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Biology

कण टेम्पलेट Emulsification Microfluidic-मुक्त ड्रॉपलेट Assays सक्षम बनाता है

Published: March 9, 2021 doi: 10.3791/62248
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, 2Chan Zuckerberg Biohub

Summary

पानी में तेल की बूंद assays विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान, एंजाइम विकास, और एकल सेल विश्लेषण के लिए उपयोगी हैं, लेकिन आमतौर पर बूंदों को बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स की आवश्यकता होती है। यहां, हम कण टेम्पलेट किए गए इमल्सिफिकेशन का वर्णन करते हैं, जो ड्रॉपलेट एसेस करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक-मुक्त दृष्टिकोण है।

Abstract

मोनोडिस्पर्स्ड ड्रॉपलेट्स में की गई प्रतिक्रियाएं थोक में किए गए समकक्ष लोगों की तुलना में बढ़ी हुई सटीकता और संवेदनशीलता प्रदान करती हैं। हालांकि, नियंत्रित बूंदों को बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स की आवश्यकता गैर-विशेषज्ञों के लिए एक बाधा लगाती है, जिससे उनके उपयोग को सीमित किया जाता है। यहां, हम कण टेम्पलेट किए गए पायसीकरण का वर्णन करते हैं, जो माइक्रोफ्लुइडिक्स के बिना मोनोडिस्पर्स ड्रॉपलेट्स उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण है। टेम्प्लेटिंग हाइड्रोजेल क्षेत्रों का उपयोग करते हुए, हम सरल भंवर द्वारा मोनोडिस्पर्स्ड बूंदों में नमूनों को समाहित करते हैं। हम माइक्रोफ्लुइडिक-मुक्त डिजिटल पीसीआर करने के लिए इसका उपयोग करके दृष्टिकोण का प्रदर्शन करते हैं।

Introduction

ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक्स थोक प्रतिक्रियाओं की तुलना में एसेस की संवेदनशीलता और सटीकता को बढ़ाने के लिए पिकोलिटर बूंदों में कंपार्टमेंटलाइजेशन का लाभ उठाता है, और रासायनिक स्क्रीनिंग, प्रोटीन इंजीनियरिंग और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 1,2,3 में कई अनुप्रयोग हैं। उदाहरण के लिए, डिजिटल ड्रॉपलेट पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (ddPCR) थोक मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) की तुलना में बढ़ी हुई सटीकता प्रदान करता है, जिसमें कैंसर में आनुवंशिक भिन्नता के लिए अनुप्रयोग, उत्परिवर्तन पैदा करने वाली बीमारी का पता लगाने और प्रसवपूर्व निदान 4,5,6 के लिए अनुप्रयोग होते हैं। ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक्स की एक चुनौती, हालांकि, विभाजन के नमूनों के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की आवश्यकता है; जबकि माइक्रोफ्लुइडिक्स ड्रॉपलेट गुणों पर उत्कृष्ट नियंत्रण प्रदान करते हैं, उन्हें 7,8 बनाने और संचालित करने के लिए विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। नतीजतन, ड्रॉपलेट-आधारित तरीके काफी हद तक विशेषज्ञ प्रयोगशालाओं तक सीमित हैं या, दुर्लभ उदाहरणों में, ऐसे अनुप्रयोग जिनमें एक वाणिज्यिक उपकरण उपलब्ध है9,10। ड्रॉपलेट एसेस के उपयोग को व्यापक बनाने के लिए, विशेष माइक्रोफ्लुइडिक इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता एक बाधा है जिसे दूर किया जाना चाहिए।

इस लेख में, हम कण टेम्पलेटेड एमल्सिफिकेशन (पीटीई) का वर्णन करते हैं, जो मोनोडिस्पर्स्ड बूंदों में प्रतिक्रियाओं को करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक-मुक्त विधि है। पीटीई में, टेम्प्लेटिंग कण नमूने को वाहक तेल में बूंदों में सरल भंवर (चित्रा 1) द्वारा घेर लेते हैं। जैसा कि सिस्टम मिश्रण करता है, जलीय भाग के टुकड़े आकार को कम करने की बूंदों में तब तक होते हैं जब तक कि बूंदों में एकल कण नहीं होते हैं, जिस बिंदु पर आगे विखंडन संभव नहीं है क्योंकि इसके लिए कणों को तोड़ने की आवश्यकता होती है। घिरा हुआ नमूना कणों को बूंदों में एक खोल के रूप में घेरता है, जिससे किसी भी छितरी हुई कोशिकाओं, अभिकर्मकों, या कार्यात्मक moieties (चित्रा 1 डी) को encapsulating। इस प्रकार, पीटीई को एक सामान्य भंवर से परे बूंद प्रतिक्रियाओं को करने के लिए किसी उपकरण या विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ मिनट या घंटों की तुलना में ड्रॉपलेट पीढ़ी में सेकंड लगते हैं, और उत्पादित राशि कंटेनर की मात्रा के लिए आनुपातिक होती है, न कि डिवाइस ऑपरेशन समय, जिससे यह अत्यधिक स्केलेबल हो जाता है। ये लाभ पीटीई को विभिन्न परिस्थितियों में बूंद assays के संचालन के लिए आदर्श बनाते हैं जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक्स अव्यावहारिक होते हैं। यहां, हम पीटीई का प्रदर्शन करते हैं और इसका उपयोग ddPCR का संचालन करने के लिए करते हैं।

