Summary
ここでは、成熟ヒト網膜オルガノイドを生成し、それらを光受容体毒性アッセイに利用して、加齢性網膜変性疾患黄斑毛細血管拡張症2型(MacTel)の医薬品候補を特定するための段階的なプロトコルを紹介します。
Abstract
オルガノイドは、細胞培養の汎用性とスループットを備えたヒト組織の状況下で、疾患メカニズムと治療法を直接研究するための有望なプラットフォームを提供します。成熟ヒト網膜オルガノイドは、加齢性網膜変性疾患黄斑毛細血管拡張症2型(MacTel)の潜在的な薬物治療法をスクリーニングするために利用されています。
我々は最近、MacTelが非定型脂質種であるデオキシスフィンゴ脂質(deoxySL)のレベルの上昇によって引き起こされる可能性があることを示しました。これらの脂質は網膜に有毒であり、MacTel患者に発生する視細胞喪失を引き起こす可能性があります。デオキシSL光受容体毒性を予防する薬剤をスクリーニングするために、非MacTel誘導多能性幹細胞(iPSC)株からヒト網膜オルガノイドを作製し、機能的に成熟した光受容体を含む網膜の神経系譜由来細胞をすべて発達させる有糸分裂後年齢まで成熟させました。網膜オルガノイドをデオキシSL代謝物で処理し、免疫組織化学を用いて視細胞層内のアポトーシスを測定した。この毒性モデルを用いて、デオキシSL誘発性光受容体死を予防する薬理学的化合物をスクリーニングした。標的候補アプローチを使用して、高コレステロールおよびトリグリセリドの治療に一般的に処方される薬であるフェノフィブラートも、網膜の細胞におけるデオキシSL毒性を予防できると判断しました。
毒性スクリーニングは、視受容体死を防ぐことができるFDA承認薬を特定することに成功しました。これは、テストされた疾患関連性の高いモデルにより、直接実用的な発見です。このプラットフォームは、網膜疾患における将来の治療法発見のために、任意の数の代謝ストレッサーおよび潜在的な薬理学的介入をテストするために簡単に変更できます。
Introduction
細胞培養および動物モデルにおけるヒト疾患のモデリングは、薬理学的治療法の発見、改変、および検証のための非常に貴重なツールを提供し、候補薬から承認された治療法に進むことを可能にしました。in vitroモデルと非ヒトin vivoモデルの組み合わせは、長い間医薬品開発パイプラインの重要な要素でしたが、新薬候補の臨床性能を予測できないことがよくあります1。単純なヒト細胞単培養と臨床試験の間のギャップを埋める技術の開発が明らかに必要です。自己組織化された3次元組織培養であるオルガノイドの最近の技術的進歩により、モデル化する組織への忠実度が向上し、前臨床医薬品開発パイプライン2の有望なツールとなっています。
非ヒトin vivoモデルに対するヒト細胞培養の主な利点は、ヒトとマウスなどの高次脊椎動物の間でもかなり異なる可能性のあるヒト代謝の特定の複雑さを再現できることです3。ただし、この特異性は、組織の複雑さが失われると影が薄くなる可能性があります。これは、複数の細胞型が複雑に織り交ぜられ、単一培養では複製できない細胞サブタイプ間の独特の共生代謝相互作用を有する網膜組織の場合です4。ヒトオルガノイドは、複雑なヒト組織の複製に細胞培養のアクセシビリティとスケーラビリティを提供し、これらの疾患モデリングプラットフォームの欠陥を克服する可能性を秘めています。
幹細胞由来の網膜オルガノイドは、ヒト神経網膜の複雑な組織のモデリングに特に忠実であることが証明されています5。これにより、網膜オルガノイドモデルは網膜疾患の研究と治療のための有望な技術になりました6,7。これまで、網膜オルガノイドの疾患モデリングの多くは、網膜オルガノイドが疾患の原因となる遺伝的変異を持つiPS細胞株に由来する単一遺伝子網膜疾患に焦点を当ててきました7。これらは一般に、発生表現型として現れる浸透性の高い突然変異です。遺伝子変異や環境ストレッサーが正常に発達した組織に影響を与える老化疾患については、あまり効果的に行われていません。老化の神経変性疾患は、複雑な遺伝的遺伝と、短期間の細胞培養を使用してモデル化することが本質的に困難な環境ストレッサーからの寄与を持つ可能性があります。しかし、多くの場合、これらの複雑な疾患は、完全に発達したヒト組織でテストすると、老化の神経変性疾患に関する強力な洞察を提供することができる一般的な細胞性または代謝性ストレッサーに合体する可能性があります8。
遅発性黄斑変性疾患である黄斑毛細血管拡張症II型(MacTel)は、一般的な代謝異常で合体する遺伝的に複雑な神経変性疾患の好例です。MacTelは、黄斑部の光受容体とミュラーグリアの喪失をもたらし、中心視力の進行性の喪失をもたらす、老化の珍しい網膜変性疾患です9,10,11,12,13。MacTelでは、未決定の、おそらく多因子の遺伝的遺伝が患者の循環セリンの一般的な減少を引き起こし、その結果、デスフィンゴ糖脂質(deoxySL)と呼ばれる神経毒性脂質種が増加します14,15。deoxySLの蓄積が網膜に毒性があることを証明し、潜在的な医薬品治療法を検証するために、ヒト網膜オルガノイドの光受容体毒性をアッセイするためのこのプロトコルを開発しました14。
ここでは、ヒト網膜オルガノイドを鑑別し、オルガノイドを使用した毒性およびレスキューアッセイを確立し、結果を定量化するための特定のプロトコルの概要を説明します。疾患原因が疑われるデオキシSLの組織特異的毒性を特定し、デオキシSL誘発網膜毒性の潜在的な治療のための安全なジェネリック医薬品であるフェノフィブラートの使用を検証する成功例を提供します。以前の研究では、フェノフィブラートが患者のデオキシSLの分解を増加させ、循環デオキシSLを低下させる可能性があることが示されていますが、デオキシSL誘発網膜毒性の低減におけるその有効性はテストされていません16,17。具体的な例を紹介しますが、このプロトコルは、網膜組織に対する任意の数の代謝/環境ストレッサーおよび潜在的な治療薬の効果を評価するために利用できます。
