Summary
Представлен протокол инъекций (агроинъекция) на основе Agrobacterium для посева вируса мозаики лисохвоста и вируса мозаики сахарного тростника в саженцы кукурузы. Инокуляция таким образом приводит к вирусной инфекции, вызванному вирусом глушению генов-маркеров и вирусной сверхэкспрессии GFP.
Abstract
Подходы к инокуляции на основе агробактерий широко используются для введения вирусных векторов в ткани растений. В этом исследовании подробно описан протокол инъекции саженцев кукурузы вблизи меристематической ткани с Agrobacterium, несущим вирусный вектор. Для оптимизации этого метода были использованы клоны рекомбинантного вируса мозаики лисохвоста (FoMV), разработанные для глушения генов и экспрессии генов, и его использование было расширено, чтобы включить рекомбинантный вирус мозаики сахарного тростника (SCMV), разработанный для экспрессии генов. Фрагменты генов или кодирующие последовательности, представляющие интерес, вставляются в модифицированный инфекционный вирусный геном, который был клонирован в бинарный Т-ДНК плазмидный вектор pCAMBIA1380. Полученные плазмидные конструкции трансформируются в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101. Саженцы кукурузы в возрасте от 4 дней можно вводить вблизи колеоптилярного узла с бактериями, повторно суспендированными в растворе MgSO4. Во время заражения Agrobacterium Т-ДНК, несущая вирусный геном, переносится в клетки кукурузы, что позволяет транскрипцировать геном вирусной РНК. Поскольку рекомбинантный вирус реплицируется и системно распространяется по всему растению, на листьях могут наблюдаться вирусные симптомы и фенотипические изменения, возникающие в результате глушения поражений генов-мишеней 22 (les22) или фитоендесатуразы (pds), или экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) может быть обнаружена при освещении ультрафиолетовым светом или флуоресцентной микроскопией. Для обнаружения вируса и оценки целостности вставки одновременно из листьев вводимого растения извлекают РНК и проводят ОТ-ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих множественный сайт клонирования (MCS), несущий вставленную последовательность. Этот протокол эффективно используется в нескольких генотипах кукурузы и может быть легко распространен на другие вирусные векторы, тем самым предлагая доступный инструмент для внедрения вирусных векторов в кукурузу.
Introduction
Инфекционные клоны многих вирусов растений были разработаны для вирус-индуцированного глушения генов (VIGS), гиперэкспрессии генов (VOX) и совсем недавно для редактирования генов с поддержкой вирусов (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . По мере разработки новых вирусных конструкций необходимо также рассмотреть методы успешного заражения тканей растений этими модифицированными вирусами. Современные методы запуска вирусных инфекций в растениях включают бомбардировку частицами, втирание транскриптов РНК in vitro или клонов ДНК, посев проколов сосудов или посев Agrobacterium tumefaciens (агроинокуляция)5,12,13,14,15,16,17 . Каждый из этих методов вакцинации имеет неотъемлемые преимущества и недостатки, которые включают в себя стоимость, потребность в специализированном оборудовании и осуществимость в рамках данной системы вирусов растений. Методы, которые используют инфильтрацию или инъекцию штаммов Agrobacterium, содержащих бинарные конструкции Т-ДНК, предназначенные для доставки рекомбинантных вирусов, являются предпочтительными, потому что они просты и недороги. Однако подробные методы агроинокуляции для однодольных видов, таких как Zea mays (кукуруза), отсутствуют.
Одно из первых сообщений об агроинокуляции для доставки вируса было опубликовано в 1986 году, когда геном вируса мозаики цветной капусты (CaMV) был вставлен в конструкцию Т-ДНК, и полученная агробактерия, несущая эту конструкцию, была привита растениям репы18. С тех пор были разработаны дополнительные методы агроинокуляции. Например, в случае вируса мозаики лисохвоста (FoMV) Nicotiana benthamiana может быть использована в качестве промежуточного хозяина для генерации вирусных частиц в листьях, которые обеспечивают источник инокулята6. Втирать кукурузу с использованием инфицированных листьев N. benthamiana эффективно, быстро и просто, но использование промежуточного хозяина не работает для всех вирусов, заражающих кукурузу. Например, вирус мозаики сахарного тростника (SCMV) не может заразить N. benthamiana, что требует использования альтернативных источников инокулята для переносчиков, полученных из этого вируса. В 1988 году Agrobacterium, содержащая вирус кукурузной полосы (MSV), ДНК-вирус, была введена в саженцы кукурузы путем инъекции (агроинъекция), демонстрируя методы посева на основе Agrobacterium также полезны для монокотов19. Несмотря на этот ранний успех с агроинъекцией, было опубликовано мало исследований, использующих этот метод в кукурузе, оставляя открытыми вопросы о применимости этого метода к РНК-вирусам и векторам VIGS, VOX и VEdGE20,21,22. Тем не менее, широкое использование агроинъекции в монокотных видах является многообещающим, поскольку этот общий подход был использован в орхидеях, рисе и пшенице23,24,25,26,27,28.
Этот протокол был оптимизирован для Штамма FoMV и Agrobacterium GV3101, а также был применен к вектору SCMV. FoMV является потексвирусом с широким диапазоном хозяев, который включает в себя 56 видов монокотов и дикот29. FoMV имеет 6,2 килобаза (kb) положительного смысла, одноцепочечный геном РНК, который кодирует пять различных белков из пяти открытых кадров чтения (ORFs) 30,31,32,33,34,35. FoMV был ранее разработан как вектор VIGS, так и VOX для кукурузы путем включения инфекционного клона в плазмидную основу Т-ДНК6,36,37. Вирусный геном модифицировали для применения VIGS путем добавления сайта клонирования (MCS1*) непосредственно после белка оболочки (CP) (рисунок 1A)36. Для приложений VOX и VEdGE промоутер CP был продублирован и добавлен второй сайт клонирования (MCS2), чтобы обеспечить вставку интересующих последовательностей между ORF 4 и CP (рисунок 1B)6. Вектор FoMV, содержащий как MCS1, так и MCS2 без вставок, является пустым вектором FoMV (FoMV-EV) (рисунок 1).
SCMV является несвязанным вирусом, который был разработан для VOX в кукурузе38. Он является членом семейства Potyviridae, несколько членов которого были спроектированы для экспрессии чужеродных белков в planta39,40,41,42,43,44. Диапазон хозяев SCMV включает кукурузу, сорго и сахарный тростник45,46, что делает его ценным для генных функциональных исследований в этих основных сельскохозяйственных растениях36,38. SCMV имеет положительный смысл, одноцепочечный геном РНК длиной около 10 кб47,48. Для создания вектора SCMV VOX в качестве места вставки гетерологичных последовательностей использовался хорошо зарекомендовавший себя переход P1/HCPro38. За этим сайтом клонирования следует последовательность, кодирующая участок расщепления протеазы NIa-Pro, что приводит к образованию белков, независимых от полипротеина SCMV (рисунок 1C).
Т-ДНК плазмиды, несущие инфекционную кДНК этих рекомбинантных вирусов, были преобразованы в штамм Agrobacterium GV3101. GV3101 представляет собой штамм нопалинового типа, который, как известно, способен передавать Т-ДНК однодольным видам, включая кукурузу26,28,49. Кроме того, в предыдущих исследованиях агроинъекции использовались штаммы C58 или его производное GV3101, а также 19,20,22,27.