Figure 1
चित्र 1. कण टेम्पलेट emulsification प्रक्रिया का अवलोकन. (ए) टेम्प्लेटिंग कणों को अभिकर्मकों के साथ मिलाया जाता है। (बी) अतिरिक्त अभिकर्मकों को सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद हटा दिया जाता है। (C) टेम्पलेट अणुओं का जोड़ तेल के अतिरिक्त होने से पहले होता है। (डी) भंवर एक एकल टेम्पलेट अणु युक्त बूंदों का उत्पादन करता है। (ई) बाद में थर्मोसाइक्लिंग और इमेजिंग लक्ष्य टेम्पलेट के डिजिटल ड्रॉपलेट विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

1. कण टेम्पलेट emulsification के लिए हाइड्रोजेल कणों की तैयारी.

कण टेम्पलेट किए गए पायसीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले हाइड्रोजेल कणों को दो अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है।

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कणों का उपयोग करके तैयारी
    1. पीटीई के साथ संगत सूखे पॉलीएक्रिलामाइड कणों के 0.5 ग्राम जोड़ें (उदाहरण के लिए, बायो-जेल पी -60 जेल (बायो-रेड), 45-90 μm व्यास) 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बाँझ पानी के 30 मिलीलीटर में और अच्छी तरह से मिश्रण करें। 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  2. कणों के माइक्रोफ्लुइडिक निर्माण का उपयोग करके तैयारी
    नोट: PTE के साथ संगत Polyacrylamide कणों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ड्रॉप निर्माताओं (उदाहरण के लिए, QX200 ड्रॉप जनरेटर (बायो-रेड), RayDrop (Fluigent) आदि), या कस्टम माइक्रोफ्लुइडिक डिजाइन द्वारा का उपयोग करके तैयार किया जा सकता है।
    1. कस्टम मास्टर का निर्माण
      1. कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन (सीएडी) सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक नरम फोटोलिथोग्राफी मास्क डिज़ाइन करें। सर्किट बोर्ड फिल्म पर एक 10 μm संकल्प के साथ फोटोमास्क मुद्रित करें।
      2. सिलिकॉन वेफर में एक 3 के केंद्र पर photoresist के 1 mL डालो. एक स्पिन कोटर का उपयोग करने के लिए फोटोरेसिस्ट की एक 50 μm परत बनाने के लिए इसे 30 सेकंड के लिए 500 rpm पर कताई द्वारा 30 सेकंड के लिए 1250 rpm द्वारा पीछा किया। विलायक को वाष्पित करने के लिए वेफर को 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए हॉटप्लेट पर रखें।
      3. एक कवर ग्लास स्लाइड के साथ सिलिकॉन वेफर पर फोटोमास्क को सुरक्षित करें और 2.5 मिनट के लिए एक कोलिमेटेड 190 mW, 365 μm यूवी एलईडी के तहत वेफर को बेनकाब करें। पोस्ट एक्सपोज़र बेकिंग के लिए 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए हॉटप्लेट पर वेफर रखें।
      4. फोटोरेसिस्ट-सिलिकॉन वेफर को 15 मिनट तक 100% प्रोपलीन ग्लाइकोल मोनोमिथाइल ईथर एसीटेट (PGMEA) के स्नान में विसर्जित करके विकसित करें। ताजा 100% PGMEA के साथ वेफर कुल्ला 100% isopropanol के बाद. हवा वेफर सूखी.
      5. 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक हॉटप्लेट पर वेफर को सुखाकर किसी भी अवशिष्ट आइसोप्रोपेनॉल को हटा दें। वेफर को पेट्री डिश में एक साफ 3 में रखें।
    2. कस्टम माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का निर्माण
      1. polydimethylsiloxane (PDMS) सिलिकॉन आधार और इलाज अभिकर्मक को द्रव्यमान द्वारा 10: 1 अनुपात में मिलाएं। घर वैक्यूम के तहत एक desiccator का उपयोग कर मिश्रित PDMS degas जब तक कोई हवा बुलबुले अवलोकन योग्य हैं.
      2. पेट्री डिश में मास्टर पर degassed PDMS डालें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सिलिकॉन वेफर पूरी तरह से जलमग्न है। सिलिकॉन वेफर और पीडीएमएस degas किसी भी हवा के बुलबुले है कि डालने के दौरान गठन हो सकता है को हटाने के लिए.
      3. कम से कम 60 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक ओवन में सिलिकॉन वेफर और पीडीएमएस रखकर पीडीएमएस का इलाज करें। पीडीएमएस का एक ब्लॉक जिसमें एक स्केलपेल का उपयोग करके पेट्री डिश से माइक्रोफ्लुइडिक विशेषताएं होती हैं। सिलिकॉन मास्टर पर मौजूद किसी भी विशेषताओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरतें।
