Summary
本研究は、C.エレガン複合体I病ガス-1(fc21)ワーム、すなわちZebraLab(中スループットアッセイ)とWormScan(ハイスループットアッセイ)における2つの半自動運動活動分析アプローチのプロトコルを提示し、ネマトデ挙動と統合神経筋機能を定量化するための広範な研究方法の間で比較分析を提供する。
Abstract
カエノハブディティス・エレガンスは、多様なヒト疾患のメカニズムや治療法を効率的に問い合わせた翻訳動物モデルとして、その中心的な有用性が広く認められています。ワームは、高速開発サイクル、大きなブロードサイズ、短寿命、顕微鏡的透明性、低いメンテナンスコスト、ゲノムツールの堅牢なスイート、変異型リポジトリ、および生体内およびex vivo生理学の両方を尋問する実験的方法論を利用することによって、治療目標と治療法に関するより深い洞察を得るために、ハイスループットの遺伝的および薬物スクリーンに特に適しています。ワーム運動活動は、原因および症状において非常に不均質であるが、細胞エネルギーを産生する能力の低下を総称して共有するミトコンドリア病において頻繁に障害される特に関連する表現型を表す。一連の方法論は、ワームの動作を問い合わせて使用できますが、これらは、実験コスト、複雑さ、およびゲノムまたは薬物のハイスループット画面の有用性で大きく異なります。ここでは、16種類の活動分析方法論の相対的なスループット、利点、および限界を比較して、異なる段階、年齢、および実験期間におけるC.エレガンスの単一ワームまたはワーム集団における線球移動、スラッシング、咽頭ポンピング、および/または気化を定量化した。利用可能なソフトウェアツールの新しいアプリケーション、すなわちZebraLab(中スループットアプローチ)とWormScan(ハイスループットアプローチ)を表す線虫運動活動を定量化する2つの半自動化された方法について、詳細なプロトコルが実証されました。これらの方法を適用したデータは、L4幼虫期で同様の程度の動物活動が起こったことを示し、1日目成人において、ミトコンドリア複合体I病(gas-1(fc21))の変異型の野生型(N2ブリストル)C.エレガンスにおいて進行した。このデータは、ミトコンドリア病の前臨床動物モデルにおけるワーム行動に関する高スループット薬物スクリーニングをサポートする可変容量を有する、ZebraLabまたはWormScanソフトウェアツールを使用してワーム運動活動を効率的かつ客観的に定量化するこれらの新しいアプリケーションの有用性を検証する。
Introduction
カエノハビディティス・エレガンスは、固体培地上の交配、給餌、卵子産、排便、水泳、移動を含むすべてのワーム行動を調整する302ニューロンを有することに基づく神経科学における優れたモデルとして広く認識されている。これらの雌雄同体線虫はまた、そのよく特徴付けられるゲノムとC.エレガンスとヒト2、3、4の間の〜80%遺伝子の高相同性によって可能にされる、幅広い種類のヒト疾患メカニズムを理解するために広く使用されている。C.エレガンスは長い間、ヒトミトコンドリア病5、6、7、8、9、10を尋問するために使用されてきましたが、これは、細胞エネルギーを生成する能力を損ない、神経筋機能、運動不耐症、疲労を実質的に損なう臨床的に存在する遺伝性代謝障害の非常に遺伝的および典型的な不均一なグループである11 、12,13,14.この目的のために、C.エレガンスモデルの使用は、ミトコンドリア病の異なる遺伝的サブタイプにおける動物活動および神経筋機能の定量的側面の前臨床モデリングと、神経筋機能および全体的な活動を改善する可能性のある候補療法への反応を可能にする。
C.エレガンスにおける神経筋活性は、固体または液体培地の機能的分析を可能にする手動および半自動化アプローチの両方を含む様々な実験方法論によって客観的に測定可能である(表1)1、15。C.エレガンス活性の正確な定量は、筋肉および神経系16、17、18の機能および発達に関連する発見を可能にするために重要であることが証明されている。この研究は、発達段階と年齢の範囲でのベースラインと候補療法への応答の両方で、C.エレガンス病モデルの4つの主要な結果に対する神経筋機能と活動を評価するために研究室で行うことができる17の異なるアッセイの実験要件、利点、および限界を要約し、比較する(表1).実際、この研究は、C.エレガンススラッシング(1分あたりの身体屈曲)、運動活動、咽頭ポンプ、および化学療法の速度を特徴付けるために利用可能な実験的アプローチの範囲の詳細な概要を提供し、各方法の利点と限界を使用し、各方法の利点と限界を実行し、分析するために必要な機器とソフトウェア 高スループットの遺伝的または薬物スクリーニング目的での使用をサポートする各方法のスループット容量。各アッセイのスループット容量は、実験プロトコルの複雑性(ワームのメンテナンス、処理時間、シングルウェルまたはマルチウェルプレートの使用、実験設定およびデータ解析を完了するのに必要な実験時間)に基づいて、低、中、または高と表現されます。
スラッシング19の手動分析、運動活動20、咽頭ポンプ17、21、および走体22、23は、実体顕微鏡24を必要とするワーム活性を評価するための確立された方法論である。ワームのスラッシング活性を測定するには、1分間に身体が曲がる頻度を決定するために液体媒体で分析する必要がありますが、ワームの運動活動は固体媒体または液体媒体で測定することができます。ただし、個々のワームアクティビティの手動分析は、本質的に時間がかかり、ユーザーが生成する避けられないバイアスを伴います。ワーム活動解析の自動化により、ユーザーが生成するバイアスを最小限に抑え、実験スループットを大幅に向上させることができます25.液体メディアにおけるワームスラッシング活動のビデオ録画は、wrMTrck、ImageJプラグイン26を使用して分析することができます。しかし、wrMTrck用に開発された元の実験設定は、単一の液体滴の中であまりにも多くのワームがワームの重複を引き起こしたため、正確な追跡を困難にしたため、その有用性を制限しました。この実験的な制限は27で解決されましたが、wrMTrck法はハイスループットスクリーニングをサポートできません。
