농균 계 주사 (농업 주입) 프로토콜은 옥수수 묘목으로 여우 꼬리 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 클론의 접종을 위해 제시된다. 이러한 방식으로 접종은 바이러스 감염, 마커 유전자의 바이러스 유발 유전자 침묵, GFP의 바이러스 과발현으로 이어집니다.
Agrobacterium 기반 접종 접근 법은 식물 조직에 바이러스 벡터를 도입하는 데 널리 사용됩니다. 이 연구는 바이러스 벡터를 운반하는 Agrobacterium 와 결합 조직 근처 옥수수 묘목의 주입을위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 유전자 염기질 및 유전자 발현을 위해 설계된 재조합 폭스테일 모자이크 바이러스(FoMV) 클론이 이 방법을 최적화하는 데 사용되었고, 유전자 발현을 위해 설계된 재조합 사탕수수 모자이크 바이러스(SCMV)를 포함하도록 그 사용이 확장되었다. 유전자 단편 또는 코딩 서열은 이진 T-DNA 플라스미드 벡터 pCAMBIA1380으로 복제된 수정된 전염성 바이러스 게놈으로 삽입된다. 결과 플라스미드 구조는 Agrobacterium tumefaciens 변형 GV3101로 변환됩니다. 옥수수 모종4 일 정도 된 MgSO4 솔루션에서 재중단 된 박테리아와 콜옵티어 노드 근처에 주입 될 수 있습니다. Agrobacterium감염 시 바이러스 게놈을 운반하는 T-DNA는 옥수수 세포로 옮겨져 바이러스 RNA 게놈의 전사를 허용합니다. 재조합 바이러스가 식물 전체에 걸쳐 복제되고 체계적으로 확산됨에 따라, 표적 유전자의 침묵으로부터 인한 바이러스 증상 및 페노티픽 변화는 잎에서 관찰될 수 있다(les22) 또는 식물성 desaturase (pds)는 자외선을 가진 문턱 또는 유광액의 발현을 관찰할 수 있다. 바이러스를 검출하고 삽입물의 무결성을 동시에 평가하기 위해, RNA는 주입된 식물의 잎으로부터 추출되고 RT-PCR은 삽입된 서열을 운반하는 다중 복제 부위(MCS)를 측면에 있는 프라이머를 사용하여 수행된다. 이 프로토콜은 여러 옥수수 유전자형에서 효과적으로 사용되었으며 다른 바이러스 벡터로 쉽게 확장하여 옥수수에서 바이러스 벡터 도입을위한 접근 가능한 도구를 제공합니다.
많은 식물 바이러스의 전염성 클론은 바이러스 유발 유전자 침묵(VIGS), 유전자 과발현(VOX), 그리고 가장 최근에는 바이러스 지원 유전자 편집(VEdGE)1,2,2,3,4,5,6,7,9,10,11에 대해 설계되었습니다. . 새로운 바이러스 구조가 개발됨에 따라 이러한 수정된 바이러스로 식물 조직을 성공적으로 감염하는 방법도 고려해야 합니다. 식물에서 바이러스 감염을 시작하는 현재 방법은 입자 폭격을 포함, 체외 RNA 전사체 또는 DNA 클론의 문지름 접종, 혈관 천자 접종, 또는 Agrobacterium tumefaciens 접종 접종 (농림막)5,12,13,14,15,16,17 . 이러한 각 접종 방법은 주어진 식물 바이러스 시스템 내에서 비용, 특수 장비의 필요성 및 타당성을 포함하는 고유의 장점과 단점을 가지고 있습니다. 재조합 바이러스를 전달하기 위해 설계된 이진 T-DNA 구조를 포함하는 Agrobacterium 균주의 침투 또는 주입을 활용하는 방법은 간단하고 저렴하기 때문에 바람직하다. 그러나, 제아 메이스(maize)와 같은 단응종에 대한 상세한 농경화 방법은 부족하다.
