Summary
تعتبر مقايسات قطرات الماء في الزيت مفيدة للكيمياء التحليلية وتطور الإنزيم وتحليل الخلايا المفردة ، ولكنها تتطلب عادة مركبات ميكروفلويديك لتشكيل القطرات. هنا، ونحن نصف مستحلب الجسيمات قالب، وهو نهج خالية من microfluidic لأداء المقايسات قطرة.
Abstract
ردود الفعل التي أجريت في قطرات أحادية التشتت تحمل دقة وحساسية معززة مقارنة مع تلك التي أجريت بكميات كبيرة. ومع ذلك ، فإن شرط microfluidics لتشكيل قطرات تسيطر عليها يفرض حاجزا على غير الخبراء ، والحد من استخدامها. هنا ، نصف مستحلب الجسيمات المنماذج ، وهو نهج لتوليد قطرات أحادية التشتت دون microfluidics. باستخدام المجالات الهيدروجيل templating، ونحن تغليف العينات في قطرات أحادية التشتت عن طريق دوامة بسيطة. نحن نثبت هذا النهج باستخدامه لأداء PCR الرقمية الخالية من السوائل الدقيقة.
Introduction
تستفيد Droplet microfluidics من التقسيم في قطرات البيكوليتر لزيادة حساسية ودقة المقايسات مقارنة بالتفاعلات السائبة ، ولها العديد من التطبيقات في الفحص الكيميائي وهندسة البروتين وتسلسل الجيل التالي1،2،3. على سبيل المثال، يتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (ddPCR) دقة متزايدة مقارنة بسلسلة تفاعل البوليميراز الكمية السائبة (qPCR)، مع تطبيقات للاختلاف الوراثي في السرطانات، والكشف عن الأمراض المسببة للطفرات، وتشخيص ما قبل الولادة4،5،6. ومع ذلك، فإن التحدي المتمثل في المركبات الدقيقة القطرات هو اشتراط وجود أجهزة ميكروفلويديك لتقسيم العينات؛ في حين أن microfluidics تحمل سيطرة ممتازة على خصائص القطيرات ، فإنها تتطلب خبرة متخصصة لبناء وتشغيل7،8. وبالتالي، تقتصر الأساليب القائمة على القطيرات إلى حد كبير على مختبرات الخبراء أو، في حالات نادرة، التطبيقات التي تتوفر فيها أداة تجارية 9,10. لتوسيع استخدام المقايسات قطرة، شرط لأجهزة microfluidic المتخصصة هي عقبة يجب التغلب عليها.
في هذه المقالة، نقوم بوصف مستحلب الجسيمات (PTE)، وهي طريقة خالية من السوائل الدقيقة لأداء ردود الفعل في قطرات أحادية التشتت. في PTE، تبتلع جزيئات التمبلر العينة إلى قطرات في زيت الناقل عن طريق الدوامة البسيطة (الشكل 1). ومع اختلاط النظام، يتفتت الجزء المائي إلى قطرات من الحجم المتناقص حتى تحتوي القطرات على جزيئات مفردة، وعند هذه النقطة لا يمكن زيادة التجزؤ لأنه يتطلب كسر الجسيمات. تحيط العينة الغارقة بالجسيمات كقشرة في القطرات ، وبالتالي تغليف أي خلايا مشتتة أو كاشفات أو مويتات وظيفية (الشكل 1D). وبالتالي ، لا يتطلب PTE أي معدات أو خبرة لأداء ردود فعل قطرات تتجاوز الدوامة الشائعة. بالإضافة إلى ذلك ، يستغرق توليد القطيرات ثوان مقارنة بالدقائق أو الساعات مع microfluidics ، والكمية المنتجة تتناسب مع حجم الحاوية ، وليس وقت تشغيل الجهاز ، مما يجعلها قابلة للتطوير بشكل كبير. هذه الفوائد تجعل PTE مثالية لإجراء المقايسات قطرة في مجموعة متنوعة من الظروف التي microfluidics غير عملي. هنا، ونحن نثبت PTE واستخدامه لإجراء ddPCR.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 نظرة عامة على عملية استحلاب الجسيمات المنماذجة. (أ) تختلط جزيئات التمبلات بالكواشف. (ب) إزالة الكواشف الزائدة بعد الطرد المركزي. (ج) إضافة جزيئات قالب يحدث قبل إضافة النفط. (د) تنتج الدوامة قطرات تحتوي على جزيء قالب واحد. (ه) يسمح التصوير والسيكلات الحرارية اللاحقة بتحليل رقمي للنماذج المستهدفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
1. إعداد جزيئات الهيدروجيل للاستحلاب الجسيمات قالب.