      4. एक 0.75 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग कर माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में इनलेट्स और आउटलेट्स के अनुरूप पीडीएमएस ब्लॉक में इनलेट्स और आउटलेट्स को पंच करें। दोहराए जाने वाले आवेदन और PDMS ब्लॉक की सतह पर पैकेजिंग टेप को हटाने के साथ किसी भी धूल और कणों को हटा दें।
      5. एक 50 मिमी x 75 मिमी ग्लास स्लाइड को 100% आइसोप्रोपेनॉल के साथ धोकर साफ करें और बाद में सतह को सुखाने वाली हवा। प्लाज्मा एक प्लाज्मा बॉन्डर का उपयोग करके 1 मिनट के लिए O2 प्लाज्मा के 1 mbar का उपयोग करके ग्लास स्लाइड और PDMS (सुविधाओं का सामना करना पड़ रहा है) दोनों का इलाज करता है।
      6. प्लाज्मा इलाज PDMS ग्लास स्लाइड पर नीचे का सामना करना पड़ रहा है, प्लाज्मा इलाज पक्ष ऊपर का सामना करना पड़ के साथ सुविधाओं के साथ रखकर कांच स्लाइड करने के लिए चिपकाएँ। बॉन्डिंग को पूरा करने के लिए स्लाइड को कम से कम 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेट किए गए ओवन में रखें।
      7. सतह हाइड्रोफोबिकिटी सुनिश्चित करने और गीला होने से रोकने के लिए एक फ्लोरिनेटेड सतह उपचार के साथ सभी माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों का इलाज करें। डिवाइस को कम से कम 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।
    3. टेम्प्लेटिंग कणों का निर्माण
      1. 6.2% एक्रिलामाइड, 0.18% एन, एन'-मेथिलीनबिस (एक्रिलामाइड), और 0.3% अमोनियम परसल्फेट से मिलकर एक पॉलीएक्रिलामाइड (पीएए) समाधान तैयार करें। इस घोल को 28G सुई के साथ 1 mL सिरिंज में लोड करें।
      2. बूंदों के उत्पादन और स्थिरीकरण के लिए हाइड्रोफ्लोरोएथर (एचएफई) तेल में 5% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) फ्लोरोसर्फेक्टेंट और 1% एन, एन, एनएन-टेट्रामेथिलेथिलेलेनडायमाइन (टीईएमईडी) से मिलकर एक अघुलनशील निरंतर चरण तैयार करें। नए 1 एमएल सिरिंज में समाधान लोड करें।
      3. सिरिंज पंपों (जैसे, NE-501) में सिरिंज युक्त पीएए और एचएफई समाधान दोनों को लोड करें। सिरिंज पर और डिवाइस में डाले गए पॉलीथीन टयूबिंग का उपयोग करके माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस से दोनों सिरिंज को कनेक्ट करें। कनेक्ट करने से पहले, टयूबिंग से हवा को हटाने के लिए पंपों को प्राइम करें।
        नोट:: मॉडल के आधार पर, सिरिंज पंप इनपुट, निर्माण सॉफ़्टवेयर, या एक कस्टम स्क्रिप्ट (https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program पर उपलब्ध) में निर्मित के साथ नियंत्रित किया जा सकता है।
      4. पीएए और एचएफई तेल इनपुट के साथ क्रमशः 300 μL / h और 500 μL / h पर ड्रॉप जनरेशन डिवाइस चलाएं। एक 15 mL संग्रह ट्यूब में बूंदों के 1 mL इकट्ठा और पोलीमराइजेशन के लिए कमरे के तापमान पर 3 ज के लिए इनक्यूबेट। इनक्यूबेशन के बाद, पिपेटिंग द्वारा तेल की निचली परत को हटा दें।
      5. एक रासायनिक demulsifier के रूप में 15 mL संग्रह ट्यूब के लिए HFE तेल में 20% (v / v) perfluoro-1-octanol (PFO) के 1 mL जोड़ें। मिश्रण के बाद, 2 मिनट के लिए 2000 x g पर 15 mL संग्रह ट्यूब नीचे स्पिन। पीएफओ / एचएफई supernatant pipetting द्वारा निकालें। 1x दोहराएँ.
      6. 15 mL संग्रह ट्यूब और मिश्रण करने के लिए भंवर करने के लिए हेक्सेन में 2% sorbitan monooleate के 2 mL जोड़ें। 3 मिनट के लिए 3000 x g पर ट्यूब स्पिन. surfactant/hexane समाधान को हटाने के लिए pipetting द्वारा supernatant निकालें। 2x दोहराएँ.
      7. TEBST बफर के 5 mL जोड़ें (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 274 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0.2% Triton X-100) और अच्छी तरह से मिश्रण। 3 मिनट के लिए 3,000 x g पर नीचे स्पिन। पिपेटिंग द्वारा supernatant निकालें। 3x दोहराएँ.
      8. 5 mL TEBST में resuspend. इस समाधान को अनिश्चित काल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. कण टेम्पलेट emulsification.

