Summary
本研究为C.elegans复合I病气体-1（fc21）蠕虫（即斑马实验室（中通量检测）和WormScan（高通量检测）的两种半自动运动体活性分析方法提供了协议，并在各种研究方法中提供了比较分析，以量化线虫行为和综合神经肌肉功能。
Abstract
卡诺哈布迪炎埃莱甘斯被广泛认可为一种转化动物模型，可以有效地询问各种人类疾病的机制和疗法。蠕虫特别适合高通量基因和药物筛选，通过利用其快速发展周期、大育雏规模、短寿命、微观透明度、低维护成本、强大的基因组工具套件、突变存储库和实验方法来深入了解治疗靶点和疗法，从而对活体和前体内生理学进行询问。蠕虫体活性代表一种特别相关的表型，经常在线粒体疾病中受损，线粒体疾病在病因和表现上高度异质，但共同具有产生细胞能量的能力受损。虽然一套不同的方法可用于询问蠕虫行为，但这些方法在实验成本、复杂性和基因组或药物高通量屏幕的效用方面差异很大。在这里，比较了16种不同活性分析方法的相对产量、优势和局限性，在C.elegans的单个蠕虫或蠕虫群中对线虫运动、颤动、咽抽吸和/或化疗进行量化，时间不同。elegans的单个蠕虫或蠕虫种群在不同阶段、年龄和实验持续时间。演示了两种半自动化方法的详细协议，以量化代表现有软件工具新应用的线虫运动体活动，即 ZebraLab（中等吞吐量方法）和 WormScan（高通量方法）。应用这些方法的数据表明，类似的减少动物活动发生在L4幼虫阶段，并在第一天成人进展，在线粒体复合I病（气体-1（fc21）突变蠕虫相对于野生类型（N2布里斯托尔）C.elegans。这些数据验证了使用 ZebraLab 或 WormScan 软件工具高效、客观地量化蠕虫运动活动的这些新应用的效用，具有可变容量，支持线粒体疾病临床前动物模型中对蠕虫行为进行高通量药物筛查。
Introduction
卡诺哈比德炎是公认的神经科学的杰出模型，因为它有302个神经元，协调所有蠕虫的行为，包括交配，喂养，产卵，排便，游泳和固体介质1运动。这些造虫线虫也广泛用于理解广泛的人类疾病机制，其良好的基因组特征和高同源性 +80% 的基因之间的C. elegans和人类2，3，4.长期以来，C.elegans一直被用来询问人类线粒体疾病5，6，7，8，9，10，这是一个高度遗传和表型异构的遗传代谢紊乱组，共享受损的能力，以产生细胞能量，往往临床存在严重受损的神经肌肉功能，运动不耐受和疲劳11 ，12，13，14。为此，使用C.elegans模型，能够对线粒体疾病不同遗传亚型动物活动和神经肌肉功能的定量方面进行临床前建模，以及它们对可能改善其神经肌肉功能和整体活动的候选人疗法的反应。
C.elegans的神经肌肉活动通过一系列实验方法客观地可以测量，包括手动和半自动方法，允许在固体或液体介质（表1）1，15进行功能分析。准确量化C.elegans活动已被证明对与肌肉和神经系统16、17、18的功能和发展有关的发现非常重要。本研究总结并比较了17种不同检测方法的实验要求、优势和局限性，这些分析可以在研究实验室中进行，以评估C.elegans疾病模型中的四个关键结果的神经肌肉功能和活动，这些结果既在一系列发育阶段和年龄的基线上，也针对候选疗法（表1）).事实上，该研究提供了详细的概述，以描述C.elegans击打率（身体弯曲每分钟），体液活动，咽抽水，和化疗在每种情况下，具体说明使用的实验和分析方法，每种方法的优势和局限性，设备和软件需要执行和分析每个检测， 以及每种方法的吞吐量，以支持其用于高通量基因或药物筛选目的。根据实验协议的复杂性（包括蠕虫维护、处理时间、使用单井或多井板以及/或完成实验设置和数据分析所需的实验时间）来描述每个检测的吞吐量为低、中或高。