При разработке этого протокола использовались три маркерных гена: два для глушения генов и один для экспрессии генов. Фрагмент пары оснований (bp) 329 из повреждения гена кукурузы, имитирующего 22 (les22, GRMZM2G044074), был использован для построения глушающего вектора FoMV-LES22. Когда les22 заглушается в кукурузе, вдоль сосудистой системы листьев появляются небольшие круглые участки некротических клеток, которые расширяются и сливаются в большие участки некротической ткани листьев50. FoMV-PDS, содержащий фрагмент 313 bp из фитоендесатуразы гена сорго (pds, LOC110436156, 96% идентичности последовательности для кукурузы pds, GRMZM2G410515), индуцирует глушение pds в кукурузе, что приводит к небольшим полосам фотоотбеленных клеток вдоль сосудистой системы листьев, которые удлиняются с течением времени51. Интактная кодирующая последовательность для зеленого флуоресцентного белка (GFP) использовалась для демонстрации экспрессии белка как для FoMV (FoMV-GFP), так и для SCMV (SCMV-GFP). Экспрессия GFP в листьях обычно наиболее обнаруживается через 14 дней после прививки (DPI)6. Хотя были проведены предыдущие исследования с использованием агроинъекции вирусных векторов в кукурузе, эти эксперименты только показали, что агроинъекция может способствовать вирусной инфекции от инфекционного клона в саженцах кукурузы и не распространяется на рекомбинантные вирусы, предназначенные для применения VIGS или VOX19,20,21,22. Представленный здесь протокол основывается на предыдущих методах агроинъекции, в частности Grismley et al.19. В целом, этот метод агроинъекции совместим с векторами VIGS и VOX, не требует специализированного оборудования или альтернативных хозяев в качестве источников инокулята и снижает общее время и стоимость, необходимые для настройки и выполнения прививок по сравнению с другими распространенными методами, которые требуют биолистики или транскрипции in vitro. Этот протокол облегчит исследования функциональной геномики в кукурузе с приложениями с участием VIGS, VOX и VEdGE.
Protocol
1. Плазмидная конструкция
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть применен к другим вирусным векторам или штаммам Agrobacterium , но это может повлиять на общий успех инокуляции путем агроинъекции. Всегда выполняйте бактериальную прививку и нанесение покрытий в ламинарной вытяжке.
- Конструкция глушения FoMV
ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель Luria-Bertani (LB) (Миллер) используется для всех носителей, если не указано иное. Жидкий LB получают путем суспендирования 25 г гранул в 1000 мл дистиллированной воды и автоклавирования в течение 15 мин при 121 °C. Твердая среда LB аналогично изготавливается с добавлением 1,5% агара перед автоклавированием. Антибиотики добавляют после того, как LB охлаждают до ~60 °C, и раствор заливают в пластины Петри размером 95 х 15 мм. Используемые концентрации антибиотиков следующие: рифампицин (риф) при 25 мкг/мл, гентамицин (гент) при 50 мкг/мл и канамицин (кан) при 50 мкг/мл.- ПЦР амплируют фрагменты из гена кукурузы, подлежащие глушению (например, les22 или pds), используя прямую праймер с сайтом ограничения PacI и обратную праймер с сайтом ограничения XbaI. Это позволит лигировать фрагменты гена в MCS1* бинарного вектора FoMV-pCAMBIA1380 в антисмысловой ориентации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройте ПЦР с использованием высокоточной ДНК-полимеразы, прямых и обратных праймеров по 10 мкМ каждый, плазмидного шаблона ДНК и воды, следуя спецификациям ДНК-полимеразы. Амплифицируйте в течение 35 циклов, используя температуру отжига в соответствии с температурой плавления ДНК-полимеразы и грунтовки (Tm) и удлинение 30 с на килобазу, подлежащее усилению. - Выполните очистку ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии со спецификациями набора.
- Переварите очищенный продукт ПЦР и FoMV-EV с ферментами рестрикции XbaI и PacI. Используйте 1 мкг плазмиды или весь очищенный продукт ПЦР, 2 мкл 10x буфера, 1 мкл фермента рестрикции и добавьте воду, чтобы получить конечный реакционный объем 20 мкл. Инкубировать в соответствии со спецификацией фермента.
- Лигировать переваренный продукт ПЦР и FoMV-EV вместе с Т4 ДНК-лигазой в соответствии с протоколом производителя.
- Преобразуйте лигированную плазмиду в химически компетентные клетки E. coli DH5α с помощью метода теплового шока.
- Разморозьте клетки на льду и добавьте в трубку 3 мкл плазмиды. Инкубировать на льду в течение 30 мин, затем тепловой удар в течение 30 с при 42 °C.
- Поместите на лед в течение 5 мин, добавьте 200 мкл супероптимального отвара с катаболическим вытеснением (SOC) и дайте клеткам E. coli восстановиться в среде SOC в течение 1 ч при 37 °C с встряхиванием при 225 об/мин.
- Пластину на канамицин селективной LB среде и инкубируют при 37 °C в течение ночи.
- Проверьте колонии на наличие точных клонов методом секвенирования Сэнгера с помощью праймеров FM-5840F и FM-6138R (Дополнительная таблица 1). Отправьте 250 нг плазмидной ДНК в учреждение, которое будет выполнять секвенирование Сэнгера. Для этого эксперимента образцы были отправлены в Центр ДНК Университета штата Айова.
- Инокулируют 2 мл жидкого LB выбранной колонией и инкубируют при 37 °C в течение ночи с встряхиванием при 225 об/мин. Экстрагируйте плазмидную ДНК из ночной культуры с помощью щелочного лизиса препарата плазмидной ДНК52.
- Трансформировать плазмидную ДНК в клетки штамма Agrobacterium GV3101 с помощью метода замораживания-оттаивания. Дайте 100 мкл химически компетентных клеток оттаять на льду, добавьте 1-5 мкл плазмиды и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Поместить в жидкий азот на 1 мин, затем инкубировать при 37 °C в течение 3 мин. Добавьте 1 мл SOC, дайте восстановиться в течение 2-3 ч при 28 °C с встряхиванием, пластиной на риф, гентированной и кан селективной LB средой и инкубируйте при 28 °C в течение 2 дней.
- Скрининг колоний на наличие вставки с колонией ПЦР. Выберите одну бактериальную колонию и смешайте ее в 30 мкл воды. Настройте реакцию ПЦР путем добавления 12,5 мкл полимеразной мастер-смеси, 1,25 мкл каждого праймера 10 мкМ, FM-5840F и FM-6138R, 3 мкл суспензии бактериальной колонии и воды до конечного объема 25 мкл. Цикл 35 раз с температурой отжига 64 °C и временем продления 1 мин (1 мин на каждый усиленный кб).
- Инокулируют 2-5 мл жидкого LB (риф, гент, кан) правильной колонией agrobacterium . Дайте ему вырасти ночью при 28 °C с встряхиванием при 225 оборотах в минуту.
- Смешайте культуру на ночь с 50% раствором глицерина 1:1. Хранить при температуре -80 °C для длительного хранения.
- ПЦР амплируют фрагменты из гена кукурузы, подлежащие глушению (например, les22 или pds), используя прямую праймер с сайтом ограничения PacI и обратную праймер с сайтом ограничения XbaI. Это позволит лигировать фрагменты гена в MCS1* бинарного вектора FoMV-pCAMBIA1380 в антисмысловой ориентации.
- Конструкция выражения FoMV
- ПЦР усиливают интересующую кодирующую последовательность, включая кодоны запуска и остановки (например, GFP), как описано в 1.1.1, добавляя сайт ограничения Bsu36I на прямой грунтовке и сайт ограничения PspOMI на обратном праймере для обеспечения направленного клонирования в смысловой ориентации в MCS2.
- Выполните очистку ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии со спецификациями набора.
- Переваривайте продукт ПЦР и FoMV-EV с ферментами рестрикции Bsu36I и PspOMI, как описано в 1.1.3.
- Лигировать переваренный продукт ПЦР и FoMV-EV вместе с Т4 ДНК-лигазой в соответствии с протоколом производителя.
- Преобразование в химически компетентные клетки E. coli DH5α с использованием метода теплового шока, описанного в 1.1.5. Пластину на канамицин селективной LB среде и инкубируют при 37 °C в течение ночи.
- Проверьте колонии на наличие точных клонов путем секвенирования Сэнгера, как описано в 1.1.6, используя праймеры 5AmuS2 и 5AmuA2 (Дополнительная таблица 1).