टेम्प्लेटिंग कणों की तैयारी के बाद, पीटीई का उपयोग बूंदों में नमूने और अभिकर्मकों को समाहित करने के लिए किया जाता है।

  1. कणों को गोली मारने के लिए 1 मिनट के लिए 6000 x g पर centrifuging द्वारा कण टेम्पलेट emulsification के लिए polyacrylamide कणों को तैयार करें, तो pipetting द्वारा supernatant को हटाने और बाँझ पानी का उपयोग कर resuspend. किसी भी अवशिष्ट TEBST को हटाने को सुनिश्चित करने के लिए 3x दोहराएँ।
  2. हेमोसाइटोमीटर (या समकक्ष) का उपयोग करके टेम्प्लेटिंग कणों की एकाग्रता और व्यास निर्धारित करें। पिक्सेल में व्यास को मापने और माइक्रोन में परिवर्तित करके अलग-अलग कण व्यास की गणना करें। माइक्रोन में पिक्सेल के रूपांतरण की गणना हेमोसाइटोमीटर (या समकक्ष) को अंशांकन स्लाइड के रूप में और पिक्सेल में ज्ञात ग्रिड दूरी को मापने का उपयोग करके की जा सकती है।
  3. एक पीसीआर मास्टर मिश्रण, उपयुक्त प्राइमरों, और तालिका 1 के अनुसार एक फ्लोरोसीन हाइड्रोलिसिस जांच का उपयोग करके एक ताजा 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में फैलाव चरण तैयार करें। घटकों के समरूप वितरण को सुनिश्चित करने के लिए एक ट्यूब रोटेटर का उपयोग करके कोमल आंदोलन (10 आरपीएम) के तहत 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    नोट:: मात्रा और कणों के लक्ष्य एकाग्रता Poisson लोड िंग पर आधारित है। सामान्य नियम के रूप में, कणों की संख्या encapsulated किए जाने वाले नमूनों की संख्या से अधिक परिमाण का एक क्रम होना चाहिए। अज्ञात सांद्रता के नमूनों के लिए, पॉइसन लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला आवश्यक है।
आयतन अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ)
100 μL कण (450 कण / μL)
200 μL 2x पीसीआर मास्टर मिश्रण
18 μL 10 μM फॉरवर्ड प्राइमर
18 μL 10 μM रिवर्स प्राइमर
18 μL 10 μM प्रोब
0.8 μL ट्राइटन X100
45.2 μL न्यूक्लिएज मुक्त जल

तालिका 1. डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर के लिए पीटीई के साथ उपयोग किए जाने वाले पीसीआर मास्टर मिश्रण की तैयारी।