手动分析击打19，龙体活性20，咽泵17，21，化疗22，23是公认的方法来评估蠕虫活动，需要立体显微镜24。虽然测量蠕虫的击打活性需要分析液体介质，以确定每分钟身体弯曲的频率，但蠕虫的体压活动可以用固体介质或液体介质来测量。但是，对单个蠕虫活动的手动分析本身就很费时，并且涉及不可避免的用户生成的偏差。蠕虫活动分析的自动化可最大限度地减少用户生成的偏差，并可大幅提高实验吞吐量25。液体介质中蠕虫击打活动的视频录音可以使用"wrMTrck"（ImageJ插件26）进行分析。然而，最初为wMTrck开发的实验设置限制了其效用，因为单个液体掉落中的蠕虫太多导致蠕虫重叠，使得精确跟踪变得困难。虽然这个实验限制已经解决了27，wrMTrck方法不能支持高通量筛选。
存在一系列方法来量化基线的蠕虫运动体活动，并响应C.elegans线粒体疾病模型中的候选疗法。其中包括斑马实验室（视点生命科学），Tierpsy跟踪器28，宽视场线虫跟踪平台（WF-NTP）29，蠕虫汽车，蠕虫观察器30，蠕虫实验室31，无限芯片32，和W微轨跟踪器133（表1）。这些方法能够同时分析多蠕虫菌株或条件下的移动，通常位于多井板上，从而支持高通量药物筛选应用。其中一些方法具有独特的考虑因素，可能会限制或增强其通用性，例如需要昂贵的设备而不是开放访问软件，以及执行实验协议的不同易用性。总体而言，没有一个实验系统或协议非常适合所有C.elegans运动实验。相反，重要的是要仔细选择哪种方法最适合特定的调查员的实验目标和要求。
咽部抽水是评估C.elegans神经肌肉活动的另一个重要结果。C.elegans咽由20个肌肉细胞、20个神经元和20个其他细胞组成，这些细胞能够在蠕虫的胃道34、35、36的前端摄入大肠杆菌（大肠杆菌）。已建立了若干手动方法，以确定咽抽水率17，21，37，38。大多数方法是基于使用立体显微镜和相机可视化和记录咽抽吸频率与实验观察者21直接计数。通过执行称为电磷图 （EPG） 的细胞外记录，可以进行自动咽泵速率分析，该记录提供了有关每个泵39持续时间的其他信息。在微流体系统WormSpa中，也可以进行咽部抽吸率分析，其中单个蠕虫被限制在40、41室中。一种可用于促进咽泵速率分析的商业方法是 ScreenChip 系统（InVivo 生物系统），它测量、可视化和分析在自定义芯片中固定的单个蠕虫中喂养行为的神经肌肉方面。这种咽抽水定量方法可用于评估神经元和生理对药物的反应，衰老，和其他因素42，43，44，45。
切莫塔西斯描述了 C.elegans 的运动，以响应在线虫生长介质（NGM）板块的定义区域放置远离蠕虫的气味。评估化疗反应提供了蠕虫神经元和神经肌肉活动的综合测量，通过观察和测量蠕虫在规定的时间段46中向气味剂移动的物理距离来量化。多蠕虫跟踪器是一种自动方法，可用于提高实验效率，量化蠕虫向吸引者或驱虫剂47的距离。
在这里，描述了为量化蠕虫活动而建立的两种新型半自动化方法的详细协议。第一种方法利用ZebraLab一种最初开发用于研究Danio rerio（斑马鱼）游泳活动的商业软件，用于一种新的中等通量应用，根据运动过程中的像素变化（表1，图1）量化C.elegans液体介质中的整体运动体活动。数据输出是从大量并发条件和在玻璃滑梯上分析的样品中快速获得的，尽管这种方法不适合多井板格式。第二种方法是对WormScan方法48，49（图2）的全新改编，它使用平板扫描仪创建两个连续扫描的差分图像，可以与开源软件一起使用，从而能够半自动定量分析综合生理结果，如生育和生存。在这里，开发了一种新的WormScan方法，以量化每口96井平底板15个幼虫阶段4（L4）蠕虫种群中液体介质中的蠕虫体活性。这种半自动化和低成本的WormScan方法可以很容易地适应高通量的药物筛选，以及分析各种动物阶段和年龄48，49岁。
