Summary
Een agrobacterium-based injection (agroinjectie) protocol wordt gepresenteerd voor de inenting van vossenstaart mozaïek virus en suikerriet mozaïek virusclones in maïs zaailingen. Inenting op deze manier leidt tot virale infectie, virus-geïnduceerde gen-uitschakeling van markergenen en virale overexpressie van GFP.
Abstract
Agrobacterium-gebaseerde inentingsbenaderingen worden veel gebruikt voor het introduceren van virale vectoren in plantenweefsels. Deze studie beschrijft een protocol voor de injectie van maïszaailingen in de buurt van meristematisch weefsel met Agrobacterium die een virale vector draagt. Recombinant vossenstaartmozaïekvirus (FoMV) klonen ontworpen voor gen-uitschakeling en genexpressie werden gebruikt om deze methode te optimaliseren, en het gebruik ervan werd uitgebreid met een recombinant suikerrietmozaïekvirus (SCMV) ontworpen voor genexpressie. Genfragmenten of coderende sequenties van belang worden ingevoegd in een gemodificeerd, infectieus viraal genoom dat is gekloond in de binaire T-DNA plasmide vector pCAMBIA1380. De resulterende plasmideconstructies worden omgezet in Agrobacterium tumefaciens stam GV3101. Maïszaailingen vanaf 4 dagen oud kunnen in de buurt van de coleoptilar-knoop worden geïnjecteerd met bacteriën die zijn geresuspendeerd in MgSO4-oplossing . Tijdens infectie met Agrobacterium wordt het T-DNA dat het virale genoom draagt overgebracht naar maïscellen, waardoor de transcriptie van het virale RNA-genoom mogelijk is. Naarmate het recombinante virus zich repliceert en systemisch door de plant verspreidt, kunnen virale symptomen en fenotypische veranderingen als gevolg van het uitschakelen van de doelgenen laesie nabootsen 22 (les22) of fytoeen desaturase (pds) worden waargenomen op de bladeren, of expressie van groen fluorescerend eiwit (GFP) kan worden gedetecteerd bij verlichting met UV-licht of fluorescentiemicroscopie. Om het virus te detecteren en tegelijkertijd de integriteit van de insert te beoordelen, wordt RNA geëxtraheerd uit de bladeren van de geïnjecteerde plant en wordt RT-PCR uitgevoerd met behulp van primers die de multiple cloning site (MCS) flankeren die de ingebrachte sequentie dragen. Dit protocol is effectief gebruikt in verschillende maïsgenotypes en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar andere virale vectoren, waardoor het een toegankelijk hulpmiddel biedt voor de introductie van virale vectoren in maïs.
Introduction
Infectieuze klonen van veel plantenvirussen zijn ontworpen voor virus-geïnduceerde gen-uitschakeling (VIGS), genoverexpressie (VOX) en meest recent, virus-enabled gene editing (VEdGE)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Naarmate nieuwe virale constructies worden ontwikkeld, moeten ook methoden worden overwogen om plantenweefsels met deze gemodificeerde virussen met succes te infecteren. Huidige methoden om virusinfecties in planten te lanceren omvatten deeltjesbombardement, rub-inenting van in vitro RNA-transcripten of DNA-klonen, vasculaire punctie-inenting of Agrobacterium tumefaciens-inenting (agroinoculatie)5,12,13,14,15,16,17 . Elk van deze inentingsmethoden heeft inherente voor- en nadelen, waaronder kosten, behoefte aan gespecialiseerde apparatuur en haalbaarheid binnen een bepaald plant-virussysteem. Methoden die gebruik maken van infiltratie of injectie van Agrobacterium-stammen die binaire T-DNA-constructies bevatten die zijn ontworpen om recombinante virussen af te leveren, hebben de voorkeur, omdat ze eenvoudig en goedkoop zijn. Gedetailleerde agroinoculatiemethoden voor eenzaadlobbige soorten zoals Zea mays (maïs) ontbreken echter.
