Summary
Vand-i-olie dråbe assays er nyttige for analytisk kemi, enzym evolution, og enkelt celle analyse, men kræver typisk mikrofluidics at danne dråber. Her beskriver vi partikelskabelon emulsificering, en mikrofluidisk-fri tilgang til at udføre dråbe assays.
Abstract
Reaktioner udført i monodispersed dråber giver forbedret nøjagtighed og følsomhed i forhold til tilsvarende dem, der udføres i løs vægt. Kravet om mikrofluidics om at danne kontrollerede dråber pålægger imidlertid en barriere for ikke-eksperter, hvilket begrænser deres anvendelse. Her beskriver vi partikelskabelon emulsivering, en tilgang til at generere monodispersedråber uden mikrofluidics. Ved hjælp af templating hydrogel kugler, indkapsler vi prøver i monodispersed dråber ved simpel vortexing. Vi demonstrerer tilgangen ved at bruge den til at udføre mikrofluidisk-fri digital PCR.
Introduction
Dråbe mikrofluidics udnytter opdeling i picoliter dråber til at øge følsomheden og nøjagtigheden af assays i forhold til bulk reaktioner, og har mange anvendelser i kemisk screening, protein engineering, og næste generation sekventering1,2,3. For eksempel giver digital dråbe polymerase kædereaktion (ddPCR) øget nøjagtighed sammenlignet med bulk kvantitativ polymerase kædereaktion (qPCR), med applikationer til genetisk variation i kræft, påvisning af sygdom forårsager mutationer, og prænatal diagnostik4,5,6. En udfordring ved dråbemikrofluidics er imidlertid kravet om mikrofluidiske anordninger til at opdele prøver; mens mikrofluidics giver fremragende kontrol over dråbe egenskaber, de kræver specialiseret ekspertise til at bygge og drive7,8. Derfor er dråbebaserede metoder i vid udstrækning begrænset til ekspertlaboratorier eller i sjældne tilfælde applikationer, hvor et kommercielt instrument er tilgængeligt9,10. For at udvide brugen af dråbe assays, kravet om specialiseret mikrofluidisk instrumentering er en forhindring, der skal overvindes.
I denne artikel beskriver vi partikelskabelon emulsification (PTE), en mikrofluidisk-fri metode til udførelse af reaktioner i monodispersed dråber. I PTE opsluger templaterende partikler prøven til dråber i bæreolie ved simpel hvirvlen (figur 1). Som systemet blander, den vandige del fragmenter i dråber af reducerende størrelse, indtil dråberne indeholder enkelte partikler, hvorefter yderligere fragmentering er ikke muligt, fordi det kræver at bryde partiklerne. Den opslugte prøve omgiver partiklerne som en skal i dråberne og indkapsler derved eventuelle spredte celler, reagenser eller funktionelle moietier (figur 1D). Pte kræver således intet udstyr eller ekspertise til at udføre dråbereaktioner ud over en almindelig vortexer. Derudover tager dråbegenerering sekunder sammenlignet med minutter eller timer med mikrofluidics, og den producerede mængde er proportional med beholdervolumen, ikke enhedens driftstid, hvilket gør den yderst skalerbar. Disse fordele gør PTE ideel til at gennemføre dråbe assays i en række forskellige omstændigheder, hvor mikrofluidics er upraktisk. Her demonstrerer vi PTE og bruger den til at udføre ddPCR.
Figur 1. Oversigt over partikelskabelon emulsiveringsproces. (A) Templating partikler blandes med reagenser. (B) Overskydende reagenser fjernes efter centrifugering. (C) Tilsætning af skabelonmolekyler sker før tilsætning af olie. (D) Vortexing producerer dråber, der indeholder et enkelt skabelonmolekyle. (E) Efterfølgende termocykling og billeddannelse giver mulighed for digital dråbeanalyse af målskabelonen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
1. Fremstilling af hydrogelpartikler til partikelskabelon emulgering.
Hydrogel partikler, der anvendes til partikel skabelon emulsivering kan fremstilles ved hjælp af to forskellige metoder.