- Инокулируют 2 мл жидкого LB выбранной колонией и инкубируют при 37 °C в течение ночи с встряхиванием при 225 об/мин. Экстрагируйте плазмидную ДНК из ночной культуры с помощью щелочного лизиса препарата плазмидной ДНК52.
- Трансформировать плазмидную ДНК в химически компетентные клетки штамма Agrobacterium GV3101 с помощью метода замораживания-оттаивания, описанного в 1.1.8. Пластину на риф, гент и кан селективные LB среды и инкубируют при 28 °C в течение 2 дней.
- Экран колоний на наличие вставки с колонией ПЦР используют праймеры 5AmuS2 и 5AmuA2.
- Инокулируют 2-5 мл жидкого LB (риф, гент, кан) правильной колонией agrobacterium . Встряхните ночью при 225 об/мин при 28 °C.
- Смешайте культуру на ночь с 50% раствором глицерина 1:1. Хранить при температуре -80 °C для длительного хранения.
- Конструкция выражения SCMV
- ПЦР амплируют интересующий ген (например, GFP), исключая стоп-кодон, как описано в 1.1.1, включая сайт пищеварения PspOMI на прямом праймере и сайт пищеварения SbfI на обратном праймере, чтобы обеспечить направленное клонирование в бинарный вектор SCMV-pCAMBIA1380.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вставка должна быть клонирована в рамке с вирусным полипротеином. - Выполните очистку ПЦР с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии со спецификациями набора.
- Переваривайте продукт ПЦР и SCMV-EV с ферментами рестрикции PspOMI и SbfI, как описано в 1.1.3.
- Лигат переваренного продукта ПЦР и SCMV-EV вместе с Т4 ДНК-лигазой в соответствии с протоколом производителя.
- Превратите продукт в химически компетентные клетки E. coli DH5α с помощью метода теплового шока, описанного в 1.1.5. Пластину на кан селективной ЛБ среде и инкубируют при 37 °C в течение ночи.
- Скрининговые колонии для точных клонов методом секвенирования Сэнгера, как описано в 1.1.6, с использованием праймеров SC-745F и HCProR1 (Дополнительная таблица 1).
- Инокулируют 2 мл жидкого LB выбранной колонией и инкубируют при 37 °C в течение ночи с встряхиванием при 225 об/мин. Извлеките плазмидную ДНК из ночной культуры с помощью щелочного лизиса препарата плазмидной ДНК52.
- Трансформируйте плазмидную ДНК в химически компетентные клетки штамма Agrobacterium GV3101 с помощью метода замораживания-оттаивания, как описано в 1.1.8. Пластину на риф, гент и кан селективные LB среды и инкубируют при 28 °C в течение 2 дней.
- Экранные колонии на наличие вставки с колониальной ПЦР с праймерами SC-745F и HCProR1, как описано в 1.1.9.
- Инокулируют 2-5 мл жидкого LB (риф, гент, кан) правильной колонией agrobacterium . Встряхните ночью при 225 об/мин при 28 °C.
- Смешайте культуру на ночь с 50% раствором глицерина 1:1. Хранить при температуре -80 °C для длительного хранения.
- ПЦР амплируют интересующий ген (например, GFP), исключая стоп-кодон, как описано в 1.1.1, включая сайт пищеварения PspOMI на прямом праймере и сайт пищеварения SbfI на обратном праймере, чтобы обеспечить направленное клонирование в бинарный вектор SCMV-pCAMBIA1380.
2. Подготовка рассады
- Посадите 1-2 семени кукурузы (сладкая кукуруза 'Golden Bantam', FR1064, B73 и др.) в питательную среду на торфяной основе в небольшие вставки, помещенные внутрь лотков за 4-7 дней до инъекции. Поместите в камеру роста в течение 16 ч дней при 25 °C и 8 ч ночи при 22 °C (~185 фотосинтетически активного излучения (PAR)) или в теплицу в течение 16 ч дней при 22-25 °C и 8 ч ночи при 22-25 °C (350-400 PAR).
ПРИМЕЧАНИЕ: Восприимчивость к агробактериям варьируется среди генотипов кукурузы, что влияет на показатели успеха. Кроме того, некоторые вирусные векторы могут быть несовместимы с определенными генотипами кукурузы. - Регулярно поливайте и удобряйте раз в неделю 15-5-15 жидкими удобрениями по 330 частей на миллион (PPM).
3. Приготовление агробактерий
- За сутки до инъекции подготовьте лб жидкие среды с соответствующим антибиотиком (риф, гент, кан) и привите штаммом Agrobacterium , несущим нужную вирусную конструкцию. Рекомендуется добавить 20 мкл глицерина в 50 мл LB, который должен дать достаточно бактериальной культуры для прививки >100 растений и может быть увеличен или уменьшен по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте достаточное количество инокулята, чтобы иметь конечное количество бактериальной суспензии не менее 1 мл при оптической плотности 600 нм (OD600) 1,0 на каждые 4-5 растений. - Встряхивайте при 225 об/мин при 28 °C в течение 24 ч.
- Гранулированные бактерии в течение 10 мин при 4000 х г при комнатной температуре. Выбросьте супернатант.
- Тщательно вымойте гранулу 1 мл деионизированной (DI) воды путем пиоттинга или мягкого вихря.
- Повторите шаг 3.3 для гранулированных бактерий.
- Повторно суспендировать гранулу в 1 мл 10 мМ раствора MgSO4 путем пипетирования или мягкого вихря.
- Необязательно добавьте в раствор 200 мкМ ацетосиргинон. Хотя ацетосиргинон обычно используется, он только усиливает трансформационную способность некоторых штаммов Agrobacterium . Авторы не обнаружили, что добавление ацетосиргинона влияет на эффективность в этом протоколе (Дополнительная таблица 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: 10 мМ раствор MgSO4 может быть изготовлен из 1 М запасного раствора с рН 6,3, хранящегося при комнатной температуре. Раствор, скорее всего, не потребует регулировки pH.
- Необязательно добавьте в раствор 200 мкМ ацетосиргинон. Хотя ацетосиргинон обычно используется, он только усиливает трансформационную способность некоторых штаммов Agrobacterium . Авторы не обнаружили, что добавление ацетосиргинона влияет на эффективность в этом протоколе (Дополнительная таблица 2).
- Измерить OD600 образца спектрофотометром и разбавить до 1,0 OD600 раствором MgSO4 10 мМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это безопасный остановочный пункт. Бактериальную суспензию можно хранить при комнатной температуре до 5 ч перед инъекцией.
4. Инъекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Саженцы кукурузы от 4-7 дней можно использовать для инъекций. Скорость роста рассады в значительной степени зависит от условий роста, количества PAR (т. Е. Более высокого PAR в теплице, чем в камере роста) и генотипа, среди прочего, которые может быть трудно контролировать в условиях теплицы. Растения можно вводить в возрасте 4 дней, когда они достигают 2-3 см в высоту без расширенных листьев, и в возрасте до 7 дней, когда расширяется самый нижний лист с округлым кончиком. Успешность этих методов вакцинации быстро падает, поскольку растения стареют более 7 дней после посева. Место инъекции одинаково независимо от возраста рассады.
- Надев защитные очки, введите бактериальную суспензию в саженцы на высоте 2-3 мм выше колеоптилярного узла с помощью иглы 25G x 5/8", прикрепленной к одноразовому шприцу объемом 1 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Колеоптилярный узел - это место, где в конечном итоге образуются корни кроны. Это самый низкий узел на заводе. Как правило, цвет будет изменен с зеленого на белый на узле и под ним. Место инъекции находится чуть выше меристемы. Рассечение нескольких саженцев на этом этапе может помочь в визуализации местоположения меристемы и, следовательно, правильного места инъекции. - Нанесите мягкое давление на шприц до тех пор, пока суспензия не заполнит колеоптиль или не будет видна в мутовке, в зависимости от стадии роста растений. Это примерно 100-200 мкл суспензии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если трудно ввести суспензию в рассаду, место инъекции может быть слишком низким. Умеренное давление – это все, что должно понадобиться для введения суспензии. - Вводите все саженцы, меняя шприцы и иглы для каждой конструкции.
