjerteeksisjon
- Bedøv musen med isofluran ved å plassere den i et inkubasjonskammer forbundet med en isofluran fordamper og skylles med 5% isofluran / 95% oksygen.
- Etter injeksjon av fentanyl for analgesi, åpne ribbe buret og perfuse hjertet ved å injisere 5-10 ml iskald 1x PBS direkte inn i venstre ventrikel (LV). Trekk ut musens hjerte og legg det på disseksjonsskålen. Eksperimentelle detaljer er beskrevet i detalj tidligere10.
3. Mikrodisseksjon av SAN og AVN
- Etter å ha isolert hjertet, utfør følgende mikrodisseksjonsprosedyrer i disseksjonsskålen med iskald 1x PBS under dissekeringsmikroskopet.
- Bruk hjerteanatomiske landemerker, dvs. aorta, lungearterie, koronar sinus, venstre / høyre ventrikel, etc. for å bestemme venstre / høyre (venstre: LV; høyre: RV) og fremre / bakre (fremre: aorta; bakre: koronar sinus) i hjertet. Etter at orienteringen er bestemt, snu hjertet med forsiden av det på bunnen av parabolen (for å eksponere de store venene som ligger bakre).
- Mikrodisseksjon av SAN
MERK: Mikrodisseksjon av SAN er tidligere beskrevet10. Prosessen er beskrevet i korte trekk nedenfor.- Utsett interkavalområdet ved å feste høyre atrievedheng (RAA) og vevet ved siden av overlegen vena cava (SVC) og dårligere vena cava (IVC) på mikrodisseksjonsskålen ved hjelp av insektpinner.
- Skjær hjertet langs interatrialseptumet parallelt med crista terminalis (CT) for å separere interkavalområdet og for å få SAN-prøven (figur 1A, figur 2A). Sett prøven i et tomt 1,5 ml mikrosentrifugerør på is.
- Mikrodisseksjon av AVN
- Etter innsamling av SAN-prøven sikre at RAA og deler av riktig atrium (RA) allerede er kuttet bort slik at bare interatrial septum (IAS) og interventrikulær septum (IVS).
- Fest de resterende delene av hjertet gjennom vevet ved siden av IAS og IVS ved hjelp av insektpinner for å gjøre høyre atrieside av IAS vendt opp.
- Se på høyre atrium på endokardialoverflaten for trekanten Koch. Det vil bli avgrenset fremre av hengsellinjen til septalbrosjyren til trikuspidalklaffen (TV), og bakre av senen til Todaro. Åpningen av koronar sinus observeres ved basen. (Figur 1B, figur 2B).
- Klipp trekanten til Koch, som inneholder AVN, og legg den direkte i et tomt 1,5 ml mikrosentrifugerør på is.
4. Fordøyelse
- Forbered fordøyelsesbufferen (tabell 1) kort tid før bruk.
- Hakk SAN- og AVN-vevet godt med skalpeller.
MERK: Hakking av vevet godt vil øke fordøyelseseffektiviteten og bidra til å få god cellesuspensjon for sortering. Siden SAN- og AVN-prøvene er ganske små, anbefales det å hakke vevet direkte inne i 1,5 ml mikrosentrifugerøret for å redusere tapet av prøven. - Tilsett 500 μL fordøyelsesbuffer per prøve og vask ned alt hakket vev fra veggen på 1,5 ml mikrosentrifugerøret. Skånsom pipettering hjelper til med å fordøye prøven.
- Homogeniser røret på en virvelmaskin (innstillinger: 37 ° C, 750 o / min i 1 time).
- Etter fordøyelsen, overfør vevsuspensjonen til et friskt 15 ml sentrifugerør ved å passere gjennom en 40 μm cellesil. Skyll cellesilen med ytterligere 5 ml cellesorteringsbuffer for å stoppe fordøyelsen.
- Sentrifuge 15 ml rør ved 350 x g i 7 min ved 4 °C. Fjern deretter supernatanten helt ved hjelp av pipetten. Resuspend cellepelleten med 90 μL cellesorteringsbuffer.
MERK: Før magnetisk separasjon, pipetter cellen suspensjon forsiktig et par ganger eller passere gjennom en 30 μm celle sil for å fjerne celleklumper om nødvendig, for å oppnå en enkelt celle suspensjon for optimal ytelse av magnetisk anrikning av interessante cellepopulasjoner.