在这里，使用斑马实验室和WormScan半自动化方法分析C.elegans运动活动的协议和有效性在线粒体复合物I病，气体-1（fc21）的成熟C.elegans模型中得到了证明。气体-1（K09A9.5基因）是人类NDUFS2（NADH：尿素氧化物酶核（铁硫蛋白）子组2）（图3）的正词。C.elegans气体-1（fc21）突变菌株携带同源p.R.R.290K误入原位突变在NDUFS250的人类正统，导致显著减少的生育和寿命， 受损的呼吸链氧化磷化（OXPHOS）容量51，以及线粒体质量和膜潜力降低，增加氧化应激5，8 .尽管过去二十年来它已久经研究线粒体疾病，但此前没有报告过气体-1（fc21）突变体的体活性。在这里，ZebraLab和WormScan方法被应用于独立量化气体-1（fc21）与野生类型（WT，N2布里斯托尔）蠕虫的旋孔活性，既作为验证方法的一种方式，也是为了证明其实验协议和信息学分析的相对效用和效率。ZebraLab 软件允许快速量化C. elegans线粒体疾病模型中蠕虫运动者活动的几个并发条件，并有可能应用于有针对性的药物筛选或验证研究。WormScan 分析尤其适合于方便地启用复合库的高通量药物筛选，并优先考虑改善原发线粒体疾病临床前C. elegans模型中的动物神经肌肉功能和运动体活性的引线。
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Protocol
1. 使用 ZebraLab 软件在玻璃幻灯片上的液体介质中的蠕虫运动器活动分析
- 线虫生长和处理
- 在含有线虫生长介质 （NGM） 的培养皿板上种植C. elegans，并以大肠杆菌OP50 作为食物来源传播。将蠕虫培养保持在 20 °C，如前所述8。
- 同步蠕虫执行定时卵子奠定52 和研究蠕虫在所需的阶段。在此协议中，对 L4 阶段蠕虫进行了分析。
- 生长控制和突变蠕虫菌株在PGM板有和没有药物治疗测试或缓冲控制。为了评估药物治疗效果，准备在S.基底溶液中所需的药物库存浓度：将计算的特定体积分散到 NGM 板上，使其干燥。在特定幼虫或成人阶段转移蠕虫，并在分析前在药物治疗板上保持所需的持续时间。
- 用于运动体活动视频录制和斑马实验室分析的蠕虫实验设置
- 使用蠕虫选择每个菌株和条件选择 5 个同步 L4 蠕虫。Pipette 将一滴 20 μL 的 S. 基底溶液滴到玻璃滑梯上，该滑梯位于连接到摄像机的立体显微镜下，并将 5 种蠕虫转移到其中（图 1A，B）。仅在录制前的那一刻，将含有 NGM 和大肠杆菌OP50 的培养皿中的 5 种蠕虫转移到液体下降中。
注意：继续维护培养皿上的其他蠕虫，直到录制之前的视频。这将避免在过程中（干燥时间 +15-20 分钟）20 μl 滴干而对其他蠕虫造成的损害。 - 派佩特在一张幻灯片上多次掉落以获得多个技术复制（图 1A）。从不同的 NGM 板（生物复制）中选择蠕虫。不要使用盖单。
- 调整显微镜的工作距离，可视化单滴的完整区域。设置并保持低视频分辨率（<1024 x 768）以上传软件中的文件。
- 在录制之前，允许蠕虫在室温下在幻灯片上适应 1 分钟。
- 以每秒 15 帧（fps）的速度将蠕虫游泳活动记录在 1 滴 1 分钟。重复对板上每个额外掉落的成像。
- 使用蠕虫选择每个菌株和条件选择 5 个同步 L4 蠕虫。Pipette 将一滴 20 μL 的 S. 基底溶液滴到玻璃滑梯上，该滑梯位于连接到摄像机的立体显微镜下，并将 5 种蠕虫转移到其中（图 1A，B）。仅在录制前的那一刻，将含有 NGM 和大肠杆菌OP50 的培养皿中的 5 种蠕虫转移到液体下降中。
- C. 斑马 实验室软件中的乐根斯运动记录分析
- 使用选项 ZEBRALAB AVI 将视频上传到软件。单击 选项量化与 AVI 文件（图 1C）。
- 要创建新协议，请选择 文件>生成协议，然后添加为分析选择的区域数。选择 位置计数： 1.