ベースラインで、およびC.エレガンスミトコンドリア病モデルの候補療法に応答して、ワームの運動活動を定量化する様々な方法が存在する。これらには、ZebraLab(ビューポイントライフサイエンス)、ティアプシートラッカー28、広視野線虫追跡プラットフォーム(WF-NTP)29、ワームモーテル、ワームウォッチャー30、ワームラボ31、インフィニティチップ32、WMicrotrackerOne33(表1)が含まれます。これらの方法は、複数のワーム株または条件(通常はマルチウェルプレート上)での移動の同時分析を可能にし、それによってより高スループットの薬物スクリーニングアプリケーションをサポートする。これらの方法の中には、高価な機器とオープンアクセスソフトウェアの必要性、実験プロトコルの実行の容易さなど、一般的なユーティリティを制限または強化する可能性のある独自の考慮事項があります。全体として、単一の実験システムまたはプロトコルは、理想的にはすべてのC.エレガンス運動活動実験に適していません。むしろ、特定の研究者の実験目標と要件に最も適した方法を慎重に選択することが重要です。
咽頭ポンプは、C. エレガンスの神経筋活動を評価するもう一つの重要な結果を表す。C.エレガンス咽頭は、20個の筋肉細胞、20個のニューロン、および20個の他の細胞で構成されており、ワームの消化管34、35、36の前端で大腸菌(大腸菌)の摂取を可能にする。咽頭ポンプ速度17、21、37、38を決定するためにいくつかの手動方法が確立されています。ほとんどの方法は、実験観察者21による直接カウントを用いて咽頭ポンプ周波数を可視化し記録するための実体顕微鏡およびカメラの使用に基づいている。自動咽頭ポンプ速度分析は、電気咽頭図(EPG)と呼ぶ細胞外記録を行うことにより可能であり、これは各ポンプ39の持続時間に関する追加情報を提供する。咽頭ポンプ速度分析は、個々のワームがチャンバー40、41に閉じ込められているマイクロ流体システム、WormSpaでも可能です。咽頭ポンプ速度の解析を容易にする市販の方法は、カスタムチップに固定化された単一ワームにおける摂食行動の神経筋の側面を測定、可視化、分析するScreenChipシステム(InVivoバイオシステム)です。この咽頭ポンプ定量アプローチは、薬物、老化、および他の因子42、43、44、45に対する神経および生理学的応答の両方を評価するために使用することができる。
化学療法は、線虫成長培地(NGM)プレートの定義された領域にワームから離れて配置された臭気に応答して C.エレガン スの動きを記述する。この化学運動量応答を評価することは、定義された期間46の中で、ワームが臭気に向かって移動する物理的距離を観察および測定することによって定量可能なワーム神経および神経筋活動の統合的尺度を提供する。マルチワームトラッカーは、刺激剤に向かって、または忌避剤からワームが移動する距離を定量化する実験効率を向上させるために使用することができる自動方法です47.
ここでは、ワーム活性を定量化するために確立された2つの新規の半自動化方法の詳細なプロトコルについて説明する。最初のアプローチは、もともとDanio rerio(ゼブラフィッシュ)の水泳活動を研究するために開発された商用ソフトウェアZebraLabを利用し、動き中のピクセル変化に基づいてC.エレガンスの液体媒体中の全体的なloco運動活性を定量化する新しい中スループットアプリケーションのために(表1、図1)。この方法はマルチウェルプレート形式には適していませんが、多数の同時条件とサンプルをグラススライド上で分析して、データ出力を迅速に取得します。2つ目のアプローチは、WormScanの方法論48、49(図2)の新しい適応であり、フラットベッドスキャナを使用して、オープンソースソフトウェアで可変的に使用できる2つのシーケンシャルスキャンの差分画像を作成し、胎児性や生存などの統合生理学的結果の半自動化された定量的分析を可能にします。ここでは、96ウェルの平底プレートのウェルあたり15の幼虫ステージ4(L4)ワームの集団中の液体培地におけるワームロコモ運動活性を定量化するWormScan方法論の新しいハイスループット適応が開発された。この半自動化および低コストのWormScan方法論は、ハイスループットの薬物スクリーンに容易に適応できるだけでなく、様々な動物の段階および年齢48、49の分析に合わせることができる。
ここで、ゼブララボとワームスキャンの両方の半自動化法を用いてC.エレガンス運動活動を分析するプロトコルと有効性が、ミトコンドリア複合体I病の確立されたC.エレガンスモデル、gas-1(fc21)で実証されている。 gas-1(K09A9.5遺伝子)は、ヒトNDUFS2のオルソログ(NADH:ユビキノンオキシド還元酵素コア(鉄硫黄タンパク質)サブユニット2)である(図3)。C.エレガンスガス-1(fc21)変異株は、NDUFS250のヒト正射体にホモ接合性p.R290Kミスセンス突然変異を運び、胎児性および寿命の有意な減少を引き起こし、呼吸鎖酸化リン酸化(OXPHOS)容量51の障害を引き起こし、ミトコンドリア質量および膜電位を減少させる5、 .ミトコンドリア病を研究するために過去20年間にわたって確立された使用にもかかわらず、ガス-1(fc21)変異体の運動活動は以前には報告されていなかった。ここでは、ZebraLabとWormScanの方法を適用して、野生型(WT、N2 Bristol)ワームと比較して、ガス-1(fc21)の運動活動を独自に定量化し、その方法を検証する方法と、実験プロトコルと情報解析の比較有用性と効率を実証する方法の両方を行いました。ZebraLabソフトウェアは、標的薬物スクリーニングまたは検証研究のための潜在的な適用で、C.エレガンスミトコンドリア病モデルにおけるワーム運動活動のいくつかの同時条件の迅速な定量を可能にした。特にWormScan分析は、化合物ライブラリのハイスループット薬物スクリーンを容易に有効にし、原発性ミトコンドリア病の前臨床C.エレガンスモデルにおける動物の神経筋機能および運動活動を改善するリードを優先するのに適している。
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Protocol
1. ZebraLabソフトウェアを使用したガラススライド上の液体メディアにおけるワーム運動活動解析
- 線虫の成長と取り扱い
- ネマトード成長培地(NGM)を含むペトリプレート上に C.エレガン スを成長させ、食品源として 大腸菌 OP50と広がります。前に説明した8のように、20°Cでワーム培養を維持する。
- 時を取った卵を実行するワームを同期させて52 を産み、所望の段階でワームを研究する。このプロトコルでは、L4段階のワームを分析した。
