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Analyse comparative de méthodes expérimentales pour quantifier l’activité animale dans les modèles de maladie mitochondriale de Caenorhabditis elegans

Published: April 4, 2021 doi: 10.3791/62244
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1,2
1Mitochondrial Medicine Frontier Program, Division of Human Genetics, Department of Pediatrics, The Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Cette étude présente des protocoles pour deux approches d’analyse de l’activité locomotrice semi-automatisées chez les vers gas-1de la maladie du complexe I de C. elegans (fc21),à savoir ZebraLab (un test à débit moyen) et WormScan (un test à haut débit) et fournit une analyse comparative parmi un large éventail de méthodes de recherche pour quantifier le comportement des nématodes et la fonction neuromusculaire intégrée.

Abstract

Caenorhabditis elegans est largement reconnu pour son utilité centrale en tant que modèle animal translationnel permettant d’interroger efficacement les mécanismes et les thérapies de diverses maladies humaines. Les vers sont particulièrement bien adaptés aux écrans génétiques et médicamenteux à haut débit pour mieux comprendre les cibles thérapeutiques et les thérapies en exploitant leur cycle de développement rapide, leur grande taille de couvain, leur courte durée de vie, leur transparence microscopique, leurs faibles coûts de maintenance, leur suite robuste d’outils génomiques, leurs dépôts mutants et leurs méthodologies expérimentales pour interroger la physiologie in vivo et ex vivo. L’activité locomotrice du ver représente un phénotype particulièrement pertinent qui est fréquemment altéré dans la maladie mitochondriale, qui est très hétérogène dans les causes et les manifestations, mais partage collectivement une capacité altérée à produire de l’énergie cellulaire. Bien qu’une série de méthodologies différentes puisse être utilisée pour interroger le comportement des vers, celles-ci varient considérablement en termes de coûts expérimentaux, de complexité et d’utilité pour les éventreurs génomiques ou à haut débit de médicaments. Ici, le débit relatif, les avantages et les limites de 16 méthodologies d’analyse d’activité différentes ont été comparés qui quantifient la locomotion des nématodes, le battement, le pompage pharyngé et / ou la chimiotaxie chez des vers uniques ou des populations de vers de C. elegans à différents stades, âges et durées expérimentales. Des protocoles détaillés ont été démontrés pour deux méthodes semi-automatisées de quantification de l’activité locomotrice des nématodes qui représentent de nouvelles applications des outils logiciels disponibles, à savoir ZebraLab (une approche à débit moyen) et WormScan (une approche à haut débit). Les données issues de l’application de ces méthodes ont démontré que des degrés similaires de réduction de l’activité animale se sont produits au stade larvaire L4 et ont progressé chez les adultes du jour 1, dans la maladie mitochondriale I (gas-1(fc21)par rapport aux vers mutants de type sauvage (N2 Bristol) C. elegans. Ces données valident l’utilité pour ces nouvelles applications d’utiliser les outils logiciels ZebraLab ou WormScan pour quantifier l’activité locomotrice des vers de manière efficace et objective, avec une capacité variable pour soutenir le dépistage médicamenteux à haut débit sur le comportement des vers dans les modèles animaux précliniques de maladie mitochondriale.

Introduction

Caenorhabiditis elegans est largement reconnu comme un modèle exceptionnel en neurosciences basé sur le fait qu’il a 302 neurones qui coordonnent tous les comportements des vers, y compris l’accouplement, l’alimentation, la ponte, la défécation, la natation et la locomotion sur des milieux solides1. Ces nématodes hermaphrodites sont également largement utilisés pour comprendre un large éventail de mécanismes de maladies humaines, rendus possibles par son génome bien caractérisé et son homologie élevée d’environ 80% de gènes entre C. elegans et les humains2,3,4. C. elegans a longtemps été utilisé pour interroger la maladie mitochondriale humaine5,6 ,7,8,9,10, qui est un groupe très génétiquement et phénotypiquement hétérogène de troubles métaboliques héréditaires qui partagent une capacité altérée à générer de l’énergie cellulaire et souvent cliniquement présents avec une fonction neuromusculaire considérablement altérée, une intolérance à l’exercice et une fatigue11 ,12,13,14. À cette fin, l’utilisation de modèles de C. elegans permet la modélisation préclinique des aspects quantitatifs de l’activité animale et de la fonction neuromusculaire dans différents sous-types génétiques de maladies mitochondriales, ainsi que leur réponse aux thérapies candidates qui peuvent améliorer leur fonction neuromusculaire et leur activité globale.

