Summary
Denne undersøgelse præsenterer protokoller for to semi-automatiserede lokomotorisk aktivitet analyse tilgange i C. elegans kompleks I sygdom gas-1(FC21) orme, nemlig ZebraLab (en medium-throughput assay) og WormScan (en high-throughput assay) og give sammenlignende analyse blandt en bred vifte af forskningsmetoder til at kvantificere nematode adfærd og integreret neuromuskulær funktion.
Abstract
Caenorhabditis elegans er bredt anerkendt for sin centrale nytte som en translationel dyremodel til effektivt at afhøre mekanismer og behandlinger af forskellige menneskelige sygdomme. Orme er særligt velegnede til højgennemsigtige genetiske og lægemiddelskærme for at få dybere indsigt i terapeutiske mål og terapier ved at udnytte deres hurtige udviklingscyklus, stor brødstørrelse, kort levetid, mikroskopisk gennemsigtighed, lave vedligeholdelsesomkostninger, robust pakke af genomiske værktøjer, mutantlagre og eksperimentelle metoder til at afhøre både in vivo og ex vivo fysiologi. Orm lokomotorisk aktivitet repræsenterer en særlig relevant fænotype, der ofte forringes i mitokondriesygdom, som er meget heterogen i årsager og manifestationer, men kollektivt deler en nedsat evne til at producere cellulær energi. Mens en suite af forskellige metoder kan bruges til at afhøre orm adfærd, disse varierer meget i eksperimentelle omkostninger, kompleksitet, og nytte for genomiske eller stof high-throughput skærme. Her blev den relative gennemløb, fordele og begrænsninger af 16 forskellige aktivitetsanalysemetoder sammenlignet, der kvantificerer nematode-bevægelse, thrashing, svælgpumpning og / eller chemotaxis i enkelte orme eller ormpopulationer af C. elegans på forskellige stadier, aldre og eksperimentelle varigheder. Detaljerede protokoller blev demonstreret for to halvautomatiske metoder til at kvantificere nematode lokomotorisk aktivitet, der repræsenterer nye anvendelser af tilgængelige softwareværktøjer, nemlig ZebraLab (en medium-throughput tilgang) og WormScan (en høj-throughput tilgang). Data fra anvendelsen af disse metoder viste lignende grader af reduceret animalsk aktivitet forekom på L4 larvestadiet, og skred frem i dag 1 voksne, i mitokondrie kompleks I sygdom (gas-1(fc21)) mutant orme i forhold til vilde-type (N2 Bristol) C. elegans. Disse data validerer nytten for disse nye applikationer ved hjælp af ZebraLab eller WormScan softwareværktøjer til at kvantificere orm lokomotorisk aktivitet effektivt og objektivt, med variabel kapacitet til at støtte high-throughput lægemiddel screening på orm adfærd i prækliniske dyremodeller af mitokondriesygdom.
Introduction
Caenorhabiditis elegans er bredt anerkendt som en fremragende model i neurovidenskab baseret på det at have 302 neuroner, der koordinerer alle orm adfærd, herunder parring, fodring, æglægning, afføring, svømning, og bevægelse på solide medier1. Disse hermafroditiske nematoder bruges også i vid udstrækning til at forstå en bred vifte af menneskelige sygdomsmekanismer, muliggjort af dets velkarakteriserede genom og høje homologi af ~ 80% gener mellem C. elegans og mennesker2,3,4. C. elegans har længe været brugt til at afhøre human mitokondriesygdom5,6,7,8,9,10, som er en meget genetisk og fænotype heterogen gruppe af arvelige metaboliske lidelser, der deler nedsat kapacitet til at generere cellulær energi og ofte klinisk til stede med væsentligt nedsat neuromuskulær funktion, motion intolerance og træthed11 ,12,13,14. Med henblik herpå muliggør brugen af C. elegans modeller præklinisk modellering af kvantitative aspekter af dyrs aktivitet og neuromuskulær funktion i forskellige genetiske undertyper af mitokondriesygdom samt deres reaktion på kandidatbehandlinger, der kan forbedre deres neuromuskulære funktion og samlede aktivitet.
Neuromuskulær aktivitet i C. elegans er objektivt målbar ved en række eksperimentelle metoder, herunder både manuelle og halvautomatiske tilgange, der tillader funktionelle analyser i enten faste eller flydende medier (Tabel 1)1,15. Nøjagtig kvantificering af C. elegans aktivitet har vist sig vigtigt at gøre det muligt opdagelser relateret til funktion og udvikling af muskel-og nervesystemet16,17,18. Denne undersøgelse opsummerer og sammenligner eksperimentelle krav, fordele og begrænsninger af 17 forskellige analyser, der kan udføres i forskningslaboratorier for at evaluere neuromuskulær funktion og aktivitet på fire vigtige resultater i C. elegans sygdomme modeller, både ved baseline på en række udviklingsstadier og aldre samt som reaktion på kandidat behandlinger (Tabel 1 ). Undersøgelsen giver faktisk et detaljeret overblik over rækken af tilgængelige eksperimentelle tilgange til at karakterisere satser for C. elegans thrashing (krop bøjninger pr minut), lokomotorisk aktivitet, svælg pumpning, og chemotaxis-i hvert enkelt tilfælde angiver den eksperimentelle og analytiske metode, der anvendes, fordele og begrænsninger af hver metode, udstyr og software er nødvendige for at udføre og analysere hver analyse, og gennemløbskapaciteten for hver metode til at understøtte dens anvendelse til genetiske eller lægemiddelscreeningsformål med høj kapacitet. Gennemløbskapaciteten for hver analyse beskrives som lav, mellem eller høj baseret på den eksperimentelle protokolkompleksitet, herunder ormvedligeholdelse, behandlingstid, brug af enkelt- eller multi-brøndplader og/ eller eksperimentatortid, der er nødvendig for at fuldføre den eksperimentelle indstilling og dataanalyser.