- Forberedelse ved hjælp af kommercielt tilgængelige partikler
- Tilsæt 0,5 g tørrede polyacrylamidpartikler, der er kompatible med PTE (f.eks. Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), 45-90 μm diameter) til 30 mL sterilt vand i et 50 mL konisk rør og bland godt. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
- Forberedelse ved hjælp af mikrofluidisk fremstilling af partikler
BEMÆRK: Polyacrylamidpartikler, der er kompatible med PTE, kan fremstilles ved hjælp af kommercielt tilgængelige dråbeproducenter (f.eks. QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent) osv.) eller ved brugerdefineret mikrofluidisk design.- Fabrikation af brugerdefineret mester
- Design en blød fotolitografimaske ved hjælp af computerstøttet design (CAD)-software. Udskriv fotomasken med en opløsning på 10 μm på printkortfilm.
- Hæld 1 mL fotoresist på midten af en 3 i silicium wafer. Brug en spin coater til at skabe et 50 μm lag fotoresisten ved at dreje den ved 500 omdr./min. i 30 sek efterfulgt af 1250 rpm i 30 sek. Læg vaflerne på en kogeplade, der er indstillet til 95 °C i 15 minutter, for at fordampe opløsningsmidlet.
- Fastgør fotomasken på silicium wafer med et dæk glas slide og udsætte wafer under en sammenlagt 190 mW, 365 μm UV LED i 2,5 min. Læg vaflerne på en kogeplade, der er indstillet til 95 °C i 5 min for posteksponeringsbagning.
- Udvikle fotoresist-silicium wafer ved at nedsænke det i et bad på 100% propylenglycol monomethyl ether acetat (PGMEA) i op til 15 min. Skyl waferen med frisk 100% PGMEA efterfulgt af 100% isopropanol. Luft tørre wafer.
- Fjern eventuel resterende isopropanol ved at tørre vaflerne på en kogeplade, der er indstillet til 95 °C i 1 min. Læg waferen i en ren 3 i Petriskål.
- Fabrikation af den brugerdefinerede mikrofluidiske enhed
- Bland polydimethylsiloxane (PDMS) silicium base og hærdning reagens i en 10:1 forholdet efter masse. Afgas den blandede PDMS ved hjælp af en udtørrer under hus vakuum, indtil ingen luftbobler er observerbare.
- Hæld den afgassede PDMS over mesteren i petriskålen, så silicium waferen er helt nedsænket. Afgas silicium wafer og PDMS at fjerne eventuelle luftbobler, der kan have dannet under hældning.
- Pdms hærder ved at placere silicium wafer og PDMS i en ovn indstillet til 65 °C i mindst 60 min. Punktafgifter en blok af PDMS indeholder mikrofluidiske funktioner fra petriskålen ved hjælp af en skalpel. Vær ekstra forsigtig for at undgå at beskadige eventuelle funktioner, der er til stede på siliciummasteren.
- Punch indløb og afsætningsmuligheder i PDMS blok svarende til indløb og udtag i mikrofluidiske enhed ved hjælp af en 0,75 mm biopsi punch. Fjern støv og partikler med gentagen påføring og fjernelse af emballagetape til overfladen af PDMS-blokken.
- Rengør en 50 mm x 75 mm glasrutschebane ved at skylle den med 100% isopropanol og efterfølgende lufttørre overfladen. Plasma behandler både glas slide og PDMS (funktioner vender op) ved hjælp af 1 mbar af O2 plasma i 1 min ved hjælp af en plasma bonder.
- Fastgør PDMS på glasrutschebanen ved at placere den plasmabehandlede PDMS med funktioner, der vender ned på glasrutschebanen, plasmabehandlet side, der vender op. Skuben i en ovn i et sæt til 65 °C i mindst 30 min for at fuldføre limningen.
