Summary
물방울 분석은 분석 화학, 효소 진화 및 단일 세포 분석에 유용하지만 일반적으로 액적을 형성하기 위해 미세 유체학이 필요합니다. 여기서는 액적 저술을 수행하기 위한 미세유체없는 접근 방식인 입자 템플릿 유화제를 설명합니다.
Abstract
단분산 된 물방울에서 수행 된 반응은 대량으로 수행 되는 동등한 것과 비교하여 향상된 정확도와 감도를 부여합니다. 그러나, 제어 된 물방울을 형성 하기 위해 미세 유체의 요구 는 비 전문가에 장벽을 부과, 그들의 사용을 제한. 여기서는 미세유체가 없는 단분산 방울을 생성하는 접근법인 입자 템플릿 유화제를 설명합니다. 감광 하이드로겔 구체를 사용하여 간단한 소용돌이로 단분산 된 물방울에 샘플을 캡슐화합니다. 우리는 미세 유체없는 디지털 PCR을 수행하기 위해 그것을 사용하여 접근 방식을 보여줍니다.
Introduction
방울 미세 유체액은 피콜리터 액적물의 구획화를 활용하여 대량 반응에 비해 분석의 감도와 정확도를 높이고 화학 스크리닝, 단백질 공학 및 차세대 시퀀싱1,2,3에 많은 응용 을 적용합니다. 예를 들어, 디지털 물방울 폴리머라제 연쇄 반응(ddPCR)은 암의 유전적 변이, 돌연변이를 유발하는 질병의 검출, 산전 진단4,5,6에 비해 정밀도가 높아집니다. 그러나 액적 미세 유체학의 과제는 미세 유체 장치가 샘플을 분할하는 데 요구되는 것입니다. 미세 유체는 방울 특성을 잘 제어 할 수 있지만, 그들은 구축하고 운영하기 위해 전문 지식이 필요합니다7,8. 따라서 물방울 기반 방법은 주로 전문 실험실또는 상용 기기를 사용할 수 있는 응용 프로그램으로 제한됩니다9,10. 물방울 분석의 사용을 확대하기 위해, 특수 미세 유체 계측에 대한 요구 사항은 극복해야 장애물이다.
이 문서에서는 단일 분산 된 물방울에서 반응을 수행하기위한 미세 유체없는 방법인 입자 템플릿 유화제 (PTE)를 설명합니다. PTE에서, 템플릿 입자는 간단한 소용돌이에 의해 캐리어 오일의 물방울에 샘플을 삼켜 (그림 1). 시스템이 혼합되면, 수성 부는 액적이 단일 입자를 포함할 때까지 크기를 줄이는 방울로 조각되며, 이 때 입자를 파괴해야 하기 때문에 추가 조각화가 불가능합니다. 침몰한 시료는 입자를 물방울의 쉘로 둘러싸고 분산된 세포, 시약 또는 기능적 모이티(그림 1D)를 캡슐화합니다. 따라서 PTE는 일반적인 소용돌이 를 넘어 액적 반응을 수행하기 위한 장비 나 전문 지식이 필요하지 않습니다. 또한, 액적 생성은 미세 유체와 분 또는 시간에 비해 몇 초 가 걸리며, 생산된 양은 장치 작동 시간이 아닌 컨테이너 부피에 비례하여 확장성이 매우 가능합니다. 이러한 이점은 PTE가 미세 유체제가 비실용적이는 다양한 상황에서 물방울 검사를 수행하는 데 이상적입니다. 여기에서 PTE를 시연하고 ddPCR을 수행하는 데 사용합니다.
그림 1. 파티클 템플릿 유화제 프로세스의 개요입니다. (A) 측동기 입자는 시약과 혼합된다. (B) 원심 분리 후 초과 시약이 제거됩니다. (C) 템플릿 분자의 첨가는 오일을 첨가하기 전에 발생합니다. (D) 소용돌이는 단일 템플릿 분자를 포함하는 방울을 생성합니다. (E) 후속 열순환 및 이미징을 통해 대상 템플릿의 디지털 물방울 분석을 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
1. 입자 템플릿 유화제를위한 하이드로겔 입자의 준비.