바이러스 전달을 위한 농약의 첫번째 보고의 한은 1986년에 간행되었습니다, 콜리플라워 모자이크 바이러스의 게놈 (CaMV)가 T DNA 구조물로 삽입되고, 이 구조물을 운반하는 결과 Agrobacterium은 순무 식물에 문지르기 접종되었다18. 농업 접종을 위한 추가 방법은 그 이후로 개발되었습니다. 예를 들어, 폭스테일 모자이크 바이러스(FoMV)의 경우, 니코티아나 벤타미아나는 무분부한 소스를 제공하는 잎에서 바이러스 입자를 생성하는 중간 숙주로서 사용될 수 있다6. 감염된 N. benthamiana 잎을 사용하여 옥수수의 문지비 접종은 효율적이고 빠르며 간단하지만 중간 숙주의 사용은 모든 옥수수 감염 바이러스에 작동하지 않습니다. 예를 들어 슈가케인 모자이크 바이러스(SCMV)는 N. 벤타미아나를 감염시킬 수 없으며, 이 바이러스로부터 유래된 벡터에 대한 대체 접종원의 사용을 요구한다. 1988년, 옥수수 줄무늬 바이러스(MSV)를 함유한 아그로박테리움은 주사(agro주입)에 의해 옥수수 묘목으로 도입되었으며, 아그로박테리움 기반 접종 방법을 시연하는 것은 모노코브19에도 유용하다. 농업 주입이 초기 성공에도 불구하고, 옥수수에서이 기술을 활용 하는 몇 가지 연구 출판 되었습니다., RNA 바이러스와 VIGS에 대 한이 방법의 적용에 대 한 열린 질문을 떠나, VOX, 그리고 VEdGE 벡터20,21,22. 그러나, 모노코트 종에서 농사주입의 광범위한 사용은 유망한, 이 일반적인 접근은 오키드, 쌀 및 밀23,24,25,26,27,28에서 이용되었기 때문에.
이 프로토콜은 FoMV 및 Agrobacterium 균주 GV3101에 최적화되었으며 SCMV 벡터에도 적용되었습니다. FoMV는 56 모노코트와 디코 종을 포함하는 넓은 숙주 범위를 가진 potexvirus29입니다. FoMV는 6.2킬로베이스(kb) 양성 감각, 5개의 개방 판독 프레임(ORFs)에서 5개의 다른 단백질을 인코딩하는 단하나 좌초 RNA 게놈을 30,31,32,33,34,35로 갖는다. FoMV는 이전에 T-DNA 플라스미드 백본6,36,37에 전염성 클론을 통합하여 옥수수를 위한 VIGS 및 VOX 벡터로 개발되었다. 바이러스 게놈은 비그네시 적용을 위해 비그(VIGS) 적용을 위해 수정되었다(MCS1*) 즉시 하류의 코트 단백질(CP)(도 1A)36. VOX 및 VEdGE 애플리케이션의 경우 CP 프로모터가 복제되고 두 번째 복제 사이트(MCS2)가 추가되어 ORF 4와 CP(그림 1B)6 사이의 관심 서열 삽입을 가능하게 했습니다. 인서트가 없는 MCS1과 MCS2를 모두 포함하는 FoMV 벡터는 FoMV 빈 벡터(FoMV-EV)(그림 1)입니다.
SCMV는 옥수수 38에서 VOX를 위해 개발 된 관련이없는 바이러스입니다. 포티비리대 가문의 일원이며, 그 중 몇몇 회원들은 planta39,40,41,42,43,44에서 외국 단백질을 표현하도록 설계되었다. SCMV의 호스트 범위는 옥수수, 사탕수수 및 사탕수수45,46을 포함하며, 이러한 주요 작물 식물36,38에서 유전자 기능 연구에 귀중합니다. SCMV는 길이47,48에서 약 10kb의 양성 감각, 단일 좌초 RNA 게놈을 갖는다. SCMV VOX 벡터를 만들기 위해 잘 확립된 P1/HCPro 접합은 이종 체계38의 삽입 부위로 활용되었다. 이러한 복제 부위는 NIa-Pro 프로테아제 분열 부위를 인코딩하여 SCMV 다단백(도 1C)으로부터 독립적인 단백질의 생산으로 이어진다.