L’activité neuromusculaire chez C. elegans est objectivement mesurable par une gamme de méthodologies expérimentales, y compris des approches manuelles et semi-automatisées qui permettent des analyses fonctionnelles en milieu solide ou liquide (Tableau 1)1,15. Une quantification précise de l’activité de C. elegans s’est avérée importante pour permettre des découvertes liées à la fonction et au développement du système musculaire et nerveux16,17,18. Cette étude résume et compare les exigences expérimentales, les avantages et les limites de 17 tests différents qui peuvent être effectués dans des laboratoires de recherche pour évaluer la fonction et l’activité neuromusculaires sur quatre critères de jugement clés dans les modèles de maladies de C. elegans, à la fois au départ à divers stades de développement et âges ainsi qu’en réponse à des thérapies candidates (Tableau 1 ). En effet, l’étude fournit un aperçu détaillé de la gamme d’approches expérimentales disponibles pour caractériser les taux de battement de C. elegans (courbures du corps par minute), l’activité locomotrice, le pompage pharyngé et la chimiotaxie - dans chaque cas en spécifiant la méthodologie expérimentale et analytique utilisée, les avantages et les limites de chaque méthode, l’équipement et le logiciel nécessaires pour effectuer et analyser chaque essai, et la capacité de débit de chaque méthode pour soutenir son utilisation à des fins de dépistage génétique ou de dépistage de drogues à haut débit. La capacité de débit de chaque essai est décrite comme faible, moyenne ou élevée en fonction de la complexité du protocole expérimental, y compris la maintenance des vers, le temps de traitement, l’utilisation de plaques à un ou plusieurs puits et/ou le temps d’expérimentation nécessaire pour terminer le cadre expérimental et les analyses de données.

Les analyses manuelles du thrashing19,de l’activité locomotrice20,du pompage pharyngé17,21et de la chimiotaxie22,23 sont des méthodologies bien établies pour évaluer l’activité des vers qui nécessitent un stéréomicroscope24. Bien que la mesure de l’activité de battement des vers nécessite une analyse dans des milieux liquides pour déterminer la fréquence des courbures du corps par minute, l’activité locomotrice des vers peut être mesurée soit sur des milieux solides, soit dans des milieux liquides. Cependant, les analyses manuelles de l’activité individuelle des vers prennent intrinsèquement beaucoup de temps et impliquent un biais inévitable généré par l’utilisateur. L’automatisation des analyses d’activité des vers minimise les biais générés par l’utilisateur et peut augmenter considérablement le débit expérimental25. Les enregistrements vidéo de l’activité de thrashing des vers dans les milieux liquides peuvent être analysés à l’aide de wrMTrck, un plugin ImageJ26. Cependant, les paramètres expérimentaux originaux qui ont été développés pour wrMTrck ont limité son utilité, car trop de vers dans une seule goutte liquide entraînaient un chevauchement des vers qui rendait difficile le suivi précis. Bien que cette limitation expérimentale ait été résolue27, la méthode wrMTrck n’est pas en mesure de prendre en charge le criblage à haut débit.

Il existe une gamme de méthodes pour quantifier l’activité locomotrice des vers au départ et en réponse à des thérapies candidates dans des modèles de maladie mitochondriale à C. elegans. Il s’agit notamment de ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28,de la plate-forme de suivi des nématodes à large champ de vision (WF-NTP)29,de WormMotel, de WormWatcher30,de WormLab31,d’Infinity Chip32et de WMicrotracker One33 (Tableau 1). Ces méthodes permettent une analyse simultanée de la locomotion dans plusieurs souches ou conditions de vers, généralement sur des plaques multipères, prenant ainsi en charge les applications de dépistage de médicaments à haut débit. Certaines de ces méthodes ont des considérations uniques qui peuvent limiter ou améliorer leur utilité générale, telles que le besoin d’équipement coûteux par rapport aux logiciels en libre accès, et la facilité variable d’exécution des protocoles expérimentaux. Dans l’ensemble, aucun système ou protocole expérimental unique n’est parfaitement adapté à toutes les expériences d’activité locomotrice de C. elegans. Il est plutôt important de choisir avec soin la méthode la mieux adaptée aux objectifs et aux exigences expérimentales spécifiques de l’investigateur.

Le pompage pharyngé représente un autre résultat important pour évaluer l’activité neuromusculaire chez C. elegans. Le pharynx de C. elegans est composé de 20 cellules musculaires, de 20 neurones et de 20 autres cellules qui permettent l’ingestion d’Escherichia coli (E. coli)à l’extrémité antérieure du tractus alimentaire du ver34,35,36. Plusieurs méthodes manuelles ont été établies pour déterminer les taux de pompage pharyngé17,21,37,38. La plupart des méthodes sont basées sur l’utilisation d’un stéréomicroscope et d’une caméra pour visualiser et enregistrer la fréquence de pompage pharyngé avec comptage direct par l’observateur expérimental21. L’analyse automatisée du débit de pompage pharyngé est possible en effectuant un enregistrement extracellulaire appelé électropharyngéogramme (EPG), qui fournit des informations supplémentaires sur la durée de chaque pompe39. L’analyse de la vitesse de pompage pharyngé est également possible dans un système microfluidique, WormSpa, où les vers individuels sont confinés dans des chambres40,41. Une méthode commerciale disponible pour faciliter l’analyse du taux de pompe pharyngée est le système ScreenChip (InVivo Biosystems), qui mesure, visualise et analyse les aspects neuromusculaires du comportement alimentaire dans un seul ver immobilisé dans une puce personnalisée. Cette approche de quantification par pompage pharyngé peut être utilisée pour évaluer les réponses neuronales et physiologiques aux médicaments, au vieillissement et à d’autres facteurs42,43,44,45.

La chimiotaxie décrit le mouvement de C. elegans en réponse à un odorant placé loin des vers dans une zone définie de la plaque du milieu de croissance des nématodes (NGM). L’évaluation de la réponse de la chimiotaxie fournit une mesure intégrée de l’activité neuronale et neuromusculaire des vers qui est quantifiable en observant et en mesurant la distance physique parcourue par les vers vers vers l’odorant dans une période de temps définie46. Le Multi-Worm Tracker est une méthode automatique qui peut être utilisée pour améliorer l’efficacité expérimentale de la quantification de la distance parcourue par les vers vers un attractif ou à partir d’un répulsif47.