5. Продолжение ухода за растениями
- Пересадите введенные саженцы в горшки размером 13 х 13 х 15 см или больше, когда им исполнится 7-8 дней.
- Поддержание условий роста (16 ч фотопериода и подкормка один раз в неделю).
6. Подтверждение инфекции (фенотипически и ОТ-ПЦР)
- Фенотипически оценивают растения между 14-21 DPI. Поражения от глушения контрольных генов , имитирующие 22 или фитоендесатуразу , можно легко увидеть на листьях и отличаются от симптомов FoMV. Экспрессия GFP может быть обнаружена с помощью флуоресцентного микроскопа или другой визуализации ультрафиолетового света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторым конструкциям / вирусным векторам может потребоваться больше времени, чтобы показать симптомы или могут вообще не проявлять никаких симптомов. Условия высокой освещенности значительно увеличивают фенотипы, вызванные глушающим поражением, имитирующим 22 и фитоендесатуразой. Поражения могут быть менее заметными или отсутствовать, если растения поддерживаются в условиях низкой освещенности, таких как камера роста, однако фактическая скорость заражения, определяемая ОТ-ПЦР, не должна быть затронута (таблица 1). - Чтобы подтвердить инфекцию молекулярно, возьмите образец листа 6 между 14-21 DPI и извлеките общую РНК с использованием экстракции фенол-хлороформа в соответствии с инструкцией производителя.
- Использование извлеченной РНК в качестве шаблона для генерации кДНК первой цепи.
- Наладили реакцию кДНК с общим количеством РНК до 5 мкг, 1 мкл случайных гексамерных праймеров, 1 мкл олиго(dT)18 праймеров, 1 мкл дНТП, 1 мкл обратной транскриптазы и водой для конечного объема 14,5 мкл.
- Используя праймеры, предназначенные для вирусной конструкции и кДНК в качестве шаблона, выполните ПЦР на каждом образце для подтверждения вирусной инфекции и определения целостности гена или фрагмента гена, представляющего интерес, как описано в 1.1.1, за исключением сокращения циклов до 25 для FoMV и 30 для SCMV, чтобы избежать ложных срабатываний.
- Для конструкций глушения FoMV используйте праймеры FM-5840F и FM-6138R для усиления по всему MCS1*, который содержит фрагмент гена кукурузы. Для конструкций экспрессии FoMV используйте праймеры 5AmuS2 и 5AmuA2 для усиления по всему MCS2, который содержит вставленный ген.
- Для конструкций экспрессии SCMV используйте праймеры SC745-F и HCProR1 для усиления по всему MCS, который содержит вставленный ген (дополнительный рисунок 3).
- Для эндогенного контрольного гена используют праймеры ZmActS и ZmActA, которые усиливают фрагмент мРНК актина кукурузы (GRMZM2G126010) или праймеры ZmUbiF и ZmUbiR, которые усиливают фрагмент мРНК полиубиквитина кукурузы (GRMZM2G409726_T01).
- Визуализируйте продукт ПЦР на 1% агарозном геле, содержащем пятно нуклеиновой кислоты, чтобы определить наличие или отсутствие вируса и гена или фрагмента гена.
Representative Results
Целью этого исследования была разработка простого протокола для непосредственного введения рекомбинантных вирусов, спроектированных для глушения генов или экспрессии генов, в саженцы кукурузы (рисунок 2). Вирусные векторы, несущие вставки, разрабатываются и клонируются с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Фрагменты генов для глушения вставляются в MCS1* в FoMV-EV, а кодирующие последовательности для экспрессии вставляются в FoMV-EV в MCS2 или SCMV-EV в MCS. Полученные плазмиды переносятся на штамм Agrobacterium GV3101. Впоследствии саженцы кукурузы вводят в течение недели и менее после посадки. Через две недели после инъекции растения могут быть оценены как фенотипически, так и молекулярно на предмет вирусной инфекции, глушения генов и экспрессии генов.
Растения кукурузы выращивают в торфяной среде в течение 4-7 дней. На этой стадии побег апикальной меристемы находится чуть выше колеоптилярного узла (рисунок 3А). После того, как колеоптиль вытянулся на 2-3 сантиметра или до 7 дней после посева, растения вводят на 2-3 мм выше колеоптилярного узла (рисунок 3B-F). Примерно через 12 дней после инъекции растения начнут демонстрировать фенотипы глушения на своих листьях, обычно наблюдаемые вблизи сосудистой ткани, и эти поражения визуально отличаются от симптомов вирусной мозаики FoMV (рисунок 4). Как присутствие FoMV, так и глушение генов-мишеней обнаруживаются в инъекционных растениях (рисунок 5). Экспрессия GFP может быть обнаружена через 2 недели после инъекции под флуоресцентным микроскопом и наиболее сильна на листьях 5-7 (рисунок 6). При наблюдении под флуоресцентной системой визуализации экспрессия GFP от FoMV может быть визуализирована как множество небольших пунктатных областей флуоресценции, распределенных по листьям вблизи сосудистой ткани, в то время как экспрессия GFP от SCMV состоит из более крупных пятен (рисунок 6, дополнительный рисунок 1). Хотя симптомы вирусной мозаики часто видны на растениях, инфицированных конструкциями глушения FoMV, растения, которым вводят конструкции экспрессии GFP, которые успешно экспрессируют GFP, часто не имеют этих симптомов. В результате растение без видимых симптомов все еще может быть положительным на экспрессию вируса и GFP. Кроме того, следует избегать прокалывания меристемы во время процедуры агроинъекции, так как это может вызвать морфологические дефекты, но полученные растения выживают и часто являются симптоматическими (рисунок 7).
Хотя этот протокол был первоначально разработан с использованием сладкой кукурузы, несколько инбредных линий кукурузы могут быть успешно привиты конструкциями глушения гена FoMV с использованием агроинъекции. Например, FR1064 и B73 обычно имеют высокие показатели вирусной инфекции (таблица 2). Примечательно, что Mo17, линия с известной генетической устойчивостью к FoMV, имела 0% эффективность заражения, как и ожидалось36,53. Кроме того, используемая конструкция влияет на эффективность инфекции (таблица 3). В случае FoMV FoMV-EV и FoMV-LES22 обычно имеют самую высокую эффективность заражения - 53% и 54% соответственно. FoMV-PDS имеет несколько более низкий КПД на 38%, а FoMV-GFP является самым низким на 17%. SCMV-GFP имеет инфекционную эффективность 8%. Эти проценты являются средними за несколько экспериментов; отдельные эксперименты могут иметь более высокую или более низкую эффективность заражения.