- 試験または緩衝制御する薬物治療の有無にかかわらずNGMプレート上の制御および突然変異虫株を成長させる。薬物治療効果を評価するには、S.基底溶液に所望の薬物ストック濃度を調製する。計算された特定のボリュームをNGMプレートに広げ、乾燥させます。特定の幼虫または成人期にワームを移し、分析前に所望の期間薬物治療プレート上に維持する。
- 運動活動ビデオ記録とZebraLab解析のためのワームの実験的セットアップ
- ワームピックを使用して、株と条件ごとに5つの同期L4ワームを選びます。カメラに接続された実体顕微鏡の下にあるガラススライド上にS.基底溶液の単一の20 μLの滴をピペットし、それに5つのワームを移す(図1A、B)。NGMと大腸菌OP50を含むペトリ皿から5ワームを、記録前の瞬間にのみ液体ドロップに移します。
注:前のビデオが記録されるまで、ペトリ皿の他のワームを維持し続けます。これはプロシージャの間に20のμlの滴の乾燥による他のワームの損傷を避ける(乾燥時間は15-20分)。 - 1つのスライド上のピペットの複数の滴は、複数の技術的な複製を得るために(図1A)。異なるNGMプレートからワームを選択します(生物学的複製)。カバースリップは使用しないでください。
- 顕微鏡の作動距離を調整して、単一のドロップの完全な領域を視覚化します。低いビデオ解像度(<1024 x 768)を設定して、ソフトウェア内のファイルをアップロードします。
- 記録する前に、1分間室温でスライドにワームを順応させます。
- 1 ドロップで 1 ドロップでワームスイムアクティビティを 1 秒あたり 15 フレーム (fps) で記録します。プレート上の追加のドロップごとにイメージングを繰り返します。
- ワームピックを使用して、株と条件ごとに5つの同期L4ワームを選びます。カメラに接続された実体顕微鏡の下にあるガラススライド上にS.基底溶液の単一の20 μLの滴をピペットし、それに5つのワームを移す(図1A、B)。NGMと大腸菌OP50を含むペトリ皿から5ワームを、記録前の瞬間にのみ液体ドロップに移します。
- C. ゼブララボソフトウェアにおけるエレガンス運動活動記録解析
- オプションZEBRALAB AVIを使用して、ソフトウェアにビデオをアップロードします。[AVIファイルを使用したクオンタイズ]オプションをクリックします(図1C)。
- 新しいプロトコルを作成するには、[ ファイル>生成プロトコル] を選択し、分析対象として選択した領域の数を追加します。 [ロケーション数: 1]を選択します。
- [プロトコル パラメータ]を開き、[実験期間]ウィンドウで[1分]を選択します。実験期間ごとに異なる実験期間を選択します。目的のデータ出力に応じて、ウィンドウ「時間ビンなし」を選択または選択解除し、「統合期間」を選択します。この研究では、タイムビンが選択されていません(図1D)。
注: タイムビンは、アクティビティの平均化に使用される時間です。 - プロトコルが既に作成されている場合は、[ オープン プロトコル ] を選択し、保存されているプロトコルを選択します (.vte 形式)。
- [ ファイル] および [ムービーを開く]を 選択して、以前に録画した個々のビデオファイルをアップロードします。
- 図 1Eに示されている領域アイコン (黒矢印) を選択して、検出の単一領域を構築し、ワームが配置されている液体ドロップ全体の周囲に領域を作成します。[選択] をクリックし、[マークをクリアする領域] の下の緑色の丸アイコン(灰色の矢印) > [ マークの作成 ] >下の矢印をクリックします。
注: 定義されたドロップ内のすべてのワームのアクティビティは、選択した領域で検出されます (図1E、F)。 - キャリブレーション>描画スケール(図1E)に移動し、ビデオ領域の左から右に水平線を描きます。キャリブレーションする実際の距離を指定します。次に、[グループに適用] を選択します。
- 領域を構築するために選択したアイコン ( 図 1Eの矢印) を選択解除し、 透明を選択または選択解除します。
注:この研究では、 透明 が選択され、より良い結果を得た。 - 検出感度とアクティビティしきい値を調整して、分析されたすべての異なるC.エレガンスワーム株の検出を可能にします。
注: この実験では、検出感度は 8 に設定され、それぞれ 15 と 2 の [バースト] および [凍結] の値が設定されています (図 1F)。 - アクティビティ解析中に動物が作成したトラックを視覚化するには、 表示スケール を 70 に設定します。次 に、[グループに適用] を選択します (図 1F)。
- [ テスト>実行>名前を付けて保存] をクリックし、[スタート] ボタンを クリックします。ウィンドウが開きます。ビデオを迅速 に解析するには、[最大コンピュータ速度でビデオメディアを処理しますか?] を選択します(例えば、1分のビデオ録画は5 sのZebraLabソフトウェアで分析されます)。
- 別のウィンドウが開きます: 実験を実行します。 [開始 ]をクリックして実験を進めます。
- ビデオの録画が完了すると、分析が停止します。[ 実験>停止] をクリックします。これにより、スプレッドシート内の 1 回のドロップから分析されたアクティビティが保存されます。
- 個々のドロップの各ビデオに対して分析を繰り返します。各ドロップは、1 つの技術的な複製です。
- ゼブララボデータの出力と分析
注: 実験後、各ビデオのデータは、個別のスプレッドシートとして選択したフォルダに保存されます。データ出力ファイルでは、個々のドロップで移動するすべてのワームの統合アクティビティレベルが、アクチンテグ下でのピクセル変化として記録されます。- 各ビデオの分析から得た各スプレッドシートを開きます。手動で 1 つのファイルにコンパイルします。
変異型データと野生型データを制御のパーセントに正規化します。ここでは、グループ間の平均活動レベルを比較するために統計分析を行った。
- 各ビデオの分析から得た各スプレッドシートを開きます。手動で 1 つのファイルにコンパイルします。
2. WormScanソフトウェア解析による96ウェルプレート形式の液体メディアにおけるワーム運動活動解析
- 線虫の成長と取り扱い
- セクション 1.1.1 で説明したように 、C. エレガンス を成長させる。
- セクション 1.1.2 で説明されているようにワームを同期します。
- L4 ステージまたは 1 日目の成人までセクション 1.1.3 で説明されているように、特定のメディアでワームを成長させる。
