Summary
Vann-i-olje dråpeanalyser er nyttige for analytisk kjemi, enzymutvikling og enkeltcelleanalyse, men krever vanligvis mikrofluidikk for å danne dråpene. Her beskriver vi partikkelmalt emulgering, en mikrofluidfri tilnærming for å utføre dråpeanalyser.
Abstract
Reaksjoner utført i monodispersed dråper gir forbedret nøyaktighet og følsomhet sammenlignet med tilsvarende som utføres i bulk. Imidlertid pålegger kravet om mikrofluidikk å danne kontrollerte dråper en barriere for ikke-eksperter, noe som begrenser bruken av dem. Her beskriver vi partikkelmalt emulgering, en tilnærming for å generere monodisperse dråper uten mikrofluidikk. Ved hjelp av fristende hydrogelkuler innkapsler vi prøver i monodisperserte dråper ved enkel virvelsetting. Vi demonstrerer tilnærmingen ved å bruke den til å utføre mikrofluidisk-fri digital PCR.
Introduction
Mikrofluidikk i dråper utnytter oppdeling i picoliterdråper for å øke følsomheten og nøyaktigheten til analysene sammenlignet med bulkreaksjoner, og har mange bruksområder innen kjemisk screening, proteinteknikk og neste generasjons sekvensering1,2,3. For eksempel gir digital dråpepolymerasekjedereaksjon (ddPCR) økt nøyaktighet sammenlignet med bulk kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), med anvendelser for genetisk variasjon i kreft, påvisning av sykdom som forårsaker mutasjoner og prenatal diagnostikk4,5,6. En utfordring med mikrofluidikk fra dråper er imidlertid kravet om mikrofluidiske enheter for å partisjonere prøver; mens mikrofluidikk gir utmerket kontroll over dråpeegenskaper, krever de spesialisert ekspertise for å bygge og operere7,8. Derfor er dråpebaserte metoder i stor grad begrenset til ekspertlaboratorier eller, i sjeldne tilfeller, applikasjoner der et kommersielt instrument er tilgjengelig9,10. For å utvide bruken av dråpeanalyser er kravet til spesialisert mikrofluidisk instrumentering et hinder som må overvinnes.
I denne artikkelen beskriver vi partikkelmalt emulgering (PTE), en mikrofluidfri metode for å utføre reaksjoner i monodisperserte dråper. I PTE oppsluker fristende partikler prøven i dråper i bærerolje ved enkel virvelsetting (figur 1). Når systemet blandes, fragmenterer den vandige delen i dråper med redusert størrelse til dråpene inneholder enkle partikler, og da er ytterligere fragmentering ikke mulig fordi det krever å bryte partiklene. Den oppslukte prøven omgir partiklene som et skall i dråpene, og innkapsler dermed eventuelle dispergerte celler, reagenser eller funksjonelle moieties (figur 1D). Derfor krever PTE ikke noe utstyr eller ekspertise for å utføre dråpereaksjoner utover en vanlig virvel. I tillegg tar dråpegenerering sekunder sammenlignet med minutter eller timer med mikrofluidikk, og mengden som produseres er proporsjonal med beholdervolumet, ikke enhetens driftstid, noe som gjør den ekstremt skalerbar. Disse fordelene gjør PTE ideell for å gjennomføre dråpeanalyser under en rekke omstendigheter der mikrofluidikk er upraktisk. Her demonstrerer vi PTE og bruker den til å utføre ddPCR.
Figur 1. Oversikt over partikkelmalt emulgeringsprosess. (A) Fristende partikler blandes med reagenser. (B) Overflødige reagenser fjernes etter sentrifugering. (C) Tilsetning av malmolekyler skjer før tilsetning av olje. (D) Vortexing produserer dråper som inneholder et enkelt malmolekyl. (E) Etterfølgende termosycling og avbildning muliggjør digital dråpeanalyse av målmal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
1. Fremstilling av hydrogelpartikler for partikkelmalt emulgering.
Hydrogelpartikler som brukes til partikkelmalt emulgering kan fremstilles ved hjelp av to forskjellige metoder.
- Fremstilling ved bruk av kommersielt tilgjengelige partikler
- Tilsett 0,5 g tørkede polyakrylamidpartikler som er kompatible med PTE (f.eks. Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), 45-90 μm diameter) til 30 ml sterilt vann i et 50 ml konisk rør og bland godt. Inkuber ved romtemperatur i 30 min.