  1. 1 मिनट के लिए 6000 x g पर फैलाव चरण centrifuge और supernatant को हटाने. supernatant निकाले गए की मात्रा रिकॉर्ड करें और 2.3 में परिकलित कुल फैलाव चरण मात्रा का उपयोग कर गोली की मात्रा निर्धारित करें।
    नोट: निकाले गए supernatant की मात्रा कण पैकिंग, व्यास, और 300 μL की एक न्यूनतम अपेक्षित मात्रा के साथ एकाग्रता के आधार पर भिन्न होगा।
  2. 1.62 पीजी / μL Saccharomyces cerevisiae जीनोमिक डीएनए के 1 μL को 2.4 से गोली में जोड़ें और pipetting या जोरदार दोहन द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण।
    नोट: अतिरिक्त जलीय सामग्री की उपस्थिति encapsulation दक्षता को कम कर सकते हैं। यदि नमूना मात्रा गोली की मात्रा के 1% से अधिक है, तो नमूना ध्यान केंद्रित करें। यदि नमूना केंद्रित नहीं किया जा सकता है, तो पीसीआर मास्टर मिश्रण और परिणामस्वरूप छर्रे की मात्रा को नमूना मात्रा के अनुसार स्केल करें। पीटीई छोटे (10 μL) के emulsification को templating कणों के बड़े (2 mL) वॉल्यूम के लिए अनुमति देता है। पीसीआर मास्टर मिश्रण (2.3) और तेल (2.6) को क्रमशः कण गोली के लक्ष्य (2.3) और मापा (2.4) मात्रा के अनुसार स्केल किया जा सकता है।
  3. 200 μL 2% fluorosurfactant HFE तेल में इमल्सीफिकेशन के लिए अघुलनशील निरंतर चरण के रूप में ट्यूब में जोड़ें। सुनिश्चित करें कि गोली pipetting या दोहन / ट्यूब flicking द्वारा विस्थापित है. फिर 30 सेकंड के लिए 3000 आरपीएम पर भंवर।
    नोट:: 3000 rpm करने के लिए संगत सेटिंग ब्रांड और मॉडल के आधार पर भिन्न हो सकता है।
  4. इमल्शन के लिए 1 मिनट के लिए बसने के लिए अनुमति दें। नीचे तेल चरण के 100 μL निकालें और HFE तेल में ताजा 2% fluorosurfactant के साथ इस मात्रा को प्रतिस्थापित करें। धीरे से मिश्रण करने के लिए कई बार ट्यूब उलटें। 3-5x दोहराएं या जब तक छोटे उपग्रह बूंदों को हटा नहीं दिया जाता है।

3. डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर और विश्लेषण.

  1. बसने के 2-5 मिनट के बाद, नीचे तेल चरण को हटा दें। फ्लोरोकार्बन तेल (जैसे, FC-40) में 5% फ्लोरोसर्फेक्टेंट के साथ इस मात्रा को बदलें।
  2. एक चौड़े बोर पिपेट टिप का उपयोग करते हुए, सावधानीपूर्वक 200 μL पीसीआर ट्यूबों में नमूने के 100 μL pipette. पीसीआर ट्यूबों को थर्मोसाइकलर में रखें और तालिका 2 के अनुसार चलाएं।
क़दम तापमान अवधि नोट्स
1 95 °C 2 मिनट
2 95 °C 30 सेकंड
3 50 °C 90 सेकंड
4 72 °C 60 सेकंड
5 x34 चरण 2 से 4 तक दोहराएँ
6 72 °C 2 मिनट
7 4 °C पकड

तालिका 2. पीटीई इमल्शन का उपयोग करके डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर के लिए थर्मोसाइक्लिंग की स्थिति।

  1. फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए एक विस्तृत बोर पिपेट टिप का उपयोग करके एक गिनती स्लाइड पर नमूना पिपेट करें। 490 एनएम उत्तेजना और 525 एनएम उत्सर्जन का पता लगाने तरंग दैर्ध्य के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नमूना छवि।
  2. उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए सकारात्मक फ्लोरोसेंट बूंदों (एनपी) और कुल बूंदों (एनटी) को मापें और सकारात्मक बूंदों (एनपी / एनटी) और पॉइसन आंकड़ों के अंश का उपयोग करके टेम्पलेट अणुओं (π) की संख्या की गणना करें:
    Equation 1
  3. 95% विश्वास अंतराल (zc = 1.96) की गणना कीजिये:
    Equation 2
  4. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करके चरण 2.5 में जोड़े गए नमूने के आयतन (μL में π) का उपयोग करके नमूना सांद्रता (अणुओं /μL) की गणना कीजिये। तकनीकी प्रतिकृतियों का उपयोग करके नमूना एकाग्रता का माध्य और मानक विचलन निर्धारित करें।
    Equation 3

Representative Results

Figure 2
चित्र 2. कण टेम्पलेट emulsification का उपयोग कर बूंदों में नमूने का encapsulation. (ए) कण टेमप्लेटिंग इमल्सीफिकेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले कणों को टेम्प्लेटिंग करना। (बी) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद supernatant से templating कण गोली का पृथक्करण। (सी) (डी) पहचान योग्य जलीय खोल के साथ कण टेम्पलेट किए गए इमल्सीफिकेशन के परिणामस्वरूप होने वाली बूंदें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पीटीई में, इमल्शन की मोनोडिस्पर्सिटी को टेम्प्लेटिंग कणों द्वारा निर्धारित किया जाता है, क्योंकि बूंदों का व्यास कणों की तुलना में थोड़ा बड़ा होता है। इस प्रकार, समान कण ों को नियंत्रित PTE encapsulation11 के लिए केंद्रीय हैं। रासायनिक (सोल-जेल, इमल्शन पोलीमराइजेशन), हाइड्रोडायनामिक (झिल्ली इमल्सीफिकेशन, होमोजेनाइजेशन), और निस्पंदन विधियों सहित समान टेम्प्लेटिंग कणों को उत्पन्न करने के लिए विभिन्न प्रकार के तरीके मौजूद हैं। विशेष रूप से माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण, शानदार monodispersity (चित्रा 2A) को बर्दाश्त करते हैं और PTE12 में अपनी कार्यक्षमता को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त कण इंजीनियरिंग की अनुमति देते हैं। वैकल्पिक रूप से, टेम्प्लेटिंग कणों को खरीदा जा सकता है, हालांकि उनकी एकरूपता, जबकि पर्याप्त है, आमतौर पर माइक्रोफ्लुइडिक पीढ़ी 11 की तुलना में कम है।