5. Magnetisk anrikning av CD45 og prøvefarging
MERK: For å isolere hjertemakrofagene med høy sorteringseffektivitet ble utelukkelse av uønskede celler, inkludert lymfocytter, utført med CD45-mikroperler i henhold til produsentens protokoll. Basert på sorteringspanelet ble hjertebeboermakrofager identifisert som CD45 høy CD11b høy CD64 høy Ly6Clav/int F4/80 høy.
- Tilsett 10 μL CD45 mikroperler per 107 celler totalt til cellesuspensjonen i 15 ml sentrifugerøret. Bland prøvene godt og inkuber dem i 15 minutter ved 4 °C.
MERK: Celletellingen ved hjelp av et hemocytometer bør gjøres kort for å sikre at hvert rør ikke inneholder mer enn 107 celler totalt. Når du arbeider med høyere celletall, må volumet av magnetiske perler skaleres opp. - Klargjør antistoffblandingen ved å fortynne følgende antistoffer i cellesorteringsbuffer (1:100 fortynning for hvert antistoff): CD45-PE, CD11b-APC-Cy7, CD64-APC, F4/80-PE-Cy7, Ly6C-FITC. DAPI vil bli lagt senere til farging for levende / døde diskriminering.
- Etter 15 min magnetisk dråpeinkubasjon, tilsett 100 μL antistoffblanding direkte inn i cellesuspensjonen i 15 ml røret (da er alle antistoffenes endelige konsentrasjon 1:200) og inkuber i 20 minutter ved 4 ° C.
- Etter 20 minutter med antistoffinkubasjon, vask cellesuspensjonen ved å tilsette 1-2 ml cellesorteringsbuffer per 107 celler og sentrifuge ved 350 x g i 10 minutter. Fjern supernatanten helt ved pipettering.
- Resuspend opptil 108 celler i 500 μL cellesorteringsbuffer.
MERK: Maksimalt cellenummer for magnetisk separasjon skal bestemmes i henhold til produsentens protokoll. - Forbered det magnetiske separasjonssettet.
- Fest magnetsøylen til en egnet magnetisk separator og plasser et oppsamlingsrør under magnetsøylen.
- Forbered de magnetiske kolonnene ved å skylle med cellesorteringsbuffer: legg til 500 μL cellesorteringsbuffer øverst i kolonnen og la bufferen passere gjennom.
- Bruk cellesuspensjonen umiddelbart på kolonnen mens cellesorteringsbufferen passerer.
NOTAT: Unngå dannelse av luftbobler i kolonnen. I henhold til fremstillingsprotokollen, selv om kolonnefyllingstiden kan endres fra lagringsforholdene, har den ingen innflytelse på kvaliteten på separasjonen. - Vask kolonnen med 3 x 500 μL cellesorteringsbuffer. Gjennomstrømningen i trinn 5.7 og trinn 5.8 inneholder umerkede celler, som kan forkastes hvis det ikke er behov for ytterligere eksperimenter.
MERK: Legg til cellesorteringsbufferen umiddelbart når kolonnereservoaret er nesten tomt. - Fjern kolonnen fra magnetseparatoren og legg den på et nytt oppsamlingsrør.
- Legg til 1 ml cellesorteringsbuffer i kolonnen. Skyll kolonnen umiddelbart ved å påføre stempelet som følger med kolonnen. Gjennomstrømningen inneholder de magnetisk merkede cellene.
- Legg til DAPI-løsning i alle de innsamlede magnetisk merkede cellesuspensjonene kort tid før du kjører dem på cellesortereren. Juster den endelige konsentrasjonen av DAPI til 0,3-0,5 μg / ml.
- Utfør FACS-analyse.
6. Prøver for kompensasjon
- Forbered 6 brune 1,5 ml mikrosentrifugerør merket som henholdsvis "PE", "APC-Cy7", "APC", "PE-Cy7", "FITC" og "DAPI" for å beskytte antistoffer mot lys. Forbered et 1,5 ml mikrosentrifugerør merket som "unstained".
MERK: Dette kan gjøres samtidig som cellesuspensjonen inkuberes med mikroperler og antistoffer. Den ufargede prøven kan være kardiomyocyttvevet som samles tilfeldig fra det sparte hjertevevet og også behandles i henhold til trinn 4. - Fortynn hvert enkelt fluorescenskonjugert antistoff med cellesorteringsbuffer til 1:50 i de 1,5 ml brune mikrosentrifugerørene som er merket tilsvarende.
- Tilsett en dråpe kompensasjonsperleløsning og inkuber i 20 minutter ved 4 °C.