Ici, le protocole détaillé de deux nouvelles méthodes semi-automatisées établies pour quantifier l’activité des vers est décrit. La première approche utilise ZebraLab, un logiciel commercial qui a été développé à l’origine pour étudier l’activité de nage de Danio rerio (poisson-zèbre), pour une nouvelle application à débit moyen permettant de quantifier l’activité locomotrice globale dans les milieux liquides de C. elegans en fonction des changements de pixels pendant le mouvement (Tableau 1, Figure 1). La sortie de données est rapidement obtenue à partir d’un grand nombre de conditions simultanées et d’échantillons analysés sur une lame de verre, bien que cette méthode ne convienne pas à un format de plaque multi-puits. La deuxième approche est une nouvelle adaptation de la méthodologie WormScan48,49 ( Figure2), qui utilise un scanner à plat pour créer une image différentielle de deux scans séquentiels qui peuvent être utilisés de manière variable avec un logiciel open source pour permettre une analyse quantitative semi-automatisée des résultats physiologiques intégrés tels que la fécondité et la survie. Ici, une nouvelle adaptation à haut débit de la méthodologie WormScan pour quantifier l’activité locomotrice des vers dans les milieux liquides dans des populations de quinze vers larvaires de stade 4 (L4) par puits d’une plaque à fond plat de 96 puits a été développée. Cette méthodologie WormScan semi-automatisée et peu coûteuse peut être facilement adaptée aux écrans de médicaments à haut débit, ainsi qu’aux analyses de différents stades animaux et des âgesde 48à49 ans.

Ici, le protocole et l’efficacité de l’analyse de l’activité locomotrice de C. elegans à l’aide de méthodes semi-automatisées ZebraLab et WormScan sont démontrés dans un modèle bien établi de C. elegans pour la maladie du complexe mitochondrial I, gas-1(fc21). gas-1 (gène K09A9.5) est un orthologue du NDUFS2 humain (NADH : ubiquinone oxydoréductase core (iron-sulfur protein) subunit 2) (Figure 3). La souche mutante C. elegans gas-1(fc21) porte une mutation homozygote p.R290K dans l’orthologue humain de NDUFS250, entraînant une diminution significative de la fécondité et de la durée de vie, une altération de la capacité de phosphorylation oxydative de la chaîne respiratoire (OXPHOS)51, ainsi qu’une diminution de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire avec une augmentation du stress oxydatif5,8 . Malgré son utilisation bien établie au cours des deux dernières décennies pour étudier les maladies mitochondriales, l’activité locomotrice des mutants gaz-1(fc21)n’a pas été rapportée auparavant. Ici, les méthodes ZebraLab et WormScan ont été appliquées pour quantifier indépendamment l’activité locomotrice du gaz-1(fc21)par rapport aux vers de type sauvage (WT, N2 Bristol), à la fois pour valider les méthodes et pour démontrer leur utilité comparative et l’efficacité des protocoles expérimentaux et des analyses informatiques. Le logiciel ZebraLab a permis une quantification rapide de plusieurs conditions simultanées d’activité locomotrice de vers dans des modèles de maladie mitochondriale de C. elegans, avec une application potentielle pour des études ciblées de dépistage ou de validation de médicaments. L’analyse WormScan, en particulier, est bien adaptée pour permettre facilement des éclicateurs de médicaments à haut débit des bibliothèques de composés et hiérarchiser les pistes qui améliorent la fonction neuromusculaire animale et l’activité locomotrice dans les modèles précliniques de C. elegans de la maladie mitochondriale primaire.

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Protocol

1. Analyse de l’activité locomotrice des vers dans les milieux liquides sur des lames de verre à l’aide du logiciel ZebraLab