- ワームスキャン活動解析用96ウェルプレートにおけるワームの実験的セットアップ
- 前述の49,53の96ウェル、透明、平底、マイクロプレートの各ウェルに、S.基底媒体の液体懸濁液中の大腸菌OP50の体積当たり2%の重量の50 μLを加える。
- 実体顕微鏡の下で、96ウェルマイクロプレートの各実験井戸内の液体培地に彼らのNGMプレートからL4段階または1日目の成人で手動で15の同期ワームを選びます。ワームが液体メディアに20分間順応してからスキャンします。
注:他の動物の段階や年齢は、容易に研究のために置き換えることができます。
- 96ウェルプレートでのWormScanアクティビティ分析とスプレッドシートへのデータエクスポート。
- スキャンの間に10 s未満で、標準のフラットベッドスキャナを使用して、各96ウェル、クリア、フラットボトム、マイクロプレートを2回連続してスキャンします。
注: ここでは、JPEG 画像を生成するために 1,200 ドット/in および 16 ビットのグレースケールの解像度の写真スキャナを使用しました。フォトスキャナーを使用して4つの96ウェルプレートをスキャンするのに必要な時間は10分未満です。 - オープンソースソフトウェア49を使用して、2つの連続したスキャン(図2A)を整列します。
注: ソフトウェアは、対象領域の 2 つの連続画像 (図 2B)と相対的な WormScan スコアの間のピクセルの変化を評価する差分イメージを生成します。この WormScan スコアは、ピクセルしきい値 5 (図 2C) に設定した場合にスキャナーが生成する光強度に基づく運動応答の変化と同等です。 - WormScan からデータをスプレッドシートとしてエクスポートします。データを含むスプレッドシートをローカル コンピューターに保存します。データを制御の割合 (POC) として正規化し、多様な変異体または治療条件に対する生物学的複製実験を比較します。統計的分析を実行して、学生 t -testを使用して変異体と制御手段を比較します。
- スキャンの間に10 s未満で、標準のフラットベッドスキャナを使用して、各96ウェル、クリア、フラットボトム、マイクロプレートを2回連続してスキャンします。
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Representative Results
液体媒体中のC.エレガンス・ロコ運動活性の分析は、固体培地上で容易に定量化できない可能性のあるミトコンドリア病ワームモデルの統合表現型を容易に捕捉することができる。ZebraLabは、L4幼虫期の液体培地中のWTwormsに対して、確立されたミトコンドリア複合体I病ガス-1(fc21)株のロコ運動活性を定量化するために使用された。1回の液滴で5ワームの活動を1分間にわたって記録し、各菌株について合計19本のビデオ(技術的複製)を記録し、1株当たり95ワームの合計分析を行いました。4つの生物学的複製実験が1株当たり得た。N2 ブリストル WT コントロールに正規化すると、ワームのアクティビティはピクセル変化 (図 3A)として表示され、制御のパーセント (POC) として表示されます (図 3B)。ガス-1(fc21)ワーム(62%±16%ピクセル変化、平均±SD、n = 19)は、Wtワーム(100%±11.35%、平均SD、n = 95ワーム/19生物学的反復の反復)と比較して ±、L4段階でのlocomotor活性において有意な38%減少(p<0.001、t-test)を有する。
また、液媒体中のL4ステージガス-1(fc21)およびWTワームの運動活性を定量化するために、WormScan分析を行った。データを3つの生物学的複製実験のために収集し、そこで各生物学的複製プレートを、標準のフラットベッドスキャナーを用いてスキャンした2つの逐次画像によって評価した。微分画像のワーム活性をピクセル変化として比較し、同時N2ブリストルWT制御に正規化した。同様に、ゼブラフィッシュの行動スクリーニング法で見られたように、 ワームスキャンベースの分析は、ガス-1(fc21)ワーム(65.9±6.1、± 平均SD、n = 13ウェル)がN2ブリストル野生型ワーム(100%±4.8%、± 平均SEM、n1C)と比較して34%(p<0.001、t-test)のlocomotor活性の有意な減少を有することを実証した。 ワームスキャンを使用した1日目の成人ガス-1(fc21)ワーム(50.1%±10.7%、平均 ±SD、n=7ウェル)は、WTワーム <(100%±16.2%、平均SD±16.6)と比較して49%の運動活動の減少を示した(±SD、nウェル図)
表1:C.エレガンス神経筋活性を評価するために利用可能な実験的アッセイの比較概要。詳細な概要は、C.エレガンスにおけるスラッシング、移動、咽頭ポンピング、および/または気胸の結果に対するワーム神経筋活性を定量化するために使用できる16種類の実験技術の幅広い配列を提供する。読み取り形式、方法論、実験スループット容量、ソフトウェアおよび/または機器の要件、ならびに各アッセイの利点と制限が詳細に記載されています。各アッセイおよびソフトウェアツールの参照および関連ウェブサイトも提供されています。各アッセイのスループット容量は、実験の複雑さ、単一または多ウェルプレートの使用、および実験の設定とデータ分析を完了するために必要な実験時間に基づいて、低、中、または高と記述されています。* 移動の評価に方法論を使用できることを示します。このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