- 打开协议参数，在实验持续时间窗口中选择1 分钟。选择不同的实验持续时间，以不同的实验持续时间。根据所需的数据输出选择或取消"无时间箱"窗口并选择集成期。在这项研究中，没有时间斌被选中（图1D）。
注：时间箱是活动的平均时间。 - 如果已创建协议，请选择 "打开协议" 并选择保存的协议（以 。vte 格式）。
- 选择 文件 并 打开电影 以上传以前录制的每个视频文件。
- 选择图 1E（黑色箭头）中指示的区域图标，以构建单个检测区域，并在蠕虫所在的整个液体掉落周围创建一个区域。点击选择，然后绿色圆圈图标（灰色箭头）下区域>建立>清晰的标记。
注：在所选区域（图1E，F）将检测到定义掉落中所有蠕虫的活动。 - 转到 校准>绘制 刻度（图 1E），并绘制视频区域左侧至右侧的水平线。指示校准的实际距离。然后选择 "申请组"。
- 取消选择图标来构建区域（ 图 1E中的箭头），并选择或取消选择 透明。
注：在这项研究中， 透明 被选中，并给出了更好的结果。 - 调整 检测灵敏度 和 活动阈值 ，以便检测分析的所有不同的 C. elegans 蠕虫菌株。
注：在本次实验中，检测灵敏度设置为8，爆裂值和冻结值分别为15和2（图1F）。 - 将显示刻度设置为70，以便在活动分析进行时可视化动物制作的轨道。然后选择"申请组"（图1F）。
- 点击 实验>执行>保存，然后 开始。一扇窗户打开。选择 要以最大计算机速度处理视频媒体吗？ 快速分析视频（例如，ZebraLab 软件在 5 秒内分析 1 分钟的视频录制）。
- 另一扇窗户打开： 跑步实验：单击 "开始 "继续实验。
- 视频录制完成后，分析停止。点击 实验>停止。这样可以保存从电子表格中的单个下降中分析的活动。
- 重复每个单个掉落视频的分析。每滴都是一个技术复制。
- 斑马实验室数据的输出和分析
注：实验结束后，每个视频的数据将作为选定文件夹中的单独电子表格单独保存。在数据输出文件中，所有蠕虫在单个下降中移动的集成活动水平记录为 Act 集成下的像素变化。- 打开从每个视频分析中获取的每个电子表格。手动编译为单个文件。
将突变和野生类型数据正常化为百分之一的控制。在这里，进行了统计分析，以比较各组之间的平均活动水平。
- 打开从每个视频分析中获取的每个电子表格。手动编译为单个文件。
2. WormScan 软件分析的 96 井板格式液体介质中的蠕虫运动体活性分析
- 线虫生长和处理
- 如第1.1.1节所述，种植 C.埃莱甘 。
- 同步蠕虫，如第1.1.2节所述。
- 在特定介质上种植蠕虫，如第 1.1.3 节所述，直到 L4 阶段或第 1 天成人。
- 96井板中蠕虫的实验设置，用于蠕虫活性分析
- 在 S. basal 介质的液体悬浮液中加入 50 μL，每卷大肠杆菌 OP50 的重量为 2%， 以加入 96 井、清澈、平底、微板的每口井，如前所述的 49，53。
- 在立体显微镜下，在L4阶段或第1天成人时，手动将15种同步蠕虫从其NGM板中挑选成96井微板每个实验井内的液态介质。在扫描之前，让蠕虫适应液体介质20分钟。
注：其他动物阶段和年龄可以很容易地替代研究。
- WormScan 活性分析在 96 井板和数据输出到电子表格。
- 使用标准平板扫描仪连续扫描每个 96 井、清晰、平底、微板两次，扫描间距不到 10s。
注：在这里，分辨率为 1，200 点/in 和 16 位灰度的照片扫描仪用于生成 jpeg 图像。使用照片扫描仪扫描四个 96 井板所需的时间不到 10 分钟。 - 使用开源软件49对齐两个连续扫描 （图 2A）。
注：该软件生成一个差异图像，以评估两个连续图像之间的像素变化的兴趣区域（图2B）和相对 WormScan分数。此 WormScan 分数相当于根据扫描仪设置为 5 像素阈值（图 2C）时产生的光强度而引起的运动响应变化。 - 将来自 WormScan 的数据导出作为电子表格。将包含数据的电子表格保存到本地计算机。将数据标准化为控制百分比 （POC），并针对不同的突变或治疗条件进行生物复制实验进行比较。使用学生 t测试进行统计分析以比较突变和控制手段。