पीटीई करने के लिए, कणों को नमूने के साथ मिश्रित किया जाता है (चित्रा 1 ए), और अतिरिक्त supernatant centrifugation और pipetting (चित्रा 1 B) द्वारा हटा दिया जाता है, जैसा कि पीसीआर ट्यूब (चित्रा 2 बी) के तल पर एक कण गोली की तस्वीर द्वारा सचित्र है। एक स्थिर surfactant युक्त encapsulating तेल तो जोड़ा जाता है (चित्रा 1C), और नमूना धीरे से 30 सेकंड (चित्रा 1 डी) के लिए भंवर से पहले pipetted, इमल्शन (चित्रा 2C) उत्पन्न करने के लिए. परिणामी बूंदों में एक कण कोर और जलीय खोल होता है जिसमें प्रारंभिक नमूना होता है, जिसके भीतर अभिकर्मकों, लक्ष्य अणुओं और प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक कोशिकाएं रहती हैं (चित्रा 2 डी)। ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक एनकैप्सुलेशन की तरह, छोटे मोतियों या कोशिकाओं जैसी असतत संस्थाओं को बेतरतीब ढंग से और पॉइसन वितरण के अनुसार समझाया जाता है, हालांकि लगभग सभी बूंदों में पीटीई भौतिकी की प्रकृति के कारण एक टेम्प्लेटिंग कण होता है।

Figure 3
चित्र 3. पहचान और कण टेम्पलेट emulsification बूंदों की सफाई. (ए) अपर्याप्त भंवर से प्रति बूंद कई कणों के साथ गैर-समान बूंद पीढ़ी का उदाहरण। (बी) कण टेम्पलेट किए गए इमल्सीफिकेशन और (सी) पानी में तेल फ्रैक्शनेशन के बाद उपग्रहों और बूंदों की अपेक्षित उपस्थिति। (डी) तेल धोने के बाद परिणामी इमल्शन। (ई) अत्यधिक उपग्रह उत्पादन कण टेम्पलेट किए गए इमल्सीफिकेशन के दौरान अवशिष्ट supernatant के परिणामस्वरूप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यहां तक कि सफल पीटीई में, डबल या ट्रिपल कोर ड्रॉपलेट्स मौजूद हैं, हालांकि वे आम तौर पर प्रतिक्रिया में नगण्य रूप से योगदान देते हैं, बशर्ते वे दुर्लभ हों। पर्याप्त गोले को बनाए रखते हुए मल्टीकोर बूंदों की कम आवृत्ति प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया मापदंडों के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जिसमें सतह तनाव, अंतर-कण आसंजन बल, नमूना चिपचिपाहट, कंटेनर आकार, और भंवर शक्ति और समय शामिल हैं। उदाहरण के लिए, एक खराब अनुकूलित emulsification में कई templating कणों (चित्रा 3A) के साथ polydispersed बूंदें हो सकती हैं, यह दर्शाता है कि भंवर पूरी तरह से नमूने को emulsify करने के लिए अपर्याप्त था। ऐसे उदाहरणों में, डिटर्जेंट को अंतर-कण आसंजन और निचले सतह तनाव को कम करने के लिए जोड़ा जा सकता है, या भंवर शक्ति या समय बढ़ाया जा सकता है। एक और आम मुद्दा अत्यधिक उपग्रहों की पीढ़ी है, जो छोटी खाली बूंदें हैं (चित्रा 3 बी)। उपग्रहों PTE इमल्शन में अपरिहार्य हो सकता है नमूना और वाहक तेल के इंटरफेसियल तनाव और rheological गुणों पर निर्भर करता है. हालांकि, वे अक्सर emulsification (चित्रा 2 B) से पहले अतिरिक्त नमूने को पर्याप्त रूप से हटाने या बहुत अधिक शक्ति के साथ भंवर, बूंदों से गोले को अलग करने से नहीं होते हैं। एक सफल PTE emulsification में, उपग्रहों को कुल encapsulated नमूना मात्रा (चित्रा 3C) 11 के ~ 10% से अधिक शामिल नहीं होना चाहिए। इस स्तर पर, वे आमतौर पर प्रतिक्रिया में नगण्य योगदान देते हैं और उन्हें अनदेखा किया जा सकता है। सौंदर्य प्रयोजनों के लिए, उन्हें ताजे तेल (चित्रा 3 डी) के साथ धोकर इमल्शन से साफ किया जा सकता है।