입자 템플릿 에멀화에 사용되는 하이드로겔 입자는 두 가지 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
- 시판 가능한 입자를 이용한 준비
- PTE와 호환되는 건조 폴리 아크라이글아미드 입자 0.5g(예: 바이오-젤 P-60 Gel(Bio-Rad), 45-90 μm 직경)을 50mL 원추형 튜브에 멸균수 30mL에 넣고 잘 섞는다. 실온에서 30분 동안 배양하십시오.
- 입자의 미세 유체 제조를 이용한 준비
참고: PTE와 호환되는 폴리아크릴아미드 입자는 시판되는 낙하 제터(예: QX200 드롭 제너레이터(Bio-Rad), 레이드롭(Fluigent) 등) 또는 맞춤형 미세유체 설계로 제조할 수 있습니다.- 사용자 정의 마스터의 제작
- CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 부드러운 포토리소그래피 마스크를 디자인합니다. 회로 기판 필름에 10 μm 해상도로 포토마스크를 인쇄합니다.
- 실리콘 웨이퍼로 3의 중앙에 1mL의 포토레지스트를 붓습니다. 스핀 코터를 사용하여 30초 동안 500rpm에서 회전한 다음 30초 동안 1250rpm으로 포토레지스트50 μm 층을 만듭니다. 웨이퍼를 95°C로 설정된 핫플레이트에 15분 동안 놓아 용매를 증발시다.
- 커버 글래스 슬라이드로 실리콘 웨이퍼에 포토마스크를 고정하고 2.5분 동안 190mW, 365 μm UV LED아래에 웨이퍼를 노출한다. 웨이퍼를 95°C로 설정된 핫플레이트에 5분 동안 놓습니다.
- 100% 프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트(PGMEA)를 최대 15분 동안 목욕에 담그어 포토레지스트-실리콘 웨이퍼를 개발한다. 100% 이소프로판올이 그 뒤를 이어 신선한 100% PGMEA로 웨이퍼를 헹구는 다. 웨이퍼를 공기 건조.
- 핫플레이트의 웨이퍼를 95°C로 1분 동안 건조시켜 잔류 이소프로파놀을 제거하십시오. 웨이퍼를 페트리 접시에 깨끗한 3에 넣습니다.
- 사용자 정의 미세 유체 장치의 제조
- 폴리디메틸실록산(PDMS) 실리콘 베이스와 경화 시약을 질량별로 10:1 비율로 혼합한다. 기포가 관찰될 수 없을 때까지 집 진공 하에서 건조기 아래를 사용하여 혼합 PDMS를 탈가스합니다.
- 페트리 접시의 마스터 위에 탈가스 PDMS를 부어 실리콘 웨이퍼가 완전히 침수되도록 합니다. 실리콘 웨이퍼와 PDMS를 탈가스하여 붓는 동안 형성되었을 수 있는 기포를 제거합니다.
- 실리콘 웨이퍼와 PDMS를 65°C로 설정된 오븐에 60분 이상 배치하여 PDMS를 치료한다. 메스를 사용하여 페트리 접시에서 미세 유체 기능을 포함하는 PDMS 블록을 소비합니다. 실리콘 마스터에 존재하는 모든 기능을 손상시키지 않도록 주의하십시오.
- 0.75mm 생검 펀치를 사용하여 마이크로 유체 장치의 입구 및 콘센트에 대응하는 PDMS 블록에 입구와 콘센트를 펀치. PDMS 블록의 표면에 반복적 인 적용 및 포장 테이프의 제거와 먼지와 미립자를 제거합니다.