Manuelle analyser af thrashing19, locomotorisk aktivitet20, svælgpumpning17,21og chemotaxis22,23 er veletablerede metoder til evaluering af ormaktivitet, der kræver et stereomikroskop24. Mens måling af thrashing aktivitet orme kræver analyse i flydende medier til at bestemme hyppigheden af kroppen bøjninger per minut, orm lokomotorisk aktivitet kan måles enten på faste medier eller i flydende medier. Manuelle analyser af individuelle ormaktivitet er dog i sagens natur tidskrævende og involverer uundgåelig brugergenereret bias. Automatisering af ormaktivitetsanalyser minimerer brugergenereret bias og kan i høj grad øge eksperimentelle gennemløb25. Videooptagelser af orm thrashing aktivitet i flydende medier kan analyseres ved hjælp af wrMTrck, en ImageJ plugin26. Men de oprindelige eksperimentelle indstillinger, der blev udviklet til wrMTrck begrænset sin nytte, da alt for mange orme i en enkelt flydende dråbe førte til overlapning af orme, der gjorde præcis sporing vanskelig. Mens denne eksperimentelle begrænsning er blevet løst27, wrMTrck metode er ikke i stand til at støtte high-throughput screening.
Der findes en række metoder til at kvantificere orm lokomotorisk aktivitet ved baseline og som reaktion på kandidatbehandlinger i C. elegans mitokondriesygdomsmodeller. Disse omfatter ZebraLab (ViewPoint Life Sciences), Tierpsy Tracker28, wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP)29, WormMotel, WormWatcher30, WormLab31, Infinity Chip32og WMicrotracker One33 (Tabel 1). Disse metoder muliggør samtidig analyse af bevægelse i flere ormstammer eller tilstande, typisk på multi-brønd plader, og dermed støtte højere gennemløb lægemiddelscreening applikationer. Nogle af disse metoder har unikke overvejelser, der kan begrænse eller forbedre deres generelle nytte, såsom behovet for dyrt udstyr versus open-access software, og varierende lethed at udføre eksperimentelle protokoller. Samlet set er intet enkelt eksperimentelt system eller protokol ideelt egnet til alle C. elegans lokomotoriske aktivitetseksperimenter. Det er snarere vigtigt omhyggeligt at vælge, hvilken metode der passer bedst til den specifikke investigators eksperimentelle mål og krav.
Pharyngeal pumpning repræsenterer et andet vigtigt resultat til at vurdere neuromuskulær aktivitet i C. elegans. C. elegans svælg består af 20 muskelceller, 20 neuroner, og 20 andre celler, der muliggør indtagelse af Escherichia coli (E. coli) i den forreste ende af ormens fordøjelseskanalen34,35,36. Flere manuelle metoder er blevet etableret til at bestemme svælg pumpehastigheder17,21,37,38. De fleste metoder er baseret på brugen af et stereomikroskop og kamera til at visualisere og registrere svælg pumpefrekvens med direkte optælling af den eksperimentelleobservatør 21. Automatiseret pharyngeal pumpehastighed analyse er mulig ved at udføre en ekstracellulær optagelse kaldes elektropharyngeogram (EPG), som giver yderligere oplysninger om varigheden af hver pumpe39. Pharyngeal pumpehastighed analyse er også muligt i et mikrofluidisk system, WormSpa, hvor de enkelte orme er begrænset ikamre 40,41. En kommerciel metode til rådighed for at lette analysen af den svælg pumpehastighed er ScreenChip System (InVivo Biosystems), som måler, visualiserer og analyserer de neuromuskulære aspekter af fodringsadfærd i en enkelt orm, der er immobiliseret i en brugerdefineret chip. Denne svælg pumpe kvantificering tilgang kan bruges til at vurdere både neuronal og fysiologiske reaktioner på narkotika, aldring, og andre faktorer42,43,44,45.
Chemotaxis beskriver bevægelsen af C. elegans som reaktion på et lugtstof placeret væk fra ormene i et defineret område af nematode vækstmedier (NGM) plade. Vurdering af chemotaxis respons giver et integreret mål for orm neuronal og neuromuskulær aktivitet, der kan kvantificeres ved at observere og måle den fysiske afstand, der rejses af orme mod lugtstof i en defineret periode46. Multi-Worm Tracker er en automatisk metode, der kan bruges til at forbedre den eksperimentelle effektivitet at kvantificere den afstand, der rejses af orme mod et attractant eller fra en afvisende47.