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Protocol
1. iPS細胞/ESCの解凍・継代・膨張
注:すべての細胞培養ステップで、ベストプラクティスを使用して滅菌細胞培養を維持します。
- 6ウェル細胞培養プレートを基底膜マトリックス培地でコーティングします。
- この培地を1倍調製するには、製品仕様に従うか、75 μLのコールドマトリックス培地を9 mLのDMEM/F12で希釈します。1ウェルあたり1.5 mLの新しく調製した1x培地を6ウェルプレートに加えます。37°Cで30分間インキュベートします。
- 基底膜マトリックス培地を吸引し、各ウェルを3 mLのDMEM/F12ですすいでください。2 mLのDMEM/F12を加え、使用するまで37°Cでインキュベートします。プレートは準備した日に使用してください。
- 岩石抑制剤(Y-27632二塩酸塩)の10mMストック溶液をPBSに調製し、使用するまで-20°Cで保存する。
- iPSC/ESCのバイアルをDMEM/F12培地に解凍し、400 x g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットをmTeSR培地に再懸濁する。細胞のプレート1バイアルを、10 μMの岩石阻害剤(Y-27632二塩酸塩)を含むmTeSR培地でコーティングされた6ウェルウェルにかけ、インキュベーター内で一晩インキュベートします。翌日、メディアを吸引し、mTeSRだけを追加します。
メモ: 継代まで毎日メディアを交換してください。 - 500 mL の PBS で 0.5 M EDTA を 500 μL に希釈して、0.5 mM EDTA を PBS で調製します。
- 継代細胞は80〜90%のコンフルエントに達したとき。細胞の増殖速度に応じて、ウェルあたり1:3または1:6で細胞を分割します。
- プレートから接着細胞を除去するには、培地を吸引し、PBS中の0.5 mM EDTAとともに室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、EDTA溶液を取り出し、p1000ピペットで1 mLのmTeSR培地を細胞に強制的に排出して細胞を持ち上げます。
- mTeSR培地および細胞を吸引し続け、最大5倍まで強制的に排出し、付着した残りの細胞を除去する。細胞をmTeSR培地で新鮮な基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート上にプレートします。プレートが再び80〜100%のコンフルエントに達するまで、毎日メディアの交換を続けます。
- 細胞が完全な6ウェルプレートに拡大し、80〜100%のコンフルエントに達したら、1つのウェルを確保して、その後の分化のために細胞株を拡張するか、凍結保存のために凍結します。残りの5つのウェルを使用して、胚様体を作ることによって分化プロセスを開始します。
2. 胚様体(EB)の作成
注:EB形成および分化培地レシピは、Cowan et al.5、Ohlemacher et al.18、およびZhong et al.19のプロトコルから導き出された。
- 以下に説明するように、1xディスパーゼ溶液と神経誘導培地(NIM)を準備します。
- 粉末をDMEM/F12に溶解することにより、ディスパーゼの5xストック溶液10 mg/mLを調製します。滅菌フィルターは0.22μmフィルターを使用した。1 mL アリコートは、使用するまで -20 °C で保存してください。
- 5xディスパーゼ溶液を使用して、DMEM/F12で2 mg/mLディスパーゼの1 mL /ウェルを調製します。溶液を37°Cで30分間温めます。
- DMEM/F12に1%N2サプリメント、1%MEM NEAA、および2 mg/mLヘパリンを180 U/mgで補給してNIMを調製します。
- 16 mL の mTeSR:NIM (12mL:4mL) 溶液の 3:1 ミックスを調製し、室温まで温めます。
- 分化した細胞を取り除き、温かいディスパーゼ溶液を加えます。
- iPSC/ESC細胞培養から分化細胞を除去します。解剖スコープの下で、p10ピペットチップで不透明な白いコロニーをこすり落とします。培養ウェルからmTeSR培地を吸引除去します。これにより、削り取られたばかりの分化した塊が取り除かれます。
- 予熱したDispase溶液を直ちに加え、顕微鏡下で細胞コロニーの端の大部分が丸くなり始めるまで37°Cでインキュベートします。これには4〜8分かかります。
注:Dispaseでの細胞のインキュベーション時間は、ラボごとに決定する必要があります。持続時間は細胞株によって異なる可能性があり、3日以上播種された細胞にはより長いインキュベーションが必要です。コンフルエントに達するまでに3日以上かかる成長の遅いiPSC/ESCは、プレートへの強度を高めて接着し始め、細胞を持ち上げるのが困難になります。増殖が遅い細胞の場合は、細胞を1:2で継代して完全な6ウェルプレートに増殖させ、プレーティングからコンフルエントまでの時間を短縮します。