- 使用标准平板扫描仪连续扫描每个 96 井、清晰、平底、微板两次，扫描间距不到 10s。
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Representative Results
分析液体介质中的C. elegans运动体活性可以轻松捕获线粒体疾病蠕虫模型的集成表型，这些模型在固体介质上可能不容易量化。ZebraLab 用于量化在 L4 幼虫阶段液体介质中相对于 WT 虫的成熟线粒体复合体 I 病气体-1（fc21）菌株的体活动。在1分钟内记录了5个蠕虫在一次液体下降中的活性，每个菌株总共记录了19个视频（技术复制），总共分析了每个菌株95个蠕虫。每个菌株获得了四个生物复制实验。蠕虫活动显示为像素变化 （图 3A），以及当规范化到 N2 布里斯托尔 WT 控制 （图 3B）时的控制百分比 （POC） 。气体-1（fc21） 蠕虫 （62% ± 16% 像素变化， 平均± SD， n = 19） 在 L4 阶段的±活动显著减少 38%（p < 0.001， t- 测试）， 与 WT 蠕虫相比 （100% ± 11.35%， 平均± SD， n = 95 蠕虫每个条件在 19 个技术复制超过 4 个生物复制） 。
还进行了WormScan分析，以量化液态介质中L4级气体-1（fc21）和WT蠕虫的体活性。为三项生物复制实验收集了数据，其中每个生物复制板都由使用标准平板扫描仪扫描的两个连续图像进行评估。将差分图像的蠕虫活动比作像素变化，并正常化为并发的 N2 布里斯托尔 WT 控制。同样，正如斑马鱼行为筛查方法所见，基于WormScan的分析表明，气体-1（fc21）蠕虫（65.9± 6.1， 平均± SD， n = 13 井） 与 N2 布里斯托尔野生类型蠕虫 （100% < ± 4.8%，平均± SEM， n = 12 井） 相比显著减少34%（图 3C）。分析使用WormScan在第一天成人气体-1（fc21） 蠕虫 （50.1% ± 10.7%， 平均± SD， n = 7 井） 显示与 WT 蠕虫相比，locomotor 活性下降了 49%（p < 0.001，t-测试）（100% ± 16.2%，平均± SD，n = 6 井）（图 3D）。
表1：可用于评估 C.elegans 神经肌肉活动的 实验性测定的比较概述。详细概述了16种不同的实验技术，可用于量化蠕虫神经肌肉活动在 C.elegans的击打，运动，咽抽水和/或化疗的表型结果。详细介绍了阅读格式、方法、实验吞吐量、软件和/或设备要求，以及每次检测的优势和局限性。还提供了每个检测和软件工具的参考文献和相关网站。根据实验的复杂性、单井或多井板的使用以及完成实验设置和数据分析所需的/或实验者时间，每个测定器的吞吐量被描述为低、中或高。* 表示该方法也可用于评估运动。 请点击这里下载此表。
图1：使用斑马实验室软件 进行叶拉甘斯 运动分析。 （A，B）蠕虫视频录制的实验协议。每滴（20 μL）S.基底溶液引入5种蠕虫，在立体显微镜下放置4个滴放在单个玻璃滑梯上。每滴5只蠕虫代表一个技术复制实验，并在单独的电影中使用带电耦合设备（CCD）相机记录了1分钟。（C-F）斑马实验室的实验设置适应了对 C.elegans的龙体活动的评价。（C） 选择具有 AVI 文件的量化，以量化每个录制视频的蠕虫运动体活动。（D） 协议参数设置，1分钟被选为实验持续时间。（E） 建立区域以选择感兴趣的区域。该区域被选定，并围绕放置 5 个蠕虫的 1 滴溶液构建。（F） 检测是根据灰度阈值确定的，以检测每个蠕虫的全身（红色）。