Een van de eerste rapporten over agroinoculatie voor virusafgifte werd gepubliceerd in 1986, toen het genoom van bloemkoolmozaïekvirus (CaMV) werd ingebracht in een T-DNA-constructie en de resulterende Agrobacterium die dit construct droeg, werd ingewreven op raapplanten18. Aanvullende methoden voor agroinoculatie zijn sindsdien ontwikkeld. In het geval van vossenstaartmozaïekvirus (FoMV) kan Nicotiana benthamiana bijvoorbeeld worden gebruikt als tussengastheer om virusdeeltjes in bladeren te genereren die een entbron vormen6. Wrijfinenting van maïs met behulp van geïnfecteerde N. benthamiana-bladeren is efficiënt, snel en eenvoudig, maar het gebruik van een tussengastheer werkt niet voor alle maïs-infecterende virussen. Suikerrietmozaïekvirus (SCMV) kan bijvoorbeeld N. benthamiana niet infecteren, waardoor het gebruik van alternatieve entbronnen voor vectoren die van dit virus zijn afgeleid, vereist is. In 1988 werd Agrobacterium containing maize streak virus (MSV), een DNA-virus, via injectie (agro-injectie) in maïszaailingen geïntroduceerd, wat aantoont dat agrobacterium-gebaseerde inentingsmethoden ook nuttig zijn voor monocots19. Ondanks dit vroege succes met agro-injectie, zijn er weinig studies gepubliceerd die deze techniek in maïs gebruiken, waardoor er open vragen zijn over de toepasbaarheid van deze methode voor RNA-virussen en VIGS-, VOX- en VEdGE-vectoren20,21,22. Een breed gebruik van agro-injectie bij eenzaadlobbige soorten is echter veelbelovend, omdat deze algemene aanpak is gebruikt in orchideeën, rijst en tarwe23,24,25,26,27,28.
Dit protocol is geoptimaliseerd voor FoMV en Agrobacterium stam GV3101 en is ook toegepast op een SCMV vector. FoMV is een potexvirus met een breed gastheerbereik dat 56 eenzaadlobbige en tweezaadlobbige soorten omvat29. FoMV heeft een 6,2 kilobase (kb) positief zintuig, enkelstrengs RNA-genoom dat codeert voor vijf verschillende eiwitten uit vijf open leesframes (ORF's)30,31,32,33,34,35. FoMV werd eerder ontwikkeld tot zowel een VIGS- als VOX-vector voor maïs door een infectieuze kloon op te nemen in een T-DNA-plasmide-backbone6,36,37. Het virale genoom werd voor VIGS-toepassingen aangepast door toevoeging van een kloonplaats (MCS1*) direct stroomafwaarts van het vachteiwit (CP) (figuur 1A)36. Voor VOX- en VEdGE-toepassingen werd de CP-promotor gedupliceerd en werd een tweede kloonlocatie (MCS2) toegevoegd om het invoegen van interessante sequenties tussen ORF 4 en de CP mogelijk te maken (figuur 1B)6. De FoMV-vector die zowel MCS1 als MCS2 zonder inserts bevat, is FoMV lege vector (FoMV-EV) (figuur 1).
SCMV is een niet-verwant virus dat is ontwikkeld voor VOX in maïs38. Het is een lid van de Potyviridae-familie, waarvan verschillende leden zijn ontworpen om vreemde eiwitten in planta39,40,41,42,43,44 tot expressie te brengen. Het gastheerbereik van SCMV omvat maïs, sorghum en suikerriet45,46, waardoor het waardevol is voor genfunctionele studies in deze belangrijke gewasplanten36,38. SCMV heeft een positief zintuiglijk, enkelstrengs RNA-genoom van ongeveer 10 kb lang47,48. Om de SCMV VOX-vector te maken, werd de gevestigde P1 /HCPro-junctie gebruikt als een insertieplaats voor heterologe sequenties38. Deze kloonplaats wordt gevolgd door sequentiecodering van een NIa-Pro proteasesplitsingsplaats, wat leidt tot de productie van eiwitten die onafhankelijk zijn van het SCMV-polyproteïne (figuur 1C).
T-DNA plasmiden die infectieus cDNA van deze recombinante virussen dragen, zijn omgezet in Agrobacterium stam GV3101. GV3101 is een nopaline-type stam, waarvan bekend is dat ze T-DNA kunnen overbrengen naar eenzaadlobbige soorten, waaronder maïs26,28,49. Bovendien hebben eerdere agro-injectiestudies de stammen C58 of het derivaat GV3101 gebruikt, evenals19,20,22,27.