図1: ゼブララボソフトウェアを用いた エレガン ス運動活動解析 (A,B)ワームビデオ録画の実験プロトコル。S.基底溶液の1滴当たり(20μL)に5つのワームが導入され、4滴が単一のガラススライド上に立体顕微鏡下に置かれました。5つのワームの各滴は技術的な複製実験を表し、荷電結合装置(CCD)カメラを使用して別の映画に1分間記録された。(C-F)ゼブララボの実験設定は 、C.エレガンスにおける運動活動の評価に適応した。(C) AVI ファイル による量子化 の選択により、記録された各ビデオのワーム運動活動を定量化する。(D) プロトコル パラメータ設定、実験期間として 1 分選択。(E) 対象領域を選択するためのビルド領域。この領域は、5つのワームが配置されたソリューションの約1滴を選択し、構築されました。(F)検出は、各ワームの全身を検出するグレースケールの閾値(赤)に基づいて決定した。しきい値セクションでは、ピクセルの変化に伴うワームのアクティビティを分析するために、バースト値と凍結値を選択しました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ワームスキャン方法論を用いたC.エレガンス運動活動解析.(A)エプソンv800フラットベッドスキャナを使用して、96ウェルプレートの2つの連続スキャンを1,200ドット/inと16ビットグレースケールでキャプチャし、jpeg画像を生成した。(B) 96ウェルプレートのこれら2つの連続画像は、WTワームの参照対象領域(ROI)に整列した。(C) 画像解析は、N2 ブリストルの 15 ワーム/ウェルを持つ ROI ごとに計算された差分画像スコアに基づいています。差異画像は正規化され、制御率(POC)として報告された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ZebraLabとWormScanソフトウェアアッセイによるLocomotor活性の比較分析は、N2ブリストル野生型ワームに対するミトコンドリア病ワーム(A,B)およびガス-1(fc21)の液滴中のワーム活性(5ワーム/ドロップ)を1分間記録し、(A)ピクセルとして定量化した) ZebraLab ソフトウェアを使用した野生型制御の割合。全体として、ZebraLabベースのワーム活動分析は、野生型制御(***p<0.001)と比較して、ガス-1(fc21)L4ステージワームで38%有意に減少しました。グラフは、すべてのデータ±平均SDを示し、各ドットはS.基底降下当たり5つのワームの全体的な活性を伝える。各ドロップは技術的な複製を表し、条件ごとに合計4つの生物学的複製が研究されています。合計 19 のビデオ (5 ワームのドロップごとに 1 つのビデオ) が記録され、各条件で調査された個々のワームの合計 95 個。プリズム-グラフパッドv6の学生t-testを用いて統計解析を行った。L4段階でのWTとガス-1(fc21)のワームをフラットベッドスキャンで解析し、WormScanソフトウェアで解析した2つのシーケンシャル画像を生成し、差分画像を生成した。3つの生物学的複製実験を、96ウェルプレートで1ウェルあたり15個のワームで行った。WTワームの活性は、制御の割合(POC)を正規化するためのベースラインとして使用された。gas-1(fc21) 活性は、野生型制御(***p <0.001)と比較して34%減少した。棒グラフは3つの生物学的複製実験で平均と標準偏差を伝える。(D) N2 およびgas-1(fc21) 成人 1 日目段階のワームを、1 日目のパネル C. gas-1(fc21) 活性が野生型制御ワームに対して 49.1% 減少した(0.001 <の) と同様に分析した。棒グラフは、N2(n = 15ワーム/ウェルの6ウェル)とガス-1(15ワーム/ウェルのn =7ウェル)を比較した1つの生物学的複製におけるピクセル変化の平均と標準偏差を伝える。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、ワームスラッシング、移動運動、咽頭ポンピング、気胸など、多様な結果のレベルでC.エレガンス神経筋活動を研究するための詳細な情報と根拠を要約した。16の異なる活動分析方法論の比較は、異なる年齢および実験期間における単一のワームまたはワーム集団における線虫活動を定量化する相対的なスループット、利点、および限界の観点から行われた。これらの中で、半自動分析の2つの新しい適応と適用は、L4幼虫発生段階での幼虫段階のワームおよび1日目に確立されたミトコンドリア複合体I疾患C.エレガンス株の若年成人の運動活動の有意な減少を示すために強調された。
特に、C.エレガンス神経筋機能および運動活動は、WTワームの動きが正弦波パターンにおいて非常に規則的であるため、固体培地に関して広く研究されてきた。彼らの規則的な移動経路および速度の異常は、しばしば低スループットで退屈なアッセイにおいて、実験観察者によって顕微鏡的に検出され、手動で採点することができる。実験用のスループットを向上させるためには、自動化された高スループットの方法を選択する必要があります。ワームの活動障害は液体メディアで定量化することができ、ガラススライド上またはマルチウェルプレートの液滴中のワームの全体的な運動活動を、異なるソフトウェアツールで半自動または自動化された方法でビデオ記録および定量化することができます。実際、私たちのデータは、ZebraLabソフトウェアがガラススライド上の液体滴中のワームのビデオでロコモ運動活性を定量化する新しいアプリケーション(中スループットスクリーニング能力アプローチ)と、WormScanソフトウェアを使用してワームの微分フラットベッドスキャン画像でワームロコモ運動活性を定量化することによって、客観的かつ効率的に線虫運動活動を測定する有用性を強調しています。 55、56(ハイスループットスクリーニング能力アプローチ)ZebraLabソフトウェアアプローチは、マルチウェルプレートフォーマット用の現在開発されたプロトコルなしで、研究された各条件に単一プレートを使用する必要があるため、中スループットアッセイと考えられています。ZebraLabソフトウェアアプローチを使用すると、いくつかの条件でC.エレガンスの活動を分析する際に最小限の時間を必要としますが、複数の条件に適用すると実験時間が長くなります。ここで実験時間は、ワームを液滴に移し、その活動のビデオを記録し、各条件に対して18の技術的複製を考慮して約2時間であった。ZebraLabソフトウェアを使用してこれらのビデオの分析に費やした時間は約1時間でした。それに比べて、WormScan法は、10分未満で4つの96ウェルプレートの同時分析を可能にするマルチウェルプレートフォーマットを組み込み、COPAS Bisoterで96ウェルプレートを設定することも10分未満であるため、高スループットです。
どちらの方法論も、Wtワームに対するL4幼虫期ガス-1(fc21)ミトコンドリア病変異虫において同様に減少した活性を示し、したがって、ワーム挙動の違いを定量化するための両方の異なるアプローチを検証した。また、ワームスキャン解析は、成人期1日までに明らかなように、ガス-1(fc21)ワームにおいて動物運動活動の進行性低下が加齢とともに起こったことを容易に示すために使用された。