Рисунок 1: Схематические изображения клонов Т-ДНК FoMV и SCMV, используемых для агроинъекции кукурузы. Вектор FoMV содержит два нескольких сайта клонирования (MCS1* и MCS2). Пустой вектор, FoMV-EV, составляет 7 269 bp и не содержит вставок ни в одном из MCS. (A) Глушение генов с использованием вектора FoMV может быть достигнуто путем вставки фрагментов генов в MCS1*, обозначенных как интересующая последовательность (SOI), обычно в античувственной ориентации. (B) Экспрессия генов с использованием вектора FoMV может быть достигнута путем вставки генных ORF в MCS2 в смысловой ориентации, обозначенной как SOI. (C) Вектор SCMV был спроектирован таким образом, чтобы иметь одну MCS между P1 и HCPro. Пустой вектор, SCMV-EV, составляет 11 015 bp и не содержит никаких вставок в MCS. Генные ORF, вставленные в MCS, которые находятся в рамке с полипротеином SCMV, будут экспрессироваться в виде белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схематическое резюме протокола агроинъекции. (A) Клонирование SOI, cdS или фрагмент гена, в вирусный вектор и трансформация в штамм Agrobacterium GV3101. (B) Сажайте кукурузу и выращивайте в течение 4-7 дней. (C) Вырастите GV3101 в жидкой культуре на ночь при 28 °C. (D) Подготовьте бактериальную суспензию для инъекций. (E) Вводят в рассаду на высоте 2-3 мм выше колеоптилярного узла 100-200 мкл суспензии. (F) Пересаживать саженцы, когда им исполнится 7 дней, в большие горшки и расти в течение 2-3 недель, пока не будет виден 5-й лист. Фенотип при желании. (G) Образец листа 5 и экстракт РНК. (H) Сделать кДНК и провести ПЦР для амплификации вируса/SOI. (I) Запустить на геле для качественного анализа для определения наличия/отсутствия вируса и усеченного или неповрежденного SOI. Эта фигура была создана с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Агроинъекционный метод инокуляции рассады чуть выше колеоптильного узла. (А) 4-5-дневные растения. Колеоптиль полностью расширяется, и первый настоящий лист может быть частично виден, но не развернут. (B) 6-7-дневные растения. Первый лист может быть расширен, но воротники не будут видны. Второй лист также будет виден и может начать разворачиваться на этом этапе. (C) Рассечение 6-7-дневных растений, показывающее расположение побега апикальной меристемы по отношению к колеоптильному узлу. (D) Инъекции 4-5-дневных растений. (E) Инъекции 6-7-дневных растений. (F) Инъекция 6-7-дневным растениям с использованием раствора красителя, показывающего окрашенный инокулят, выходящий из мутовки саженца. (G) Крупный план места инъекции 6-7-дневных растений по отношению к колеоптильному узлу. (H) Крупный план растения 6-7-дневного возраста после инъекции, показывающий окрашенный инокулят в мутовке растения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Симптомы глушения контрольных генов, используемых в экспериментах по агроинъекции. (A) Лист, сфотографированный при 17 DPI после того, как растению ввели FoMV-LES22. FoMV-LES22 несет вставку 329 bp 3' CDS поражения, имитирующего ген 22 кукурузы в антисмысловой ориентации. Глушение приводит к накоплению токсичного метаболита, который, в свою очередь, вызывает некротические поражения, которые сначала появляются в виде полос вдоль сосудистой системы и перерастают в более крупные участки, как показано здесь. (B) Лист, сфотографированный при 17 DPI после того, как растению ввели FoMV-PDS. FoMV-PDS несет вставку 313 пар оснований 3' CDS гена фитоендесатуразы сорго в антисмысловой ориентации. Глушение pds в кукурузе вызывает системный фенотип фотоотбеливания, который начинается как небольшие, тонкие полосы вдоль сосудистой системы, которые вырастают в более длинные полосы по длине листа, как показано здесь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: qRT-PCR растений, которым вводят конструкции глушения гена FoMV. Подтверждение системной инфекции FoMV и глушения генов, индуцированных конструкциями FoMV-LES22 и FoMV-PDS, доставляемыми путем агроинъекции в растения сладкой кукурузы (Golden x Bantam). (A) Гелевые изображения показывают анализы ОТ-ПЦР, подтверждающие наличие пустого вектора FoMV-MCS1* (ампликон 315 bp) и FoMV-PDS (625 bp amplicon) в листе 6 из пяти отдельных растений. Используемые праймеры ПЦР производят ампликон, который охватывает MCS1*. В качестве эталона служит ампликон гена кукурузы актина (Zm-Actin). Гистограмма представляет относительные значения экспрессии qRT-PCR для экспрессии pds в листе 6 через 37 дней после посева (DPI) путем агроинъекции с Помощью FoMV-MCS1* или FoMV-PDS. Подавление pds обнаруживается в каждой из пяти биологических реплик (p = 0,003; тест Даннетта после hoc; полосы ошибок указывают на стандартное отклонение (SD) трех технических реплик). (B) Изображения геля показывают анализы ОТ-ПЦР, подтверждающие наличие FoMV-MCS1* (ампликон 315 bp) в листе 6 пяти отдельных растений. FoMV-LES22 (ампликон 625 bp) был обнаружен в ткани листа 6 (образцы FoMV-LES22 1-5, 38 DPI) и листа 4 (образцы FoMV-LES22 6-10, 20 DPI) для десяти отдельных растений. Ампликон Zm-Actin служил эталонным геном. Гистограмма представляет относительные значения экспрессии qRT-PCR для экспрессии les22 в тканях кукурузы путем агроинъекции вирусных конструкций FoMV-MCS1* или FoMV-LES22. Подавление Les22 происходит в 9 из 10 биологических реплик (p = <0,0001; тест Даннетта после хок; полосы ошибок указывают SD для трех технических реплик). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6. Фенотипы различных конструкций, используемые в агроинъекционных экспериментах. Все изображенные растения были введены в возрасте 6-7 дней штаммом Agrobacterium GV3101, несущим указанные конструкции. Снимки были сделаны при 16 DPI. (A) Листовые симптомы pCAMBIA1380 (пустая плазмидная основа), FoMV-EV, FoMV-GFP и SCMV-GFP в видимом свете, под фильтром хлорофилла FluorCam при воздействии 250 мкс и под фильтром FluorCam GFP при воздействии 10 мс. (B) Флуоресцентные микроскопические изображения листьев инъецированных растений, обработанных имитацией (вводимых только раствором MgSO4 ), FoMV-EV и FoMV-GFP. Показаны каналы DIC, DsRed и EGFP, каждый из которых был снят при экспозиции 1500 мс. Шкала составляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7. Морфологические эффекты инъекций. Пример более серьезных морфологических эффектов, которые могут возникнуть при прямом введении в меристематические ткани. Эта травма может привести к «измельчению» листьев и расщеплению стебля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Вирус | Условия роста | Генотип | # Зараженные растения | Общее количество растений | % Инфекции | Средний процент инфекции |
| ФомВ-ЭВ | Камера роста | Кукуруза | 22 | 23 | 96% | 97% |
| В73 | 18 | 18 | 100% | |||
| В104 | 20 | 21 | 95% | |||
| Теплица | Кукуруза | 20 | 23 | 87% | 89% | |
| В73 | 17 | 18 | 94% | |||
| В104 | 16 | 19 | 84% | |||
| СКМВ-ЭВ | Камера роста | Кукуруза | 14 | 21 | 67% | 47% |
| В73 | 5 | 18 | 28% | |||
| В104 | 10 | 21 | 48% | |||
| Теплица | Кукуруза | 14 | 23 | 61% | 49% | |
| В73 | 0 | 19 | 0% | |||
| В104 | 19 | 22 | 86% |
Таблица 1: Влияние условий теплицы и камеры роста на эффективность посева агроинъекций. Семена проращивались при одинаковых условиях роста. Пророщенные саженцы были заселены агроинъекцией, а половина из них была перемещена в камеру роста (25 ° C 16 часов дневного света / 22 ° C 8 часов ночью; 185 PAR), а другая половина была перемещена в теплицу (22-25 ° C 16 часов дневного света / 22-25 ° C 8 часов ночью; 350-400 PAR). В этой таблице представлен уровень инфицирования в процентах, рассчитанный из числа растений, удостоверенных ОТ-ПЦР, инфицированных соответствующим вирусом, деленных на общее количество агроинъекционных растений. Нет статистической разницы в эффективности инфекции между камерой роста и тепличными условиями (FoMV два хвостатых t-теста p=0,08; SCMV двуххвостый t-тест p=0,96).