- 50mm x 75mm 유리 슬라이드를 100% 이소프로파놀로 헹구고 그 후 표면을 건조시키는 공기건조를 합니다. 플라즈마는 플라즈마 본더를 사용하여 1 분 동안 O2 플라즈마 1 mbar를 사용하여 유리 슬라이드와 PDMS (위쪽 피처)를 모두 처리합니다.
- 플라즈마 처리 PDMS를 유리 슬라이드에 올려 놓고, 플라즈마 처리 측이 위를 향하고 있는 기능을 배치하여 PDMS를 유리 슬라이드에 부착합니다. 슬라이드를 65°C로 설정된 오븐에 넣고 30분 이상 접합을 완료합니다.
- 모든 미세 유체 채널을 불소 표면 처리로 처리하여 표면 소수성을 보장하고 습윤을 방지합니다. 장치를 65°C에서 10분 이상 굽습니다.
- 템플릿 입자의 제조
- 아크릴아미드 6.2%, N+메틸렌네비스(아크릴아미드), 0.3% 아킬레늄 아황산염으로 구성된 폴리아크릴아미드(PAA) 용액을 준비한다. 이 솔루션을 28G 바늘로 1mL 주사기에 넣습니다.
- 수력 불소로에테르(HFE) 오일의 5%(w/w) 불소 활성제 및 1% N, N,N-테트라메틸레틸레틸레티아네디아민(TEMED)으로 구성된 불용성 연속 상을 수분물물의 생성 및 안정화를 위해 준비한다. 솔루션을 새로운 1mL 주사기에 로드합니다.
- 주사기를 포함하는 PAA 및 HFE 솔루션을 주사기 펌프(예: NE-501)에 로드합니다. 주사기에 삽입된 폴리에틸렌 튜브를 사용하여 주사기를 마이크로 유체 장치에 연결하고 장치에 연결합니다. 연결하기 전에 펌프를 사용하여 튜브에서 공기를 제거합니다.
참고: 모델에 따라 주사기 펌프는 입력, 제조 소프트웨어 또는 사용자 지정 스크립트(https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program 사용 가능)로 내장되어 있는 것으로 제어될 수 있습니다. - PAA 및 HFE 오일 입력을 각각 300 μL/h 및 500 μL/h로 드롭 생성 장치를 실행합니다. 15mL 수집 튜브에서 1mL의 물방울을 수집하고 중합을 위해 실온에서 3 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이션 후, 파이펫팅하여 오일의 하부 층을 제거합니다.
- HFE 오일에 20%(v/v) 퍼플루오로-1-옥탄올(PFO)의 1mL을 15mL 수집 튜브에 화학 적해로 넣습니다. 혼합 후 15mL 컬렉션 튜브를 2000 x g 에서 2분 동안 회전합니다. 파이펫팅을 통해 PFO/HFE 상체를 제거합니다. 1x를 반복합니다.
- 육산에 2mL의 소비탄 모노올레아테를 15mL 수집 튜브와 소용돌이에 넣고 섞어 넣습니다. 튜브를 3000 x g 에서 3 분 동안 회전합니다. 계면 활성제 / 헥산 용액을 제거하기 위해 파이펫팅으로 상체를 제거합니다. 2x를 반복합니다.
- TEBST 버퍼 5mL(20m Tris-HCl pH 8.0, 274m NaCl, 5.4mM KCl, 20mM EDTA, 0.2% 트리톤 X-100)를 추가하고 잘 섞는다. 3분 동안 3,000 x g 로 회전합니다. 파이펫팅으로 상체를 제거합니다. 3배 반복합니다.
- 5mL TEBST에서 다시 중단합니다. 이 용액은 4°C에서 무기한 으로 저장될 수 있다.
- 사용자 정의 마스터의 제작
2. 파티클 템플릿 유화제.
임시 입자의 제조 에 따라, PTE는 물방울에 샘플 및 시약을 캡슐화하는 데 사용됩니다.