  1. Croissance et manipulation des nématodes
    1. Cultivez C. elegans sur des plaques de Petri contenant des milieux de croissance de nématodes (NGM) et répandez-les avec Escherichia coli OP50 comme source de nourriture. Maintenir la culture de vers à 20 °C, comme décrit précédemment8.
    2. Synchronisez les vers effectuant une ponte d’œufs chronométrée52 et étudiez les vers au stade souhaité. Dans ce protocole, les vers de stade L4 ont été analysés.
    3. Cultiver des souches de vers témoins et mutants sur des plaques NGM avec et sans traitements médicamenteux à tester ou contrôle tampon. Pour évaluer les effets du traitement médicamenteux, préparer la concentration souhaitée sur le stock de médicaments dans la solution basale de S. ; étaler le volume spécifique calculé sur les plaques NGM et le laisser sécher. Transférer les vers à un stade larvaire ou adulte spécifique et maintenir sur la plaque de traitement médicamenteux pendant la durée souhaitée avant l’analyse.
  2. Mise en place expérimentale de vers pour l’enregistrement vidéo d’activité locomotrice et l’analyse ZebraLab
    1. Choisissez 5 vers L4 synchronisés par souche et par condition à l’aide d’un pic à ver. Pipeter une seule goutte de 20 μL de solution basale de S. sur une lame de verre située sous un stéréomicroscope connecté à une caméra et y transférer 5 vers (Figure 1A, B). Transférer les 5 vers de la boîte de Petri contenant NGM et E. coli OP50 dans la goutte liquide uniquement au moment précédant l’enregistrement.
      REMARQUE: Continuez à maintenir les autres vers sur la boîte de Petri jusqu’à ce que la vidéo précédente soit enregistrée. Cela évitera les dommages causés aux autres vers en raison du dessèchement des gouttes de 20 μl pendant la procédure (temps de séchage ~ 15-20 min).
    2. Pipettez plusieurs gouttes sur une lame pour obtenir plusieurs répliques techniques (Figure 1A). Sélectionnez des vers à partir de différentes plaques NGM (réplique biologique). N’utilisez pas de bordereau de couverture.
    3. Ajustez la distance de travail du microscope pour visualiser la zone complète d’une seule goutte. Définissez et maintenez une faible résolution vidéo (<1024 x 768) pour télécharger les fichiers dans le logiciel.
    4. Laissez les vers s’acclimater sur la glissière à température ambiante pendant 1 min avant l’enregistrement.
    5. Enregistrez l’activité de nage du ver en 1 goutte pendant 1 min à 15 images par seconde (fps). Répétez l’imagerie pour chaque goutte supplémentaire sur la plaque.
  3. Analyse de l’enregistrement de l’activité locomotrice de C. elegans dans le logiciel ZebraLab
    1. Utilisez l’option ZEBRALAB AVI pour télécharger des vidéos dans le logiciel. Cliquez sur l’option Quantification avec les fichiers AVI ( Figure1C).
    2. Pour créer un nouveau protocole, sélectionnez Fichier > Générer le protocole, puis ajoutez le nombre de zones sélectionnées pour l’analyse. Choisissez Le nombre d’emplacements: 1.
    3. Ouvrez Paramètres du protocole et sélectionnez 1 min dans la fenêtre Durée de l’expérience. Sélectionnez une durée expérimentale différente pour différentes durées expérimentales. Sélectionnez ou désélectionnez la fenêtre No Time Bin et choisissez Période d’intégration, en fonction de la sortie de données souhaitée. Dans cette étude, aucun bac temporel n’a été sélectionné (Figure 1D).
      REMARQUE: Le bac temporel est le temps sur lequel l’activité sera moyenée.
    4. Si un protocole a déjà été créé, sélectionnez Protocole ouvert et sélectionnez le protocole enregistré (au format .vte).
    5. Sélectionnez Fichier et Ouvrir un film pour télécharger chaque fichier vidéo individuel précédemment enregistré.
    6. Sélectionnez l’icône Zone indiquée à la Figure 1E (flèche noire) pour créer une seule zone de détection et créer une zone autour de toute la goutte de liquide où se trouvent les vers. Cliquez sur Sélectionner, puis sur l’icône de cercle vert (flèche grise) sous Zones > Construire > Effacer les marques.
      REMARQUE: L’activité de tous les vers dans la goutte définie sera détectée dans la zone sélectionnée (Figure 1E, F).
    7. Accédez à Calibration > Échelle de dessin (Figure 1E)et tracez une ligne horizontale de gauche à droite de la zone vidéo. Indiquez la distance réelle à calibrer. Sélectionnez ensuite Appliquer au groupe.
    8. Désélectionnez l’icône sélectionnée pour créer la zone (flèche de la Figure 1E) et sélectionnez ou désélectionnez Transparent.
      NOTE: Dans cette étude, Transparent a été sélectionné et a donné de meilleurs résultats.
    9. Ajuster la sensibilité de détection et le seuil d’activité pour permettre la détection de toutes les différentes souches de vers C. elegans analysées.
      REMARQUE: Dans cette expérience, la sensibilité de détection a été définie à 8 avec des valeurs de rafale et de congélation de 15 et 2, respectivement (Figure 1F).
    10. Réglez l’échelle d’affichage à 70 pour visualiser la piste effectuée par l’animal pendant que l’analyse de l’activité est en cours. Sélectionnez ensuite Appliquer au groupe ( Figure1F).
    11. Cliquez sur Expérimenter > Exécuter > Enregistrer sous, puis sur Démarrer. Une fenêtre s’ouvre. Choisissez Voulez-vous traiter le support vidéo à la vitesse maximale de l’ordinateur? pour analyser la vidéo rapidement (par exemple, un enregistrement vidéo de 1 min est analysé par le logiciel ZebraLab en 5 s).
    12. Une autre fenêtre s’ouvre : Running Experiment; cliquez sur Démarrer pour poursuivre l’expérience.
    13. Une fois l’enregistrement vidéo terminé, l’analyse s’arrête. Cliquez sur Expérimenter > Arrêter. Cela permet d’économiser l’activité analysée à partir d’une seule goutte dans une feuille de calcul.
    14. Répétez l’analyse pour chaque vidéo de chute individuelle. Chaque goutte est une réplique technique.
  4. Sortie et analyse des données ZebraLab
    REMARQUE: Après l’expérience, les données de chaque vidéo sont enregistrées individuellement sous forme de feuilles de calcul distinctes dans le dossier choisi. Dans le fichier de sortie de données, le niveau d’activité intégré de tous les vers se déplaçant dans une goutte individuelle est enregistré sous forme de changements de pixels sous actinteg.
    1. Ouvrez chaque feuille de calcul obtenue à partir de l’analyse de chaque vidéo. Compilez-les manuellement dans un seul fichier.
      Normalisez les données mutantes et de type sauvage à un pourcentage de contrôle. Ici, des analyses statistiques ont été effectuées pour comparer les niveaux d’activité moyens entre les groupes.