| Генотип кукурузы | ФомВ-ЭВ | ФомВ-ЛЕС22 | Общий итог | ||||
| Инфицированный | Итог | % Инфицировано | Инфицированный | Итог | % Инфицировано | % Инфицировано | |
| Кукуруза | 18 | 23 | 78% | 15 | 23 | 65% | 72% |
| МО47 | 7 | 22 | 32% | 1 | 21 | 5% | 19% |
| К55 | 1 | 15 | 7% | 3 | 17 | 18% | 13% |
| В64А | 10 | 22 | 45% | 8 | 20 | 40% | 43% |
| МЧ17 | 0 | 16 | 0% | 0 | 13 | 0% | 0% |
| В73 | 10 | 18 | 56% | 7 | 17 | 41% | 49% |
| В101 | 12 | 21 | 57% | 8 | 24 | 33% | 44% |
| ФР1064 | 4 | 4 | 100% | 4 | 4 | 100% | 100% |
| В104 | 10 | 22 | 45% | 5 | 21 | 24% | 35% |
| ВСЦ22 | 2 | 7 | 29% | 4 | 6 | 67% | 46% |
| А188 | 0 | 3 | 0% | 4 | 6 | 67% | 44% |
Таблица 2: Инфекционная эффективность конструкций FoMV для всех генотипов кукурузы. FoMV-EV и FoMV-LES22 были агроинъектированы в 11 генотипов кукурузы. После инъекции рассаду перенесли в теплицу. В этой таблице подробно описан уровень инфицирования в процентах, рассчитанный на основе числа растений, инфицированных FoMV, подтвержденного ОТ-ПЦР, деленного на общее количество сельскохозяйственных растений. Совокупный общий уровень инфицирования показывает средние показатели инфицирования каждого генотипа для обеих протестированных конструкций FoMV.
| Стадия завода | 4-5 дневных растений | 6-7 дневных растений | Общий итог | ||||
| Симптоматический | Всего растений | % Инфицировано | Симптоматический | Всего растений | % Инфицировано | % Инфицировано | |
| ФомВ-ЭВ | 42 | 72 | 58% | 80 | 170 | 47% | 53% (А) |
| ФомВ-ПДС | 65 | 157 | 41% | 66 | 184 | 36% | 39% (B C) |
| ФомВ-ЛЕС22 | 115 | 195 | 59% | 144 | 292 | 49% | 54% (А Б) |
| ФомВ-ГФП | 16 | 103 | 16% | 37 | 217 | 17% | 16% (С) |
| СКМВ-ГФП | 10 | 95 | 11% | 5 | 82 | 6% | 8% (С) |
Таблица 3: Резюме инъекционных экспериментов. В этой таблице представлена сводка инъекционных экспериментов, проведенных с августа 2017 года по август 2018 года на саженцах сладкой кукурузы Golden Bantam. Растения оценивали на вирусные симптомы (FoMV-EV), заглушающие симптомы (pds и les22) или флуоресценцию GFP (GFP) с помощью визуального (FoMV-EV, FoMV-PDS и FoMV-LES22) или FluorCam (FoMV-GFP и SCMV-GFP) скрининга. Результаты показываются индивидуально для 4-5-дневных растений и 6-7-дневных растений, а также резюме по всем возрастным растениям. Между растениями 4-5-дневного возраста и 6-7-дневными растениями не обнаружено существенной разницы (односторонняя ANOVA, F=0,6513). Существует разница между вирусной конструкцией (Onaway ANOVA, F = <0,0001), с буквами, представляющими отчет о связующих буквах Tukey-Kramer HSD.
Дополнительная таблица 1: Таблица, в которой перечислены все имена и последовательности букв, используемые в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительная таблица 2: Тест на ацетосиргин. (A) Первоначальный тест на ацетозириндон, сравнивающий частоту симптомов фиктивных, FoMV-EV и FoMV-LES22, вводимых растениями между суспензиями прививки 200 мкМ ацетозиргинона (+) или без ацетосиргинона (-). (B) Сравнение скоростей инфицирования FoMV-LES22, определяемых методом ОТ-ПЦР, между инокуляционными суспензиями без ацетосиргинона (-), с 200 мкМ ацетосиргингона (+), и добавлением 20 мкМ ацетосиргинона в бактериальную культуру за 4 часа до повторной суспензии в буфере вместе с добавлением 200 мкМ ацетосириндона к конечной суспензии (++). В целом, не было обнаружено существенной разницы между лечением ацеотисиргиноном (Oneway ANOVA, f = 0,5452). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительный рисунок 1: Флуоресцентная визуализация и молекулярная валидация агроинъекционного SCMV и экспрессия гетерологичных белков в кукурузе. Кукуруза была заложена с модифицированной конструкцией SCMV, содержащей как CDS GFP, так и нано люциферазу (NLuc). (A) Флюоркамовая визуализация использовалась для скрининга и обнаружения GFP. Слева - макет инжекционной установки, а справа - инжекционная установка SCMV-NLucGFP. (B) Экстракты листового белка были разделены SDS-PAGE и оценены на наличие NLuc, GFP и белка оболочки SCMV (CP) с помощью анализа в геле люциферазы или иммуноблота, как указано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Agrobacterium является важным инструментом, который облегчает многочисленные методы молекулярной биологии в исследованиях, связанных с растениями. Это исследование предоставляет протокол агроинъекции для инокуляции вирусных векторов FoMV и SCMV непосредственно в ткани кукурузы для применения VIGS и VOX. Основной целью является повышение простоты и полезности вирусных технологий для исследований в монокотных сельскохозяйственных культурах. Хотя прямая агроинокуляция кукурузы была зарегистрирована для нескольких вирусов, авторы не знают о подробном протоколе, и в этих исследованиях нет примеров применения VIGS и VOX19,22.
Сообщалось и было подтверждено при разработке этого протокола, что место инъекции является ключевым фактором для успешного запуска системной вирусной инфекции через агроинъекцию19. Последовательная инъекция рекомендуемого места на растении считается самой большой переменной, потому что точное положение меристемы в саженцах кукурузы практически не обнаруживается на глаз. Чтобы свести к минимуму межличностные вариации, рекомендуется рассечь несколько саженцев кукурузы до меристемы, чтобы лучше визуализировать ее местоположение (рисунок 3C). Положение меристемы по отношению к колеоптилярному узлу должно быть примерно одинаковым для растений в возрасте 4-7 дней. Кроме того, практика инъекции с окрашенной жидкостью обеспечивает легко видимую демонстрацию того, как «инокулятив» заполняет мутовку листа, и поскольку место инъекции помечено красителем, точность места инъекции может быть подтверждена (рисунок 3G, H). Меристематические ткани наиболее восприимчивы к агроинъекции, но введение суспензий Agrobacterium непосредственно в эту ткань приводит к нежелательным морфологическим эффектам (рисунок 6)19. Растения с поврежденными меристемами выживают, но образовавшиеся дефекты нежелательны, и, таким образом, следует избегать прямых инъекций этой ткани.
Существует несколько переменных, которые могут повлиять на успешный запуск системной вирусной инфекции через агроинъекцию, потому что три сложные биологические системы (растение, вирус и штамм Agrobacterium) должны взаимодействовать в координации. Этому сложному взаимодействию могут способствовать быстро делящиеся клетки меристематической области, что делает ее идеальным местом для агроинокуляции19. Штамм Agrobacterium должен быть в состоянии инфицировать клетки растительных тканей, чтобы доставить Т-ДНК, несущую вирусный геном, и растение должно быть восприимчиво к вирусу, чтобы инициировать вирусную репликацию и системную инфекцию. Генотипы кукурузы различаются по своей восприимчивости к вирусам (например, Mo17 устойчив к FoMV) или штаммам Agrobacterium, но большинство протестированных штаммов, по-видимому, восприимчивы как к FoMV, так и к SCMV (Таблица 1 и Таблица 2)53. Например, инбредная линия FR1064 и сорт сладкой кукурузы Golden Bantam могут быть особенно восприимчивы как к GV3101 Agrobacterium, так и к векторам на основе FoMV.
Количество отобранных листьев и сроки отбора проб для ОТ-ПЦР имеют решающее значение для точной оценки вирусной инфекции. В примерах, показанных здесь, номер листа определяли, начиная с первого округлого листа (широко известного как «лист большого пальца») и отсчитывая вверх. Листья были отобраны после того, как они были расширены, и следующий лист начал появляться. Однако то, какие листья являются оптимальными для отбора проб, может варьироваться в зависимости от используемых видов вируса, условий роста и генотипа кукурузы. Поэтому при применении этого протокола к новой вирусной системе рекомендуется провести эксперимент с начальным временным курсом для оптимизации стратегии отбора проб в отношении листьев и времени.