يمكن إعداد جزيئات الهيدروجيل المستخدمة في استحلاب الجسيمات المنماذج باستخدام طريقتين مختلفتين.
- التحضير باستخدام الجسيمات المتاحة تجاريا
- إضافة 0.5 غرام من جزيئات البولي أكريلاميد المجففة متوافقة مع PTE (على سبيل المثال، بيو-جل P-60 جل (بيو راد)، قطر 45-90 ميكرومتر) إلى 30 مل من المياه العقيمة في أنبوب مخروطي 50 مل وتخلط جيدا. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إعداد باستخدام تصنيع microfluidic من الجسيمات
ملاحظة: يمكن إعداد جزيئات البولي أكريلاميد المتوافقة مع PTE باستخدام صانعي الإسقاط المتاحة تجاريا (على سبيل المثال، QX200 قطرة مولد (بيو راد)، RayDrop (Fluigent) الخ)، أو حسب تصميم microfluidic مخصص.- تلفيق سيد مخصص
- تصميم قناع فوتوغرافيا ناعم باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). طباعة قناع ضوئي مع قرار 10 ميكرومتر على فيلم لوحة الدارة.
- صب 1 مل من الكواتر الضوئي على مركز 3 في رقاقة السيليكون. استخدم طبقة الدوران لإنشاء طبقة 50 ميكرومتر من جهاز التصوير الضوئي عن طريق تدويرها عند 500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية تليها 1250 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. ضع الرقاقة على لوحة ساخنة إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتتبخر المذيبات.
- تأمين قناع ضوئي على رقاقة السيليكون مع شريحة زجاجية الغطاء وفضح رقاقة تحت 190 mW collimated، 365 ميكرومتر الأشعة فوق البنفسجية LED لمدة 2.5 دقيقة. ضع الرقاقة على مجموعة من الألواح الساخنة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للخبز بعد التعرض.
- تطوير رقاقة سيليكون سيليكون الكواتر الضوئية عن طريق غمرها في حمام من 100٪ بروبيلين غليكول خلات الأثير أحادية ميثيل (PGMEA) لمدة تصل إلى 15 دقيقة. شطف رقاقة مع الطازجة 100٪ PGMEA تليها 100٪ isopropanol. الهواء يجفف الرقاقة.
- إزالة أي isopropanol المتبقية عن طريق تجفيف رقاقة على مجموعة hotplate إلى 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. وضع رقاقة في نظيفة 3 في طبق بيتري.
- تصنيع الجهاز microfluidic مخصص
- امزج قاعدة السيليكون متعدد الديميثيلسيلوكسيان (PDMS) وشفط المعالجة بنسبة 10:1 حسب الكتلة. ديغا PDMS المختلطة باستخدام مجفف تحت فراغ المنزل حتى لا فقاعات الهواء يمكن ملاحظتها.
- صب PDMS degassed على سيد في طبق بيتري، وضمان رقاقة السيليكون مغمورة تماما. ديغا رقاقة السيليكون وPDMS لإزالة أي فقاعات الهواء التي قد تكونت أثناء صب.
- علاج PDMS عن طريق وضع رقاقة السيليكون وPDMS في فرن تعيين إلى 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل. استئصال كتلة من PDMS التي تحتوي على ميزات microfluidic من طبق بيتري باستخدام مشرط. اتخاذ مزيد من الحذر لتجنب إتلاف أي ميزات موجودة على سيد السيليكون.
- لكمة مداخل ومنافذ في كتلة PDMS المقابلة للمداخل ومنافذ في الجهاز microfluidic باستخدام لكمة خزعة 0.75 ملم. إزالة أي الغبار والجسيمات مع التطبيق المتكرر وإزالة الشريط التعبئة والتغليف إلى سطح كتلة PDMS.
- تنظيف شريحة زجاجية 50 ملم × 75 ملم عن طريق الشطف مع 100٪ isopropanol وتجفيف الهواء في وقت لاحق السطح. البلازما علاج كل من الشريحة الزجاجية وPDMS (ملامح تواجه) باستخدام 1 ملليبار من البلازما O2 لمدة 1 دقيقة باستخدام المستعبدين البلازما.