- 溶液を吸引し、ウェルあたり少なくとも2 mLのDMEM/F12培地を静かに戻します。DMEM/F12培地をウェルの側面にゆっくりと加え、細胞がはがれないように注意します。
- DMEM/F12培地を吸引し、新鮮な1 mLのDMEM/F12を細胞に直接強制的に戻し、細胞コロニーをプレートから持ち上げます。p1000ピペットでDMEM/F12をウェル内で繰り返し吸引し、最大5倍まで強制的に排出し、できるだけ多くの細胞コロニーを除去します。
注:分化/分化したiPSC/ESCは、未分化のiPSC/ESCよりもプレートに付着します。繰り返しピペッティングしても剥がれない細胞は、残すのが最適です。過剰なピペッティングは細胞を殺し、EB生産の効率を低下させます。細胞塊は、塊あたり100〜400個の細胞を有するであろう。
- DMEM/F12培地を吸引し、新鮮な1 mLのDMEM/F12を細胞に直接強制的に戻し、細胞コロニーをプレートから持ち上げます。p1000ピペットでDMEM/F12をウェル内で繰り返し吸引し、最大5倍まで強制的に排出し、できるだけ多くの細胞コロニーを除去します。
- 浮遊コロニーを15 mLコニカルチューブに移し、ウェルあたりさらに1 mLのDMEM/F12培地でウェルをすすぎ、残りの浮遊コロニーを収集します。
- 浮遊コロニーを重力によって5分以内に沈降させます。落ち着いたら、1〜2 mLを除くすべての上清を取り除きます。底の柔らかいペレットをかき混ぜないように注意してください。
- ペレットを予熱した3:1 mTeSR:NIM培地に再懸濁し、超低接着T75フラスコに移します。一晩インキュベートしてEBを形成させます。これは、分化の0日目と見なされます。
- 培地を徐々にNIMに変更して、EBの神経前駆細胞への分化を開始します。
- 翌日、培地を取り出し、10 mLの1:1 mTeSR:NIM培地と交換します。フリーフローティングEB培養から培地を除去するには、フラスコを上に傾けて、EBがフラスコの下隅に集まるようにします。上清を吸引し、底部のペレット中のEBを吸引しないようにします。
- 翌日、培地を10 mLの1:3 mTeSR:NIM培地と交換します。
- 翌日、メディアをフル NIM メディアと交換します。ディスパーゼ処理後7日まで、NIM培地で2日ごとに培地交換を続けます。
3. EBのプレーティングと神経網膜分化の開始
- Dispase処理の1週間後、成長因子を低減した基底膜マトリックス培地でコーティングした6ウェルプレート上にフリーフローティングEBをプレート化します。プレートをコーティングするには、手順1.1を参照してください。
- 使用済み培地をEBから吸引し、12 mLのNIMと交換します。
- EB含有培地を攪拌してEBを再懸濁し、培地の6分の1(2 mL)をすばやく取り出して1つのウェルに分注することにより、EBが各ウェルに均等に分布するようにします。残りのウェルについても繰り返します。
- インキュベートする前に、プレートを前後に、次に左右にゆっくりと振って、EBを均等に分配します。EBが途中で凝集すると、適切に区別されません。
注:めっき密度は差別化に重要です。ウェルあたり30EBを超えるプレートを必ず行ってください。EBの生産が効率的でない場合は、EBをより少ないウェルに分配します。
- NIM メディアを使用してメディアを毎日交換します。ウェル内の培地のレベルを~3 mLに保ちます。培地を交換するときは、めっきしたEBを乾燥させないように1 mLを除くすべての培地を取り除き、細胞がプレートから浮き上がらないように2 mLの培地をウェルの側面にそっと加えます。
- EBのプレーティングから9日後に、2日間かけて培地をNIMから網膜分化培地(RDM)に変更し始めます。
- 48%DMEM/F12(1:1)と48%DMEMにビタミンAを含まない2%B27サプリメント、1%MEM NEAAおよび1%ペンストレプトを混合してRDMを調製します。フィルターは0.20μmフィルターを使用して滅菌します。RDMは4°Cで最長1ヶ月間保存できます。
- 初日は、メディアを NIM:RDM の 1:1 ミックスに切り替えます。2 日目に、メディアを RDM に変更します。その後のすべての日、細胞RDMを供給します。
注:今後数週間で、メッキされたEBは神経網膜前駆細胞を形成し、目に見えて色素性のあるRPEを生成し始めます。
4. 自由浮遊オルガノイドの作製と浮遊オルガノイド培養の維持
- 最初のディスパーゼ処理の28日後(EBメッキの21日後)に滅菌メスを使用してEBをフラグメントメッキし、1〜2 mm2 グリッドをメッキEBに切断しました。これにより、網膜前駆細胞コロニーが小さな塊に分離されるため、開発の後半で、中心での不十分な栄養交換から大きくなりすぎたり、壊死したりすることはありません。
- メッキされたEBを取り外します。
- これを行うには、まず各ウェルに2 mLのRDMを追加します。次に、p1000ピペットを使用してウェルから~1000 μLの培地を吸引します。次に、先端を完全に沈めた状態で、メディアをメッキされたEBに直接強制的に排出します。
- すべてのセルがプレートから持ち上げられるまで、これを繰り返します。メディアの排出中はチップを水没させたままにし、気泡を避けるためにピペットプランジャーを最初のストップを超えて押し込まないでください。
- 新生剥離したEBチャンクを滅菌プラスチック125 mL三角フラスコに再懸濁し、フラスコに~40 mLのRDM培地を充填します。フラスコを標準的なインキュベーターに入れたオービタルシェーカーに置きます。シェーカー速度を130〜140 RPM(速度設定3)に設定します。