2. Analyse de l’activité locomotrice des vers dans un milieu liquide au format de plaque à 96 puits par analyse logicielle WormScan

  1. Croissance et manipulation des nématodes
    1. Cultivez C. elegans comme décrit à la section 1.1.1.
    2. Synchronisez les vers comme décrit dans la section 1.1.2.
    3. Cultiver des vers sur des milieux spécifiques comme décrit à la rubrique 1.1.3 jusqu’au stade L4 ou au jour 1 adulte.
  2. Configuration expérimentale de vers dans une plaque de 96 puits pour l’analyse de l’activité WormScan
    1. Ajouter 50 μL de 2 % de poids par volume d’E. coli OP50 en suspension liquide dans un milieu basal S. à chaque puits d’une microplaque à fond plat, claire et à fond plat de 96 puits, comme décrit précédemment49,53.
    2. Sous un stéréomicroscope, choisissez manuellement 15 vers synchronisés au stade L4 ou au jour 1 adulte de leurs plaques NGM dans un milieu liquide dans chaque puits expérimental de la microplaque de 96 puits. Laissez les vers s’acclimater au milieu liquide pendant 20 minutes avant de numériser.
      REMARQUE: D’autres stades et âges d’animaux peuvent être facilement substitués pour l’étude.
  3. Analyse de l’activité WormScan dans une plaque à 96 puits et exportation des données vers une feuille de calcul.
    1. Numérisez chaque microplaque à fond plat de 96 puits deux fois séquentiellement à l’aide d’un scanner à plat standard, avec moins de 10 s entre les numérisations.
      REMARQUE: Ici, le scanner photo avec une résolution de 1 200 points / in et des niveaux de gris 16 bits a été utilisé pour produire des images jpeg. Le temps nécessaire pour numériser quatre plaques de 96 puits à l’aide du scanner photo est inférieur à 10 minutes.
    2. Aligner les deux scans séquentiels (Figure 2A) à l’aide d’un logiciel open source49.
      REMARQUE: Le logiciel génère une image de différence pour évaluer les changements de pixels entre les deux images séquentielles pour une région d’intérêt(Figure 2B)et un score WormScan relatif. Ce wormScan Score est équivalent à des changements de réponse locomotrice basés sur l’intensité lumineuse produite par le scanner lorsqu’il est réglé sur un seuil de pixels de 5 (Figure 2C).
    3. Exportez les données de WormScan sous forme de feuille de calcul. Enregistrez la feuille de calcul contenant les données sur l’ordinateur local. Normalisez les données en pourcentage de contrôle (POC) et comparez les expériences biologiques de réplication pour diverses conditions mutantes ou de traitement. Effectuer une analyse statistique pour comparer les moyens mutants et de contrôle à l’aide du test tde l’élève.

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Representative Results

L’analyse de l’activité locomotrice de C. elegans dans les milieux liquides pourrait facilement saisir un phénotype intégré de modèles de vers de maladies mitochondriales qui peuvent ne pas être facilement quantifiables sur des milieux solides. ZebraLab a été utilisé pour quantifier l’activité locomotrice de la souche bien établie du complexe mitochondrial I de la maladie gas-1(fc21)par rapport aux vers WT dans un milieu liquide au stade larvaire L4. L’activité de 5 vers dans une seule goutte liquide a été enregistrée sur 1 min, avec un total de 19 vidéos (répliques techniques) enregistrées pour chaque souche, ce qui a donné lieu à l’analyse totale de 95 vers par souche. Quatre expériences de réplication biologique ont été obtenues par souche. L’activité du ver est affichée sous forme de changement de pixel(Figure 3A)et de pourcentage de contrôle (POC) lorsqu’elle est normalisée au contrôle N2 Bristol WT (Figure 3B). Les vers gaz-1(fc21)(62% ± 16% de changement de pixel, moyenne ± SD, n = 19) ont eu une diminution significative de 38% (p < 0,001, t-test) de leur activité locomotrice au stade L4 par rapport aux vers WT (100% ± 11,35%, moyenne ± SD, n = 95 vers par condition dans 19 répliques techniques sur 4 répliques biologiques).

L’analyse WormScan a également été effectuée pour quantifier l’activité locomotrice des vers gaz-1(fc21)et WT de stade L4 dans les milieux liquides. Les données ont été recueillies pour trois expériences de réplication biologique, où chaque plaque répliquée biologique a été évaluée par deux images séquentielles scannées à l’aide d’un scanner à plat standard. L’activité des vers des images différentielles a été comparée en tant que changement de pixel et normalisée au contrôle simultané N2 Bristol WT. De même, comme l’a montré la méthode de dépistage du comportement du poisson zèbre, l’analyse basée sur WormScan a démontré que les vers gaz-1(fc21)(65,9 ± 6,1, moyenne ± SD, n = 13 puits) avaient une diminution significative de l’activité locomotrice de 34% (p < 0,001, t-test)par rapport aux vers de type sauvage N2 Bristol (100% ± 4,8%, moyenne ± SEM, n = 12 puits) ( Figure3C). L’analyse à l’aide de WormScan le jour 1 des vers de gaz adultes 1(fc21)(50,1 % ± 10,7 %, moyenne ± SD, n = 7 puits) a démontré une diminution de l’activité locomotrice de 49 % (p < 0,001, t-test)par rapport aux vers WT (100 % ± 16,2 %, moyenne ± SD, n = 6 puits) ( Figure3D).