- 입자 를 1 분 동안 6000 x g 에서 원심분리하여 입자 템플릿 유화제를 위한 폴리 아크릴아미드 입자를 준비한 다음, 배관하여 상퍼를 제거하고 멸균 물을 사용하여 다시 중단합니다. 잔류 TEBST를 제거하기 위해 3배 반복합니다.
- 혈변계(또는 이와 동등한)를 사용하여 측광 입자의 농도와 직경을 결정합니다. 픽셀의 직경을 측정하고 미크론으로 변환하여 개별 입자 직경을 계산합니다. 픽셀을 미크론으로 변환하는 것은 교정 슬라이드로서 혈류계(또는 이와 동등한)를 사용하여 계산될 수 있으며, 알려진 그리드 거리를 픽셀 단위로 측정할 수 있다.
- 표 1에 따른 PCR 마스터 믹스, 적절한 프라이머 및 형광석 가수 분해 프로브를 사용하여 신선한 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브에서 분산 단계를 준비합니다. 구성 요소의 균일 한 분포를 보장하기 위해 튜브 회전기를 사용하여 부드러운 동요 (10 rpm)에서 5 분 동안 실온에서 배양하십시오.
참고: 입자의 부피 및 표적 농도는 푸아송 하중을 기반으로 합니다. 일반적으로 파티클 수는 캡슐화할 샘플 수보다 크기가 더 높아야 합니다. 알 수 없는 농도의 샘플의 경우 푸아송 로딩을 보장하기 위해 희석 계열이 필요합니다.
| 음량 | 시약 |
| 100 μL | 입자(450개의 입자/μL) |
| 200 μL | 2x PCR 마스터 믹스 |
| 18 μL | 10 μM 포워드 프라이머 |
| 18 μL | 10 μM 역 프라이머 |
| 18 μL | 10 μM 프로브 |
| 0.8 μL | 트리톤 X100 |
| 45.2 μL | 뉴클레아제 프리 워터 |
표 1. 디지털 물방울 PCR에 대한 PTE와 함께 사용되는 PCR 마스터 믹스의 준비.
- 분산 단계는 6000 x g 에서 1분 동안 원심분리하고 상체를 제거합니다. 추출된 상체의 부피를 기록하고 2.3 에서 계산된 총 분산 상부량을 사용하여 펠릿 부피를 결정한다.
참고: 추출된 상체의 양은 입자 포장, 직경 및 농도에 따라 달라지며 최소 예상 부피인 300μL입니다. - 1.62 pg /μL Saccharomyces cerevisiae 게놈 DNA의 1 μL을 2.4에서 펠릿에 넣고 파이펫팅 또는 격렬한 태핑으로 철저히 섞습니다.
참고: 과도한 수성 함량이 존재하면 캡슐화 효율이 저하될 수 있습니다. 샘플 부피가 펠릿 부피의 1%를 초과하는 경우 샘플을 농축합니다. 샘플을 농축할 수 없는 경우 샘플 볼륨에 따라 PCR 마스터 믹스 및 결과 펠릿 볼륨을 배율 조정합니다. PTE는 작은(10 μL)의 화량을 큰(2mL) 측량 입자로 유화할 수 있도록 합니다. PCR 마스터 믹스(2.3)와 오일(2.6)은 각각 입자 펠릿의 표적(2.3) 및 측정(2.4) 부피에 따라 배율화될 수 있다. - 유화를 위한 불용성 연속 단계로 HFE 오일에 200 μL 2% 불활성제를 튜브에 첨가한다. 튜브를 피펫팅하거나 두드리거나 깜박임으로써 펠릿이 빠져나가지 않도록 하십시오. 그런 다음 30 초 동안 3000 rpm에서 소용돌이.
참고: 3000rpm에 해당하는 설정은 브랜드 및 모델에 따라 다를 수 있습니다. - 에멀젼이 1분 동안 정착하도록 허용합니다. 바닥 오일 상 100 μL을 제거하고 이 부피를 HFE 오일의 2% 불활성제로 대체합니다. 튜브를 여러 번 부드럽게 반전하여 혼합합니다. 3-5배 또는 작은 위성 물방울이 제거될 때까지 반복합니다.