在阈值部分，选择爆裂值和冻结值来分析像素变化的蠕虫活动。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：使用WormScan方法进行C.elegans电工活动分析。（A ）使用爱普生v800平板扫描仪，捕获了两个直接连续扫描的96井板，分辨率为1，200点/in和16位灰度，以产生jpeg图像。（B） 这两个96井板块的连续图像随后对齐到WT蠕虫的参考区域（ROI）。（C） 图像分析基于每个投资回报率与 N2 布里斯托尔 15 蠕虫/井计算的差值图像分数。差分图像已规范化并报告为控制百分比 （POC）。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：斑马实验室和蠕虫软件检测中与N2布里斯托尔野生型蠕虫相比的线粒体疾病蠕虫的间歇虫活动比较分析。 （A，B） WT 和气体-1（fc21） 液体滴 （5 蠕虫/滴） 中的蠕虫活动被录下来 1 分钟，并量化为（A）像素变化或（B））使用斑马实验室软件的野生类型控制百分比。总体而言，ZebraLab 的蠕虫活动分析显示，与野生类型对照器相比，气体-1（fc21）L4 阶段蠕虫显著减少 38%（***p < 0.001）。该图显示所有数据的± SD，每个点传达每个 S. 基底下降五个蠕虫的整体活动。每滴代表一个技术复制，总共研究了四个生物复制每个条件。总共录制了19个视频（每滴5个蠕虫一个视频），共研究了95个每个病种的蠕虫。统计分析是使用棱镜 - 图形板 v6 中的学生t测试进行的。（C） WT 和气体-1（fc21） 蠕虫在 L4 阶段通过平板扫描进行分析，生成两个连续图像，在 WormScan 软件中进行分析，以产生不同的图像。在96口井板中，每口井有15只蠕虫，进行了三次生物复制实验。WT 蠕虫的活动被用作使控制百分比 （POC） 正常化的基线。与野生类型控制相比，气体-1（fc21） 活动量减少了 34%（***p < 0.001）。条形图在三个生物复制实验中传达平均值和标准偏差。（D） N2 和气体-1（fc21） 蠕虫在成人第 1 阶段被分析为类似的详细面板 C.气体-1（fc21）活动在第 1 天成人减少 49.1% 相比野生类型的控制蠕虫 （*** p < 0.001）.条形图表示一个生物复制中像素变化的平均值和标准偏差，比较 N2（n = 6 井 15 蠕虫/井）和气体-1（fc21）（n = 7 井 15 蠕虫/井）。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，该研究总结了详细的信息和理由，研究C.elegans神经肌肉活动在不同的结果水平，包括蠕虫击打，运动，咽抽水，化疗。比较了16种不同的活动分析方法，从不同年龄和实验持续时间的单个蠕虫或蠕虫种群中线虫活动的相对吞吐量、优势和局限性进行。其中，突出了两种新型的适应和半自动分析的应用，以证明在L4幼虫发育阶段幼虫和在一个成熟的线粒体复合体I病C.elegans菌株，气体-1（fc21）相对于WT控制的第一天，幼虫的体活性显著减少。
特别是，由于WT蠕虫运动在鼻窦波模式中非常规律，C.elegans神经肌肉功能和运动体活动在固体介质上得到了广泛的研究。实验观察者可以通过微观检测和手动评分，在通常吞吐量低且乏味的测定中，可以从微观上检测出其正常运动路径和速度的异常。为了增加实验性吞吐量，应选择自动化和高吞吐量的方法。蠕虫的受损活性可以在液体介质中量化，在液体介质中，可以通过不同的软件工具以半自动或自动化的方式对玻璃滑梯或多井板上的蠕虫整体运动活动进行视频记录和量化。事实上， 我们的数据突出了客观和有效地测量线虫活动的作用，通过斑马实验室软件的新应用，量化在视频蠕虫在玻璃滑梯上的液体滴（中等- 吞吐量筛选能力方法），以及通过利用WormScan软件量化蠕虫在差异平板扫描图像蠕虫在96井板液体介质接近54， 55，56 （高通量筛选能力方法） 。