Her beskrives den detaljerede protokol for to nye, halvautomatiske metoder, der er etableret til kvantificering af ormaktivitet. Den første tilgang udnytter ZebraLab en kommerciel software, der oprindeligt blev udviklet til at studere svømning aktivitet Danio rerio (zebrafisk), for en ny medium-throughput ansøgning om at kvantificere den samlede lokomotoriske aktivitet i flydende medier af C. elegans baseret på pixel ændringer under bevægelse (Tabel 1, Figur 1). Data output er hurtigt opnået fra et stort antal samtidige forhold og prøver analyseret på et glas dias, selv om denne metode ikke er egnet til en multi-brønd plade format. Den anden tilgang er en ny tilpasning af WormScan metode48,49 ( Figur2), som bruger en flatbed scanner til at skabe et differentieret billede af to sekventielle scanninger, der kan varierende bruges med open source-software til at muliggøre semi-automatiseret kvantitativ analyse af integrerede fysiologiske resultater såsom fecundity og overlevelse. Her blev der udviklet en ny high-throughput tilpasning af WormScan-metoden til at kvantificere orm lokomotorisk aktivitet i flydende medier i populationer af femten larvetrin 4 (L4) orme pr. brønd af en 96-brønd, fladbundsplade. Denne semi-automatiserede og billige WormScan metode kan let tilpasses til high-throughput drug skærme, samt til analyser af forskellige dyr faser og alderen48,49.
Her er protokollen og effekten af at analysere C. elegans locomotorisk aktivitet ved hjælp af både ZebraLab og WormScan semi-automatiserede metoder demonstreret i en veletableret C. elegans model for mitokondrie kompleks I sygdom, gas-1(fc21). gas-1 (K09A9.5 gen) er en ortholog af human NDUFS2 (NADH: ubiquinon oxidoreductase kerne (jern-svovlprotein) subunit 2) (Figur 3). Den mutante si C. elegans gas-1(fc21) bærer en homoseksuøs p.R290K missense mutation i den menneskelige ortholog af NDUFS250, forårsager signifikant nedsat fecundity og levetid, nedsat respiratorisk kædeoxidativ fosforylering (OXPHOS) kapacitet51, samt nedsat mitokondrie masse og membran potentiale med øget oxidativ stress5,8 . På trods af den veletablerede brug i løbet af de sidste to årtier til at studere mitokondriesygdom blev lokomotorisk aktivitet af gas-1(fc21) mutanter ikke tidligere rapporteret. Her blev ZebraLab og WormScan metoder anvendt til selvstændigt at kvantificere lokomotorisk aktivitet af gas-1(fc21) i forhold til vilde-type (WT, N2 Bristol) orme, både som en måde at validere metoder samt at demonstrere deres komparative nytte og effektivitet af de eksperimentelle protokoller og informatik analyser. ZebraLab software tilladt hurtig kvantificering af flere samtidige betingelser for orm locomotor aktivitet i C. elegans mitokondrie sygdom modeller, med potentiel anvendelse for målrettet lægemiddelscreening eller validering undersøgelser. WormScan analyse, især, er velegnet til let at muliggøre høj-throughput lægemiddel skærme af sammensatte biblioteker og prioritere fører, der forbedrer dyret neuromuskulære funktion og lokomotorisk aktivitet i prækliniske C. elegans modeller af primær mitokondriesygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Orm lokomotorisk aktivitetsanalyse i flydende medier på glasrutschebaner ved hjælp af ZebraLab-software
- Nematode vækst og håndtering
- Grow C. elegans på Petri plader, der indeholder nematode vækstmedier (NGM) og spredes med Escherichia coli OP50 som fødekilde. Bevar ormkulturen ved 20 °C, som tidligere beskrevet8.
- Synkroniser orme, der udfører et tidet æg, lå52 og studerer orme på det ønskede stadium. I denne protokol blev L4-trins orme analyseret.
- Grow control og mutant orm stammer på NGM plader med og uden lægemiddel behandlinger, der skal testes eller buffer kontrol. For at evaluere lægemiddelbehandlingseffekterne forberedes den ønskede lægemiddelbestandkoncentration i S. basalopløsning; det beregnede specifikke volumen på NGM-pladerne og lade det tørre. Overfør ormene på et bestemt larve- eller voksenstadium og opretholde på lægemiddelbehandlingspladen i den ønskede varighed før analyse.
- Eksperimentel opsætning af orme til lokomotorisk aktivitetsvideooptagelse og ZebraLab-analyse
- Vælg 5 synkroniserede L4 orme pr. stamme og tilstand ved hjælp af et ormpluk. Pipette en enkelt 20 μL dråbe S. basal opløsning på et glas dias placeret under et stereomikroskop tilsluttet et kamera og overføre 5 orme ind i det (Figur 1A,B). Overfør de 5 orme fra petriskålen, der indeholder NGM og E. coli OP50, til væskedråben først i øjeblikket forud for optagelsen.
BEMÆRK: Fortsæt med at vedligeholde de andre orme på petriskålen, indtil den tidligere video er optaget. Dette vil undgå skader forårsaget på de andre orme som følge af udtørring af de 20 μl dråber under proceduren (tør tid ~ 15-20 min). - Pipette flere dråber på et dias for at opnå flere tekniske replikter (Figur 1A). Vælg orme fra forskellige NGM-plader (biologisk replikering). Brug ikke dæksel.