Используемая специфическая конструкция существенно влияет на эффективность этого протокола. Например, пустые векторы, FoMV-EV и SCMV-EV, а также FoMV-PDS и FoMV-LES22, которые содержат небольшие вставки (313 bp и 329 bp соответственно), обычно производят самый высокий процент растений с вирусными симптомами в этих экспериментах (таблицы 1 и таблица 2). Однако рекомбинантные вирусы, несущие более крупные вставки GFP ORF (720 bp) в FoMV-GFP и SCMV-GFP, имели гораздо более низкие показатели инфицирования по сравнению с растениями, вводимыми с пустым вектором или структурами глушения генов. Эта тенденция может быть связана с негативным воздействием на вирусную пригодность, вызванным увеличением количества экзогенного генетического материала в вирусном геноме. Несколько исследований показали, что стабильность вставки растительных вирусных векторов в значительной степени зависит от размера и последовательности вставки36,54,55,56,57. Кроме того, наблюдалась заметная разница в процентном соотношении растений, которые заражаются после посева пустым вектором FoMV или SCMV, что говорит о том, что для оптимизации этого протокола для SCMV требуется дополнительная работа (таблица 1). Эти результаты указывают на то, что при разработке конструкции может потребоваться некоторое устранение неполадок, поскольку последовательность и длина фрагмента могут влиять на эффективность.
В целом, это исследование показало, что агроинъекция саженцев кукурузы является эффективным методом вакцинации для двух различных РНК-вирусов растений, нескольких векторных конфигураций и 11 генотипов кукурузы. Эта работа с FoMV и SCMV, в сочетании с предыдущими работами, использующими инъекцию вируса хлоротической пятнистости кукурузы (MCMV) или MSV, указывает на то, что агроинъекция подходит для инокуляции саженцев кукурузы инфекционными клонами как РНК, так и ДНК вирусов19,20,21,22. Кроме того, эта работа также показывает, что агроинъекция является жизнеспособным методом для векторов VIGS и VOX и может быть применена к растениям в возрасте четырех дней (таблица 3). Ожидается, что представленный здесь протокол будет легко адаптирован биологами кукурузы для облегчения исследований функциональной геномики, включающих глушение переходных генов (VIGS) и сверхэкспрессию (VOX). Агроинъекция также обладает потенциалом для содействия подходам к редактированию генов на основе вирусов (VEdGE), которые в противном случае были бы ограничены зависимостью от трансформации растений, потенциально повышая эффективность редактирования, а также доступность58,59,60. Учитывая соответствующий штамм Agrobacterium, генотипы кукурузы и вирусные векторы продуманно комбинированы, ожидается, что инокуляция путем агроинъекции станет ценным инструментом для анализа переходной функции генов кукурузы.
Disclosures
У исследователей нет конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Университет штата Айова является частью команды, поддерживающей программу DARPA Insect Allies HR0011-17-2-0053. Эта работа также была поддержана Институтом наук о растениях Университета штата Айова, Центром биоинженерии сельскохозяйственных культур Университета штата Айова, проектом USDA NIFA Hatch No 3808 и фондами штата Айова. K.L.H. также был частично поддержан программой подготовки выпускников Университета штата Айова predictive Plant Phenomics, финансируемой Национальным научным фондом (DGE #1545453), и грантом Сельскохозяйственной и продовольственной исследовательской инициативы No 2019-07318 от Национального института продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США. Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования и сбора, анализа и интерпретации данных, а также в написании рукописи. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, являются мнениями авторов и не обязательно отражают взгляды спонсоров.
Мы благодарим Ника Лаутера (USDA-ARS, Ames, IA) за семена инбредных линий кукурузы, Кристиана Ф. Монтес-Сери (Университет штата Айова) за создание клона FoMV-GFP и Тайлера Остина (Университет штата Айова) за техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
| 15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
| 1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
| 25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
| 28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
| 37°C Incubator | For E. coli | ||
| Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
| Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
| Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
| cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
| DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
| DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
| EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
| Ethanol | For RNA extraction | ||
| Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
| Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
| Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
| FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
| Fluorescence Microscope | |||
| Gel Electrophoresis Box | |||
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
| Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
| Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
| Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
| Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
| Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
| Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
| Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
| MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
| PacI | New England Biolabs | R0547 | |
| Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
| Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
| pH Meter | |||
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
| Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
| PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
| Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
| Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
| SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
| Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
| Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
| Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
| Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Thermocycler | For PCR | ||
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
| Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
| Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| XbaI | New England Biolabs | R0145 |
References
- Zaidi, S. E. A., Mansoor, S. Viral vectors for plant genome engineering. Frontiers in Plant Science. 8, 539 (2017).
- Kant, R., Dasgupta, I. Gene silencing approaches through virus-based vectors: speeding up functional genomics in monocots. Plant Molecular Biology. 100, 3-18 (2019).
- Hu, J., et al. A barley stripe mosaic virus-based guide RNA delivery system for targeted mutagenesis in wheat and maize. Molecular Plant Pathology. 20 (10), 1463-1474 (2019).
- Pasin, F., Menzel, W., Daròs, J. A. Harnessed viruses in the age of metagenomics and synthetic biology: an update on infectious clone assembly and biotechnologies of plant viruses. Plant Biotechnology Journal. 17 (6), 1010-1026 (2019).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B. Plant virus vectors 3.0: Transitioning into synthetic genomics. Annual Review of Phytopathology. 57 (1), 211-230 (2019).
- Mei, Y., et al. Protein expression and gene editing in monocots using foxtail mosaic virus vectors. Plant Direct. 3 (11), 00181 (2019).
- Ruiz, M. T., Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell. 10 (6), 937-946 (1998).
- Bekele, D., Tesfaye, K., Fikre, A. Applications of virus induced gene silencing (VIGS) in plant functional genomics studies. Journal of Plant Biochemistry & Physiology. 07 (01), 1000229 (2019).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Jackson, A. O. Plant virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annual Review of Phytopathology. 34 (1), 299-323 (1996).
- Holzberg, S., Brosio, P., Gross, C., Pogue, G. P. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. Plant Journal. 30 (3), 315-327 (2002).
- Wang, R., et al. An efficient virus-induced gene silencing vector for maize functional genomics research. Plant Journal. 86 (1), 102-115 (2016).
- Redinbaugh, M. G., et al. Transmission of viral RNA and DNA to maize kernels by vascular puncture inoculation. Journal of Virological Methods. 98 (2), 135-143 (2001).
- Scholthof, H. B. The capsid protein gene of tomato bushy stunt virus is dispensable for systemic movement and can be replaced for localized expression of foreign genes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6 (3), 309 (1993).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Kikkert, M., Jackson, A. O. Tomato bushy stunt virus spread is regulated by two nested genes that function in cell-to-cell movement and host-dependent systemic invasion. Virology. 213 (2), 425-438 (1995).
- Scholthof, H. B. Rapid delivery of foreign genes into plants by direct rub-inoculation with intact plasmid dna of a tomato bushy stunt virus gene vector. Journal of Virology. 73 (9), 7823-7829 (1999).
- Zhang, J., et al. Vacuum and co-cultivation agroinfiltration of (germinated) seeds results in tobacco rattle virus (TRV) mediated whole-plant virus-induced gene silencing (VIGS) in wheat and maize. Frontiers in Plant Science. 8, 393 (2017).
- Vaghchhipawala, Z., Rojas, C. M., Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Agroinoculation and agroinfiltration: simple tools for complex gene function analyses. Methods in Molecular Biology. 678, Clifton, N.J. 65-76 (2011).
- Grimsley, N., Hohn, B., Hohn, T., Walden, R. "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83 (10), 3282-3286 (1986).
- Grimsley, N. H., Ramos, C., Hein, T., Hohn, B. Merisfematic tissues of maize plants are most suscepnsle to agroinfection with maize streak virus. Bio/Technology. 6 (2), 185-189 (1988).
- Martin, D. P., Rybicki, E. P. Improved efficiency of Zea mays agroinoculation with Maize streak virus. Plant Disease. 84 (10), 1096 (2000).