注:シェーカーでオルガノイドを培養すると、高濃度のオルガノイドで培養する際にオルガノイドがくっつくのを防ぐことができます。バイオリアクターも同じ目的を達成しますが、シェーカーはより安価です。 - 培地を部分的に交換してオルガノイドを給餌し、培地の黄色化に応じて、週に2〜3回、約12 mLのRDMを交換します。初期のオルガノイドは多くの摂食を必要としませんが、成長するにつれて、より多くの培地でより頻繁な培地交換が必要になります。
- 2週間ごとにオルガノイドを剪定して、非網膜、生い茂った、死にかけているオルガノイドを除去します。これにより、培地の消耗を防ぎ、残りの網膜オルガノイドの健康を改善します。
- 5 mLピペットを使用して、フラスコから6ウェルプレートまたは10 cmディッシュに細胞を移します。層状神経上皮を示すオルガノイドを保持します(図1A、アスタリスク)。これらのオルガノイドは透明で白色です。
- 形成不良または生い茂った網膜オルガノイド、および非網膜オルガノイドを5 mLピペットで選別して除去します。これらは一般的に不透明で黄色がかっています(図1A)。また、層状神経上皮のように見えないものも取り除きます。最初の数回の剪定は労働集約的ですが、オルガノイドが大きくなり均質になるにつれて、その後は毎回はるかに簡単になります(図1B)。
5.成熟したオルガノイドを維持し、有糸分裂後の網膜組織に分化させる
- EB形成のための最初のDispase処理後56日目(8週目)(フラスコ内で除去されたEBを培養してから28日後)に、オルガノイド培地をRDM+に変更します。これは、網膜組織として完全に成熟したオルガノイドに追加の栄養素を提供します。
- PBSで100 mMタウリンを準備します。アリコートは使用するまで-20°Cで保存してください。
- RDMに10%FBS、100 μMタウリン、および2 mMの市販グルタミンサプリメントを補給してRDM+を準備します。フィルターは0.20μmフィルターを使用して滅菌します。
- RDM+メディアの交換を週に2〜3回続けます。
- 17〜18週目(ディスパーゼ処理後)に、5 mLピペットを使用して、オルガノイドを三角フラスコから超低アタッチメント6ウェルプレートに移します。最初の1週間は、オルガノイドがくっつかなくなるまで、毎日オルガノイドを剪定して分離し続けます。最適密度はウェルあたり10〜15個のオルガノイドです。週に2〜3回メディアを交換してください。
注:オルガノイドが頻繁に互いに接着する場合、または培地交換の間に培地が非常に黄色に変わる場合は、ウェルあたりのオルガノイドの数を減らします。 - オルガノイドは、神経網膜細胞が全体に存在する18週目5 時までに完全に有糸分裂後になることを期待してください。24週目までに、オルガノイドの外側に初歩的な外側セグメントが形成されていることを確認します。26〜28週目までに、外側のセグメントがオルガノイドの外側に厚くなっていることを確認します(図1C)。26週目以降、オルガノイドが成熟分化状態を示す外側セグメントを定義したときに毒性アッセイを実行します。
注:毒性アッセイには、高分化型網膜オルガノイドのみを使用してください。明確に定義された外側セグメントを持つオルガノイドに対して毒性アッセイを実行すると、それらの同定が可能になります。
6.デオキシスフィンガニン(デオキシSA)と薬物治療
注:ここに示されているのは、4日間にわたってデオキシSA毒性を救済するためのフェノフィブラートの単回治療です(図2)。しかしながら、オルガノイドに添加されるデオキシSAの濃度、オルガノイドに対するデオキシSA処理の期間、および毒性をレスキューするために使用される薬物の種類14 は、毒性および毒性レスキューをアッセイするための実験的必要性に従って変更することができる。
- エタノール中のデオキシSAの1 mMストック溶液を調製します。-20°Cで1ヶ月間保存します。あるいは、デオキシSAのストック溶液をDMSO中で調製することができる。
- デオキシSAの段階希釈を実行して、薬物レスキューのためのデオキシSAの適切な毒性濃度を決定します。
注:まず、レスキュー効果を測定するのに十分な細胞死をもたらすデオキシSAの濃度を決定します。濃度が高すぎると、毒性反応によりオルガノイドが崩壊し、救助は観察されません。毒性反応が低すぎると、有意な救助効果を観察することが困難になります。デオキシSA毒性反応は、ラボごとおよびデオキシSAのバッチ間で異なる場合があります。- 1 mM デオキシ SA ストック溶液を 3 mL の RDM+ でそれぞれ 0.5 μM、1 μM、および 2 μM の濃度に希釈します。3 μLのエタノールをRDM+に加え、対照処理を調製します。
- 解剖顕微鏡下で、滅菌プローブを使用して、グループごとに最低5つのオルガノイドを含む4つのグループのオルガノイドを選択します。グループを超低アタッチメント6ウェルプレートの別々のウェルに分割します。ほぼ同じサイズと形状のオルガノイドを選択します。
- オルガノイドからできるだけ多くのRDM+を吸引します。オルガノイドの各ウェルに、RDM+中のデオキシSAを1濃度加えます。オルガノイドの4番目のウェルにビヒクルコントロールを追加します。
- デオキシSAまたはビヒクルで2日間培養した後、培地をRDM+で新たに調製した対応するデオキシSA希釈液と交換します。
- 治療の4日目に、ステップ7に進み、細胞死のためにオルガノイドを処理およびアッセイします。デオキシSA濃度を選択したら、ステップ6.3に進み、フェノフィブラートで治療します。.