Bij de ontwikkeling van dit protocol zijn drie markergenen gebruikt: twee voor gen-uitschakeling en één voor genexpressie. Een 329 base-pair (bp) fragment van het maïsgen laesie nabootsen 22 (les22, GRMZM2G044074) werd gebruikt om de dempingsvector FoMV-LES22 te construeren. Wanneer les22 in maïs tot zwijgen wordt gebracht, verschijnen kleine, ronde vlekken van necrotische cellen langs de vasculatuur van bladeren die uitzetten en samensmelten tot grote gebieden necrotisch bladweefsel50. FoMV-PDS, met een 313 bp-fragment van het sorghumgen fyto-etreendesaturase (pds, LOC110436156, 96% sequentie-identiteit naar maïs pds, GRMZM2G410515), induceert uitschakeling van pds in maïs, wat resulteert in kleine strepen van gefotobleekte cellen langs de vasculatuur van de bladeren die in de loop van de tijd verlengen51. De intacte coderende sequentie voor groen fluorescerend eiwit (GFP) werd gebruikt om eiwitexpressie aan te tonen voor zowel FoMV (FoMV-GFP) als SCMV (SCMV-GFP). GFP-expressie in de bladeren is meestal het meest detecteerbaar 14 dagen na inenting (DPI)6. Hoewel er eerdere studies zijn geweest met agro-injectie van virale vectoren in maïs, hebben deze experimenten alleen aangetoond dat agro-injectie virale infectie van een infectieuze kloon in maïszaailingen kan vergemakkelijken en zich niet uitbreidt naar recombinante virussen die zijn ontworpen voor VIGS- of VOX-toepassingen19,20,21,22. Het hier gepresenteerde protocol bouwt voort op eerdere agro-injectiemethoden, met name Grismley et al.19. Over het algemeen is deze agro-injectiemethode compatibel met VIGS- en VOX-vectoren, vereist deze geen gespecialiseerde apparatuur of alternatieve gastheren als entbronnen en vermindert het de totale tijd en kosten die nodig zijn om inentingen op te zetten en uit te voeren ten opzichte van andere gangbare methoden die biolistica of in vitro transcriptie vereisen. Dit protocol zal functionele genomics studies in maïs vergemakkelijken met toepassingen met VIGS, VOX en VEdGE.
Protocol
1. Plasmide constructie
OPMERKING: Dit protocol kan worden toegepast op andere virale vectoren of Agrobacterium-stammen , maar dit kan het algehele succes van inenting door agro-injectie beïnvloeden. Voer altijd bacteriële inentings- en platingstappen uit in een laminaire stroomkap.
- FoMV geluidsdemping construct
OPMERKING: Luria-Bertani (LB) media (Miller) wordt gebruikt voor alle media, tenzij anders aangegeven. Vloeibare LB wordt gemaakt door 25 g korrels in 1.000 ml gedestilleerd water te suspenseren en gedurende 15 minuten bij 121 °C te autoclaveren. Solid LB-media worden op dezelfde manier gemaakt met de toevoeging van 1,5% agar vóór het autoclaveren. Antibiotica worden toegevoegd nadat LB is afgekoeld tot ~ 60 ° C en de oplossing wordt in petriplaten van 95 x 15 mm gegoten. De te gebruiken antibioticaconcentraties zijn als volgt: rifampicine (rif) bij 25 μg/ml, gentamycine (gent) bij 50 μg/ml en kanamycine (kan) bij 50 μg/ml.- PCR versterkt fragmenten van het maïsgen die moeten worden gedempt (bijvoorbeeld les22 of pds) met behulp van een voorwaartse primer met een PacI-restrictieplaats en een omgekeerde primer met een XbaI-restrictieplaats. Dit zal ligatie van de genfragmenten in de MCS1* van de FoMV-pCAMBIA1380 binaire vector in de antisense oriëntatie mogelijk maken.
OPMERKING: Stel de PCR in met behulp van een high-fidelity DNA-polymerase, voorwaartse en omgekeerde primers op 10 μM elk, plasmide DNA-sjabloon en water, volgens de DNA-polymerasespecificaties. Amplificeer gedurende 35 cycli, met behulp van een gloeitemperatuur volgens de DNA polymerase en primer smelttemperatuur (Tm), en een 30 s extensie per kilobase die moet worden versterkt. - Voer PCR-zuivering uit met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de specificaties van de kit.
- Verteer het gezuiverde PCR-product en de FoMV-EV met de restrictie-enzymen XbaI en PacI. Gebruik 1 μg plasmide of het hele gezuiverde PCR-product, 2 μL 10x buffer, 1 μL restrictie-enzym en voeg water toe om een eindreactievolume van 20 μL te maken. Incubeer volgens enzymspecificatie.
- Ligate het verteerde PCR-product en FoMV-EV samen met T4 DNA-ligase volgens het protocol van de fabrikant.
- Transformeer het geligeerde plasmide in DH5α chemisch competente E. coli-cellen met behulp van de heat shock-methode.
- Ontdooi cellen op ijs en voeg 3 μL plasmide toe aan de buis. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten en vervolgens een hitteschok gedurende 30 s bij 42 °C.
- Leg 5 minuten op ijs, voeg 200 μL superoptimale bouillon met katabole onderdrukking (SOC) toe en laat E. coli-cellen gedurende 1 uur bij 37 °C herstellen in SOC-media met schudden bij 225 tpm.
- Plaat op kanamycine selectieve LB media en incubeer bij 37 °C 's nachts.
- Controleer kolonies op nauwkeurige klonen door Sanger-sequencing met behulp van de primers FM-5840F en FM-6138R (aanvullende tabel 1). Dien 250 ng plasmide-DNA in bij een faciliteit die Sanger-sequencing zal uitvoeren. Voor dit experiment werden monsters verzonden naar Iowa State University DNA Core Facility.