- Behandl alle mikrofluidiske kanaler med en fluorholdig overfladebehandling for at sikre overfladehydrfobicity og forhindre befugtning. Bag enheden ved 65 °C i mindst 10 min.
- Fremstilling af templaterende partikler
- Forbered en polyacrylamidopløsning (PAA) bestående af 6,2% acrylamid, 0,18% N, N′-methylenbis (acrylamid) og 0,3% ammonium persulfat. Læg denne opløsning i en 1 mL sprøjte med en 28G nål.
- Forberede en uopløselig kontinuerlig fase bestående af 5% (w / w) fluorosurfactant og 1% N, N, NN-tetramethylethylendiamin (TEMED) i hydrofluoroether (HFE) olie til generering og stabilisering af dråber. Læg opløsningen i den nye 1 mL-sprøjte.
- Læg både PAA- og HFE-opløsning, der indeholder sprøjter, i sprøjtepumper (f.eks. NE-501). Tilslut begge sprøjter til den mikrofluidiske enhed ved hjælp af polyethylenrør indsat på sprøjten og ind i enheden. Før tilslutningen skal pumperne primes for at fjerne luften fra slangen.
BEMÆRK: Afhængigt af modellen kan sprøjtepumper styres med indbygget input, fremstillingssoftware eller et brugerdefineret script (fås på https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program). - Kør dråbegenereringsenheden med PAA- og HFE-olietilførsler ved henholdsvis 300 μL/h og 500 μL/h. Saml 1 mL af dråberne i et 15 mL opsamlingsrør og inkuber i 3 timer ved stuetemperatur til polymerisering. Efter inkubationen fjernes det nederste lag olie ved pipettering.
- Tilsæt 1 mL af 20% (v/v) perfluoro-1-octanol (PFO) i HFE-olie til 15 mL opsamlingsrøret som en kemisk demulsifier. Efter blanding, drej ned 15 mL indsamling rør på 2000 x g i 2 min. Fjern PFO/HFE supernatanten ved pipettering. Gentag 1x.
- Tilsæt 2 mL 2% sorbitanmonoolat i hexan til 15 mL opsamlingsrøret og vortex til at blande. Drej røret ved 3000 x g i 3 min. Fjern supernatanten ved at pipetter for at fjerne overfladeaktive/hexanopløsning. Gentag 2x.
- Tilføj 5 mL TEBST buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 274 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) og bland godt. Drej ned ved 3.000 x g i 3 min. Fjern supernatanten ved at pipettere. Gentag 3x.
- Resuspend i 5 mL TEBST. Denne opløsning kan opbevares ved 4 °C på ubestemt tid.
- Fabrikation af brugerdefineret mester
2. Partikel skabelon emulsering.
Efter fremstilling af templaterende partikler anvendes PTE til at indkapsle prøven og reagenserne i dråber.
- Forbered polyacrylamidpartiklerne til partikelskabelonemulsificering ved centrifugering ved 6000 x g i 1 minut for at pille partiklerne, og fjern derefter supernatanten ved pipettering og genbrug ved hjælp af sterilt vand. Gentag 3x for at sikre fjernelse af eventuel resterende TEBST.
- Bestem koncentrationen og diameteren af de templaterende partikler ved hjælp af et hæmocytometer (eller tilsvarende). Beregn individuelle partikeldiameter ved at måle diametre i pixels og konvertere til mikron. Konvertering af pixels til mikron kan beregnes ved hjælp af hæmocytometeret (eller tilsvarende) som et kalibreringsdias og måling af den kendte gitterafstand i pixel.
- Spredningsfasen forberedes i et friskt 1,5 ml mikrocentrifugerør ved hjælp af et PCR-mastermix, de relevante primere og en fluorescein hydrolysesonde i henhold til tabel 1. Inkuberes ved stuetemperatur i 5 min under blid omrøring (10 rpm) ved hjælp af en rørrotator for at sikre homogen fordeling af komponenterne.