ZebraLab 软件方法被视为一种中等吞吐量测定方法，因为它要求在研究的每个条件中使用单个板，而无需当前开发的多井板格式协议。虽然使用 ZebraLab 软件方法在分析C. elegans活动时需要最短的时间，但应用于多个条件时，实验时间会增加。在这里，实验时间大约是2小时，将蠕虫转移到液滴中，并记录其活动的视频，考虑每个条件的18个技术复制。使用 ZebraLab 软件分析这些视频的时间大约是 1 小时。相比之下，WormScan 方法具有高通量，因为它采用了多井板格式，允许在 10 分钟内同时分析 4 个 96 井板，而设置 96 井板与 COPAS 比索特也小于 10 分钟。
这两种方法都表明，与WT蠕虫相比，L4幼虫阶段气体-1（fc21）线粒体疾病突变蠕虫的活动同样减少，从而验证了两种不同的方法来量化蠕虫行为的差异。此外，WormScan分析被用来很容易证明，动物体活性逐渐减少发生在气体-1（fc21）蠕虫的年龄，这一点在第1天成人阶段就很明显了。
我们为斑马鱼游泳分析开发的 ZebraLab 软件适应 C. elegans 活动分析的主要优点是，在视频中客观捕获蠕虫运动在实验上简单且成本低廉，上传到 ZebraLab 软件的电影文件中的半自动定量分析每次技术复制只需几秒钟，并消除手动量化方法中存在的基于调查器的偏差。此外，在研究实验室中拥有这一个软件工具有助于量化两种动物模型物种，即斑马鱼和 C.elegans的龙体活性。缺点是，这是一个商业软件，需要购买和蠕虫视频需要手动上传到软件，虽然上传过程很简单，软件分析时间相对较快。总的来说，这里描述的使用 ZebraLab 软件量化 C. elegans 运动活动的新应用程序具有直接的潜力来评估药物对蠕虫行为的影响，尽管鉴于其高分辨率要求，其吞吐量仍然处于中低水平，因此必须捕获在放置在玻璃幻灯片上的介质滴中移动的蠕虫的电影。
我们还对WormScan软件进行了改造，以在96井板中高效量化液体介质中蠕虫的蠕虫体容量。这种方法提供了一个高通量和低成本的实验方法，使用标准的平板扫描仪客观地量化动物的粪便和生存，并已用于高通量屏幕在 C.elegans49。该技术的主要优点是，它非常适合高通量筛选，使在任何阶段或年龄的大量条件的平行比较，易于使用，低设置成本，并快速分析在客观的方式由WormScan软件是免费和公开提供49。WormScan 的缺点是它只能询问顺序扫描之间发生的变化，在某些突变或条件下，这些变化可能不够敏感，无法检测到小程度的表型变化。此外，由于 ZebraLab 和 WormScan 方法完全依赖于图像像素变化来检测动物活动，因此可能需要考虑和/或作为这两种方法的正常化因子考虑和/或使用蠕虫大小的显著差异，以便更具体地评估和比较突变和/或治疗对动物动物活动的影响。
总的来说，广泛的实验方法可用于评估线虫神经肌肉活动对综合表型结果的打击，运动，咽部泵送和/或化疗。我们比较了其中16种方法（表1），突出了它们的具体实验和分析要求、优势、局限性和吞吐量。其中，我们为现有软件工具的两种新应用（ZebraLab（中等吞吐量方法）和WormScan（高通量方法）提供了详细的实验协议，它们对液体介质中的半自动、客观和快速量化蠕虫运动活动特别有用。这两种实验方法都表明，与L4阶段的WT C. elegans菌株相比，线粒体疾病（气体-1（fc21）的腰部运动活动程度同样降低，而在气体-1（fc21）蠕虫的年轻成人阶段，运动活动逐渐减少。这些数据证明了这些实验方法的有效性，这些方法可以产生内部一致的数据。此外，这一系列方法具有高度的多功能性，能够在不同的疾病病因、动物阶段和年龄中提供广泛的蠕虫运动活动指标，并响应候选治疗建模或高通量药物筛选，这些筛选可用于临床前评估人类疾病的主要目标。