- Juster mikroskopets arbejdsafstand for at visualisere hele området for en enkelt dråbe. Indstil og vedligehold en lav videoopløsning (<1024 x 768) for at overføre filerne i softwaren.
- Lad orme akklimatere på diaset ved stuetemperatur i 1 minut før optagelse.
- Optag ormen svømme aktivitet i 1 dråbe i 1 min på 15 billeder i sekundet (fps). Gentag billeddannelsen for hver ekstra dråbe på pladen.
- Vælg 5 synkroniserede L4 orme pr. stamme og tilstand ved hjælp af et ormpluk. Pipette en enkelt 20 μL dråbe S. basal opløsning på et glas dias placeret under et stereomikroskop tilsluttet et kamera og overføre 5 orme ind i det (Figur 1A,B). Overfør de 5 orme fra petriskålen, der indeholder NGM og E. coli OP50, til væskedråben først i øjeblikket forud for optagelsen.
- C. elegans locomotor aktivitet optagelse analyse i ZebraLab software
- Brug muligheden ZEBRALAB AVI til at uploade videoer til softwaren. Klik på indstillingen Kvantisering med AVI-filer (Figur 1C).
- Hvis du vil oprette en ny protokol, skal du vælge Filer > Generér protokolog derefter tilføje det antal områder, der er valgt til analysen. Vælg Antal placering: 1.
- Åbn protokolparametre, og vælg 1 min i vinduet Eksperimentvarighed. Vælg en anden eksperimentel varighed for forskellige eksperimentelle varigheder. Marker eller fjern markeringen af vinduet Ingen tidsplacering, og vælg Integrationsperiode, afhængigt af det ønskede dataoutput. I denne undersøgelse blev der ikke valgt nogen tidsplacering (Figur 1D).
BEMÆRK: Tidsplacering er den tid, hvor aktiviteten beregnes i gennemsnit. - Hvis der allerede er oprettet en protokol, skal du vælge Åbn protokol og vælge den gemte protokol (i .vte-format).
- Vælg Filer og Åbn en film for at overføre hver enkelt videofil, der tidligere er optaget.
- Vælg ikonet Område, der er angivet i figur 1E (sort pil), for at opbygge et enkelt detektionsområde og oprette et område omkring hele væskedråben, hvor orme er placeret. Klik på Vælgog derefter på ikonet grøn cirkel (grå pil) under Områder > Byg > Ryd mærker.
BEMÆRK: Aktiviteten af alle orme i den definerede dråbe registreres i det valgte område (Figur 1E, F). - Gå til Kalibrering > Tegn skala (Figur 1E) og tegn en vandret linje fra venstre til højre for videoområdet. Angiv den reelle afstand, der skal kalibreres. Vælg derefter Anvend på gruppe.
- Fjern markeringen af det ikon, der er valgt for at oprette området (pilen i Figur 1E), og vælg eller fravælg Gennemsigtig.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev Transparent udvalgt og gav bedre resultater. - Juster detektionsfølsomhed og aktivitetstærskel, så det kan registreres af alle de forskellige C. elegans ormstammer analyseret.
BEMÆRK: I dette eksperiment blev detektionsfølsomheden sat til 8 med burst- og fryseværdier på henholdsvis 15 og 2 (Figur 1F). - Indstil Display Scale til 70 for at visualisere dyrets spor, mens aktivitetsanalysen er i gang. Vælg derefter Anvend på gruppe ( Figur1F).
- Klik på Eksperiment > Udfør > Gem som, og derefter på Start. Der åbnes et vindue. Vælg Vil du behandle videomediet med maksimal computerhastighed? for at analysere videoen hurtigt (f.eks. analyseres en 1 min videooptagelse af i ZebraLab-softwaren i 5 s).
- Et andet vindue åbnes: Kører eksperiment; Klik på Start for at fortsætte med eksperimentet.
- Når videooptagelsen er færdig, stopper analysen. Klik på Eksperiment > Stop. Dette gemmer den aktivitet, der analyseres fra et enkelt fald i et regneark.
- Gentag analysen for hver video af individuelle drop. Hver dråbe er en teknisk replikation.
- Output og analyse af ZebraLab-data
BEMÆRK: Efter eksperimentet gemmes data fra hver video individuelt som separate regneark i den valgte mappe. I dataoutputfilen registreres det integrerede aktivitetsniveau for alle orme, der bevæger sig i en individuel dråbe, som pixelændringer under actinteg.- Åbn hvert regneark, der er hentet fra analysen af hver video. Kompiler dem manuelt i en enkelt fil.
Normaliser de mutante og vilde data til en procentdel af kontrollen. Her blev der udført statistiske analyser for at sammenligne de gennemsnitlige aktivitetsniveauer mellem grupper.
- Åbn hvert regneark, der er hentet fra analysen af hver video. Kompiler dem manuelt i en enkelt fil.
2. Orm lokomotorisk aktivitet analyse i flydende medier i 96-brønd plade format af WormScan software analyse
- Nematode vækst og håndtering
- Grow C. elegans som beskrevet i punkt 1.1.1.
- Synkroniser orme som beskrevet i afsnit 1.1.2.
- Knyt orme på bestemte medier som beskrevet i afsnit 1.1.3 indtil L4 fase eller dag 1 voksen.