- Martin, D. P., Willment, J. A., Rybicki, E. P. Evaluation of maize streak virus pathogenicity in differentially resistant Zea mays genotypes. Phytopathology. 89 (8), 695-700 (1999).
- Wang, Q., et al. Further characterization of Maize chlorotic mottle virus and its synergistic interaction with Sugarcane mosaic virus in maize. Scientific Reports. 7, 39960 (2017).
- Hsieh, M. H., et al. Optimizing virus-induced gene silencing efficiency with Cymbidium mosaic virus in Phalaenopsis flower. Plant Science. 201-202 (1), 25-41 (2013).
- Hsieh, M. H., et al. Virus-induced gene silencing unravels multiple transcription factors involved in floral growth and development in Phalaenopsis orchids. Journal of Experimental Botany. 64 (12), 3869-3884 (2013).
- Zenna, N. S., et al. Genetic analysis of tolerance to rice tungro bacilliform virus in rice (Oryza sativa L.) through agroinoculation. Journal of Phytopathology. 154 (4), 197-203 (2006).
- Marks, M. S., Kemp, J. M., Woolston, C. J., Dale, P. J. Agroinfection of wheat: A comparison of Agrobacterium strains. Plant Science. 63 (2), 247-256 (1989).
- Dasgupta, I., et al. Rice tungro bacilliform virus DNA independently infects rice after Agrobacterium-mediated transfer. Journal of General Virology. 72 (6), 1215-1221 (1991).
- Boulton, M. I., Buchholz, W. G., Marks, M. S., Markham, P. G., Davies, J. W. Specificity of Agrobacterium-mediated delivery of maize streak virus DNA to members of the Gramineae. Plant Molecular Biology. 12 (1), 31-40 (1989).
- Paulsen, A. Q. Purification and properties of foxtail mosaic virus. Phytopathology. 77 (11), 1346 (1977).
- Bancroft, J. B., Rouleau, M., Johnston, R., Prins, L., Mackie, G. A. The entire nucleotide sequence of foxtail mosaic virus RNA. Journal of General Virology. 72 (9), 2173-2181 (1991).
- Bruun-Rasmussen, M., Madsen, C. T., Johansen, E., Albrechtsen, M. Revised sequence of foxtail mosaic virus reveals a triple gene block structure similar to potato virus X. Archives of Virology. 153 (1), 223-226 (2008).
- Rouleau, M., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Partial purification and characterization of foxtail mosaic potexvirus RNA-dependent RNA polymerase. Virology. 197 (2), 695-703 (1993).
- Rouleau, M., Smith, R. J., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein. Virology. 204 (1), 254-265 (1994).
- Samuels, T. D., et al. Subcellular targeting and interactions among the potato virus X TGB proteins. Virology. 367 (2), 375-389 (2007).
- Cho, S. Y., Kim, K. H. Identification of the capsid protein-binding region of the SL1(+) RNA located at the 5' region of the potato virus X genome. Plant Pathology Journal. 28 (1), 75-80 (2012).
- Mei, Y., Zhang, C., Kernodle, B. M., Hill, J. H., Whitham, S. A. A foxtail mosaic virus vector for virus-induced gene silencing in maize. Plant Physiology. 171 (2), 760-772 (2016).
- Bouton, C., et al. Foxtail mosaic virus: A viral vector for protein expression in cereals. Plant Physiology. 177 (4), 1352-1367 (2018).
- Mei, Y., Liu, G., Zhang, C., Hill, J. H., Whitham, S. A. A sugarcane mosaic virus vector for gene expression in maize. Plant Direct. 3 (8), 00158 (2019).
- Gal-On, A., Meiri, E., Huet, H., Hua, W. J., Raccah, B., Gaba, V. Particle bombardment drastically increases the infectivity of cloned DNA of zucchini yellow mosaic potyvirus. Journal of General Virology. 76 (12), (1995).
- Gao, R., et al. Construction of an infectious cDNA clone and gene expression vector of Tobacco vein banding mosaic virus (genus Potyvirus). Virus Research. 169 (1), 276-281 (2012).
- López-Moya, J. J., García, J. A. Construction of a stable and highly infectious intron-containing cDNA clone of plum pox potyvirus and its use to infect plants by particle bombardment. Virus Research. 68 (2), (2000).
- Choi, I. R., French, R., Hein, G. L., Stenger, D. C. Fully biologically active in vitro transcripts of the eriophyid mite-transmitted wheat streak mosaic tritimovirus. Phytopathology. 89 (12), (1999).
- Kim, K. S., et al. Infectivity of in vitro transcripts of Johnsongrass mosaic potyvirus full-length cDNA clones in maize and sorghum. Archives of Virology. 148 (3), 563-574 (2003).
- Stewart, L. R., Bouchard, R., Redinbaugh, M. G., Meulia, T. Complete sequence and development of a full-length infectious clone of an Ohio isolate of Maize dwarf mosaic virus (MDMV). Virus Research. 165 (2), 219-224 (2012).
- Wylie, S. J., et al. ICTV virus taxonomy profile: Potyviridae. Journal of General Virology. 98 (3), 352-354 (2017).
- Shukla, D. D. taxonomy of potyviruses infecting maize, sorghum, and sugarcane in Australia and the United States as determined by reactivities of polyclonal antibodies directed towards virus-specific N-termini of coat proteins. Phytopathology. 79 (2), 223 (1989).
- Shukla, D. D., Ward, C. W. Amino Acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group. Journal of General Virology. 69 (11), 2703-2710 (1988).
- Chung, B. Y. W., Miller, W. A., Atkins, J. F., Firth, A. E. An overlapping essential gene in the Potyviridae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (15), 5897-5902 (2008).
- Jarchow, E., Grimsley, N. H., Hohn, B. virF, the host-range-determining virulence gene of Agrobacterium tumefaciens, affects T-DNA transfer to Zea mays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (23), 10426-10430 (1991).
- Hu, G., Yalpani, N., Briggs, S. P., Johal, G. S. A porphyrin pathway impairment is responsible for the phenotype of a dominant disease lesion mimic mutant of maize. The Plant Cell. 10 (7), 1095 (2007).
- Qin, G., et al. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis. Cell Research. 17 (5), 471-482 (2007).
- Jones, P. Isolation of plasmid DNA from E. coli. Encyclopedia of Life Sciences. , (2003).
- Ji, Q., Yang, B., Lee, M., Chen, Y., Lübberstedt, T. Mapping of quantitative trait loci/locus conferring resistance to foxtail mosaic virus in maize using the intermated B73-×-Mo17 population. Plant Breeding. 129 (6), 721-723 (2010).
- Pacak, A., et al. The brome mosaic virus-based recombination vector triggers a limited gene silencing response depending on the orientation of the inserted sequence. Archives of Virology. 155 (2), 169-179 (2010).
- Miché, L., Battistoni, F., Gemmer, S., Belghazi, M., Reinhold-Hurek, B. Host-dependent expression of Rhizobium leguminosarum bv. viciae hydrogenase is controlled at transcriptional and post-transcriptional levels in legume nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (5), 1323-1331 (2018).
- Yamagishi, M., Masuta, C., Suzuki, M., Netsu, O. Peanut stunt virus-induced gene silencing in white lupin (lupinus albus). Plant Biotechnology. 32 (3), 181-191 (2015).
- Avesani, L., et al. Stability of Potato virus X expression vectors is related to insert size: Implications for replication models and risk assessment. Transgenic Research. 16 (5), 587-597 (2007).
- Ali, Z., et al. Efficient virus-mediated genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (8), 1288-1291 (2015).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B., Mirkov, T. E. Multiplexed gene editing and protein overexpression using a tobacco mosaic virus viral vector. Plant Physiology. 175 (1), 23-35 (2017).
- Ali, Z., Eid, A., Ali, S., Mahfouz, M. M. Pea early-browning virus-mediated genome editing via the CRISPR/Cas9 system in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis. Virus Research. 244, 333-337 (2018).