注:選択されたデオキシSA治療群における標的細胞死は、10,000μm2あたり5〜20個のTUNEL陽性細胞です。オルガノイドは、治療の過程でプローブの接触によって崩壊してはなりません。
- 選択された毒性用量のデオキシSAおよびフェノフィブラートでオルガノイドを処理する。
- DMSO中のフェノフィブラートの40 mMストック溶液を調製します。-20°Cで最長1年間保管してください。
- 薬物治療培地の調製:3 mL RDM+で、1 mMデオキシSAストック溶液を1 μMデオキシSAに希釈し、40 mMフェノフィブラートストック溶液を20 μMに希釈します。
- デオキシSA処理培地の調製:3 mL RDM+で、1 mMデオキシSAストック溶液を1 μMデオキシSAに希釈し、1.5 μLのDMSOを加えます。
- コントロール培地の準備:3 mL RDM+に、3 μLのエタノールと1.5 μLのDMSOを加えます。
- 滅菌プローブを使用した解剖顕微鏡下で、グループごとに最低5つのオルガノイドを含む3つのグループのオルガノイドを選択します。グループを超低アタッチメント6ウェルプレートの別々のウェルに分割します。
- 調製した処理液(デオキシSA、デオキシSA +フェノフィブラート、またはコントロール)をオルガノイドに追加します。2日後、対応するデオキシSA /フェノフィブラート/コントロール溶液を補充した新しく調製したRDM+でウェル内の培地を交換します。
- 処置の4日目にステップ7に進み、細胞死についてオルガノイドを処理およびアッセイする(図2)。
7. オルガノイドの包埋と凍結切片
- 1 mLの16%PFAアンプルを3 mLのPBSに加えて、新鮮な4%PFAを準備します。
- オルガノイドからRDM+培地を取り出し、PBSで一度すすいでください。オルガノイドからできるだけ多くのPBSを除去します。新たに調製した4%PFA(PBS溶液)2 mLをオルガノイドに加え、室温で15分間インキュベートします。
- 15分間のインキュベーション後、オルガノイドを2 mLのPBSで2回すすぎ、PBSで10分間洗浄します。
注意: 化学ヒュームフードで固定し、PFA溶液とそれに続く2回のPBSリンスを、ヒュームフードに保管されている適切にラベル付けされたPFA廃棄物容器に廃棄します。 - すべてのPBSを吸引し、固定オルガノイドにPBS中の20%スクロースを加えます。オルガノイドがショ糖溶液に混合され、上部のPBSバブルに残っていないことを確認してください。オルガノイドは、スクロース溶液の底に沈むまで、つまり室温で~1時間、スクロース溶液中に保持します。固定オルガノイドは、ショ糖溶液中で4°Cで一晩保存することができる。
- オルガノイドを凍結切片型のOCT溶液に埋め込みます。条件ごとに複数のオルガノイドを1つの型に埋め込むことができます。オルガノイドの最適な網膜領域がクライオスタット上で断面化され、オルガノイドの中央がすべてほぼ同じ平面になるようにオルガノイドの向きを調整します。包埋されたオルガノイドを-20°Cで凍結します。 包埋オルガノイドは、-80°Cで数年間保存できます。
注:オルガノイドは凍結OCTでは見るのが難しいです。RPEクラスターをブレードに面するモールドの側に向け、オルガノイドの識別を容易にします。 - 凍結切片オルガノイドを厚さ10〜14μmの切片に、切片をポリLリジン処理スライドに接着します。凍結切片化中に、顕微鏡下でスライドを繰り返しチェックして、オルガノイドの中央を含む切片を特定します。すべての層が均等に表現されているオルガノイドの中央スライスのみを収集します(図2A-C、図3)。切片化されたスライドは、-80°Cのスライドボックスに数年間保存できます。
注:オルガノイドの末端で採取されたスライスは、最も外側の光受容体をオーバーサンプリングするため、定量には適していません。平均サイズのオルガノイドは、層状網膜層の断面を表すオルガノイドの中央の10〜15スライスを提供します。
8. アポトーシス細胞のTUNEL染色
- 凍結スライドを37°Cで30分間解凍します。 スライドをすぐに37°Cに置くことで結露を防ぎます。純水に浸した組織サンプルは、組織を歪める可能性があります。37°Cのインキュベーションでは、スライドガラスへの組織の接着も改善されます。
- 疎水性ペンを使用して、組織切片の周りのスライドガラスに連続した境界線を作成します。これにより、境界が提供され、少量の溶液で適切な固定と抗体インキュベーションが保証されます。約100〜200μL(容量はこぼれることなく疎水性境界領域を満たす)の新たに調製した4%PFAを20分間加えます。化学ヒュームフードで固定し、ドラフトに保管されている適切にラベル付けされたPFA廃棄物容器にPFA溶液を廃棄します。
- スライドをPBSで一度すすぎ、PBSで室温で25分間洗浄します。
- TUNEL混合物を調製する。in situ細胞死検出キットからバイオレットとブルーの両方のバイアルを解凍します。100 μLのバイオレットバイアル溶液(ネガティブコントロールに使用できます)を取り除き、バイオレットバイアルからの残りの450 μLの溶液を青いバイアルからの50 μLの溶液と組み合わせます。よく混ぜて暗所に保管してください。バイアルの各セット(合計500μL)は、5〜10枚のスライドを染色できます。
- 組織スライスを透過処理する。