- Eksperimentel opsætning af orme i 96-brønd plade til WormScan aktivitet analyse
- Der tilsættes 50 μL vægt pr. volumen af E. coli OP50 i flydende suspension i S. basal medium til hver brønd af en 96-brønd, klar, fladbundet mikroplade, som tidligere beskrevet49,53.
- Under et stereomikroskop skal du manuelt vælge 15 synkroniserede orme på L4-trin eller dag 1 voksen fra deres NGM-plader til flydende medier i hver eksperimentel brønd af den 96-brønd mikroplade. Lad ormene akklimatere sig til det flydende medie i 20 minutter før scanning.
BEMÆRK: Andre dyrestadier og -aldre kan let erstattes af studier.
- WormScan aktivitetsanalyse i 96-brønd plade og dataeksport til regneark.
- Scan hver 96-brønd, klar, fladbundet mikroplade to gange sekventielt ved hjælp af en standard flatbedscanner med mindre end 10 s mellem scanninger.
BEMÆRK: Her blev fotoscanneren med opløsning på 1.200 prikker /in og 16-bit gråtoneskala brugt til at producere jpeg-billeder. Den tid, det tager at scanne fire 96-brøndsplader ved hjælp af fotoscanneren, er mindre end 10 min. - Juster de to sekventielle scanninger (Figur 2A) ved hjælp af open source-software49.
BEMÆRK: Softwaren genererer et forskelsbillede for at evaluere pixelændringer mellem de to sekventielle billeder for et interesseområde (Figur 2B) og en relativ WormScan-score. Denne WormScan-score svarer til ændringer i lokomotorisk respons baseret på den lysintensitet, som scanneren frembringer, når den indstilles til en pixeltærskel på 5 (Figur 2C). - Eksporter dataene fra WormScan som et regneark. Gem regnearket, der indeholder dataene, på den lokale computer. Normalisere dataene som procentdel af kontrol (POC) og sammenligne på tværs af biologiske replika eksperimenter for forskellige mutant eller behandling betingelser. Udfør statistisk analyse for at sammenligne mutant og kontrol betyder ved hjælp af studerende t-test.
- Scan hver 96-brønd, klar, fladbundet mikroplade to gange sekventielt ved hjælp af en standard flatbedscanner med mindre end 10 s mellem scanninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse af C. elegans lokomotorisk aktivitet i de flydende medier kunne nemt fange en integreret fænotype af mitokondrie sygdom orm modeller, der ikke kan være let kvantificerbare på faste medier. ZebraLab blev brugt til at kvantificere lokomotorisk aktivitet af det veletablerede mitokondriekompleks I sygdom gas-1(fc21)stamme i forhold til WTworms i flydende medier på L4 larvestadiet. Aktiviteten af 5 orme i et enkelt flydende fald blev registreret over 1 min, med i alt 19 videoer (tekniske replikter) registreret for hver stamme, hvilket resulterer i total analyse af 95 orme pr. stamme. Der blev opnået fire biologiske replikaterperimenter pr. stamme. Ormaktivitet vises som pixelændring (Figur 3A) og som procent af kontrol (POC), når den normaliseres til N2 Bristol WT-kontrol (Figur 3B). Gas-1(fc21) orme (62% ± 16% pixel ændring, gennemsnitlige ± SD, n = 19) havde en betydelig 38% fald (p < 0,001, t-test)i deres lokomotoriske aktivitet på L4 fase i forhold til WT orme (100% ± 11,35%, gennemsnit ± SD, n = 95 orme pr betingelse i 19 tekniske replikerer over 4 biologiske replikerer).
WormScan analyse blev også udført for at kvantificere lokomotorisk aktivitet af L4 fase gas-1(FC21) og WT orme i flydende medier. Data blev indsamlet til tre biologiske replika eksperimenter, hvor hver biologisk replikering plade blev evalueret af to sekventielle billeder scannet ved hjælp af en standard flatbed scanner. Ormaktiviteten af differentialbillederne blev sammenlignet som pixelændring og normaliseret til samtidig N2 Bristol WT-kontrol. Tilsvarende, som det blev set af Zebrafish adfærd screening metode, WormScan baseret analyse viste, at gas-1(fc21) orme (65,9 ± 6,1, gennemsnit ± SD, n = 13 brønde) havde et betydeligt fald i lokomotorisk aktivitet med 34% (p < 0,001, t-test)i forhold til N2 Bristol vilde-type orme (100% ± 4,8%, gennemsnit ± SEM, n = 12 brønde) ( Figur3C). Analyse ved hjælp af WormScan på dag 1 voksen gas-1(fc21) orme (50,1% ± 10,7%, gennemsnit ± SD, n = 7 brønde) viste et fald i lokomotorisk aktivitet med 49% (p < 0,001, t-test) sammenlignet med WT orme (100% ± 16,2%, gennemsnit ± SD, n = 6 brønde) (Figur 3D).