Figure 4
चित्र 4. कण टेम्पलेट emulsification डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर का मूल्यांकन. (ए) बूंदों की फ्लोरोसेंट इमेजिंग सकारात्मक फ्लोरोसेंट बूंदों और नकारात्मक गैर-फ्लोरोसेंट बूंदों की पहचान करती है। (बी) डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर के साथ दुर्लभ टेम्पलेट या टेम्पलेट की कम सांद्रता की पहचान। (C) प्रचुर मात्रा में टेम्पलेट encapsulation पर जिसके परिणामस्वरूप प्रति बूंद टेम्पलेट अणुओं की एक चर संख्या होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पीटीई की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हमने इसका उपयोग माइक्रोफ्लुइडिक-मुक्त डिजिटल पीसीआर 11 करने के लिए किया। इस प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हमने एस सेरेविसिया जीनोमिक डीएनए सहित एक नमूना समझाया, और इसे थर्मोसाइकिल किया। डिजिटल पीसीआर में, प्रवर्धित लक्ष्यों वाली बूंदें फ्लोरोसेंट हो जाती हैं, जबकि बिना मंद रहती हैं। इस प्रकार, एक फ्लोरोसेंट ड्रॉपलेट एक लक्ष्य को इंगित करता है, जो सकारात्मक बूंदों की गिनती करके लक्ष्यों की सीधी मात्रा की अनुमति देता है (चित्रा 4 ए)। फ्लोरोसेंट बूंदों की संख्या इस प्रकार लक्ष्य अणुओं के साथ तराजू, कुछ सकारात्मक उपज जब लक्ष्य दुर्लभ है (चित्रा 4 बी) और कई जब यह प्रचुर मात्रा में है (चित्रा 4 सी). अन्य असतत घटकों के encapsulation के साथ के रूप में, लक्ष्य encapsulation एक Poisson वितरण का पालन करता है, सकारात्मक बूंद अंश को लक्ष्य एकाग्रता (चित्रा 4 डी) में परिवर्तित करने की अनुमति देता है, जिससे PTE11 के साथ डिजिटल पीसीआर करने की क्षमता का प्रदर्शन होता है।

Figure 5
चित्र 5. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीएए का उपयोग करके डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर का प्रदर्शन। (ए) बूंदों की फ्लोरोसेंट इमेजिंग नकारात्मक गैर-फ्लोरोसेंट बूंदों की पहचान करती है। (बी) डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर के साथ टेम्पलेट की कम सांद्रता की पहचान। (c) डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर के साथ टेम्पलेट की उच्च सांद्रता की पहचान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ये परिणाम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीएक्रिलामाइड कणों (चित्रा 5) का उपयोग करके दोहराए जा सकते हैं और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलीएक्रिलामाइड कणों के साथ मानक डिजिटल पीसीआर करने के लिए पीटीई की क्षमता का प्रदर्शन करते हैं, एक ही सीमा पर सटीक माप प्राप्त करते हैं।