이러한 재조합 바이러스의 전염성 cDNA를 운반하는 T-DNA 플라스미드는 Agrobacterium 균주 GV3101로 변형되었습니다. GV3101은 노팔린 형 균주로, T-DNA를 옥수수26,28,49종을 포함한 단응종으로 옮길 수 있는 것으로 잘 알려져 있다. 또한, 이전 농사 연구는 균주 C58 또는 그것의 유도체 GV3101, 뿐만 아니라 19,20,22,27를 사용 했습니다.
3개의 마커 유전자는 이 프로토콜의 발달에서 이용되었습니다: 유전자 침묵을 위한 2개 및 유전자 발현을 위한 1개. 옥수수 유전자 병변 모방 22(les22, GRMZM2G044074)로부터 329염기쌍(bp) 단편을 사용하여 침묵 벡터 FoMV-LES22를 구성하는 데 사용하였다. les22가 옥수수에서 침묵할 때, 괴사 세포의 작고 둥근 패치는 괴사 잎 조직50의 넓은 지역으로 확장하고 결합하는 잎의 혈관을 따라 나타납니다50. FoMV-PDS, sorghum 유전자 phytoene desaturase에서 313 bp 단편을 포함 (PD, LOC10436156, 96% 시퀀스 ID 는 옥수수 PD, GRMZM2G410515), 옥수수에서 PD의 침묵을 유도, 암투에 따라 사진 표백 세포의 작은 줄무늬의 결과 1. 녹색 형광 단백질(GFP)을 위한 온전한 코딩 서열은 FoMV(FoMV-GFP) 및 SCMV(SCMV-GFP)에 대한 단백질 발현을 입증하는 데 사용되었습니다. 잎의 GFP 발현은 일반적으로 14일 사후 접종(DPI)6에서 가장 검출할 수 있다. 옥수수에 있는 바이러스 벡터의 농업 주입을 이용한 이전 연구 결과가 있더라도, 이 실험은 단지 농사주입이 옥수수 묘목에서 감염성 클론에서 바이러스성 감염을 용이하게 할 수 있고 VIGS 또는 VOX 응용을 위해 디자인된 재조합 바이러스로 확장하지 않는 것을 보여주었습니다19,20,21,22. 여기에 제시된 프로토콜은 이전 농사 방법, 특히 Grismley 등 al.19를 기반으로 합니다. 전반적으로, 이 농사 법은 VIGS 및 VOX 벡터와 호환되며, 특수 장비 또는 대체 호스트를 접종 소스로 필요로 하지 않으며, 생체 내재 또는 체외 전사가 필요한 다른 일반적인 방법에 비해 접종을 설정하고 수행하는 데 필요한 전체 시간과 비용을 감소시킵니다. 이 프로토콜은 VIGS, VOX 및 VEdGE와 관련된 응용 프로그램과 함께 옥수수에서 기능 적 유전체학 연구를 용이하게 할 것입니다.
Agrobacterium은 식물 관련 연구에서 수많은 분자 생물학 기술을 용이하게하는 필수 도구입니다. 이 연구는 VIGS 및 VOX 응용 프로그램에 대한 옥수수 조직에 직접 FoMV 및 SCMV 바이러스 벡터를 접종하기위한 농업 주입 프로토콜을 제공합니다. 주요 목표는 모노코트 작물 식물 연구를 위한 바이러스 기반 기술의 용이성과 유용성을 높이는 것입니다. 옥수수의 직접 농약은 몇 가지 바이러스에 대 한 보고 되었습니다 하는 동안, 저자는 상세한 프로토콜을 인식 하지 않습니다., 그리고 그 연구에서 VIGS와 VOX 응용 프로그램의 아무 예 19,22.