- Fremstilling ved bruk av mikrofluidisk fabrikasjon av partikler
MERK: Polyakrylamidpartikler som er kompatible med PTE, kan tilberedes ved hjelp av kommersielt tilgjengelige fallmakere (f.eks. QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) etc.), eller ved tilpasset mikrofluidisk design.- Fabrikasjon av tilpasset mester
- Utform en myk fotolittografimaske ved hjelp av CAD-programvare (Computer-Aided Design). Skriv ut fotomasken med en oppløsning på 10 μm på kretskortfilm.
- Hell 1 ml fotoresist på midten av en 3 i silisiumskive. Bruk en spin coater for å lage et 50 μm lag av fotoresist ved å spinne den på 500 rpm i 30 sek etterfulgt av 1250 rpm i 30 sek. Plasser skiven på en kokeplate satt til 95 °C i 15 minutter for å fordampe oppløsningsvæsken.
- Fest fotomasken på silisiumskiven med en glasssklie og utsett skiven under en kollatert 190 mW, 365 μm UV-LED i 2,5 min. Plasser skiven på en kokeplate satt til 95 °C i 5 minutter for baking etter eksponering.
- Utvikle fotoresist-silisiumskiven ved å nedsenke den i et bad med 100% propylenglykolmonymetyleteracetat (PGMEA) i opptil 15 minutter. Skyll skiven med frisk 100% PGMEA etterfulgt av 100% isopropanol. Lufttørk skiven.
- Fjern eventuell gjenværende isopropanol ved å tørke skiven på en kokeplate satt til 95 °C i 1 min. Legg skiven i en ren 3 i Petri-tallerkenen.
- Fabrikasjon av den tilpassede mikrofluidiske enheten
- Bland polydimetylsiloksan (PDMS) silisiumbase og herdereagens i et 10:1-forhold etter masse. Degas den blandede PDMS ved hjelp av en desiccator under husvakuum til ingen luftbobler er observerbare.
- Hell avgasset PDMS over mesteren i petriskålen, og sørg for at silisiumskiven er helt nedsenket. Degas silisiumskiven og PDMS for å fjerne eventuelle luftbobler som kan ha dannet seg under helling.
- Herd PDMS ved å plassere silisiumskiven og PDMS i en ovn satt til 65 °C i minst 60 minutter. Slukk en blokk med PDMS som inneholder de mikrofluidiske egenskapene fra petriskålen ved hjelp av en skalpell. Vær ekstra forsiktig for å unngå å skade eventuelle funksjoner som finnes på silisiummesteren.
- Stans innløpene og uttakene inn i PDMS-blokken som tilsvarer innløpene og uttakene i mikrofluidenheten ved hjelp av en 0,75 mm biopsistans. Fjern støv og partikler med repeterende påføring og fjerning av emballasjebånd til overflaten av PDMS-blokken.
- Rengjør en glasssklie på 50 mm x 75 mm ved å skylle den med 100 % isopropanol og deretter lufttørke overflaten. Plasma behandle både glass lysbilde og PDMS (funksjoner vendt opp) ved hjelp av 1 mbar O2 plasma i 1 min ved hjelp av en plasma bonder.
- Fest PDMS til glasssklie ved å plassere plasmabehandlet PDMS med funksjoner som vender ned på glasssklie, plasmabehandlet side vendt opp. Plasser gliden i et ovnssett til 65 °C i minst 30 minutter for å fullføre bindingen.
- Behandle alle mikrofluidiske kanaler med fluorert overflatebehandling for å sikre overflatehydrofobitet og forhindre fukting. Stek enheten ved 65 °C i minst 10 minutter.
- Fabrikasjon av fristende partikler
- Forbered en polyakrylamid (PAA) oppløsning bestående av 6,2% akrylamid, 0,18% N,N′-metylenbis (akrylamid) og 0,3% ammoniumpersulfat. Legg denne oppløsningen i en 1 ml sprøyte med en 28 G kanyle.
- Forbered en uoppløselig kontinuerlig fase bestående av 5% (w/w) fluorosurfactant og 1% N,N,NN-tetrametylentyfendiamin (TEMED) i hydrofluorether (HFE) olje for generering og stabilisering av dråper. Legg oppløsningen i en ny 1 ml sprøyte.