- لصق PDMS إلى الشريحة الزجاجية عن طريق وضع PDMS البلازما المعالجة مع الميزات التي تواجه أسفل على الشريحة الزجاجية، البلازما الجانب المعالجة التي تواجه ما يصل. ضع الشريحة في فرن تم ضبطه على 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل لإكمال الترابط.
- علاج جميع القنوات microfluidic مع معالجة السطح المفلور لضمان رهاب الماء السطحي ومنع التبول. خبز الجهاز في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.
- تصنيع جزيئات التمبلر
- إعداد محلول البولي أكريلاميد (PAA) يتكون من 6.2٪ أكريلاميد، 0.18٪ N،N′-ميثيلينبيس (أكريلاميد)، و 0.3٪ بيرسولفيت الأمونيوم. قم بتحميل هذا المحلول في حقنة 1 مل باستخدام إبرة 28G.
- إعداد مرحلة مستمرة غير قابلة للذوبان تتكون من 5٪ (ث / ث) الفلوروسورفاكانت و 1٪ N، N، NN-tetramethylethylenediamine (TEMED) في زيت الهيدروفلوروثير (HFE) لتوليد وتثبيت قطرات. تحميل الحل في حقنة 1 مل جديدة.
- تحميل كل من PAA وHFE الحل الذي يحتوي على المحاقن في مضخات حقن (على سبيل المثال، NE-501). قم بتوصيل المحاقن بجهاز microfluidic باستخدام أنابيب البولي إيثيلين التي تم إدخالها على الحقنة وفي الجهاز. قبل الاتصال، رئيس مضخات لإزالة الهواء من الأنابيب.
ملاحظة: اعتمادا على النموذج، يمكن التحكم في مضخات الحقنة باستخدام الإدخال أو تصنيع البرامج أو برنامج نصي مخصص (متوفر في https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program). - تشغيل جهاز توليد الإسقاط مع مدخلات النفط PAA وHFE في 300 ميكرولتر / ساعة و 500 ميكرولتر / ساعة، على التوالي. جمع 1 مل من قطرات في أنبوب جمع 15 مل واحتضان لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة للبوليمرة. بعد الحضانة، قم بإزالة الطبقة السفلى من الزيت عن طريق الأنابيب.
- إضافة 1 مل من 20٪ (v/v) البيرفلورو-1-أوكتانول (PFO) في زيت HFE إلى أنبوب جمع 15 مل كمزيل للتمائم الكيميائي. بعد خلط، تدور أسفل أنبوب جمع 15 مل في 2000 × ز لمدة 2 دقيقة. إزالة PFO / HFE فائقة عن طريق الأنابيب. كرر 1x.
- إضافة 2 مل من 2٪ أحادية سوربيتان في الهيكسان إلى أنبوب جمع 15 مل ودوامة لخلط. تدور في أنبوب 3000 × ز لمدة 3 دقائق. إزالة supernatant عن طريق pipetting لإزالة محلول السطحي / الهيكسان. كرر 2x.
- إضافة 5 مل من TEBST العازلة (20 mM تريس-HCl pH 8.0, 274 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0.2٪ تريتون X-100) وتخلط جيدا. تدور أسفل في 3000 × ز لمدة 3 دقائق. إزالة supernatant عن طريق الأنابيب. كرر 3x.
- ريسوسبند في 5 مل TEBST. قد يتم تخزين هذا الحل عند 4 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
- تلفيق سيد مخصص
2. استحلاب الجسيمات قالب.
بعد إعداد جزيئات التمبلات ، يتم استخدام PTE لتغليف العينة والكواشف في قطرات.
- إعداد جزيئات البولي أكريلاميد لاستحلاب الجسيمات قالب عن طريق الطرد المركزي في 6000 × ز لمدة 1 دقيقة بيليه الجسيمات، ثم إزالة supernatant عن طريق الأنابيب وإعادة الإنفاق باستخدام المياه العقيمة. كرر 3x لضمان إزالة أي TEBST المتبقية.
- تحديد تركيز وقطر جزيئات التمبلر باستخدام مقياس الدم (أو ما يعادله). حساب قطر الجسيمات الفردية عن طريق قياس أقطار بالبكسل وتحويلها إلى ميكرون. يمكن حساب تحويل وحدات البكسل إلى ميكرون باستخدام مقياس الدم (أو ما يعادله) كشريحة معايرة وقياس مسافة الشبكة المعروفة بالبكسل.