이 프로토콜을 개발하는 동안 주사 위치가 성공적으로 agro주사19를 통해 전신 바이러스 감염을 시작하는 핵심 요소임을 확인했습니다. 옥수수 묘목에서 메리스템의 정확한 위치는 눈으로 거의 감지 할 수 없기 때문에 지속적으로 식물에 권장 위치를 주입하는 것은 가장 큰 변수로 가정된다. 대인 관계 변화를 최소화하기 위해 몇 가지 옥수수 묘목을 메리스템으로 해부하면 위치를 더 잘 시각화하는 것이 좋습니다(그림 3C). 콜옵티알러 노드와 관련하여 메리스템의 위치는 4-7일 된 식물의 경우 거의 동일해야 합니다. 또한, 염색된 액체로 주사를 연습하면 “접종”이 잎 을 채우는 방법과 주사 부위가 염료로 표시되기 때문에 주사 부위의 정확도를 확증할 수 있습니다(그림 3G, H). 수성 조직은 농약에 가장 취약하지만, 이 조직에 직접 Agrobacterium 현탁액을 주입하면 바람직하지 않은 형태학적 효과가 있습니다 (그림 6)19. 손상된 메리줄기를 가진 식물은 살아 남기, 그러나 결과 결함은 바람직하지 않다, 따라서, 이 조직의 직접 주입을 피해야한다.
3개의 복잡한 생물학 시스템 (식물, 바이러스 및 Agrobacterium 긴장)가 조정에서 상호 작용해야 하기 때문에 농업 주입을 통해 전신 바이러스 감염의 성공적인 발사에 영향을 미칠 수 있는 몇몇 변수가 있습니다. 이 복잡한 상호 작용은 메교 영역의 급속하게 분할 세포에 의해 도움이 될 수 있습니다, 그것은 농업에 대한 이상적인 위치만들기19. Agrobacterium 균주는 바이러스 게놈을 운반하는 T-DNA를 전달하기 위하여 식물 조직의 세포를 감염시킬 수 있어야 하고, 식물은 바이러스성 복제 및 전신 감염을 시작하기 위하여 바이러스에 영향을 받기 쉬운 이어야 합니다. 옥수수 유전자형은 바이러스에 대한 감수성이 다르지만(예를 들어, Mo17은 FoMV에 내성이 있음) 또는 아그로박테리움 균주, 그러나 시험된 대다수는 FoMV와 SCMV(표 1 및 표 2)53 모두에 취약해 보입니다. 예를 들어, 근친선 FR1064 및 달콤한 옥수수 품종 골든 밴탐은 GV3101 아그로바테리움 및 FoMV 계 벡터 모두에 특히 취약할 수 있다.
샘플링된 리프 번호와 RT-PCR샘플링 시기는 바이러스 감염의 정확한 평가를 위해 매우 중요합니다. 여기에 표시된 예에서, 잎 수는 첫 번째 둥근 잎 (일반적으로 “엄지 잎”이라고 함)에서 시작하여 위쪽으로 계산하여 결정되었다. 잎이 확장되고 다음 잎이 나타나기 시작하면 채취한 채 채 샘플링되었습니다. 그러나, 샘플링에 최적인 잎은 사용된 바이러스 종, 성장 조건 및 옥수수 유전자형에 따라 다를 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜을 새 바이러스 시스템에 적용하여 잎 및 타이밍에 대한 샘플링 전략을 최적화할 때 초기 시간 과정 실험을 권장합니다.
사용된 특정 구문은 이 프로토콜의 효율성에 큰 영향을 미칩니다. 예를 들어, 빈 벡터, FoMV-EV 및 SCMV-EV, 및 FoMV-PDS 및 FoMV-LES22는 모두 작은 인서츠(각각 313bp 및 329bp)를 함유하고 있으며, 일반적으로 이러한 실험에서 바이러스 증상이 있는 식물의 가장 높은 비율을 생성한다(표 1 및 표 2). 그러나, FoMV-GFP 및 SCMV-GFP에서 GFP ORF(720bp)의 더 큰 삽입을 운반하는 재조합 바이러스는 빈 벡터 또는 유전자 침묵 구조로 주입된 식물에 비해 훨씬 낮은 감염률을 가졌다. 이 경향은 바이러스 게놈에 있는 외인성 유전 물질의 양을 증가시켜 기인하는 바이러스성 적적합성에 부정적인 충격 때문일 지도 모릅니다. 몇몇 연구 결과는 식물 바이러스 벡터의 삽입 안정성이 주로 삽입 크기 및 순서36,54,55,56,57에 달려 있다는 것을 보여주었습니다. 또한, FoMV 또는 SCMV 빈 벡터로 접종후 감염되는 식물의 비율에 주목할 만한 차이가 있었는데, 이는 SCMV(표 1)에 대한 이 프로토콜을 최적화하기 위해 추가 작업이 필요하다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 조각의 시퀀스와 길이가 모두 효율성에 영향을 줄 수 있기 때문에 구도를 개발할 때 몇 가지 문제 해결이 필요할 수 있음을 나타냅니다.