- Legg både PAA- og HFE-oppløsningen som inneholder sprøyter, i sprøytepumper (f.eks. NE-501). Koble begge sprøytene til den mikrofluidiske enheten ved hjelp av polyetylenrør satt inn i sprøyten og inn i enheten. Før tilkoblingen må pumpene klargjøres for å fjerne luften fra slangen.
MERK: Avhengig av modell kan sprøytepumper styres med innebygd inngang, produksjonsprogramvare eller et tilpasset skript (tilgjengelig på https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program). - Kjør dropgenereringsenheten med PAA- og HFE-oljeinnganger med henholdsvis 300 μL/t og 500 μL/t. Samle 1 ml av dråpene i et 15 ml oppsamlingsrør og inkuber i 3 timer ved romtemperatur for polymerisering. Etter inkubasjonen, fjern det nedre laget av olje ved pipettering.
- Tilsett 1 ml 20 % (v/v) perfluoro-1-oktanol (PFO) i HFE-olje til 15 ml oppsamlingsrøret som kjemisk demulsifikator. Etter blanding, spinn ned 15 ml oppsamlingsrør ved 2000 x g i 2 min. Fjern PFO/HFE supernatant ved pipettering. Gjenta 1x.
- Tilsett 2 ml 2% sorbitanmonooleat i heksan til 15 ml oppsamlingsrør og virvel som skal blandes. Snurr røret på 3000 x g i 3 min. Fjern supernatanten ved pipettering for å fjerne overflateaktiv/heksanoppløsning. Gjenta 2x.
- Legg til 5 ml TEBST-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 274 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) og bland godt. Spinn ned på 3000 x g i 3 min. Fjern supernatanten ved å pipettere. Gjenta 3x.
- Resuspend i 5 ml TEBST. Denne oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C på ubestemt tid.
- Fabrikasjon av tilpasset mester
2. Partikkelmalt emulgering.
Etter tilberedning av fristende partikler brukes PTE til å innkapsle prøven og reagensene i dråper.
- Forbered polyakrylamidpartiklene for partikkelmalt emulgering ved sentrifugering ved 6000 x g i 1 min for å pellet partiklene, fjern deretter supernatanten ved pipettering og resuspend ved hjelp av sterilt vann. Gjenta 3x for å sikre fjerning av gjenværende TEBST.
- Bestem konsentrasjonen og diameteren til de fristende partiklene ved hjelp av et hemocytometer (eller tilsvarende). Beregn individuell partikkeldiameter ved å måle diameteren i piksler og konvertere til mikroner. Konvertering av bildepunkter til mikron kan beregnes ved hjelp av hemocytometeret (eller tilsvarende) som et kalibreringslysbilde og måling av den kjente rutenettavstanden i piksler.
- Forbered spredningsfasen i et friskt 1,5 ml mikrosenterrør ved hjelp av en PCR-masterblanding, passende primere og en fluoresceinhydrolyseprobe i henhold til tabell 1. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter under skånsom agitasjon (10 o/min) ved hjelp av en rørrotator for å sikre homogen fordeling av komponentene.
MERK: Volumet og målkonsentrasjonen av partikler er basert på Poisson-lasting. Som hovedregel bør antall partikler være en størrelsesorden mer enn antall prøver som skal innkapsles. For prøver av ukjente konsentrasjoner er det nødvendig med en fortynningsserie for å sikre Poisson-lasting.
| Volum | Reagent |
| 100 μL | Partikler (450 partikler / μL) |
| 200 μL | 2x PCR-hovedmiks |
| 18 μL | 10 μM fremoverprimer |
| 18 μL | 10 μM omvendt primer |
| 18 μL | 10 μM-sonde |
| 0,8 μL | Triton X100 |
| 45,2 μL | Nukleasefritt vann |
Tabell 1. Klargjøring av PCR-hovedmiksen som brukes med PTE for digital dråpe-PCR.
- Sentrifuger spredningsfasen ved 6000 x g i 1 min og fjern supernatanten. Registrer volumet av supernatanten som ekstraheres og bruk det totale spredningsfasevolumet beregnet i 2,3 , bestem pelletsvolumet.