- إعداد مرحلة تفريق في أنبوب طرد دقيق جديد 1.5 مل باستخدام مزيج رئيسي PCR، والتمهيديات المناسبة، ومسبار التحلل المائي الفلورسين وفقا للجدول 1. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق تحت التحريض لطيف (10 دورة في الدقيقة) باستخدام أنبوب الدوار لضمان توزيع متجانسة للمكونات.
ملاحظة: يعتمد حجم الجسيمات وتركيزها المستهدف على تحميل Poisson. وكقاعدة عامة، ينبغي أن يكون عدد الجسيمات أكثر من عدد العينات التي يتعين تغليفها. لعينات من تركيزات غير معروفة، سلسلة تخفيف ضروري لضمان تحميل بواسون.
| حجم | الكاشف |
| 100 ميكرولتر | الجسيمات (450 جسيم / ميكرولتر) |
| 200 ميكرولتر | 2x PCR مزيج رئيسي |
| 18 ميكرولتر | التمهيدي الأمامي 10 ميكرومتر |
| 18 ميكرولتر | التمهيدي العكسي 10 ميكرومتر |
| 18 ميكرولتر | مسبار 10 ميكرومتر |
| 0.8 ميكرولتر | تريتون X100 |
| 45.2 ميكرولتر | مياه خالية من النيوكليز |
الجدول 1 - الجداول إعداد مزيج PCR الرئيسي المستخدم مع PTE ل PCR القطيرات الرقمية.
- الطرد المركزي مرحلة تفريق في 6000 س ز لمدة 1 دقيقة وإزالة supernatant. تسجيل حجم supernatant المستخرجة واستخدام مجموع حجم مرحلة تفريق محسوبة في 2.3 تحديد حجم بيليه.
ملاحظة: تختلف كمية الناسخة الفائقة المستخرجة حسب تعبئة الجسيمات وقطرها وتركيزها بحد أدنى متوقع يبلغ 300 ميكرولتر. - إضافة 1 ميكرولتر من 1.62 pg /μL Saccharomyces cerevisiae الحمض النووي الجينومي إلى بيليه من 2.4 وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب أو التنصت قوية.
ملاحظة: وجود المحتوى المائي الزائد يمكن أن يقلل من كفاءة التغليف. إذا تجاوز حجم العينة 1٪ من حجم الكريات، ركز العينة. إذا كان لا يمكن تركيز العينة، قم بتحجيم المزيج الرئيسي ل PCR وحجم الكريات الناتج وفقا لحجم العينة. تسمح PTE بتسحلب كميات صغيرة (10 ميكرولتر) إلى كميات كبيرة (2 مل) من جزيئات التمبلر. ويمكن قياس المزيج الرئيسي ل PCR (2.3) والزيت (2.6) وفقا للهدف (2.3) وقياس حجم (2.4) من بيليه الجسيمات على التوالي. - إضافة 200 ميكرولتر 2٪ فلوروسورفاتانت في زيت HFE إلى الأنبوب كمرحلة مستمرة غير قابلة للذوبان لاستحلاب. تأكد من طرد بيليه عن طريق الأنابيب أو التنصت / النقر على الأنبوب. ثم دوامة في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: قد يختلف الإعداد المطابق ل 3000 دورة في الدقيقة حسب العلامة التجارية والطراز. - السماح للمستحلبات لتسوية لمدة 1 دقيقة. إزالة 100 ميكرولتر من مرحلة النفط السفلي واستبدال هذا الحجم مع 2٪ من الفلوروسورفاكانت الطازجة في زيت HFE. عكس بلطف أنبوب عدة مرات لخلط. كرر 3-5x أو حتى تتم إزالة قطرات الأقمار الصناعية الصغيرة.
3. الرقمية PCR قطرة وتحليل.
- بعد 2-5 دقائق من الاستقرار، وإزالة مرحلة النفط السفلي. استبدل هذا الحجم ب 5٪ فلوروسورفاتانت في زيت الفلوروكربون (على سبيل المثال، FC-40).