- Tilsett 2 ml cellesorteringsbuffer i hvert 1,5 ml brunt mikrosentrifugerrør og sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter. Kast supernatanten fullstendig og resuspender perlen som inneholder pellet med 300 μL cellesorteringsbuffer og overfør dem til cellesorteringsrør som også er merket tilsvarende.
7. Kjører på cellesorterings- og gatingstrategien
- Påfør de ufargede prøve- og kompensasjonsrørene først og juster spenningene til hver kanal for å justere både den positive og negative toppen til riktig posisjon av aksen. Lagre kompensasjonsinnstillingene, og bruk dem på følgende eksempler.
- Påfør prøvene på cellesortereren. Angi gating-strategien som beskrevet i figur 4. Hjertebeboermakrofager er identifisert som CD45 høy CD11b høy CD64 høy Ly6Clav / int F4/80høy. DAPI brukes som en celle levedyktighet markør.
- Kontroller flowcytometridiagrammene for å bekrefte at cellepopulasjonen av interesse er riktig vist på diagrammene. Hvis ikke, juster spenningen til hver kanal til midtvisningen av hvert diagram.
- Hvis spenningsinnstillingene er tilfredsstillende, start sorteringsprosedyren. Samle den sorterte cellepopulasjonen i kulturmedium sammensatt av DMEM som inneholder 10% føtalt bovint serum, supplert med 100 μg / ml streptomycin og 100 U / ml penicillin.
8. Resident makrofager kultur
- Etter å ha samlet de sorterte makrofagene, overfør cellene umiddelbart enten til 35 mm vevskulturretter eller 24 brønnplater, eller bruk dem direkte til påfølgende eksperimenter.
- For å dyrke sorterte makrofager, inkuber cellene ved 37 °C, 5% CO2 inkubator.
- Endre kulturmediet hver 48-72 timer. Flytende døde celler kan enkelt fjernes ved middels forandring. Bruk levende makrofager festet til bunnen av kulturskålen for påfølgende eksperiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi beskriver en praktisk prosedyre for isolering av hjertebeboermakrofager spesifikt fra SAN- og AVN-regionen. For å bekrefte korrekt disseksjon utføres Massons Trichrome-farging og immunfluorescerende HCN4-farging (figur 3)12. Med denne protokollen kunne vi samle omtrent 60 000 makrofager fra ett helt hjerte. Figur 4 viser gatingstrategien for sortering av hjertemakrofager. Hjertemakrofager med levende alder ble identifisert som CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. Figur 5 viser nysorterte hjertemakrofager som ble identifisert ved overflateantigenene CD45, F4/80 og CD11b. Nysorterte celler ble observert under lysfeltvisning av mikroskop (figur 5A). De sorterte cellene var positive for CD45 (CD45+) når de ble observert under fluorofor-PE-kanalen (figur 5B). Den samme visningen av de sorterte cellene når de ble observert under fluorofor-APC-Cy7-kanal viste CD11b+ fenotype (figur 5C). Den samme visningen av de sorterte cellene når de ble observert under fluorofor-PE-Cy7-kanalen viste F4/80+ fenotype (figur 5D). Figur 5E er det sammenslåtte bildet oppnådd med fluorescerende mikroskop for de sorterte cellene. Disse trippel positive cellene ble identifisert som hjertebeboer makrofager. Figur 6 viser isolerte hjertemakrofager dyrket i medium opptil 6 dager. Hvite piler indikerer makrofager, svarte piler indikerte flytende døde celler med rund form.