MERK: Mengden supernatant ekstrahert vil variere avhengig av partikkelpakking, diameter og konsentrasjon med et minimum forventet volum på 300 μL. - Tilsett 1 μL 1,62 pg /μL Saccharomyces cerevisiae genomisk DNA til pelletsen fra 2,4 og bland grundig ved pipettering eller kraftig tapping.
MERK: Tilstedeværelsen av overflødig vandig innhold kan redusere innkapslingseffektiviteten. Hvis prøvevolumet overstiger 1% av pelletsvolumet, konsentrer prøven. Hvis prøven ikke kan konsentreres, skalerer du PCR-masterblandingen og resulterer i pelletsvolum i henhold til prøvevolumet. PTE tillater emulgering av små (10 μL) til store (2 ml) volumer av fristende partikler. PCR-masterblandingen (2,3) og oljen (2,6) kan skaleres i henhold til henholdsvis målet (2,3) og målt (2,4) volum av partikkelpelleten. - Tilsett 200 μL 2% fluorosurfactant i HFE olje til røret som den uoppløselige kontinuerlige fasen for emulgering. Kontroller at pelletsen løsnes ved å pipettere eller trykke/flikke på røret. Deretter virvel ved 3000 rpm i 30 sek.
MERK: Innstillingen som tilsvarer 3000 rpm kan variere avhengig av merke og modell. - La emulsjonene slå seg ned i 1 min. Fjern 100 μL av bunnoljefasen og erstatt dette volumet med friskt 2% fluorosurfaktant i HFE-olje. Snu røret forsiktig flere ganger for å blande. Gjenta 3-5x eller til små satellittdråper er fjernet.
3. Digital dråpe PCR og analyse.
- Etter 2-5 min med sedimentering, fjern bunnoljefasen. Skift ut dette volumet med 5 % fluorosurfaktant i fluorkarbonolje (f.eks.
- Bruk en bred pipettespiss til å pipette forsiktig 100 μL prøven i 200 μL PCR-rør. Plasser PCR-rørene i en termosykler og kjør i henhold til tabell 2.
| Skritt | Temperatur | Varighet | Notater |
| 1 | 95 °C | 2 min. | |
| 2 | 95 °C | 30 s | |
| 3 | 50 °C | 90 s | |
| 4 | 72 °C | 60 s | |
| 5 | Gjenta x34 trinn 2 til 4 | ||
| 6 | 72 °C | 2 min. | |
| 7 | 4 °C | holde |
Tabell 2. Termocycling forhold for digital dråpe PCR ved hjelp av PTE emulsjoner.
- Pipette prøven på en tellesklie ved hjelp av en bred pipettespiss for fluorescerende avbildning. Se for deg prøven ved hjelp av et fluorescerende mikroskop med 490 nm eksitasjon og 525 nm utslippsdeteksjonsbølgelengder.
- Kvantifisere de positive fluorescerende dråpene (Np) og totale dråper (NT) for å verifisere tilstedeværelsen og beregne antall malmolekyler (λ) ved hjelp av brøkdelen av positive dråper (Np / NT) og Poisson-statistikk:
- Beregn konfidensintervallet på 95 % (zc = 1,96) ved å:
- Beregn prøvekonsentrasjonen (molekyler/μL) ved hjelp av volumet (ν i μL) av prøven som ble lagt til i trinn 2.5, ved hjelp av ligningen gitt nedenfor. Bestem gjennomsnitts- og standardavviket for prøvekonsentrasjonen ved hjelp av tekniske repliker.
Representative Results
Figur 2. Innkapsling av prøve i dråper ved hjelp av partikkelmalt emulgering. (A) templating partikler som brukes til partikkel templating emulgering. (B) Separasjon av fristende partikkelpellet fra supernatant etter sentrifugering. (C) Dråper som følge av partikkelmalt emulgering med (D) identifiserbart vandig skall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I PTE dikterer monodispersiteten til emulsjonene av de fristende partiklene, fordi dråpene har en diameter som er litt større enn partiklene. Dermed er ensartede partikler sentrale for kontrollert PTE-innkapsling11. Det finnes en rekke metoder for å generere ensartede fristende partikler, inkludert kjemiske (sol-gel, emulsjonspolymerisering), hydrodynamisk (membranemulgering, homogenisering) og filtreringsmetoder. Mikrofluidiske tilnærminger spesielt, har råd til suveren monodispersitet (figur 2A) og tillater ytterligere partikkelteknikk for å forbedre funksjonaliteten i PTE12. Alternativt kan fristende partikler kjøpes, selv om deres ensartethet, mens tilstrekkelig, vanligvis er mindre enn med mikrofluidisk generasjon11.