3. 디지털 물방울 PCR 및 분석.
- 2-5분 동안 정착한 후, 바닥 오일 상을 제거합니다. 이 부피를 불소 탄소 오일(예: FC-40)으로 5% 불소 활성제로 대체하십시오.
- 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 100 μL 의 샘플을 200 μL PCR 튜브로 조심스럽게 피펫합니다. PCR 튜브를 열순환기로 놓고 표 2에 따라 실행합니다.
| 걸음 | 온도 | 기간 | 노트 |
| 1 | 95°C | 2분 | |
| 2 | 95°C | 30 s | |
| 3 | 50 °C | 90 s | |
| 4 | 72 °C | 60 s | |
| 5 | 반복 x34 단계 2 ~ 4 | ||
| 6 | 72 °C | 2분 | |
| 7 | 4°C | 들다 |
표 2. PTE 에멀젼을 사용하여 디지털 물방울 PCR용 써볼 사이클링 조건.
- 형광 이미징을 위한 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 계산 슬라이드에 샘플을 피펫. 490 nm 난초 및 525 nm 방출 검출 파장을 가진 형광 현미경을 사용하여 샘플을 이미지합니다.
- 양양성 형광액(Np) 및 총 방울(NT)을 정량화하여 양수 액적(Np/NT) 및 푸아송 통계의 분획을 사용하여 템플릿 분자(λ)의 수를 계산합니다.
- 95% 신뢰 구간(zc = 1.96)을 계산합니다.
- 아래에 주어진 방정식을 사용하여 2.5단계에서 첨가된 샘플의 부피(μL의 θ)를 사용하여 샘플 농도(분자/μL)를 계산합니다. 기술 복제를 사용하여 샘플 농도의 평균 및 표준 편차를 결정합니다.
Representative Results
그림 2. 입자 템플릿 에멀화를 사용하여 샘플을 액적으로 캡슐화합니다. (A) 입자 측각 유화에 사용되는 입자를 측동기. (B) 원심 분리 다음 상피체로부터 입자 펠릿을 측광하는 분리. (C) (D) 식별 가능한 수성 쉘로 입자 템플릿 유화제로 인한 물방울. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PTE에서, 에멀젼의 단화성은 액적입자보다 약간 큰 직경을 갖기 때문에, 측근 입자의 단조화에 의해 결정된다. 따라서, 균일한 입자는 제어된 PTE 캡슐화11의 중심이다. 화학(솔겔, 에멀젼 중합화), 유체역학(멤브레인 유화, 균질화), 여과 방법 등 균일한 감압 입자를 생성하기 위한 다양한 방법이 존재한다. 특히 미세유체 접근법은 뛰어난 단화성(그림 2A)을 감당하고 추가 입자 엔지니어링을 통해 PTE12에서 기능을 향상시킬 수 있습니다. 또는, 시간조 입자는 균일성이 적절하지만 일반적으로 미세 유체 생성11보다 적지만 구입할 수 있습니다.
PTE를 수행하기 위해, 입자는 캡슐화될 샘플(도 1A)과 혼합되고, PCR 튜브의 바닥에 있는 입자 펠릿의 사진에 의해 도시된 바와 같이, 과잉 상퍼탄은 원심분리 및 파이펫팅(도 1B)에 의해 제거된다(도 2B). 안정화 계면활성제를 함유한 캡슐화 오일은 다음 추가(도 1C) 및 샘플은 30초 동안 소용돌이하기 전에 부드럽게 피펫처리되어 에멀젼(도 2C)을 생성한다. 결과 액적은 반응에 필요한 시약, 표적 분자 및 세포에 상주하는 초기 시료를 포함하는 입자 코어 및 수성 쉘을 함유하고 있다(도 2D). 액적 미세 유체 캡슐화에서와 마찬가지로, 작은 구슬이나 세포와 같은 이산 적 개체는 PTE 물리학의 특성으로 인해 일시적인 입자를 포함하지만 푸아송 분포에 따라 무작위로 캡슐화됩니다.