Tableau 1 : Aperçu comparatif des essais expérimentaux disponibles pour évaluer l’activité neuromusculaire de C. elegans. Un aperçu détaillé est fourni d’un large éventail de 16 techniques expérimentales différentes qui peuvent être utilisées pour quantifier l’activité neuromusculaire des vers sur les résultats phénotypiques du battement, de la locomotion, du pompage pharyngé et / ou de la chimiotaxie chez C. elegans. Le format de lecture, la méthodologie, la capacité de débit expérimental, les exigences en matière de logiciels et/ou d’équipements, ainsi que les avantages et les limites de chaque essai sont détaillés. Des références et des sites Web pertinents pour chaque essai et outil logiciel sont également fournis. La capacité de débit de chaque essai est décrite comme faible, moyenne ou élevée, en fonction de la complexité expérimentale, de l’utilisation de plaques à un ou plusieurs puits et/ou du temps d’expérimentation nécessaire pour compléter le cadre expérimental et les analyses de données. * Indique que les méthodologies peuvent également être utilisées pour l’évaluation de la locomotion. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 1
Figure 1: Analyse de l’activité locomotrice de C. elegans à l’aide du logiciel ZebraLab. (A,B) Protocole expérimental pour les enregistrements vidéo de vers. Cinq vers ont été introduits par goutte (20 μL) de solution basale de S., avec quatre gouttes placées sur une seule lame de verre sous un stéréomicroscope. Chaque goutte de 5 vers représentait une expérience technique de réplication et a été enregistrée pendant 1 min dans un film séparé à l’aide d’une caméra CCD (Charged-Coupled Device). (C-F) Paramètres expérimentaux dans ZebraLab adaptés à l’évaluation de l’activité locomotrice chez C. elegans. (C) Sélection de la quantification avec des fichiers AVI pour quantifier l’activité locomotrice du ver de chaque vidéo enregistrée. (D) Paramètres du protocole, avec 1 min sélectionné comme durée de l’expérience. (E) Construire une zone pour sélectionner la zone d’intérêt. La zone a été sélectionnée et construite autour de 1 goutte de solution dans laquelle 5 vers ont été placés. (F) La détection a été déterminée sur la base d’un seuil en niveaux de gris pour détecter tout le corps de chaque ver (rouge). Dans la section de seuil, les valeurs de rafale et de gel ont été sélectionnées pour analyser l’activité du ver à mesure que les pixels changent. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Analyse del’activité locomotrice de C. elegans à l’aide de la méthodologie WormScan. (A) À l’aide d’un scanner à plat Epson v800, deux scans immédiatement séquentiels d’une plaque de 96 puits ont été capturés avec une résolution de 1 200 points/po et des niveaux de gris 16 bits pour produire des images jpeg. (B) Ces deux images séquentielles d’une plaque de 96 puits ont ensuite été alignées sur une région d’intérêt de référence (ROI), des vers WT. (C) L’analyse d’image est basée sur un score d’image de différence calculé pour chaque ROI avec 15 vers/ puits pour N2 Bristol. L’image de différence a été normalisée et rapportée en pourcentage de contrôle (POC). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Analyse comparative de l’activité locomotrice par les tests logiciels ZebraLab et WormScan chez les vers de la maladie mitochondriale gaz-1(fc21)par rapport aux vers de type sauvage N2 Bristol. (A, B) WT et gaz-1(fc21) activité des vers dans les gouttes liquides (5 vers / goutte) a été enregistrée vidéo pendant 1 min et quantifiée comme (A) changement de pixels ou (B ) pourcentage de contrôle de type sauvage à l’aide du logiciel ZebraLab. Dans l’ensemble, l’analyse de l’activité des vers basée sur ZebraLab a démontré une diminution significative de 38% des vers de stade L4 gaz-1(fc21)par rapport aux témoins de type sauvage (*** p < 0,001). Le graphique affiche la moyenne ± SD de toutes les données, où chaque point transmet l’activité globale de cinq vers par goutte basale de S. Chaque goutte représente une réplique technique, avec un total de quatre répliques biologiques étudiées par condition. Au total, 19 vidéos ont été enregistrées (une vidéo pour chaque goutte de 5 vers), sur un total de 95 vers individuels étudiés par condition. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du test tde l’élève dans Prism -GraphPad v6. (C) WT et gas-1(fc21) au stade L4 ont été analysés par balayage à plat pour produire deux images séquentielles qui ont été analysées dans le logiciel WormScan pour produire une image de différence. Trois expériences de réplication biologique ont été réalisées avec 15 vers par puits dans une plaque de 96 puits. L’activité des vers WT a été utilisée comme base de référence pour normaliser le pourcentage de contrôle (POC). L’activité du gaz-1(fc21)a diminué de 34 % par rapport au contrôle de type sauvage (*** p < 0,001). Les graphiques à barres transmettent la moyenne et l’écart-type à travers trois expériences biologiques répliquées. (D) N2 et gaz-1(fc21) au stade adulte du jour 1 ont été analysés de la même manière que détaillée pour le panel C. gas-1(fc21) l’activité chez les adultes du jour 1 a diminué de 49,1% par rapport aux vers témoins de type sauvage (*** p < 0,001). Les graphiques à barres transmettent la moyenne et l’écart-type des changements de pixels dans une réplique biologique comparant N2 (n = 6 puits de 15 vers/puits) et gas-1(fc21)(n = 7 puits de 15 vers/puits). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ici, l’étude a résumé des informations détaillées et des justifications pour étudier l’activité neuromusculaire de C. elegans au niveau de divers résultats, y compris le battement de vers, la locomotion, le pompage pharyngé et la chimiotaxie. La comparaison de 16 méthodologies d’analyse d’activité différentes a été effectuée en termes de débit relatif, d’avantages et de limites de la quantification des activités des nématodes dans un seul ver ou populations de vers à différents âges et durées expérimentales. Parmi celles-ci, deux nouvelles adaptations et applications d’analyses semi-automatisées ont été mises en évidence pour démontrer une réduction significative de l’activité locomotrice chez les vers au stade larvaire au stade de développement larvaire L4 et au jour 1 des jeunes adultes d’une souche bien établie du complexe mitochondrial I de la maladie C. elegans, gas-1(fc21)par rapport aux témoins WT.