BEMÆRK: Volumen- og målkoncentrationen af partikler er baseret på Poisson-belastning. Som hovedregel bør antallet af partikler være en størrelsesorden, der er større end antallet af prøver, der skal indkapsles. For prøver af ukendte koncentrationer er en fortyndingsserie nødvendig for at sikre Poisson-belastning.
| Lydstyrke | Reagens |
| 100 μL | Partikler (450 partikler / μL) |
| 200 μL | 2x PCR master mix |
| 18 μL | 10 μM frem primer |
| 18 μL | 10 μM omvendt primer |
| 18 μL | 10 μM sonde |
| 0,8 μL | Triton X100 |
| 45,2 μL | Nucleasefrit vand |
Tabel 1. Forberedelse af PCR master mix, der anvendes med PTE til digital dråbe PCR.
- Centrifugere spredningsfasen ved 6000 x g i 1 min og fjern supernatanten. Optag mængden af det udvundne supernatant og brug af den samlede spredningsfasevolumen beregnet i 2.3 bestemmer pelletvolumenet.
BEMÆRK: Mængden af supernatant udvundet vil variere afhængigt af partikelpakning, diameter og koncentration med et minimum forventet volumen på 300 μL. - Pellet tilsættes 1 μL på 1,62 pg /μL Saccharomyces cerevisiae genomisk DNA til pelleten fra 2,4 og blandes grundigt ved pipettering eller kraftig aflytning.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af overskydende vandig indhold kan reducere indkapslingseffektiviteten. Hvis prøvevolumenet overstiger 1 % af pelletvolumenet, skal prøven koncentreres. Hvis prøven ikke kan koncentreres, skaleres PCR-mastermikset og den deraf følgende pelletvolumen i henhold til prøvevolumen. PTE tillader emulgering af små (10 μL) til store (2 mL) mængder templaterende partikler. PCR master mix (2.3) og olie (2.6) kan skaleres i henhold til målet (2,3) og målt (2,4) volumen af partikelpillen henholdsvis. - Tilsæt 200 μL 2% fluorosurfaktivt i HFE-olie til røret som den uopløselige kontinuerlige fase til emulgering. Sørg for, at pellet løsnes ved at pipette eller trykke/svirpe røret. Derefter hvirvler på 3000 rpm i 30 sek.
BEMÆRK: Indstillingen svarende til 3000 omdrejninger kan variere afhængigt af mærke og model. - Lad emulsionerne nøjes i 1 min. Fjern 100 μL af den nederste oliefase, og udskift dette volumen med frisk 2 % fluorosurfaktiv i HFE-olie. Vend forsigtigt røret flere gange for at blande. Gentag 3-5x, eller indtil små satellitdråber er fjernet.
3. Digital dråbe PCR og analyse.
- Efter 2-5 min afregning fjernes den nederste oliefase. Udskift dette volumen med 5% fluorosurfaktivt stof i fluorcarbonolie (f.eks. FC-40).
- Ved hjælp af en bred borepipettespids skal prøvens 100 μL forsigtigt ind i 200 μL PCR-rør. Placer PCR-rørene i en termocykel og kør i henhold til tabel 2.
| Skridt | Temperatur | Varighed | Noter |
| 1 | 95 °C | 2 min | |
| 2 | 95 °C | 30 s | |
| 3 | 50 °C | 90 s | |
| 4 | 72 °C | 60 s | |
| 5 | Gentag x34 trin 2 til 4 | ||
| 6 | 72 °C | 2 min | |
| 7 | 4 °C | holde |
Tabel 2. Termocykling betingelser for digital dråbe PCR ved hjælp af PTE emulsioner.
- Pipette prøven på en tælle slide ved hjælp af en bred boring pipette spids til fluorescerende billeddannelse. Billede prøven ved hjælp af et fluorescerende mikroskop med 490 nm excitation og 525 nm emissionsdetektering bølgelængder.