Figur 1: Anatomi av SAN og AVN under disseksjonsmikroskopet. (A) Anatomi av SAN under disseksjonsmikroskopet. Plasseringen av SAN er indikert med rød stiplet linje i interkavalområdet (svarte stiplede linjer). (B) Anatomi av AVN under disseksjonsmikroskopet. Dette tallet er endret fra tidligere publisert artikkel10. AVN (rød stiplet sirkel) er plassert på toppen av trekanten Koch (hvit stiplet trekant) nær bunnen av den membranøse septum. Trekanten til Koch er dannet av senen til Todaro (TT, grønn stiplet linje), trikuspidalklaff (TV, blå stiplet linje) og åpningen av koronar sinus (CS, gul stiplet linje). SVC, overlegen vena cava; IVC, dårligere vena cava; IAS, interatrial septum; RA, høyre atrium; RAA, høyre atrial appendage; RV, høyre ventrikel; CT, Crista terminalis; IVS, interventrikulær septum; OF, oval fossa. PA, lungearterie; RV, høyre ventrikel; LV, venstre ventrikkel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av SAN- og AVN-lokalisering. (A) skjematisk illustrasjon av SAN-lokalisering. SAN indikeres av en rød stiplet sirkel i interkavalområdet i tillegg til CT (svart stiplet linje). (B) skjematisk illustrasjon av AVN-lokalisering. AVN er indikert med en rød stiplet sirkel inne i Koch-trekanten (grå stiplet trekant) sammensatt av TV og åpningen til CS. SVC, superior vena cava; IVC, dårligere vena cava; IAS, interatrial septum; RA, høyre atrium; RAA, høyre atrial appendage; CT, Crista terminalis; IVS, interventrikulær septum; OF, oval fossa; IVS, interventrikulær septum. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Identifisering av SAN og AVN med histologisk flekk. Identifikasjon av SAN (A,B) og AVN (C,D). Immunfluorescerende farging av HCN4-positive ledningssystemceller i SAN (A) og AVN (C) samt Massons trikromfarging av SAN (B) og AVN (D). Røde piler indikerer sinusnodearterie (SNA, B), svart pil og svart stiplet linje indikerer kompakt AVN, blå pil indikerer det sentrale fibrøse legemet (CFB). CT, crista terminalis; CFB, sentral fibrøs kropp; CN, kompakt AVN; RA, høyre atrium; RV, høyre ventrikel; IAS, interatrial septum; IVS, interventrikulær septum; TV, tricuspid ventil; MV, mitralventil. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Gatestrategi for cellesortering av beboer hjertemakrofager. Mononukleære celler identifiseres, dubletter utelukkes av FSC-W vs. FSC-A og døde celler utelukkes av DAPI (A-D). Levende celler er inngjerdet på CD45+ leukocytter (E), og deretter inngjerdet på CD11b + myeloide celler (F). Kardiale makrofager ble identifisert ved ekspresjon av både F4/80 og CD64 (G), og deretter til slutt stratifisert ved Ly6C-ekspresjon (H). Hjertemakrofager med levende beboere er identifisert som CD45+CD11b+F4/80+CD64+Ly6C-. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Nysorterte hjertemakrofager og immunfluoriserende farging. (A) Nysorterte hjertemakrofager. Immunfluorescerende farging av spesifikke overflateantigener som CD45 (B), CD11b (C) eller F4/80 (D). Ifølge gating-strategien identifiseres hjertemakrofager som trippel positive celler (E). Skalalinjen representerer 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kultur av sorterte makrofager. Kultur av sorterte makrofager i kulturmedium i henholdsvis 48t (A, B), 96 h (C, D) og 6 dager (E, F). To individuelle kulturretter per tidspunkt vises (tallerken 1: A, C, E; tallerken 2: B, D, F). Hvite piler indikerer levende makrofager med spindellignende form og typiske fremspring3. Svarte piler indikerer flytende døde celler med rund form. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Sammensatt | Endelig konsentrasjon | g eller ml kreves |
| FACS buffer | ||
| BSA | 0.50% | |
| EDTA | 2 mM | |
| PBS (1X) | 500 ml | |
| Fordøyelse buffer | ||
| Kollagenase I | 450 U/ml | |
| Kollagenase XI | 125 U/ml | |
| DNase I | 60 U/ml | |
| Hyaluronidase | 60 U/ml | |
| HEPES-buffer | 20 mikroliter per 1 ml | |
| PBS (1X) | Tilsett opptil 1 ml for 2 prøver | |
| Kulturmedium | ||
| DMEM | 79 ml | |
| Penicillin/streptomycin | 1% | 1 ml |
| FBS | 20% | 20 ml |
| TAE (50x) | ||
| Tris-base | 24.20% | 24,2 g |
| 100 % eddiksyre | 5.71% | 5,71 ml |
| 0,5 M EDTA | 0,05 moh | 10 ml |
| dH2O | Tilsett opptil 100 ml | |
Tabell 1: Sammensetning av nødvendige løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll for anrikning av hjertebeboermakrofager spesifikt fra SAN- og AVN-regionene med høy renhet.
Makrofager er delt inn i underpopulasjoner basert på deres anatomiske plassering og funksjonelle fenotype. De kan også bytte fra en funksjonell fenotype til en annen som svar på variable mikromiljøsignaler13. Sammenlignet med andre organer som benmarg og lever, inneholder hjertevev en lavere prosentandel av immunceller og lavere absolutte tall for hver cellulær subpopulasjon14. Derfor er cellesortering, anrikning og rensemetoder nødvendige verktøy for å oppnå tilstrekkelige mengder av cellepopulasjonen av interesse. Fluorescensaktivert cellesortering, og MACS tillater å oppnå rene, sorterte cellepopulasjoner, da det tillater samtidig måling av ulike egenskaper til cellene.