En particulier, la fonction neuromusculaire et l’activité locomotrice de C. elegans ont été largement étudiées sur des milieux solides, car le mouvement du ver WT est très régulier dans les modèles d’ondes sinusoïdales. Les anomalies de leur trajectoire de mouvement régulière et de la vitesse peuvent être détectées au microscope et notées manuellement par l’observateur expérimental, dans des essais souvent à faible débit et fastidieux. Pour augmenter le débit expérimental, il convient de choisir des méthodes automatisées et à haut débit. L’activité altérée des vers peut être quantifiable dans des milieux liquides, où l’activité locomotrice globale des vers dans les gouttelettes sur des lames de verre ou dans des plaques multi-puits peut être enregistrée et quantifiée de manière semi-automatisée ou automatisée avec différents outils logiciels. En effet, nos données mettent en évidence l’utilité de mesurer objectivement et efficacement l’activité locomotrice des nématodes à la fois par une nouvelle application du logiciel ZebraLab pour quantifier l’activité locomotrice dans les vidéos de vers dans des gouttes liquides sur des lames de verre (une approche de capacité de criblage à débit moyen), ainsi qu’en utilisant le logiciel WormScan pour quantifier l’activité locomotrice de vers dans des images différentielles à balayage à plat de vers dans une approche de milieu liquide à plaques à 96 puits54, 55,56 (une approche de capacité de criblage à haut débit). L’approche logicielle ZebraLab est considérée comme un test à débit moyen car elle nécessite l’utilisation de plaques uniques pour chaque condition étudiée, sans protocole actuellement développé pour les formats de plaques multi-puits. Bien que l’utilisation de l’approche logicielle ZebraLab nécessite un minimum de temps lors de l’analyse de l’activité de C. elegans dans quelques conditions, le temps expérimental augmente lorsqu’il est appliqué à plusieurs conditions. Ici, le temps expérimental était d’environ 2 h pour transférer les vers dans des gouttelettes liquides et enregistrer des vidéos de leur activité, en tenant compte de 18 répliques techniques pour chaque condition. Le temps consacré à l’analyse de ces vidéos à l’aide du logiciel ZebraLab a été d’environ 1 h. En comparaison, la méthode WormScan est à haut débit car elle intègre un format de plaque multi-puits qui permet l’analyse simultanée de quatre plaques de 96 puits en moins de 10 min et la mise en place d’une plaque de 96 puits avec un BISoter COPAS est également inférieure à 10 min.

Les deux méthodologies ont montré une activité réduite similaire dans les vers mutants de la maladie mitochondriale L4 au stade larvaire gas-1(fc21)par rapport aux vers WT, validant ainsi les deux approches distinctes pour quantifier les différences de comportement des vers. De plus, l’analyse WormScan a été utilisée pour démontrer facilement que la réduction progressive de l’activité locomotrice animale se produisait avec l’âge chez les vers gaz-1(fc21),comme cela était évident au stade adulte du jour 1.

Les principaux avantages de notre adaptation du logiciel ZebraLab qui a été développé pour l’analyse de la nage du poisson-zèbre à l’analyse de l’activité de C. elegans est qu’il est expérimentalement simple et peu coûteux de capturer objectivement le mouvement des vers dans les vidéos, avec une analyse quantitative semi-automatisée dans les fichiers vidéo téléchargés sur le logiciel ZebraLab ne nécessitant que quelques secondes par réplication technique et supprime les biais basés sur l’investigateur présents dans les méthodologies de quantification manuelle. De plus, le fait d’avoir cet outil logiciel dans le laboratoire de recherche est utile pour quantifier l’activité locomotrice chez deux espèces animales modèles, à savoir le poisson-zèbre et C. elegans. L’inconvénient est qu’il s’agit d’un logiciel commercial qui nécessite un achat et que les vidéos de vers doivent être téléchargées manuellement dans le logiciel, bien que le processus de téléchargement soit simple et que le temps d’analyse du logiciel soit relativement rapide. Dans l’ensemble, la nouvelle application décrite ici d’utiliser le logiciel ZebraLab pour quantifier l’activité locomotrice de C. elegans a un potentiel direct pour évaluer les effets des médicaments sur le comportement des vers, bien que son débit reste faible à moyen compte tenu de ses exigences de haute résolution nécessitant que des films soient capturés de vers se déplaçant dans des gouttes de média placées sur des lames de verre.