For å utføre PTE blandes partiklene med prøven som skal innkapsles (figur 1A), og overflødig supernatant fjernes ved sentrifugering og pipettering (figur 1B), som illustrert ved et fotografi av en partikkelpellet nederst i et PCR-rør (figur 2B). Den innkapslede oljen som inneholder et stabiliserende overflateaktivt middel tilsettes deretter (figur 1C), og prøven pipetteres forsiktig før virveler i 30 sekunder (figur 1D), for å generere emulsjonen (figur 2C). De resulterende dråpene inneholder en partikkelkjerne og vandig skall som består av den første prøven, der reagensene, målmolekylene og cellene som er nødvendige for reaksjonen (figur 2D). Akkurat som i dråpemikrofluidisk innkapsling, er diskrete enheter som små perler eller celler innkapslet tilfeldig og i samsvar med en Poisson-distribusjon, selv om nesten alle dråper inneholder en fristende partikkel på grunn av arten av PTE-fysikk.
Figur 3. Identifisering og opprydding av partikkelmalte emulgeringsdråper. (A) Eksempel på ikke-ensartet dråpegenerering med flere partikler per dråpe fra utilstrekkelig virveling. (B) Forventet tilstedeværelse av satellitter og dråper etter partikkelmalt emulgering og (C) vann-i-olje-fraksjonering. (D) Resulterende emulsjon etter oljevask. (E) Overdreven satellittgenerering som følge av gjenværende supernatant under partikkelmalt emulgering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Selv i vellykkede PTE eksisterer doble eller tredoble kjernedråper, selv om de generelt bidrar ubetydelig til reaksjonen, forutsatt at de er sjeldne. Å oppnå en lav frekvens av multikoredråper samtidig som tilstrekkelige skall beholder, krever optimalisering av prosessparametere, inkludert overflatespenning, interpartikkeladhesjonskrefter, prøveviskositet, beholderstørrelse og virveleffekt og tid. For eksempel kan en dårlig optimalisert emulgering inneholde polydispersed dråper med mange fristende partikler (figur 3A), noe som indikerer at virvelingen ikke var tilstrekkelig til å fullstendig emulgere prøven. I slike tilfeller kan vaskemidler legges til for å redusere interpartikkeladhesjon og lavere overflatespenning, eller virveleffekt eller tid kan økes. Et annet vanlig problem er generering av overdreven satellitter, som er små tomme dråper (figur 3B). Satellitter kan være uunngåelige i PTE-emulsjoner avhengig av interfacial spenning og reologiske egenskaper til prøven og bæreroljen. Imidlertid skyldes de ofte ikke tilstrekkelig fjerning av overflødig prøve før emulgering (figur 2B), eller vortexing med for mye kraft, stripping av skallene fra dråpene. I en vellykket PTE-emulgering bør satellitter ikke utgjøre mer enn ~ 10% av det totale innkapslede prøvevolumet (figur 3C)11. På dette nivået bidrar de vanligvis ubetydelig til reaksjonen og kan ignoreres. For estetiske formål kan de fjernes fra emulsjonen ved å vaske med fersk olje (figur 3D).
Figur 4. Evaluering av partikkelmalt emulgering digital dråpe PCR. (A) Fluorescerende avbildning av dråpene identifiserer positive fluorescerende dråper og negative ikke-fluorescerende dråper. (B) Identifisering av sjeldne maler eller lave konsentrasjoner av mal med digital dråpe PCR. (C) Over rikelig malinnkapsling som resulterer i et variabelt antall malmolekyler per dråpe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å demonstrere nytten av PTE, brukte vi den til å utføre mikrofluidisk-fri digital PCR11. Ved hjelp av prosessen innkapslet vi en prøve bestående av S. cerevisiae genomisk DNA, og termocycled det. I digital PCR blir dråper som inneholder forsterkede mål fluorescerende, mens de uten forblir svake. Dermed indikerer et fluorescerende dråpe et mål, noe som tillater direkte kvantum av mål ved å telle positive dråper (figur 4A). Antallet fluorescerende dråper skalerer dermed med målmolekylene, noe som gir få positive når målet er sjeldent (figur 4B) og mange når det er rikelig (figur 4C). Som med innkapsling av andre diskrete komponenter, følger målinnkapsling en Poisson-distribusjon, slik at den positive dråpefraksjonen kan forvandles til målkonsentrasjonen (figur 4D), og dermed demonstrere muligheten til å utføre digital PCR med PTE11.