- 透過処理液の調製:0.1%TritonX-100および0.1%クエン酸ナトリウムを含むPBS
- サンプルスライドからPBSを除去し、透過処理液をサンプルに追加します。氷ブロック上または4°Cで2分間インキュベートします。 その後、PBSで一度すすぎ、PBSで10分間洗います。
- PBSを取り除き、折りたたまれたティッシュの角を使用してできるだけ多くの溶液を乾燥させます。疎水性ペンによって描かれた領域のサイズに応じて、50〜100μLの調製されたTUNEL混合物をサンプルに加えます。ガラスカバースリップで覆い、暗所で37°Cで1時間インキュベートします。
注:以下の手順のすべてのインキュベーションと洗浄は、蛍光色素の漂白を防ぐために暗所で行う必要があります。暗い箱を使用するか、スライドをアルミホイルで覆って光を遮断します。 - 光受容体に標識を付けます。PBSで一度すすぎ、PBSで20分間洗浄します。PBSを除去し、0.1%トゥイーンおよび5%ロバ血清を含むPBSで1:500に希釈した一次リカバーイン抗体(ウサギ抗リカバーイン)を追加します。4°Cで一晩インキュベートします。
- 一次抗体を除去した後、PBSで一度すすぎ、PBSで20分間洗浄します。二次抗体であるオレンジ色または赤色の蛍光色素を含むロバ抗ウサギを加え、PBSで0.1%トゥイーンおよび5%ロバ血清で1:1,000に希釈し、室温で2時間インキュベートします。PBSで一度すすぎ、PBSで20分間洗浄します。PBSに1:1000でDAPIを加え、室温で10分間インキュベートします。
- PBSで一度すすぎ、PBSで20分間洗浄します。PBSを取り外し、封入剤を追加します。カバースリップを追加し、マニキュアで密封し、暗所で乾かします。スライドは、暗い容器の中で4°Cで最大1週間保存できます。
注意: 最高の画質を得るには、翌日画像を撮ります。
9.オルガノイドスライスのイメージングと死の定量化。
注:イメージングには、3つの蛍光色素チャンネルを区別する機能を備えた共焦点顕微鏡が必要です。この実験では、緑(Alexa Fluor 488)、オレンジ(Alexa Fluor 555)、UV(DAPI)チャンネルを使用します。蛍光色素の任意の組み合わせを使用して、放出が他のチャンネルにブリードしないようにすることができます。
- イメージングと定量のための網膜切片を見つけます。顕微鏡の低倍率(5倍または10倍)で、光受容体の細胞質を標識するRecoverin染色と、すべての細胞の核を標識するDAPI染色を使用して、スライスされたオルガノイドの領域が無傷で整形式で、オルガノイドの代表的な断面をサンプリングする平面内にあります(図2 および 図3).少なくとも数細胞の厚さの光受容体の明確な外顆粒層と、Recoverin染色のない別の明確な核層を持つセクションを見つけます(図2 および 図3)。
- 画像をフレームに収めます。顕微鏡の倍率を20倍の対物レンズに増やし、スライドをフレームに入れて、できるだけ多くの感光体層で画像を埋めます(図3)。
- Z 平面を設定します。Zスタックを画像化する顕微鏡を使用する場合は、スライスの深さ全体を画像化するためにZ範囲の上限と下限を設定します。実験セット内のすべての画像に同じZスタックの厚さを使用して、すべてのサンプルで同じ量の組織がアッセイされるようにします。Zスタックを画像化する顕微鏡を使用しない場合は、スライスの中央に画像の焦点を合わせます。
- Zスタック取得における蛍光色素の3つのチャンネルすべてをイメージングします。死にかけている細胞を確実に識別するには、3つのチャネルすべてが必要です。オルガノイドごとに1つの領域を画像化します。
- 画像セットを、ピクセルあたりの面積の比率を保持するファイル形式で保存します。
10. 死にかけている細胞の定量化
- FIJI(画像J)ソフトウェアで画像スタックを開きます。 「Bio-Formats インポートオプション 」ウィンドウで、「個別のウィンドウに分割」セクションの下のボックスが選択されていないことを確認します。整列した画像チャンネル間のスクロールは、セルを適切に識別するために重要です。
- [画像>スタック]をクリックしてZスタック画像セットをフラット化し、ドロップダウンメニューから[Zプロジェクト]を選択します。これにより、定量化用の新しい画像が作成されます。オルガノイドがZシリーズでイメージングされていない場合は、この手順をスキップしてください。
- Recoverin染色を示す画像チャンネルを選択します(この例では赤)。ツールバーの ポリゴン選択ツール をクリックして、画像内の感光体の連続領域の輪郭を描きます(図3A)。[ 分析]をクリックして>測定値を設定します。[測定 の設定 ]ポップアップウィンドウで、[ 領域]の横にあるボックスを選択し、[ 分析 ]をクリックして[ 測定 ]を選択して、死にかけている細胞をカウントする光受容体の面積を測定します(またはショートカットとして「m」を押します)。面積計測がポップアップ計測ウィンドウに表示されます。
- 以前に選択した感光体領域のTUNEL陽性核をカウントします(図3B、C)。ツールバーのポイントツールを右クリックして、マルチポイントツールを選択します。 TUNELチャンネルでのみ、DAPI陽性核と重複するTUNEL陽性染色およびリカバーイン染色をクリックします。チャンネルを切り替えて、陽性のセルを検証します。