- Kvantificer de positive fluorescerende dråber (Np) og de samlede dråber (NT) for at verificere tilstedeværelsen og beregne antallet af skabelonmolekyler (λ) ved hjælp af fraktionen af positive dråber (Np / NT) og Poisson statistik:
- Beregn konfidensintervallet på 95 % (zc = 1,96) ved at:
- Prøvekoncentrationen (molekyler/μL) beregnes ved hjælp af den mængde (i μL) prøve, der blev tilsat i trin 2.5, ved hjælp af nedenstående ligning. Bestem prøvekoncentrationens middel- og standardafvigelse ved hjælp af tekniske replikater.
Representative Results
Figur 2. Indkapsling af prøve i dråber ved hjælp af partikelskabelon emulsivering. A) templating partikler, der anvendes til partikel templating emulsivering. (B) Adskillelse af templating partikel pellet fra supernatant efter centrifugering. (C) Dråber som følge af partikelskabelon emulgering med (D) identificerbar vandig skal. Klik her for at se en større version af dette tal.
I PTE dikteres emulsionernes monodispersitet af de templaterende partikler, fordi dråberne har en diameter, der er lidt større end partiklerne. Således er ensartede partikler centrale for kontrolleret PTE-indkapsling11. Der findes en række metoder til generering af ensartede templaterende partikler, herunder kemiske (sol-gel, emulsionpolymerisering), hydrodynamisk (membranemulsificering, homogenisering) og filtreringsmetoder. Især mikrofluidiske tilgange giver fremragende monodispersitet (figur 2A) og giver mulighed for yderligere partikelteknik for at forbedre deres funktionalitet i PTE12. Alternativt kan templating partikler købes, selv om deres ensartethed, mens tilstrækkelig, er typisk mindre end med mikrofluidisk generation11.
For at udføre PTE blandes partiklerne med den prøve, der skal indkapsles (figur 1A), og det overskydende supernatant fjernes ved centrifugering og pipettering (figur 1B), som illustreret ved et fotografi af en partikelpille i bunden af et PCR-rør (figur 2B). Den indkapslingsolie, der indeholder et stabiliserende overfladeaktivt middel, tilsættes derefter (figur 1C), og prøven ledes forsigtigt, før den hvirvler i 30 sekunder (figur 1D), for at generere emulsionen (figur 2C). De resulterende dråber indeholder en partikelkerne og vandig skal bestående af den oprindelige prøve, inden for hvilken de reagenser, målmolekyler og celler, der er nødvendige for reaktionen (figur 2D). Ligesom i dråbe mikrofluidisk indkapsling, diskrete enheder som små perler eller celler er indkapslet tilfældigt og i overensstemmelse med en Poisson fordeling, selv om næsten alle dråber indeholder en templating partikel på grund af karakteren af PTE fysik.
Figur 3. Identifikation og oprydning af partikel skabelon emulsivering dråber. (A) Eksempel på ikke-ensartet dråbegenerering med flere partikler pr. dråbe fra utilstrækkelig hvirvlen. (B) Forventet tilstedeværelse af satellitter og dråber efter partikelskabelon emulgering og (C) fraktionering af vand i olie. (D) Deraf følgende emulsion efter olievask. (E) Overdreven satellitgenerering som følge af resterende supernatant under partikelskabelon emulgering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Selv i vellykket PTE findes der dobbelt- eller tredobbelte kernedråber, selv om de generelt bidrager ubetydeligt til reaktionen, forudsat at de er sjældne. At opnå en lav frekvens af multicore dråber og samtidig bevare passende skaller kræver optimering af procesparametre, herunder overfladespænding, inter-partikel vedhæftning kræfter, prøve viskositet, beholder størrelse, og hvirvlende magt og tid. For eksempel kan en dårligt optimeret emulsificering indeholde polydisperseddråber med mange templaterende partikler (Figur 3A), hvilket indikerer, at hvirvlen ikke var tilstrækkelig til fuldt ud at emulgere prøven. I sådanne tilfælde kan rengøringsmidler tilsættes for at reducere inter-partikel vedhæftning og lavere overfladespænding, eller vortexing magt eller tid kan øges. Et andet almindeligt problem er generering af overdrevne satellitter, som er små tomme dråber (figur 3B). Satellitter kan være uundgåelige i PTE-emulsioner afhængigt af prøvens og bæreoliens interfaciale spænding og deologiske egenskaber. De skyldes dog ofte, at overskydende prøve ikke fjernes tilstrækkeligt før emulgeringen (figur 2B) eller hvirvler med for meget kraft og fjerner skallerne fra dråberne. Ved en vellykket PTE-emulgering bør satellitter højst omfatte ~10 % af det samlede indkapslede prøvevolumen (figur 3C)11. På dette niveau bidrager de normalt ubetydeligt til reaktionen og kan ignoreres. Til æstetiske formål kan de ryddes fra emulsionen ved at vaske med frisk olie (figur 3D).