Tabel 1: Sammenlignende oversigt over eksperimentelle analyser til rådighed til evaluering af C. elegans neuromuskulær aktivitet. En detaljeret oversigt er fastsat af en bred vifte af 16 forskellige eksperimentelle teknikker, der kan bruges til at kvantificere orm neuromuskulær aktivitet på de fænotypiske resultater af thrashing, bevægelse, svælg pumpning, og / eller chemotaxis i C. elegans. Læseformat, metodologi, eksperimentel gennemløbskapacitet, software og/eller udstyrskrav samt fordele og begrænsninger ved hver analyse er detaljerede. Der gives også referencer og relevante websteder for hvert analyse- og softwareværktøj. Gennemløbskapaciteten for hver analyse beskrives som lav, mellem eller høj, som baseret på den eksperimentelle kompleksitet, brugen af enkelt- eller multi-brøndplader og/eller eksperimentatortid, der er nødvendig for at fuldføre den eksperimentelle indstilling og dataanalyserne. * Angiver, at metoderne også kan bruges til evaluering af bevægelse. Klik her for at downloade denne tabel.
Figur 1: C. elegans locomotor aktivitetsanalyse ved hjælp af ZebraLab-software. (A,B) Eksperimentel protokol for ormvideooptagelser. Fem orme blev indført pr. dråbe (20 μL) af S. basalopløsning, med fire dråber placeret på et enkelt glasrutschebane under et stereomikroskop. Hver dråbe på 5 orme repræsenterede et teknisk replikeringseksperiment og blev optaget i 1 minut i en separat film ved hjælp af et ladet koblet enhedskamera (CCD). (C-F) Eksperimentelle indstillinger i ZebraLab som tilpasset til evaluering af lokomotorisk aktivitet i C. elegans. (C) Udvælgelse af kvantisering med AVI-filer for at kvantificere orm lokomotorisk aktivitet af hver optaget video. (D) Indstillinger for protokolparametre, hvor 1 min er valgt som eksperimentvarighed. (E) Byg område for at vælge det område af interesse. Området blev valgt og bygget omkring 1 dråbe opløsning, hvor 5 orme blev placeret. (F) Detektion blev bestemt ud fra gråskalatærskel for at registrere hele kroppen af hver orm (rød). I tærskelsektionen blev der valgt værdier for burst og frysning for at analysere ormaktiviteten, efterhånden som pixel ændres. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: C. elegans lokomotorisk aktivitetsanalyse ved hjælp af WormScan-metodologi. (A) Ved hjælp af en Epson v800 flatbedscanner blev to umiddelbart sekventielle scanninger af en 96-brønds plade fanget med en opløsning på 1.200 prikker / i og 16-bit gråtoneskala til fremstilling af jpeg-billeder. (B) Disse to sekventielle billeder af en 96-brønd plade blev derefter justeret til en reference region af interesse (ROI), af WT orme. (C) Billedanalyse er baseret på en forskel billedscore beregnet for hver ROI med 15 orme / godt for N2 Bristol. Forskelsbilledet blev normaliseret og rapporteret som procentdel af kontrol (POC). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenlignende analyse af lokomotorisk aktivitet ved ZebraLab og WormScan software assays i gas-1(fc21) mitokondrie sygdom orme i forhold til N2 Bristol vilde orme. (A,B) WT og gas-1(FC21) orm aktivitet i flydende dråber (5 orme / drop) blev video optaget i 1 min og kvantificeret som (A) pixels ændre eller (B ) procentdel af vildt-type kontrol ved hjælp af ZebraLab software. Samlet set viste ZebraLab-baserede ormaktivitetsanalyse et signifikant fald på 38% i gas-1(fc21) L4-trins orme sammenlignet med vilde kontrolelementer (*** p < 0,001). Grafen viser betyder ± SD af alle data, hvor hver prik formidler den samlede aktivitet af fem orme pr. S. basal dråbe. Hvert fald repræsenterer en teknisk replikation, med i alt fire biologiske replikater undersøgt pr tilstand. I alt 19 videoer blev optaget (en video for hver dråbe på 5 orme), på tværs af i alt 95 individuelle orme undersøgt pr tilstand. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af den studerende t-testi Prism -GraphPad v6. (C) WT og gas-1(FC21) orme på L4 fase blev analyseret ved flatbed scanning til at producere to sekventielle billeder, der blev analyseret i WormScan software til at give en forskel billede. Tre biologiske replika eksperimenter blev udført med 15 orme pr godt i en 96 godt plade. Aktiviteten af WT-orme blev brugt som baseline til at normalisere procentdelen af kontrol (POC). gas-1(fc21) aktivitet blev reduceret med 34% i forhold til vilde-type kontrol (*** p < 0,001). Søjlediagrammer formidler middel- og standardafvigelse på tværs af tre biologiske replikaforsøg. (D) N2 og gas-1(fc21) orme på voksen dag 1 fase blev analyseret på samme måde som beskrevet for panel C. gas-1(FC21)aktivitet i dag 1 voksne blev reduceret med 49,1% i forhold til vilde-type kontrol orme (*** p < 0,001). Søjlegrafer formidler middel- og standardafvigelse af pixelændringer i en biologisk replika, der sammenligner N2 (n = 6 brønde med 15 orme/brønd) og gas-1(fc21) (n = 7 brønde af 15 orme/brønd). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her opsummerede undersøgelsen detaljerede oplysninger og rationaler til at studere C. elegans neuromuskulær aktivitet på niveau med forskellige resultater, herunder orm thrashing, bevægelse, svælg pumpning, og chemotaxis. Sammenligningen af 16 forskellige aktivitetsanalysemetoder blev udført med hensyn til den relative gennemløb, fordele og begrænsninger af kvantificere nematodeaktiviteter i en enkelt orm eller ormpopulationer i forskellige aldre og eksperimentelle varigheder. Blandt disse blev to nye tilpasninger og anvendelser af halvautomatiske analyser fremhævet for at påvise en betydelig reduktion i lokomotorisk aktivitet i larvestadier orme på L4 larve udviklingsfase og i dag 1 unge voksne af et veletableret mitokondrie kompleks I sygdom C. elegans stamme, gas-1(FC21) i forhold til WT kontrol.