Nous avons également adapté le logiciel WormScan pour quantifier efficacement la capacité locomotrice des vers dans les milieux liquides dans une plaque de 96 puits. Cette approche offre une méthode expérimentale à haut débit et à faible coût qui utilise un scanner à plat standard pour quantifier objectivement la fécondité et la survie des animaux et qui a déjà été utilisée pour les écrans à haut débit dans C. elegans49. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle se prête très bien au criblage à haut débit, permettant des comparaisons parallèles d’un grand nombre de conditions à tout stade ou âge, avec une facilité d’utilisation, un faible coût d’installation et une analyse rapide de manière objective par le logiciel WormScan gratuit et accessible au public49. L’inconvénient du WormScan est qu’il ne peut interroger que le changement qui se produit entre les scans séquentiels, qui, dans certaines mutations ou conditions, peuvent ne pas être suffisamment sensibles pour détecter de petits degrés de changement phénotypique. En outre, comme les méthodes ZebraLab et WormScan reposent exclusivement sur des modifications des pixels d’image pour analyser l’activité des animaux, des différences substantielles dans la taille des vers qui peuvent survenir entre les souches ou en réponse à un traitement spécifique au fil du temps peuvent devoir être prises en compte et / ou utilisées comme facteur de normalisation pour les deux méthodes, afin de permettre plus spécifiquement l’évaluation et la comparaison des effets de mutation et / ou de traitement sur l’activité locomotrice animale.

Dans l’ensemble, un large éventail de méthodes expérimentales peut être utilisé pour évaluer l’activité neuromusculaire des nématodes sur les résultats phénotypiques intégrés du thrashing, de la locomotion, du pompage pharyngé et / ou de la chimiotaxie. Nous avons comparé 16 de ces méthodes(tableau 1),en mettant en évidence leurs exigences expérimentales et analytiques spécifiques, leurs avantages, leurs limites et leur capacité de débit. Parmi ceux-ci, nous avons fourni des protocoles expérimentaux détaillés pour deux nouvelles applications d’outils logiciels existants, ZebraLab (une approche à débit moyen) et WormScan (une approche à haut débit), qui sont particulièrement utiles pour quantifier semi-automatiquement, objectivement et rapidement l’activité de locomotion des vers dans les milieux liquides. Les deux approches expérimentales ont révélé un degré également réduit d’activité de locomotion dans la maladie mitochondriale (gas-1(fc21)) par rapport aux souches wt C. elegans au stade L4, avec un déclin progressif de l’activité locomotrice au stade jeune adulte chez les vers gaz-1(fc21). Ces données démontrent la validité de ces approches expérimentales qui produisent des données cohérentes à l’interne. En outre, cette gamme de méthodes est très polyvalente, permettant un large éventail de mesures de l’activité locomotrice des vers dans diverses étiologies de maladies, stades et âges animaux, et en réponse à la modélisation thérapeutique candidate ou aux éclicateurs de médicaments à haut débit qui sont utiles pour l’évaluation préclinique des cibles principales pour les maladies humaines.

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Disclosures

M.L., N.D.M., N.S., et E.N.-O. n’ont pas de divulgations financières pertinentes. M.J.F. est cofondateur de MitoCUREia, Inc., membre du conseil consultatif scientifique avec une participation dans RiboNova, Inc. et membre du conseil scientifique en tant que consultant rémunéré chez Khondrion et Larimar Therapeutics. M.J.F. a déjà été ou est actuellement engagé avec plusieurs sociétés impliquées dans le développement thérapeutique préclinique et / ou clinique des maladies mitochondriales en tant que consultant rémunéré (Astellas [anciennement Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) et / ou un collaborateur de recherche parrainé (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics et Stealth BioTherapeutics).

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à Anthony Rosner, PhD., pour son soutien organisationnel pour la préparation précoce de ce projet, et à Erin Haus pour sa contribution à l’analyse du protocole. Ce travail a été financé par le Juliet’s Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, le Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund et les National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 et T32-NS007413). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des bailleurs de fonds ou des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans wild isolate  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Bristol
Camera Olympus DP73
gas-1(fc-21) CGC CW152
Microscope slides ThermoFisher 4951PLUS
Nematode Growth Medium (NGM) Research Products International Corp. N81800-1000.0
OP50 Escherichia coli CGC Uracil auxotroph E. coli strain
Petri dishes (60 mm)  VWR international 25373-085
S. Basal VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660
Scanner EPSON V800
Stereomicroscope Olympus MVX10 microscope
96-well flat bottom  VWR international 29442-056
WormScan software Mathew et al. 45 S1 Standalone Java platform Software for automation of difference image of scanned plates
ZebraLab software ViewPoint Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis

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Analyse comparative de méthodes expérimentales pour quantifier l’activité animale dans les modèles de maladie mitochondriale de <em>Caenorhabditis elegans</em>
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Lavorato, M., Mathew, N. D., Shah, N., Nakamaru-Ogiso, E., Falk, M. J. Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease. J. Vis. Exp. (170), e62244, doi:10.3791/62244 (2021).

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