그림 3. 입자 템플릿 에멀화 물방울의 식별 및 정리. (A) 불충분한 소용돌이로부터 액적당 여러 입자를 가진 비균일한 액적 생성의 예. (B) 입자 템플릿 유화제 및 (C) 물 -인 - 오일 분획다음 위성 및 물방울의 예상 존재. (D) 오일 세척 후 에멀젼을 생성합니다. (E) 입자 템플릿 유화 중에 잔류 상부로 인한 과도한 위성 생성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
성공적인 PTE에서도 이중 또는 삼중 코어 방울이 존재하지만 일반적으로 반응에 무시할 만한 기여를 합니다. 적절한 쉘을 유지하면서 멀티코어 액적의 저주파를 달성하려면 표면 장력, 입자 간 접착력, 샘플 점도, 컨테이너 크기 및 소용돌이 전력 및 시간을 포함한 공정 파라미터를 최적화해야 합니다. 예를 들어, 제대로 최적화된 유화제에는 많은 측천 입자(그림 3A)가 있는 다분산 된 액적을 포함할 수 있으며, 이는 소용돌이가 샘플을 완전히 유화하기에 충분하지 않다는 것을 나타낸다. 이러한 경우, 입자 간 접착력을 줄이고 표면 장력을 낮추거나, 소용돌이 전력 또는 시간을 증가시키기 위해 세제를 첨가할 수 있다. 또 다른 일반적인 문제는 작은 빈 물방울인 과도한 위성의 생성입니다 (그림 3B). 위성은 시료 및 캐리어 오일의 얼굴 간 장력 및 유변학적 특성에 따라 PTE 에멀젼에서 피할 수 있습니다. 그러나 유화(그림 2B) 이전에 과잉 샘플을 적절히 제거하지 못하거나 너무 많은 힘으로 소용돌이치므로 물방울에서 포탄을 제거합니다. 성공적인 PTE 유화제에서 위성은 캡슐화된 총 샘플 볼륨의 ~10% 이하를 구성해야 합니다(그림 3C)11. 이 수준에서, 그들은 일반적으로 반응에 무시할 수 있고 무시할 수 있습니다. 미적 목적을 위해 신선한 오일로 세척하여 에멀젼에서 지울 수 있습니다 (그림 3D).
그림 4. 입자 템플릿 유화제 디지털 액적 PCR의 평가. (A) 액적의 형광 화상 진찰은 양성 형광액 및 부정적인 비 형광액을 식별합니다. (B) 디지털 물방울 PCR로 템플릿의 희귀 템플릿 또는 낮은 농도의 식별. (C) 풍부한 템플릿 캡슐화를 통해 액적당 다양한 템플릿 분자가 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PTE의 유용성을 입증하기 위해, 우리는 미세 유체없는 디지털 PCR11을 수행하는 데 사용했습니다. 이 과정을 이용하여 , 우리는 S. cerevisiae 게놈 DNA를 포함하는 견본을 캡슐화하고, 그것을 열순환했습니다. 디지털 PCR에서는 증폭된 대상을 함유한 액적이 형광이 되고, 그 방울은 어둡게 유지됩니다. 따라서 형광액은 대상을 나타내며, 양수 액적(그림 4A)을 계산하여 표적의 직접적인 양을 허용한다. 형광액의 수는 따라서 표적 분자로 비늘, 대상이 희귀 할 때 몇 가지 양성을 산출 (그림 4B) 그리고 풍부 할 때 많은 (그림 4C). 다른 개별 성분의 캡슐화와 마찬가지로, 대상 캡슐화는 푸아송 분포를 따르므로 양수 액적 분획을 목표 농도(그림 4D)로 변환하여 PTE11을 사용하여 디지털 PCR을 수행할 수 있는 능력을 입증합니다.