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Discussion

पीटीई भंवर द्वारा monodispersed बूंदों में नमूनों encapsulate करने के लिए कणों का उपयोग करता है। इसकी सादगी और पहुंच के अलावा, पीटीई कई अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है, जिसमें बड़ी मात्रा में बूंदों को तात्कालिक रूप से उत्पन्न करने की अनुमति देना शामिल है। इसके अलावा, प्रक्रिया को एक अलग ट्यूब में आयोजित किया जा सकता है, जो माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में नमूनों को स्थानांतरित करने, समग्र वर्कफ़्लो को सुव्यवस्थित करने और नमूना संदूषण या हानि के अवसरों को सीमित करने की आवश्यकता को कम करता है। टेम्प्लेटिंग कण भी एक साधन प्रदान करते हैं जिसके द्वारा परिणामी बूंद प्रतिक्रियाओं की सामग्री को इंजीनियर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कण आकार, रसायन विज्ञान, और नम्रता को लक्षित बायोमोलेक्यूल या सेल कैप्चर के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, जबकि एंजाइम, एक्टिव्स, या न्यूक्लिक एसिड जैसे कार्यात्मक moieties, प्रतिक्रियाओं को सुविधाजनक बनाने के लिए कण पर प्रदर्शित किया जा सकता है, जैसे कि एकल सेल अनुक्रमण या कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए। जबकि दृष्टिकोण लचीला है, फिर भी इसके उपयोग के लिए महत्वपूर्ण बाधाएं हैं। उदाहरण के लिए, वर्तमान में ड्रॉपलेट परिवर्धन करना संभव नहीं है जैसा कि अक्सर माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ आयोजित किया जाता है, जिसके लिए आवश्यक है कि सभी प्रतिक्रिया घटकों को एनकैप्सुलेशन से पहले पेश किया जाए; इसके लिए आवश्यक है कि अभिकर्मकों को तब तक संगत और स्थिर किया जा सकता है जब तक कि बूंदों को उत्पन्न नहीं किया जा सकता है और, परेशानी वाले संयोजनों के मामले में, अक्सर बर्फ पर नमूने को जल्दी से मिश्रण और emulsifying द्वारा संबोधित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रतिक्रियाशील घटक जिन्हें प्रकाश या गर्मी के साथ बाहरी रूप से ट्रिगर किया जा सकता है, उनका उपयोग किया जा सकता है13। पीटीई इस प्रकार गैर-विशेषज्ञों के लिए सुलभ ड्रॉपलेट एसेस के संचालन के लिए एक लचीला और स्केलेबल तरीका प्रदान करता है। यह, अपनी जन्मजात सादगी और लचीलेपन के साथ युग्मित, पीटीई को कई बूंद अनुप्रयोगों के निष्पादन और विकास के लिए आदर्श बनाता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रोटोकॉल को विकसित करने वाले इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01-EB019453-02), राष्ट्रीय खुफिया के निदेशक के कार्यालय, Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507) के माध्यम से इंटेलिजेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एक्टिविटी, चैन-जुकरबर्ग बायोहब इन्वेस्टिगेटर प्रोग्राम, टेक्सास ए एंड एम यूनिवर्सिटी (W911NF1920013) के माध्यम से रक्षा उन्नत अनुसंधान परियोजनाएं एजेंसी, और जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय के माध्यम से रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था। भौतिकी प्रयोगशाला (75D30-11-9C-06818 (CDC3))। यहां निहित विचार और निष्कर्ष लेखकों के हैं और उन्हें आवश्यक रूप से उपरोक्त संगठनों या अमेरिकी सरकार की आधिकारिक नीतियों, या तो व्यक्त या निहित, का प्रतिनिधित्व करने के रूप में व्याख्या नहीं की जानी चाहिए। अमेरिकी सरकार किसी भी कॉपीराइट एनोटेशन के बावजूद सरकारी उद्देश्यों के लिए पुनर्मुद्रण को पुन: पेश करने और वितरित करने के लिए अधिकृत है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 um syringe filter Milipore Sigma SLGP033RS
0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo-Fisher 15575020
0.75 mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
1 mL syringes BD 309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) Sigma-Aldrich 370533
1M Tris-HCI, pH 8.0 Thermo-Fisher 15568025
27 gauge needles BD 305109
3" silicon wafers, P type, virgin test grade University Wafers 447
3D-printed centrifuge syringe holder (custom) (custom)
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered Sigma-Aldrich A4058-100ML
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678-25G
Aquapel (fluorinated surface treatment) Pittsburgh Glass Works 47100
Hexane Sigma-Aldrich 139386
FC-40 fluorinated oil Sigma-Aldrich F9755
Isopropanol Sigma-Aldrich 109827
N,N′-Methylenebis(acrylamide) Sigma-Aldrich 146072-100G
NaCl Sigma-Aldrich S9888
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) 3M 98-0212-2928-5
polyethylene tubing Scientific Commodities B31695-PE/2
fluorosurfactant Ran Biotechnologies 008-FluoroSurfactant
PGMEA developer Sigma-Aldrich 484431
Photomasks CadArt Servcies (custom)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Spin coater Specialty Coating Systems G3P-8
Span 80 (sorbitane monooleate) Sigma-Aldrich s6760
SU-8 3025 photoresist Kayaku 17030192
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) Sigma-Aldrich t8787
Tween 20 (polysorbate 20) Sigma-Aldrich p2287
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) Applied Biosystems 4464263
Yeast FWD IDT 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′
Yeast REV IDT 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA
AC-3
Yeast Probe IDT 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk
FQ/-3′
EVOS FL AUTO Life Technologies
EVOS LED Cube, GFP Life Technologies  AMEP4651
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents)  Dow Corning DC4019862
TEMED Thermo Fisher 17919
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA Milipore 69240-3
Expanded plasma cleaner (plasma bonder) Harrick Plasma PDC-002 (230V)

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References

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Weisgerber, D. W., Hatori, M. N., Abate, A. R. Particle Templated Emulsification enables Microfluidic-Free Droplet Assays. J. Vis. Exp. (169), e62248, doi:10.3791/62248 (2021).

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