- باستخدام طرف ماصة واسعة تتحمل، ماصة بعناية 100 ميكرولتر من العينة في أنابيب PCR 200 ميكرولتر. ضع أنابيب PCR في دراجة حرارية واركض وفقا للجدول 2.
| درج | درجة الحرارة | مدة | تلاحظ |
| 1 | 95 درجة مئوية | دقيقتان | |
| 2 | 95 درجة مئوية | 30 ق | |
| 3 | 50 درجة مئوية | 90 s | |
| 4 | 72 درجة مئوية | 60 ق | |
| 5 | كرر x34 الخطوات 2 إلى 4 | ||
| 6 | 72 درجة مئوية | دقيقتان | |
| 7 | 4 درجة مئوية | مسك |
الجدول 2 - الأرباح ظروف الترموسيكلينج ل PCR قطرة الرقمية باستخدام مستحلبات PTE.
- ماصة العينة على شريحة العد باستخدام تلميح ماصة تتحمل واسعة للتصوير الفلورسنت. صورة العينة باستخدام المجهر الفلوري مع 490 نانومتر الإثارة وأطوال موجية الكشف عن الانبعاثات 525 نانومتر.
- قياس قطرات الفلورسنت الإيجابية (NP) والقطرات الإجمالية (NT) للتحقق من وجود وحساب عدد جزيئات القالب (λ) باستخدام جزء من قطرات إيجابية (NP / NT) وإحصاءات بواسون:
- حساب الفاصل الزمني الثقة 95٪ (zc = 1.96) بواسطة:
- احسب تركيز العينة (الجزيئات/الميكروغرال) باستخدام حجم العينة المضافة في الخطوة 2.5 (μL)، باستخدام المعادلة الواردة أدناه. تحديد متوسط الانحراف المعياري لتركيز العينة باستخدام النسخ المتماثلة التقنية.
Representative Results
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تغليف العينة إلى قطرات باستخدام مستحلب الجسيمات المنماذج. (أ) جزيئات التمبلر المستخدمة في استحلاب الجسيمات. (ب) فصل بيليه الجسيمات المتمبلرة عن الجسيمات الفائقة بعد الطرد المركزي. (ج) قطرات الناتجة عن استحلاب الجسيمات قالب مع (D) قذيفة مائي يمكن التعرف عليها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في PTE ، يتم إملاء أحادية المستحلبات من خلال جزيئات التمبلر ، لأن قطر القطرات أكبر قليلا من الجسيمات. وبالتالي، فإن الجسيمات الموحدة هي مركزية لتغليف PTE الخاضع للرقابة11. توجد مجموعة متنوعة من الطرق لتوليد جزيئات تمبلاتينج موحدة ، بما في ذلك المواد الكيميائية (sol-gel ، البلمرة المستحلب) ، الهيدروديناميكية (مستحلب الأغشية ، التجانس) ، وطرق الترشيح. نهج Microfluidic على وجه الخصوص ، تحمل monodispersity رائعة (الشكل 2A) والسماح هندسة الجسيمات إضافية لتعزيز وظائفها في PTE12. بدلا من ذلك، يمكن شراء جزيئات التمبلر، على الرغم من أن توحيدها، على الرغم من أنها كافية، عادة أقل مما هو عليه مع الجيل الدقيق 11.
ولأداء الجسيمات PTE، يتم خلطها مع العينة التي سيتم تغليفها (الشكل 1A)، ويتم إزالة الجسيمات الفائقة الزائدة عن طريق الطرد المركزي والأنابيب (الشكل 1B)، كما يتضح من صورة لبيليه جسيم في الجزء السفلي من أنبوب PCR (الشكل 2B). ثم يضاف زيت التغليف الذي يحتوي على عامل الخافض للانضغاء السطحي المستقر (الشكل 1C)، ويتم إخراج العينة برفق قبل الدوامة لمدة 30 ثانية (الشكل 1D)، لتوليد المستحلب (الشكل 2C). تحتوي القطرات الناتجة على نواة جسيم وقشرة مائي تتألف من العينة الأولية ، والتي توجد بداخلها الكواشف والجزيئات المستهدفة والخلايا اللازمة للتفاعل (الشكل 2D). تماما كما هو الحال في تغليف القطرات الدقيقة ، يتم تغليف الكيانات المنفصلة مثل الخرز الصغير أو الخلايا بشكل عشوائي ووفقا لتوزيع بواسون ، على الرغم من أن جميع القطرات تقريبا تحتوي على جسيم تمبلر بسبب طبيعة فيزياء PTE.