ゼブラフィッシュ水泳分析のために開発されたZebraLabソフトウェアを C.elegans 活動分析に適応させる主な利点は、ビデオ内のワームの動きを客観的にキャプチャすることは実験的に簡単で安価であり、ZebraLabソフトウェアにアップロードされた映画ファイルの半自動定量分析は技術的な複製ごとに数秒しか必要とせず、手動定量方法論に存在する研究者ベースのバイアスを取り除くことです。また、この1つのソフトウェアツールを研究室に持つことは、2つの動物モデル種、すなわちゼブラフィッシュおよび C.エレガンスにおけるロコモ運動活性を定量化するのに有用である。欠点は、購入やワームのビデオを手動でソフトウェアにアップロードする必要がある商用ソフトウェアですが、アップロードプロセスは簡単で、ソフトウェア分析時間は比較的短いです。全体として、ZebraLabソフトウェアを使用して C.エレガンス ・ロコ運動活動を定量化する新しいアプリケーションは、ワームの行動に対する薬物効果を評価する直接的な可能性を秘めていますが、そのスループットは低から中まで残っていますが、高解像度の要件を考えると、ガラススライドに置かれたメディアドロップに移動するワームの映画をキャプチャする必要があります。
また、96ウェルプレートの液体メディア中のワームのワーム運動能力を効率的に定量化するために、WormScanソフトウェアを適応させました。このアプローチは、標準的なフラットベッドスキャナーを使用して動物の胎児性と生存率を客観的に定量化し、以前は C.elegans49のハイスループットスクリーンに使用されていた高スループットおよび低コストの実験方法を提供する。この技術の主な利点は、ハイスループットスクリーニングに非常に適しており、自由で一般に利用可能なWormScanソフトウェアによる目的の方法での使いやすさ、低いセットアップコスト、および迅速な分析で、あらゆる段階または年齢で多数の条件の並列比較を可能にすることです。WormScanの欠点は、連続スキャンの間に起こる変化を尋問することしかできないことであり、いくつかの突然変異または条件では、小さな程度の現象変化を検出するのに十分に敏感でない可能性がある。さらに、ZebraLabとWormScanの両方の方法は、アッセイ動物の活動に対する画像ピクセルの変化に排他的に依存しているので、時間の経過とともに株間または特定の治療に応答して起こり得るワームサイズの大きな違いを考慮および/または両方の方法の正規化因子として使用し、動物の運動活動に対する突然変異および/または治療効果のより具体的な評価および比較を可能にする必要があります。
全体的に見て、広範な実験的方法を使用して、スラッシング、移動、咽頭ポンピング、および/または気胸の統合的な表向きの結果に基づいてネマトード神経筋活性を評価することができます。これらの方法の16を比較し(表1)、その具体的な実験的および分析的要件、利点、制限、およびスループット容量を強調した。その中で、既存のソフトウェアツールの2つの新しいアプリケーション、ZebraLab(中スループットアプローチ)とWormScan(ハイスループットアプローチ)の2つの新しいアプリケーションに対して詳細な実験プロトコルを提供しました。両方の実験アプローチは、L4段階でのWT C.エレガンス株に対するミトコンドリア病(gas-1(fc21))で同様に減少した移動活性が生じ、ガス-1(fc21)ワームにおける若年成人期による運動活動の進行的減少を示した。このデータは、内部的に一貫性のあるデータを生成するこれらの実験的アプローチの妥当性を示しています。さらに、この配列の方法は非常に汎用性が高く、多様な疾患の病因、動物の段階および年齢におけるワーム運動活動指標の広い範囲を可能にし、そして、ヒト疾患の鉛標的の前臨床評価に有用である候補治療モデリングまたは高スループットの薬物スクリーンに応答して。
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Disclosures
M.L.、N.D..M、N.S.、E.N.-O.関連する財務上の開示はありません。M.J.F.は、株式会社リボノバ社に株式権を持つ科学諮問委員であり、コンドリオンの有料コンサルタントとして科学理事を務め、ラリマー・セラピューティクスの共同設立者です。M.J.F.は以前、または現在、ミトコンドリア病治療前臨床および/または臨床段階の開発に関与するいくつかの企業を有料コンサルタント(アステラス[旧ミトブリッジ]ファーマ社、有償 サイクルリオンセラピューティクス、エピリウムバイオ、イメルセラピューティクス、ミノビアセラピューティクス、NeuroVive、レネオセラピューティクス、ステルスバイオセラピューティクス、ゾジェニックス社)および/またはスポンサー研究共同研究者(AADIセラピューティクス、カルデロセラピューティクス、 サイクルリオン・セラピューティクス、イメル・セラピューティクス、ミノビア・セラピューティクス社、ミッション・セラピューティクス、ニューロヴィーヴ、ラプター・セラピューティクス、REATA Inc.、リボノヴァ社、スタンディム・セラピューティクス、ステルスバイオセラティクス)。
Acknowledgments
アンソニー・ロズナー博士は、このプロジェクトの早期準備に対する組織的支援と、プロトコル分析に貢献してくれたエリン・ハウスに感謝しています。この研究は、ジュリエットのキュアFBXL4ミトコンドリア病研究基金、ジャックソン・フリントC12ORF65研究基金、国立衛生研究所(R01-GM120762、R01-GM120762-08S1、R35-GM134863、T32-NS0043)によって資金提供されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも資金提供者または国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C. elegans wild isolate | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 Bristol | |
| Camera | Olympus | DP73 | |
| gas-1(fc-21) | CGC | CW152 | |
| Microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS | |
| Nematode Growth Medium (NGM) | Research Products International Corp. | N81800-1000.0 | |
| OP50 Escherichia coli | CGC | Uracil auxotroph E. coli strain | |
| Petri dishes (60 mm) | VWR international | 25373-085 | |
| S. Basal | VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, and 5 mg cholesterol, in 1 l H2O | VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660 | |
| Scanner | EPSON | V800 | |
| Stereomicroscope | Olympus | MVX10 microscope | |
| 96-well flat bottom | VWR international | 29442-056 | |
| WormScan software | Mathew et al. 45 | S1 Standalone Java platform | Software for automation of difference image of scanned plates |
| ZebraLab software | ViewPoint | Software for automated quantization and tracking of zebrafish behavior, designed by ViewPoint (http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening) and here applied to C. elegans. This system is applicable for high-throughput behavioral analysis |
References
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A.
- Shaye, D. D., Greenwald, I. OrthoList: a compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
- van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), 1000027 (2008).
- Kim, W., Underwood, R. S., Greenwald, I., Shaye, D. D. OrthoList 2: A new comparative genomic analysis of human and Caenorhabditis elegans genes. Genetics. 210 (2), 445-461 (2018).
- Dingley, S., et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction variably increases oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 10 (2), 125-136 (2010).
- Polyak, E., Zhang, Z., Falk, M. J. Molecular profiling of mitochondrial dysfunction in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 837, 241-255 (2012).
- McCormick, E., Place, E., Falk, M. J. Molecular genetic testing for mitochondrial disease: from one generation to the next. Neurotherapeutics. 10 (2), 251-261 (2013).
- McCormack, S., et al. Pharmacologic targeting of sirtuin and PPAR signaling improves longevity and mitochondrial physiology in respiratory chain complex I mutant Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 22, 45-59 (2015).
- Polyak, E., et al. N-acetylcysteine and vitamin E rescue animal longevity and cellular oxidative stress in pre-clinical models of mitochondrial complex I disease. Molecular Genetics and Metabolism. 123 (4), 449-462 (2018).
- Guha, S., et al. Pre-clinical evaluation of cysteamine bitartrate as a therapeutic agent for mitochondrial respiratory chain disease. Human Molecular Genetics. 28 (11), 1837-1852 (2019).
- Gorman, G. S., et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Annals of Neurology. 77 (5), 753-759 (2015).
- Mancuso, M., Orsucci, D., Filosto, M., Simoncini, C., Siciliano, G. Drugs and mitochondrial diseases: 40 queries and answers. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 13 (4), 527-543 (2012).