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Disclosures
北卡罗来纳州、北卡罗来纳州.M、北卡罗来纳州和欧盟没有相关的财务披露。M.J.F. 是米托库雷亚公司的联合创始人，科学顾问委员会成员，拥有里博诺瓦公司的股权，科学董事会成员作为康德里翁和拉里玛治疗公司的付费顾问。M.J.F. 以前或目前作为付费顾问参与线粒体疾病治疗临床前和/或临床阶段开发的几家公司（Astellas [原米托布里奇] 制药公司， 循环疗法，埃皮里姆生物，伊梅尔治疗，米诺维亚治疗，神经Vive，雷内奥治疗，隐身生物疗法，佐格尼克斯公司）和/或赞助的研究合作者（AADI治疗，卡德罗治疗， 循环疗法，伊梅尔治疗，米诺维亚治疗公司，任务治疗，神经Vive，猛禽治疗，REATA公司，里博诺瓦公司，斯坦德格姆治疗和隐秘生物治疗）。
Acknowledgments
我们感谢安东尼·罗斯纳博士为该项目的早期准备工作提供组织支持，并感谢艾琳·豪斯为协议分析做出贡献。这项工作由朱丽叶治疗FBXL4线粒体疾病研究基金、贾克逊·弗林特C12ORF65研究基金和国家卫生研究院（R01-GM120762，R01-GM120762-08S1，R35-GM134863和T32-NS007413）资助。内容完全由作者负责，不一定代表资助者或国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans wild isolate | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 Bristol | |
| Camera | Olympus | DP73 | |
| gas-1(fc-21) | CGC | CW152 | |
| Microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS | |
| Nematode Growth Medium (NGM) | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | |
| OP50 Escherichia coli | CGC | Uracil auxotroph E. coli strain | |
| Petri dishes (60 mm) | VWR international | 25373-085 | |
| S. Basal | VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O | VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660 | |
| Scanner | EPSON | V800 | |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 microscope | |
| 96-well flat bottom | VWR international | 29442-056 | |
| WormScan software | Mathew et al. 45 | S1 Standalone Java platform | Software for automation of difference image of scanned plates |
| ZebraLab software | ViewPoint | Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis |
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