Ulike flowcytometripaneler er beskrevet for identifisering av subpopulasjoner av hjertemakrofager 3,6,15. Funksjonen av makrofager i steady state og sykdom avhenger ikke bare av deres utviklingsmessige opprinnelse, men også av vevsmiljøet. Generelt inneholder det voksne hjertet to hovedundergrupper av Ly6Clave/CCR2-bosatte makrofager som uttrykker forskjellige nivåer av MHC-II og som kan opprettholde seg selv via lokal proliferasjon ved steady state, mens klassiske Ly6C-monocytter rekrutteres til steder med betennelse under sykdom, hvor de differensieres til makrofager16 . Under utviklingen okkuperer forskjellige underpopulasjoner av makrofager forskjellige hjertesteder assosiert med forskjellige funksjoner17. Vi ønsket å studere de bosatte makrofagene spesifikt fra hjertets ledningssystem, spesielt de bosatte makrofagene fra SAN- og AVN-regionene. Ifølge Hulsmans og medarbeidere er hjertebeboer makrofager identifisert som CD45 høy CD11b høy CD64høy F4/80høy Ly6Clav/int.
Innhøstingen av hjertebeboermakrofager fra en voksen mus for cellesortering krever ca. 3 timer. Det er viktig å ordne de eksperimentelle prosedyrene logisk og å tillate inkubasjon parallelt for å spare tid og for å minimere håndteringen av de muligens skjøre makrofagene i suspensjonen. Siden sorteringsprosedyren kunne utøve press på de sorterte cellene, anbefalte vi å redusere sorteringstiden ved å bruke magnetiske perler som kunne øke sorteringseffektiviteten enormt og også tillate å oppnå høyere renhet av bosatte makrofager.
Anvendelsen av denne protokollen inkluderer, men er ikke begrenset til, rensing av makrofager og / eller andre ikke-kardiomyocytcelletyper fra hjertevevet og andre musestammer. De sorterte makrofagene kan brukes til påfølgende eksperimenter, for eksempel cellemotilitetsanalyser, gen- eller proteinuttrykksstudier, etc. Encellet RNA-sekvensering er også mulig ved å samle celler en etter en direkte fra oppsamlingsrøret til cellesorteren.
Flowcytometribasert cellesortering har imidlertid sine begrensninger. Et nøyaktig designet antistoffpanel er viktig og må vurdere uttrykket av antigener på cellepopulasjonen av interesse og fluoroforen konjugert til antistoffene. Cellenes funksjon og levedyktighet kan endres av bindingsantistoffene, noe som kan påvirke utfallet av påfølgende eksperimenter. I tillegg er de komplekse cellesorteringsinstrumentene dyre, sofistikerte og også utsatt for problemer med fluidikksystemblokkeringer og laserkalibrering. Derfor er vedlikehold av høyt utdannet spesialist og riktig drift av en erfaren profesjonell tekniker nødvendig. Selv om cellesortering kan gi en ren cellepopulasjon av interesse, er den totale effektiviteten fortsatt relativt lav.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen potensiell interessekonflikt som er relevant for denne artikkelen ble rapportert.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av China Scholarship Council (CSC, til R. Xia), det tyske senteret for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss, 81Z0600206 til S. Kääb, 81Z0600204 til CS), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), SFB 914 (prosjekt Z01 til S. Massberg), ERA-NET om kardiovaskulære sykdommer (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss) og Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss). Finansiørene hadde ingen rolle i utarbeidelsen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories |
References
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al.
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
Tags
Medisin utgave 171 hjerteledningssystem sinoatrial node atrioventrikulær node bosatt hjertemakrofager flowcytometri magnetisk aktivert cellesortering MACS fluorescensaktivert cellesortering mikrodisseksjon primær cellekulturErratum
Formal Correction: Erratum: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-Unversity Munich (LMU)
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex) LMU Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
to:
Ruibing Xia123
Simone Loy1
Stefan Kääb13
Anna Titova1
Christian Schulz123
Steffen Massberg123
Sebastian Clauss123
1University Hospital Munich, Department of Medicine I Ludwig-Maximilian-University Munich (LMU)
2Insitute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig-Maximilians-University (LMU)
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA)