- TUNEL陽性細胞の数を面積で割って、オルガノイドあたりの光受容体における細胞死の正規化値を取得します(図2D、E)。
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Representative Results
網膜オルガノイドは、非MacTelコントロールiPS細胞株から作製した。オルガノイドが培養26週に達した後、それらを選択して実験グループに分けました。オルガノイドを様々な濃度のデオキシSAで処理して、デオキシSAが光受容体に対して毒性であるかどうかを決定しました。0〜1μMの4つの濃度のデオキシSAをテストし(図2)、オルガノイドを8日間処理し、1日おきに培地を交換しました。デオキシSAに応答した細胞死は濃度依存的であり、わずか50 nMのデオキシSAで検出可能です(図2D)。試験した最高濃度の1 μMデオキシSAは、網膜オルガノイドの完全性を維持しながら堅牢な効果を示しました(図2B、D)。5μMデオキシSAの高濃度は、数日以内にオルガノイドの崩壊を引き起こした(データ示さず)。デオキシSA用量反応の結果は、将来の毒性実験のためのデオキシSAの最適濃度を決定した。1 μMのデオキシSA用量は、5 μMで観察されたように、毒性を過飽和させることなく実質的な細胞死をもたらしました。
デオキシSA誘発細胞死をレスキューするフェノフィブラートの能力をテストするために、網膜オルガノイドを1 μMデオキシSA、1 μMデオキシSAと20 μMフェノフィブラート、または無治療ビヒクルコントロールのいずれかで処理しました(図2A-C、E)。20 μMのフェノフィブラート処理は、網膜オルガノイドの光受容体におけるデオキシSA誘発毒性を防ぎ、4日間の処理後に細胞死を約80%有意に減少させました(図2A-C、E)16。追加の脂質改変薬は、デオキシSA毒性の完全な救済を示したフモノシン-B1を含む同じプロトコルを使用してテストされました。関連する脂質種も、光受容体細胞死をもたらす特定の下流スフィンゴ脂質代謝産物を同定するために試験された14。
図1:倒立光学顕微鏡下でのオルガノイドの代表的な明視野画像 。 (A)剥離後2日目の4週齢オルガノイドは、適切な網膜層状化(白*)または非網膜オルガノイドの発達を示す。(B)13週目にオルガノイドを開発する。(C)28週目の網膜オルガノイドで、網膜層がはっきりしていて、外側の感光体層から突き出た整形式の外側のセグメント(白いバー)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:細胞死の代表的な共焦点画像。 対照培地(A)、1 μMデオキシSA(B)、または1 μMデオキシSAと20 μMフェノフィブラート(C)のいずれかで4日間処理した後の網膜オルガノイドの視細胞層(Recoverin、赤)内の細胞死(TUNEL、緑)の代表的な共焦点画像。(D)さまざまな濃度のデオキシSAで網膜オルガノイド組織を処理した後のヒト光受容体の細胞死の定量化。(E)網膜オルガノイド組織をコントロール培地(n = 6)、1 μMデオキシSA(n = 22)、1 μMデオキシSA + 20 μMフェノフィブラート(n = 21)で処理した後のヒト光受容体の細胞死の定量化。*p<0.05, ***p<0.001、一元配置分散分析および事後テューキー検定。New England Journal of Medicine、Gantner、M.、Eade、K.、およびWallaceから得られたデータ。M.、他黄斑疾患および末梢神経障害におけるセリンおよび脂質代謝、381(15)、1422-1433、著作権©(2019)マサチューセッツ医学会。許可を得て転載。14この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:FIJIソフトウェアを使用して見た1 μMデオキシSAで処理した切片および染色されたオルガノイドの共焦点画像を示すスクリーンショット。 蛍光チャネルは、α-リカバーイン(A、赤)、TUNEL(B、緑)、およびDAPI(C、青)に分割されています。(A)感光体領域は、ツールバー(左上)で選択したポリゴンツールを使用して輪郭が描かれています。(B,C)ツールバーで選択したマルチポイントツールを使用して、感光体層内のTUNELポジティブ(B、緑)およびDAPIポジティブ(C、青)セルのセルカウント。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
差別化プロトコルのバリエーション
笹井芳樹のグループ20による自己形成光学カップの発明以来、多くの研究室は、ほぼすべてのステップで変化する可能性のある網膜オルガノイドを生成するためのプロトコルを開発してきました5、18、19、21。プロトコルの完全なリストは、Capowski et al.22にあります。ここで提供する鑑別プロトコルは、成熟した網膜オルガノイドを鑑別しようとするラボに適した出発点となる、シンプルで介入の少ないプロトコルです。ユーザーは、このプロトコルのバリエーションを調べて採用することをお勧めします。プロトコルバリエーションの一般的なステップは、EBの産生と早期分化、および効率を改善するためのBMP4、DKK-1、またはレチノイン酸などの分化因子の使用です5,19,23。