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن تحديد وتنظيف قطرات مستحلب الجسيمات قالب. (أ) مثال على توليد قطرات غير موحدة مع جزيئات متعددة لكل قطرة من دوامة غير كافية. (ب) الوجود المتوقع للسواتل والقطرات بعد استحلاب الجسيمات المضالبة و (ج) تفتيت الماء في الزيت. (د) مستحلب الناتجة بعد غسل الزيت. (ه) الإفراط في توليد السواتل الناتج عن بقايا الجسيمات الفائقة أثناء استحلاب الجسيمات المصطوب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
حتى في PTE الناجحة ، توجد قطرات أساسية مزدوجة أو ثلاثية ، على الرغم من أنها تساهم بشكل عام بشكل لا يذكر في رد الفعل ، شريطة أن تكون نادرة. يتطلب تحقيق تردد منخفض من قطرات متعددة النواة مع الاحتفاظ بالقذائف الكافية تحسين معلمات العملية ، بما في ذلك التوتر السطحي ، والقوى التصاق بين الجسيمات ، ولزوجة العينة ، وحجم الحاوية ، وقوة الدوامة والوقت. على سبيل المثال، قد يحتوي المستحلب غير المحسن بشكل جيد على قطرات متعددة الأضلاع تحتوي على العديد من الجسيمات المتمبلرة (الشكل 3A)، مما يشير إلى أن الدوامة لم تكن كافية لاستحلاب العينة بالكامل. في مثل هذه الحالات، يمكن إضافة المنظفات للحد من التصاق بين الجسيمات وانخفاض التوتر السطحي، أو يمكن زيادة قوة الدوامة أو الوقت. وثمة مسألة شائعة أخرى هي توليد السواتل المفرطة، وهي قطرات صغيرة فارغة (الشكل 3B). ويمكن تجنب السواتل في مستحلبات PTE تبعا للتوتر بين البيني والخصائص الريولوجية للعينة والنفط الناقل. ومع ذلك ، فإنها غالبا ما تنتج عن عدم إزالة العينة الزائدة بشكل كاف قبل الاستحلاب (الشكل 2B) ، أو الدوامة مع الكثير من الطاقة ، وتجريد الأصداف من القطرات. وفي مستحلب ناجح ل PTE، ينبغي ألا تشكل السواتل أكثر من ~ 10 في المائة من إجمالي حجم العينة المغلفة (الشكل 3C)11. على هذا المستوى ، فإنها عادة ما تسهم بشكل ضئيل في رد الفعل ويمكن تجاهلها. لأغراض جمالية، يمكن مسحها من المستحلب عن طريق غسل مع الزيت الطازج (الشكل 3D).
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال تقييم الجسيمات قالب مستحلب PCR القطيرات الرقمية. (أ) التصوير الفلوري للقطرات يحدد قطرات الفلورسنت الإيجابية وقطرات غير الفلورية السلبية. (ب) تحديد قالب نادر أو تركيزات منخفضة من القالب مع PCR قطرة الرقمية. (ج) على تغليف قالب وفيرة مما أدى إلى عدد متغير من جزيئات قالب لكل قطرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
لإثبات فائدة PTE ، استخدمناها لأداء PCR11 الرقمي الخالي من السوائل الدقيقة. باستخدام هذه العملية، قمنا بتغليف عينة تتألف من الحمض النووي الجينومي S. cerevisiae ، وثيرموسيكليد ذلك. في PCR الرقمية، قطرات تحتوي على أهداف مكبرة تصبح الفلورسنت، في حين أن تلك التي لا تزال قاتمة. وهكذا، تشير قطرة الفلورسنت إلى هدف، مما يسمح بالكمية المباشرة للأهداف عن طريق عد قطرات موجبة (الشكل 4A). وبالتالي فإن عدد قطرات الفلورسنت يتدرج مع الجزيئات المستهدفة ، مما يؤدي إلى عدد قليل من الإيجابيات عندما يكون الهدف نادرا (الشكل 4B) والعديد عندما يكون وفيرا (الشكل 4C). وكما هو الحال مع تغليف المكونات المنفصلة الأخرى، يتبع التغليف المستهدف توزيع بواسون، مما يسمح بتحويل كسر القطرة الإيجابي إلى التركيز المستهدف (الشكل 4D)، مما يدل على القدرة على أداء PCR الرقمي باستخدام PTE11.