그림 5. 시판되는 PAA를 사용하여 디지털 물방울 PCR의 데모. (A) 물방울의 형광 화상 진찰은 부정적인 비형광 물방울을 식별합니다. (B) 디지털 물방울 PCR템플릿의 낮은 농도의 식별. (C) 디지털 물방울 PCR로 템플릿의 고농도의 식별. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이러한 결과는 시판되는 폴리아크릴아미드 입자(그림 5)를 사용하여 반복가능하며, PTE가 시판되는 폴리아크릴아미드 입자로 표준 디지털 PCR을 수행할 수 있는 능력을 보여 주며 동일한 범위에서 정확한 측정을 달성한다.
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Discussion
PTE는 입자를 사용하여 소용돌이를 통해 단분산 된 물방울에 샘플을 캡슐화합니다. PTE는 단순성과 접근성 외에도 대량의 액적을 즉시 생성할 수 있도록 하는 등 몇 가지 추가 이점을 제공합니다. 더욱이, 이 과정은 격리된 튜브에서 수행될 수 있으며, 샘플을 미세 유체 장치로 이송할 필요성을 없애고, 전체 워크플로우를 간소화하고, 시료 오염 또는 손실에 대한 기회를 제한할 수 있다. 또한 템플릿 입자는 결과 액적 반응의 내용을 엔지니어링하는 수단을 제공합니다. 예를 들어, 입자 크기, 화학 및 웨트성은 표적 생체 분자 또는 세포 포획을 위해 설계될 수 있으며, 효소, 활성 또는 핵산과 같은 기능적 모니티는 단일 세포 염기서열 분석 또는 기능적 특성화와 같은 반응을 용이하게 하기 위해 입자에 표시될 수 있다. 접근 방식은 유연하지만 사용에 중요한 제약 조건이 있습니다. 예를 들어, 미세 유체로 자주 수행되는 것처럼 현재 액적 추가를 수행할 수 없으며, 캡슐화 전에 모든 반응 성분을 도입해야 합니다. 이를 위해서는 물방울이 생성될 때까지 시약이 호환되고 안정적이어야 하며, 번거로운 조합의 경우 얼음 시료를 신속하게 혼합하고 유화하여 해결할 수 있습니다. 또는 빛이나 열로 외부에서 트리거할 수 있는 반응성 성분을 사용할 수 있습니다13. 따라서 PTE는 전문가가 액세스할 수 있는 액적 분해를 수행하기 위한 유연하고 확장 가능한 방법을 제공합니다. 이는 타고난 단순성과 유연성과 결합되어 PTE가 수많은 물방울 응용 프로그램의 실행 및 개발에 이상적입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로토콜을 개발하는이 작업은 국립 보건원 (R01-EB019453-02)에 의해 지원되었다, 국가 정보 국장의 사무실, 레이시온 BBN 테크놀로지스(N66001-18-C-4507), 찬주커버그 바이오허브 조사프로그램, 텍사스 A&M 대학(W911NF1920013) 및 존스홉킨스대학을 통한 질병통제예방센터(D911NF1920013) 및 질병통제예방센터(D66001-18-C-4507)를 통한 지능형 연구 프로젝트 활동 물리 연구소 (75D30-11-9C-06818 (CDC3). 여기에 포함된 견해와 결론은 저자의 견해이며, 반드시 상기 조직이나 미국 정부의 공식 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 미국 정부는 저작권 에 대한 저작권 의에도 불구하고 정부 목적을 위해 재인쇄물을 복제하고 배포할 권한이 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
| 0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| 1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
| 27 gauge needles | BD | 305109 | |
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| 3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
| Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
| FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
| SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
| Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
| Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
| Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
| EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
| EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
| SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
| Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |
References
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- Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).
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- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).
- Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology. Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).
- Panda, P., et al. Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles. Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).
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