Figur 5. Demonstrasjon av digital dråpe-PCR ved hjelp av kommersielt tilgjengelig PAA. (A) Fluorescerende avbildning av dråpene identifiserer negative ikke-fluorescerende dråper. (B) Identifisering av lave konsentrasjoner av mal med digital dråpe PCR. (C) Identifisering av høye konsentrasjoner av mal med digital dråpe PCR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Disse resultatene kan gjentas ved hjelp av kommersielt tilgjengelige polyakrylamidpartikler (figur 5) og demonstrerer PTE's evne til å utføre standard digital PCR med kommersielt tilgjengelige polyakrylamidpartikler, og oppnå nøyaktige målinger over samme område.
Tilleggsfil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
PTE bruker partikler til å innkapsle prøver i monodisperserte dråper ved virveling. I tillegg til enkelhet og tilgjengelighet gir PTE flere ekstra fordeler, inkludert å tillate at store mengder dråper genereres øyeblikkelig. Videre kan prosessen utføres i et isolert rør, noe som hindrer behovet for å overføre prøver til mikrofluidiske enheter, effektivisere den generelle arbeidsflyten og begrense mulighetene for prøveforurensning eller tap. De fristende partiklene gir også et middel for å konstruere innholdet i de resulterende dråpereaksjonene. For eksempel kan partikkelstørrelse, kjemi og fuktbarhet konstrueres for målrettet biomolekyl eller cellefangst, mens funksjonelle moieties som enzymer, aktive eller nukleinsyrer, kan vises på partikkel for å lette reaksjoner, for eksempel for enkeltcellesekvensering eller funksjonell karakterisering. Selv om tilnærmingen er fleksibel, er det likevel viktige begrensninger for bruken. For eksempel er det for tiden ikke mulig å utføre dråpetilsetninger som ofte utføres med mikrofluidikk, noe som krever at alle reaksjonskomponenter innføres før innkapsling; Dette krever at reagenser er kompatible og stabile til dråpene kan genereres, og i tilfelle plagsomme kombinasjoner kan det ofte løses ved raskt å blande og emulgere prøven på is. Alternativt kan reaktive komponenter som kan utløses eksternt med lys eller varme brukes13. PTE gir dermed en fleksibel og skalerbar metode for å gjennomføre dråpeanalyser som er tilgjengelige for ikke-eksperter. Dette, kombinert med sin medfødte enkelhet og fleksibilitet, gjør PTE ideell for utførelse og utvikling av mange dråpeapplikasjoner.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet med å utvikle denne protokollen ble støttet av National Institutes of Health (R01-EB019453-02), kontoret til direktøren for nasjonal etterretning, Intelligens Avanserte forskningsprosjekter Aktivitet gjennom Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, Defense Advanced Research Projects Agency gjennom Texas A&M University (W911NF1920013), og Centers for Disease Control and Prevention gjennom Johns Hopkins University Applied Fysikk Laboratorium (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Synspunktene og konklusjonene i dette dokumentet er forfatternes synspunkter og bør ikke tolkes som nødvendigvis å representere den offisielle politikken, enten uttrykt eller underforstått, av de ovennevnte organisasjonene eller den amerikanske regjeringen. Den amerikanske regjeringen er autorisert til å reprodusere og distribuere reprints for statlige formål til tross for eventuelle opphavsrettsmerknader der.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
| 0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| 1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
| 27 gauge needles | BD | 305109 | |
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| 3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
| Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
| FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
| SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
| Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
| Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
| Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
| EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
| EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
| SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
| Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |
References
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology. Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Gielen, F., et al. Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS). Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).
- Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing. Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).
- Olmedillas-López, S., García-Arranz, M., García-Olmo, D. Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology. Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).
- Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).
- Yan, Y., et al. Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).
- Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y.
- The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P.
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9, 541-544 (2012).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).
- Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology. Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).
- Panda, P., et al. Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles. Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).
- Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts. ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).