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم عرض توضيحي ل PCR القطيرات الرقمية باستخدام PAA المتاحة تجاريا. (أ) التصوير الفلوري للقطرات يحدد قطرات غير فلورية سلبية. (ب) تحديد تركيزات منخفضة من القالب مع PCR قطرة الرقمية. (ج) تحديد تركيزات عالية من القالب مع PCR قطرة الرقمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وهذه النتائج قابلة للتكرار باستخدام جزيئات البولي أكريلاميد المتاحة تجاريا (الشكل 5) وتبين قدرة PTE على أداء PCR الرقمي القياسي مع جزيئات البولي أكريلاميد المتاحة تجاريا، وتحقيق قياسات دقيقة على نفس النطاق.
ملف تكميلي. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Discussion
يستخدم PTE الجسيمات لتغليف العينات في قطرات أحادية التشتت عن طريق الدوامة. بالإضافة إلى بساطتها وسهولة الوصول إليها ، توفر PTE العديد من الفوائد الإضافية ، بما في ذلك السماح بتوليد كميات كبيرة من القطرات على الفور. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء العملية في أنبوب معزول، مما يلغي الحاجة إلى نقل العينات إلى أجهزة ميكروفلويديك، وتبسيط سير العمل العام والحد من فرص تلوث العينات أو فقدانها. كما توفر جزيئات التمبلات وسيلة لهندسة محتويات تفاعلات القطرات الناتجة. على سبيل المثال، يمكن هندسة حجم الجسيمات والكيمياء والقدرة على الاشتعال للجزيئ الحيوي المستهدف أو التقاط الخلايا، في حين يمكن عرض ال moieties الوظيفية مثل الإنزيمات أو النشاطات أو الأحماض النووية على الجسيمات لتسهيل ردود الفعل، مثل تسلسل الخلية الواحدة أو التوصيف الوظيفي. ومع أن النهج مرن، فإن هناك مع ذلك قيودا هامة على استخدامه. فعلى سبيل المثال، لا يمكن حاليا إجراء إضافات قطرات كما تجرى في كثير من الأحيان باستخدام المركبات الدقيقة، مما يتطلب إدخال جميع مكونات التفاعل قبل التغليف؛ وهذا يتطلب أن تكون الكواشف متوافقة ومستقرة حتى يمكن توليد قطرات، وفي حالة تركيبات مزعجة، يمكن في كثير من الأحيان معالجتها عن طريق خلط بسرعة ومستحلب العينة على الجليد. بدلا من ذلك، يمكن استخدام المكونات التفاعلية التي يمكن تشغيلها خارجيا مع الضوء أو الحرارة13. وبالتالي توفر PTE طريقة مرنة وقابلة للتوسع لإجراء عمليات فحص القطيرات التي يمكن لغير الخبراء الوصول إليها. هذا، إلى جانب بساطته الفطرية والمرونة، يجعل PTE مثالية لتنفيذ وتطوير العديد من التطبيقات القطيرات.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل في وضع هذا البروتوكول المعاهد الوطنية للصحة (R01-EB019453-02)، ومكتب مدير الاستخبارات الوطنية، نشاط مشاريع البحوث المتقدمة الاستخبارات من خلال شركة رايثيون BBN تكنولوجيز كورب (N66001-18-C-4507)، وبرنامج تشان زوكربيرج Biohub المحقق، وكالة مشاريع البحوث المتقدمة الدفاع من خلال جامعة تكساس A & M (W911NF1920013)، ومراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها من خلال جامعة جونز هوبكنز تطبيقها مختبر الفيزياء (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). إن الآراء والاستنتاجات الواردة هنا هي آراء المؤلفين ولا ينبغي تفسيرها على أنها تمثل بالضرورة السياسات الرسمية، سواء كانت صريحة أو ضمنية، للمنظمات المذكورة أعلاه أو حكومة الولايات المتحدة. حكومة الولايات المتحدة مخولة بإعادة إنتاج وتوزيع طبعات لأغراض حكومية على الرغم من أي تعليق حقوق الطبع والنشر فيه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
| 0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| 1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
| 27 gauge needles | BD | 305109 | |
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| 3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
| Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
| FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
| SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
| Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
| Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
| Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
| EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
| EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
| SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
| Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |
References
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology. Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Gielen, F., et al. Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS). Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).
- Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing. Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).
- Olmedillas-López, S., García-Arranz, M., García-Olmo, D. Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology. Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).
- Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).
- Yan, Y., et al. Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).
- Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y.
- The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P.
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9, 541-544 (2012).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).
- Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology. Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).
- Panda, P., et al. Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles. Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).
- Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts. ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).