開発後期の多くでシェーカーでオルガノイドを培養することは、分化効率を高め、オルガノイドの取り扱いに費やす時間を短縮するための効果的なステップでした。バイオリアクターは同じ目的を達成します24が、使い捨ての三角フラスコを備えたシェーカーを使用することはより費用効果が高く、一般的な実験装置で行うことができます。オルガノイドを動員懸濁液に保持する主な利点は、成長中にプレート上にくっつくオルガノイドを分離する必要がなくなることです。懸濁培養はまた、より大きな栄養素交換を促進するため、オルガノイドは標準的なスチルプレート上のオルガノイドよりも大きくなる傾向があります。このため、ステップ4.1でメッキされたEBをできるだけ小さく断片化することから始めることをお勧めします。
成熟したレチナールオルガノイドを得るには、1回の培養で約6か月間分化する必要があるため、レチナールオルガノイドの毒性アッセイを実施するには、2D単培養を使用する場合に比べて時間がかかるように思われます。ただし、毒性アッセイは単一のコントロールラインで実行され、分化は日常的に設定できます。最初の6か月の投資の後、追加の実験とプロトコルの変更を行うためのオルガノイドの定期的な供給が遅滞なく手元にあります。1〜2か月ごとに2〜3ラウンドの網膜オルガノイド分化を開始すると、複雑で徹底的な一連の実験に十分な組織が提供されます。
オルガノイドは、標的薬物検査のための汎用性の高いモデルを提供します。
このプロトコルは、デオキシSL誘発細胞死を救済するための脂質改変薬の有効性をテストするための光受容体毒性アッセイについて説明しています。これはMacTelにおける疾患原因物質の薬理学的救助を示す特定のアプリケーションであるが、このプロトコルは、任意の数の侮辱(例えば、栄養欠乏、低酸素状態、光毒性)および薬理学的救助を試験するために利用することができる。したがって、他の網膜疾患をモデル化するように適合させることができる。私たち自身の研究では、これと同じプロトコルを使用し、スフィンゴ脂質代謝を直接ブロックするさまざまな関連するスフィンゴ脂質種と薬物を置換することにより、視細胞死につながる特定の毒性下流スフィンゴ脂質代謝物を決定することにより、MacTel病メカニズムへの洞察を提供することもできることを示しました14.変異型iPS細胞株の確立を必要とする遺伝子変異レベルで疾患をモデル化するのとは異なり、オルガノイドを使用して毒性代謝状態や環境ストレス因子をモデル化することで、豊富で容易に入手可能な組織源を持つ動的モデルとして共通の対照iPS細胞株を使用することができます。
ヒトオルガノイドモデルは、異なる細胞型が光受容体様細胞の単培養では再現できない独特の共生代謝相互作用を有する網膜における代謝疾患を研究する場合に特に有利である4。この複雑な代謝モデルにより、デオキシSLの毒性作用を直接ヒトに予防するフェノフィブラート薬の有効性を発見することができました。上昇したデオキシSLのマウスモデル14 (未発表データ)およびデオキシSL代謝のマウス胚性線維芽細胞培養モデルでは、フェノフィブラートは効果がないことが証明されました16。複雑なヒト組織モデルのコンテキストで薬物をテストすることで、効果的な治療法を特定し、マウスまたは単純な単一培養のみに依存していたら見逃されていたであろう効果のない治療法を割り引くことができます。
薬物スクリーニングの今後の展開
このプロトコルでは、最も豊富な細胞型である光受容体のアポトーシスを定量化します。しかし、他の網膜細胞型を特異的に標識する実証済みの抗体のいずれかを利用することにより、このプロトコルは、任意の網膜細胞型または細胞サブタイプ(例えば、錐体対桿体)における細胞死をアッセイするために変更可能である。組織スライス中のTUNEL染色を使用してアポトーシスを定量することの欠点は、細胞死を定量するための低スループット技術であり、候補薬の小さなリストのスクリーニングへのこのアッセイの適用を制限することです。非標的薬物ライブラリーのより大きなスクリーンは、IHCアプローチでは実現不可能であろう。より大きな薬物スクリーニングを容易にするためのこのプロトコルの将来の開発には、より容易に定量可能な細胞死マーカーの統合が必要になります。これらは入手可能ですが、網膜オルガノイドのサイズの不規則性、非網膜組織付属器の有無、および視細胞層の品質のばらつきにより、オルガノイド間で結果を正規化することは困難です。大規模な薬物ライブラリーをスクリーニングするためのヒトオルガノイド疾患モデルのスループットを向上させる将来の開発により、前臨床試験から承認された治療薬に進む薬物の発見、変更、および検証の能力が大幅に向上することを期待しています。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
ローウィー医学研究所の支援を受けています。MacTelプロジェクトを支援してくださったLowyファミリーに感謝します。Mari Gantner、Mike Dorrell、Lea Scheppkeの知的インプットと原稿の準備支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
References
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