Figur 4. Evaluering af partikelskabelon emulsification digital dråbe PCR. (A) Fluorescerende billeddannelse af dråberne identificerer positive fluorescerende dråber og negative ikke-fluorescerende dråber. (B) Identifikation af sjældne skabelon eller lave koncentrationer af skabelon med digital dråbe PCR. (C) Over rigelig skabelon indkapsling resulterer i et variabelt antal skabelon molekyler pr dråbe. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at demonstrere nytten af PTE, brugte vi det til at udføre mikrofluidisk-fri digital PCR11. Ved hjælp af processen indkapslede vi en prøve bestående af S. cerevisiae genomisk DNA og termocyklusserede den. I digital PCR bliver dråber, der indeholder forstærkede mål, fluorescerende, mens de uden forbliver svage. En fluorescerende dråbe angiver således et mål, der muliggør direkte kvantificering af mål ved at tælle positive dråber (figur 4A). Antallet af fluorescerende dråber skalerer således med målmolekylerne, hvilket giver få positive, når målet er sjældent (figur 4B) og mange, når det er rigeligt (figur 4C). Som med indkapsling af andre diskrete komponenter følger målindkapslingen en Poisson-fordeling, der gør det muligt at omdanne den positive dråbefraktion til målkoncentrationen (Figur 4D), hvilket viser evnen til at udføre digital PCR med PTE11.
Figur 5. Demonstration af digital dråbe PCR ved hjælp af kommercielt tilgængelige PAA. (A) Fluorescerende billeddannelse af dråberne identificerer negative ikke-fluorescerende dråber. (B) Identifikation af lave koncentrationer af skabelon med digital dråbe PCR. (C) Identifikation af høje koncentrationer af skabelon med digital dråbe PCR. Klik her for at se en større version af dette tal.
Disse resultater kan gentages ved hjælp af kommercielt tilgængelige polyacrylamidpartikler (figur 5) og demonstrerer PTE's evne til at udføre standard digital PCR med kommercielt tilgængelige polyacrylamidpartikler og opnå nøjagtige målinger over samme område.