전반적으로, 이 연구는 옥수수 묘목의 농약이 2개의 다른 RNA 식물 바이러스, 다중 벡터 구성 및 옥수수의 11개의 유전자형에 대한 효과적인 접종 방법임을 보여주었습니다. 이러한 작업은 옥수수 클로로틱 몰틀 바이러스(MCMV) 또는 MSV와 함께 주사를 활용하는 전작과 결합된 FoMV 및 SCMV와 함께 작용하여, 암골주입이 RNA와 DNA 바이러스 의 전염성 클론으로 옥수수 묘목을 접종하는 데 적합하다는 것을 나타냅니다19,20,21,22. 또한, 이 작품은 농사주입이 VIGS 및 VOX 벡터에 대한 실행 가능한 방법이며 4일 된 식물에 적용될 수 있다는 것을 보여준다(표 3). 여기에 제시된 프로토콜은 일시적인 유전자 침묵(VIGS) 및 과발현(VOX)과 관련된 기능성 유전체학 연구에서 연구를 용이하게 하기 위해 옥수수 생물학자에 의해 쉽게 적응될 것으로 예상됩니다. 농사주는 또한 식물 변환에 의존하여 제한될 바이러스 기반 유전자 편집 접근법(VEdGE)을 용이하게 할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 잠재적으로 편집 효율뿐만 아니라 접근성58,59,60을 개선할 수 있습니다. 적절한 농균 균주를 감안할 때, 옥수수 유전자형 및 바이러스 벡터가 신중하게 결합되어, 농경분에 의한 접종은 옥수수에서 일시적인 유전자 기능 분석을 위한 귀중한 도구가 될 것으로 기대된다.
The authors have nothing to disclose.
아이오와 주립 대학은 DARPA의 곤충 동맹국 프로그램 HR0011-17-2-0053을 지원하는 팀의 일부입니다. 이 작품은 또한 아이오와 주립 대학 식물 과학 연구소에 의해 지원되었다, 아이오와 주립 대학 작물 생물 공학 센터, USDA NIFA 해치 프로젝트 번호 3808, 아이오와 기금의 상태. K.L.H.는 또한 아이오와 주립 대학 예측 식물 전염병 대학원 교육 프로그램이 국립 과학 재단 (DGE #1545453)에 의해 지원되었으며 농식품 연구 이니셔티브 보조금 No. 2019-07318 USDA 국립 식품 및 농업 연구소에서 지원되었습니다. 기금은 데이터의 연구 및 수집, 분석 및 해석의 설계와 원고 작성에 아무런 역할이 없었다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 기금 모금자의 견해를 반영하지 않습니다.
우리는 닉 라우터 (USDA-ARS, 에임스, IA) 옥수수 근친선의 씨앗, 크리스티안 F. 몬테세리 (아이오와 주립 대학) FoMV-GFP 클론을 만들기위한, 타일러 오스틴 (아이오와 주립 대학) 기술 지원을 감사드립니다.
1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
37°C Incubator | For E. coli | ||
Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
Ethanol | For RNA extraction | ||
Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
Fluorescence Microscope | |||
Gel Electrophoresis Box | |||
Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
PacI | New England Biolabs | R0547 | |
Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
pH Meter | |||
Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
Thermocycler | For PCR | ||
Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
XbaI | New England Biolabs | R0145 |