Især C. elegans neuromuskulære funktion og lokomotorisk aktivitet er blevet grundigt undersøgt på solide medier, da WT orm bevægelse er meget regelmæssig i sinusformede bølge mønstre. Abnormiteter i deres regelmæssige bevægelsesvej og hastigheden kan mikroskopisk detekteres og scores manuelt af den eksperimentelle observatør i analyser, der ofte er lavgennemgangshastighed og kedelige. For at øge eksperimentelle gennemløb bør der vælges automatiserede og gennemløbsmetoder med høj gennemløb. Nedsat aktivitet af orme kan kvantificeres i flydende medier, hvor den samlede lokomotoriske aktivitet af orme i dråber på glasrutschebaner eller i multi-brønd plader kan videooptagelses og kvantificeres i semi-automatiseret eller automatiseret måde med forskellige softwareværktøjer. Faktisk fremhæver vores data nytten af objektivt og effektivt måling af nematode lokomotorisk aktivitet både ved en ny anvendelse af ZebraLab-software til at kvantificere lokomotorisk aktivitet i videoer af orme i flydende dråber på glasrutschebaner (en medium-throughput screeningskapacitetsmetode) samt ved at bruge WormScan-software til at kvantificere orm lokomotorisk aktivitet i differential flatbed scanningsbilleder af orme i en 96-brønd plade flydende medietilgang54, 55,56 (en tilgang til screeningskapacitet med høj kapacitet). ZebraLab software tilgang betragtes som en medium-throughput assay, da det kræver, at enkelt plader anvendes til hver tilstand undersøgt, uden nuværende udviklet protokol for multi-well plade formater. Mens du bruger ZebraLab-softwaretilgangen kræver minimal tid, når man analyserer C. elegans aktivitet under nogle få forhold, øges den eksperimentelle tid, når den anvendes på flere betingelser. Her var den eksperimentelle tid ca. 2 timer til at overføre orme til flydende dråber og optage videoer af deres aktivitet, i betragtning af 18 tekniske replikter for hver tilstand. Den tid, der blev brugt til analyse af disse videoer ved hjælp af ZebraLab-softwaren, var ca. 1 time. Til sammenligning er WormScan-metoden højgennemløb, fordi den indeholder et multi-brønd pladeformat, der tillader samtidig analyse af fire 96-brøndsplader på mindre end 10 minutter, og opsætning af en 96-brønds plade med en COPAS Bisoter er også mindre end 10 min.
Begge metoder viste en tilsvarende reduceret aktivitet i L4 larve fase gas-1(FC21) mitokondrie sygdom mutant orme i forhold til WT orme, og dermed validere begge forskellige tilgange til kvantificering forskelle i orm adfærd. Endvidere blev WormScan analyse brugt til let at påvise, at progressiv reduktion i dyr lokomotorisk aktivitet opstod med alderen i gas-1(FC21) orme, som det var tydeligt på dag 1 voksen fase.
De vigtigste fordele ved at tilpasse ZebraLab-softwaren, der blev udviklet til zebrafisksvømningsanalyse til C. elegans aktivitetsanalyse, er, at det er eksperimentelt enkelt og billigt objektivt at fange ormbevægelse i videoer med semiautomatisk kvantitativ analyse i filmfiler uploadet til ZebraLab-software, der kun kræver sekunder pr. teknisk replikering og fjerner investigatorbaseret bias, der er til stede i manuelle kvantificeringsmetoder. Endvidere er det nyttigt at have dette ene softwareværktøj i forskningslaboratoriet for at kvantificere lokomotorisk aktivitet i to dyrearter, nemlig zebrafisk og C. elegans. Ulempen er, at dette er en kommerciel software, der kræver køb og orm videoer skal uploades manuelt til softwaren, selv om upload-processen er ligetil og software analyse tid er relativt hurtig. Samlet set den nye ansøgning beskrevet her for at bruge ZebraLab software til at kvantificere C. elegans lokomotorisk aktivitet har direkte potentiale til at evaluere narkotika virkninger på orm adfærd, selv om dens gennemløb forbliver lav-til-medium i betragtning af sin høje opløsning krav nødvendiggør, at film blive fanget af orme bevæger sig i medierne dråber placeret på glas dias.