Supplerende fil. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
PTE bruger partikler til at indkapsle prøver i monodispersed dråber ved hvirvlende. Ud over sin enkelhed og tilgængelighed giver PTE flere yderligere fordele, herunder at tillade store mængder dråber at blive genereret øjeblikkeligt. Desuden kan processen udføres i et isoleret rør, hvilket fjerner behovet for at overføre prøver til mikrofluidiske enheder, strømline den samlede arbejdsgang og begrænse mulighederne for prøveforurening eller tab. De templaterende partikler giver også et middel til at konstruere indholdet af de resulterende dråbereaktioner. For eksempel kan partikelstørrelse, kemi og vådhed konstrueres til målrettet biomolekyle eller cellefangst, mens funktionelle moietier som enzymer, actives eller nukleinsyrer kan vises på partikel for at lette reaktioner, såsom for enkeltcellesekvensering eller funktionel karakterisering. Selv om tilgangen er fleksibel, er der ikke desto mindre vigtige begrænsninger for dens anvendelse. For eksempel er det i øjeblikket ikke muligt at udføre dråbetilsætninger, som ofte udføres med mikrofluidics, hvilket kræver, at alle reaktionskomponenter introduceres før indkapsling; Dette kræver, at reagenser er kompatible og stabile, indtil dråberne kan genereres, og i tilfælde af besværlige kombinationer kan man ofte løses ved hurtigt at blande og emulgere prøven på is. Alternativt kan reaktive komponenter, der kan udløses eksternt med lys eller varme, bruges13. PTE giver således en fleksibel og skalerbar metode til udførelse af dråbeanalyser, der er tilgængelige for ikke-eksperter. Dette, kombineret med sin medfødte enkelhed og fleksibilitet, gør PTE ideel til udførelse og udvikling af mange dråbe applikationer.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde med at udvikle denne protokol blev støttet af National Institutes of Health (R01-EB019453-02), kontoret for direktøren for National Intelligence, Intelligence Advanced Research Projects Activity gennem Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, Defense Advanced Research Projects Agency gennem Texas A &M University (W911NF1920013) og Centers for Disease Control and Prevention gennem Johns Hopkins University Applied Applied Fysiklaboratoriet (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). De synspunkter og konklusioner, der er indeholdt heri er forfatternes og bør ikke fortolkes som nødvendigvis repræsenterer de officielle politikker, enten udtrykt eller underforstået, af ovennævnte organisationer eller den amerikanske regering. Den amerikanske regering er bemyndiget til at reproducere og distribuere genoptryk til statslige formål uanset enhver copyright anmærkning deri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
| 0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
| 1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
| 27 gauge needles | BD | 305109 | |
| 3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
| 3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
| Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
| FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
| N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
| polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
| fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
| Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
| SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
| Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
| Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
| Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
| Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
| Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
| Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
| EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
| EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
| SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
| Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |
References
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: A tool for biology, chemistry, and nanotechnology. Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Gielen, F., et al. Ultrahigh-throughput-directed enzyme evolution by absorbance-activated droplet sorting (AADS). Proceedings of the National Academy of Sciences of USA. 113 (47), 7383-7389 (2016).
- Mai, S., Murphy, T. W., Lu, C. Microfluidics for genome-wide studies involving next generation sequencing. Biomicrofluidics. 11 (2), 021501 (2017).
- Olmedillas-López, S., García-Arranz, M., García-Olmo, D. Current and emerging Applications of Droplet Digital PCR in Oncology. Molecular Diagnosis and Therapy. 21 (5), 493-510 (2017).
- Tong, Y., Shen, S., Jiang, H., Chen, Z. Application of Digital PCR in Detecting Human Diseases Associated Gene Mutation. Cellular Physiology and Biochemistry. 43 (3), 1718-1730 (2017).
- Yan, Y., et al. Evaluation of droplet digital PCR for non-invasive prenatal diagnosis of phenylketonuria. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (27), 7115-7126 (2019).
- Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y.
- The, S., Lin, R., Hung, L., Lee, A. P.
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9, 541-544 (2012).
- Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing. Molecular Cell. 58 (4), 610-620 (2015).
- Hatori, M. N., Kim, S. C., Abate, A. R. Particle-Templated Emulsification for Microfluidics-Free Digital Biology. Analytical Chemistry. 90 (16), 9813-9820 (2018).
- Panda, P., et al. Stop-flow lithography to generate cell-laden microgel particles. Lab Chip. 8 (7), 1056-1061 (2008).
- Yozwiak, C. E., Hirschhorn, T., Stockwell, B. R. Towards a microparticle-based system for pooled assays of small molecules in cellular contexts. ACS Chemical Biology. 13 (3), 761-771 (2018).