- Gai, X., et al. Mutations in FBXL4, encoding a mitochondrial protein, cause early-onset mitochondrial encephalomyopathy. American Journal of Human Genetics. 93 (3), 482-495 (2013).
- Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
- Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).
- Avery, L., Horvitz, H. R. Effects of starvation and neuroactive drugs on feeding in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 253 (3), 263-270 (1990).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. Journal of Experimental Biology. 211 (23), 3703-3711 (2008).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Avery, L. Motor neuron M3 controls pharyngeal muscle relaxation timing in Caenorhabditis elegans. Journal of Experimental Zoology. 175, 283-297 (1993).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
- Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. Chemosensory cell function in the behavior and development of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 529-538 (1990).
- Anne, C. H.
- Biston, M. C., et al. An objective method to measure cell survival by computer-assisted image processing of numeric images of Petri dishes. Physics in Medicine & Biology. 48 (11), 1551-1563 (2003).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52321 (2015).
- Shi, W., Qin, J., Ye, N., Lin, B. Droplet-based microfluidic system for individual Caenorhabditis elegans assay. Lab on a Chip. 8 (9), 1432-1435 (2008).
- Javer, A., et al. An open-source platform for analyzing and sharing worm-behavior data. Nature Methods. 15 (9), 645-646 (2018).
- Koopman, M., et al. Assessing motor-related phenotypes of Caenorhabditis elegans with the wide field-of-view nematode tracking platform. Nature Protocols. 15 (6), 2071-2106 (2020).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Angstman, N. B., Kiessling, M. C., Frank, H. G., Schmitz, C. High interindividual variability in dose-dependent reduction in speed of movement after exposing C. elegans to shock waves. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 12 (2015).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Bianchi, J. I., Stockert, J. C., Buzzi, L. I., Blazquez-Castro, A., Simonetta, S. H. Reliable screening of dye phototoxicity by using a Caenorhabditis elegans fast bioassay. PLoS One. 10 (6), 0128898 (2015).
- Albertson, D. G., Thomson, J. N.
- Raizen, D. M., Avery, L. Electrical activity and behavior in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Neuron. 12 (3), 483-495 (1994).
- Avery, L., You, Y. J.
- Morck, C., Rauthan, M., Wagberg, F., Pilon, M. pha-2 encodes the C. elegans ortholog of the homeodomain protein HEX and is required for the formation of the pharyngeal isthmus. Developmental Biology. 272 (2), 403-418 (2004).
- Song, B. M., Avery, L. Serotonin activates overall feeding by activating two separate neural pathways in Caenorhabditis elegans. TheJournal of Neuroscience. 32 (6), 1920-1931 (2012).
- Avery, L., Raizen, D., Lockery, S.
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab in a Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Lee, K. S., et al. Serotonin-dependent kinetics of feeding bursts underlie a graded response to food availability in C. elegans. Nature Communications. 8, 14221 (2017).
- Brinkmann, V., Ale-Agha, N., Haendeler, J., Ventura, N. The Aryl Hydrocarbon Receptor (AhR) in the aging process: Another puzzling role for this highly conserved transcription factor. Frontiers in Physiology. 10, 1561 (2019).
- Huang, C., et al. Intrinsically aggregation-prone proteins form amyloid-like aggregates and contribute to tissue aging in Caenorhabditis elegans. eLife. 8, 43059 (2019).
- Zhu, B., et al. Functional analysis of epilepsy-associated variants in STXBP1/Munc18-1 using humanized Caenorhabditis elegans. Epilepsia. 61 (4), 810-821 (2020).
- Weeks, J. C., Robinson, K. J., Lockery, S. R., Roberts, W. M. Anthelmintic drug actions in resistant and susceptible C. elegans revealed by electrophysiological recordings in a multichannel microfluidic device. International Journal of Parasitology. Drugs and Drug Resistance. 8 (3), 607-628 (2018).
- Haroon, S., et al. Multiple molecular mechanisms rescue mtDNA disease in C. elegans. Cell Reports. 22 (12), 3115-3125 (2018).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans. PLoS One. 7 (3), 33483 (2012).
- Mathew, M. D., et al. Using C. elegans forward and reverse genetics to identify new compounds with anthelmintic activity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005058 (2016).
- Kayser, E. B., Morgan, P. G., Hoppel, C. L., Sedensky, M. M. Mitochondrial expression and function of GAS-1 in Caenorhabditis elegans. Journal Biological Chemistry. 276 (23), 20551-20558 (2001).
- Falk, M. J., Kayser, E. B., Morgan, P. G., Sedensky, M. M. Mitochondrial complex I function modulates volatile anesthetic sensitivity in C. elegans. Current Biology. 16 (16), 1641-1645 (2006).
- Kwon, Y. J., Guha, S., Tuluc, F., Falk, M. J. High-throughput BioSorter quantification of relative mitochondrial content and membrane potential in living Caenorhabditis elegans. Mitochondrion. 40, 42-50 (2018).
- Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
- Steele, W. B., Mole, R. A., Brooks, B. W. Experimental protocol for examining behavioral response profiles in larval fish: Application to the Neuro-stimulant caffeine. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), e57938 (2018).
- Carlsson, G., Blomberg, M., Pohl, J., Orn, S. Swimming activity in zebrafish larvae exposed to veterinary antiparasitic pharmaceuticals. Environmental Toxicology and Pharmacology. 63, 74-77 (2018).
- Yang, X., et al. High-throughput screening in larval zebrafish identifies novel potent sedative-hypnotics. Anesthesiology. 129 (3), 459-476 (2018).