Vi har også tilpasset WormScan software til effektivt at kvantificere orm lokomotorisk kapacitet orme i flydende medier i en 96-brønd plade. Denne tilgang tilbyder en høj-throughput og billige eksperimentelle metode, der bruger en standard flatbed scanner til objektivt kvantificere dyr fecundity og overlevelse og har tidligere været brugt til high-throughput skærme i C. elegans49. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at det er meget modtageligt for high-throughput screening, muliggør parallelle sammenligninger af et stort antal betingelser på ethvert tidspunkt eller alder, med brugervenlighed, lave opsætningsomkostninger og hurtig analyse på en objektiv måde af WormScan-softwaren, der er gratis og offentligt tilgængelig49. Ulempen ved WormScan er, at det kun kan afhøre den ændring, der opstår mellem de sekventielle scanninger, som i nogle mutationer eller betingelser måske ikke er tilstrækkeligt følsomme til at opdage små grader af fænotypisk ændring. Da både ZebraLab- og WormScan-metoderne desuden udelukkende er afhængige af ændringer i billedpixelerne i analysen af dyrets aktivitet, kan det være nødvendigt at overveje og/eller anvendes som en normaliseringsfaktor for begge metoder for mere specifikt at muliggøre evaluering og sammenligning af mutations- og/eller behandlingseffekter på dyrs lokomotoriske aktivitet.
Samlet set kan en bred vifte af eksperimentelle metoder bruges til at vurdere nematode neuromuskulær aktivitet på integrerede fænotypiske resultater af thrashing, bevægelse, svælg pumpning, og / eller chemotaxis. Vi sammenlignede 16 af disse metoder (tabel 1), der fremhævede deres specifikke eksperimentelle og analytiske krav, fordele, begrænsninger og gennemløbskapacitet. Blandt disse leverede vi detaljerede eksperimentelle protokoller til to nye applikationer af eksisterende softwareværktøjer, ZebraLab (en medium-throughput-tilgang) og WormScan (en højgennemgang), som er særligt nyttige til semi-automatisk, objektivt og hurtigt kvantificere orm bevægelsesaktivitet i flydende medier. Begge forsøgsmetoder afslørede en tilsvarende reduceret grad af bevægelse aktivitet fandt sted i mitokondriesygdom (gas-1(FC21)) i forhold til WT C. elegans stammer på L4 fase, med gradvis nedgang i lokomotorisk aktivitet af de unge voksne fase i gas-1(FC21) orme. Disse data viser gyldigheden af disse eksperimentelle tilgange, der giver internt konsistente data. Desuden er denne vifte af metoder meget alsidig, hvilket muliggør en bred vifte af orm lokomotoriske aktivitetsmålinger i forskellige sygdomsetiologier, dyrestadier og aldre og som reaktion på kandidat terapeutisk modellering eller lægemiddelskærme med høj kapacitet, der er nyttige til præklinisk evaluering af blymål for menneskelig sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.L., N.D.M., N.S. og E.N.-O. ikke har nogen relevante finansielle oplysninger. MJF er medstifter af MitoCUREia, Inc., videnskabeligt advisory board medlem med aktieinteresse i RiboNova, Inc., og videnskabeligt bestyrelsesmedlem som betalt konsulent med Khondrion, og Larimar Therapeutics. M.J.F. har tidligere været eller er i øjeblikket beskæftiget med flere virksomheder, der er involveret i mitokondriesygdom terapeutisk præklinisk og / eller klinisk faseudvikling som betalt konsulent (Astellas [tidligere Mitobridge] Pharma Inc., Cyclerion Therapeutics, Epirium Bio, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics, NeuroVive, Reneo Therapeutics, Stealth BioTherapeutics, Zogenix, Inc.) og / eller en sponsoreret forskningssamarbejdspartner (AADI Therapeutics, Cardero Therapeutics, Cyclerion Therapeutics, Imel Therapeutics, Minovia Therapeutics Inc., Mission Therapeutics, NeuroVive, Raptor Therapeutics, REATA Inc., RiboNova Inc., Standigm Therapeutics og Stealth BioTherapeutics).
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Anthony Rosner, ph.d., med hans organisatoriske støtte til den tidlige forberedelse af dette projekt, og at Erin Haus for at bidrage til protokol analyse. Dette arbejde blev finansieret af Juliet's Cure FBXL4 Mitochondrial Disease Research Fund, Jaxson Flynt C12ORF65 Research Fund og National Institutes of Health (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863 og T32-NS007413). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis finansieringskildernes eller de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans wild isolate | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 Bristol | |
| Camera | Olympus | DP73 | |
| gas-1(fc-21) | CGC | CW152 | |
| Microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS | |
| Nematode Growth Medium (NGM) | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | |
| OP50 Escherichia coli | CGC | Uracil auxotroph E. coli strain | |
| Petri dishes (60 mm) | VWR international | 25373-085 | |
| S. Basal | VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O | VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660 | |
| Scanner | EPSON | V800 | |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 microscope | |
| 96-well flat bottom | VWR international | 29442-056 | |
| WormScan software | Mathew et al. 45 | S1 Standalone Java platform | Software for automation of difference image of scanned plates |
| ZebraLab software | ViewPoint | Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis |
References
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
- van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
- Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
- Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
- Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
- McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
- McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
- Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
- Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
- Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
- Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
- Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
- Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
- Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
- Anne, C. H.
- Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
- Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
- Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
- Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
- Albertson, D. G., Thomson, J. N.
- Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
- Avery, L., You, Y. J.
- Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
- Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
- Avery, L., Raizen, D., Lockery, S.
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
- Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
- Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
- Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
- Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
- Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
- Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
- Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
- Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
- Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
- Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
- Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
- Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).