- Ent 2 ml vloeibare LB met de gekozen kolonie en incubeer bij 37 °C 's nachts met schudden bij 225 tpm. Extract plasmide DNA uit de nachtkweek door middel van een alkalische lysis plasmide DNA-preparaat52.
- Transformeer plasmide-DNA in Agrobacterium stam GV3101-cellen met behulp van de vries-dooimethode. Laat 100 μL chemisch competente cellen ontdooien op ijs, voeg 1-5 μL plasmide toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Breng gedurende 1 min vloeibare stikstof aan en incubeer vervolgens bij 37 °C gedurende 3 min. Voeg 1 ml SOC toe, laat 2-3 uur bij 28 °C herstellen met schudden, plaat op rif, gent en kan selectieve LB-media en incubeer bij 28 °C gedurende 2 dagen.
- Scherm kolonies op de aanwezigheid van insert met kolonie PCR. Kies een enkele bacteriekolonie en meng deze in 30 μL water. Stel een PCR-reactie in door toevoeging van 12,5 μL polymerasemastermix, 1,25 μL van elke 10 μM primer, FM-5840F en FM-6138R, 3 μL van de bacteriële koloniesuspensie en water tot een eindvolume van 25 μL. Cyclus 35 keer met een gloeitemperatuur van 64 °C en een verlengingstijd van 1 min (1 min voor elke kb versterkt).
- Ent 2-5 ml vloeibare LB (rif, gent, kan) met de juiste Agrobacterium-kolonie . Laat het een nacht groeien bij 28 °C met schudden bij 225 rpm.
- Meng de nachtcultuur met een 50% glyceroloplossing 1:1. Bewaren bij -80 °C voor langdurige opslag.
- PCR versterkt fragmenten van het maïsgen die moeten worden gedempt (bijvoorbeeld les22 of pds) met behulp van een voorwaartse primer met een PacI-restrictieplaats en een omgekeerde primer met een XbaI-restrictieplaats. Dit zal ligatie van de genfragmenten in de MCS1* van de FoMV-pCAMBIA1380 binaire vector in de antisense oriëntatie mogelijk maken.
- FoMV expressie construct
- PCR versterkt de coderingsvolgorde van belang, inclusief start- en stopcodons (bijv. GFP) zoals beschreven in 1.1.1, door een Bsu36I-restrictiesite toe te voegen op de voorwaartse primer en een PspOMI-restrictiesite op de omgekeerde primer om directioneel klonen in de zinsoriëntatie in MCS2 mogelijk te maken.
- Voer PCR-zuivering uit met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de specificaties van de kit.
- Verteer het PCR-product en de FoMV-EV met de restrictie-enzymen Bsu36I en PspOMI, zoals beschreven in 1.1.3.
- Ligate het verteerde PCR-product en FoMV-EV samen met T4 DNA-ligase volgens het protocol van de fabrikant.
- Transformeer in DH5α chemisch competente E. coli-cellen met behulp van de hitteschokmethode zoals beschreven in 1.1.5. Plaat op kanamycine selectieve LB media en incubeer bij 37 °C 's nachts.
- Controleer kolonies op nauwkeurige klonen door Sanger-sequencing zoals beschreven in 1.1.6 met behulp van de primers 5AmuS2 en 5AmuA2 (aanvullende tabel 1).
- Ent 2 ml vloeibare LB met de gekozen kolonie en incubeer bij 37 °C 's nachts met schudden bij 225 RPM. Extract plasmide DNA uit de nachtkweek door middel van een alkalische lysis plasmide DNA-preparaat52.
- Transformeer plasmide-DNA in Agrobacterium stam GV3101 chemisch competente cellen met behulp van de vries-dooimethode zoals beschreven in 1.1.8. Plaat op rif, gent en kan selectieve LB media en incubeer bij 28 °C gedurende 2 dagen.
- Scherm kolonies op de aanwezigheid van insert met kolonie PCR met behulp van de primers 5AmuS2 en 5AmuA2.
- Ent 2-5 ml vloeibare LB (rif, gent, kan) met de juiste Agrobacterium kolonie. Schud 's nachts bij 225 rpm bij 28 °C.
- Meng de nachtcultuur met een 50% glyceroloplossing 1:1. Bewaren bij -80 °C voor langdurige opslag.
- SCMV-expressieconstruct
- PCR versterkt het gen van belang (bijv. GFP) met uitzondering van het stopcodon zoals beschreven in 1.1.1, inclusief een PspOMI-verteringsplaats op de voorwaartse primer en een SbfI-verteringsplaats op de omgekeerde primer om directioneel klonen in de SCMV-pCAMBIA1380 binaire vector mogelijk te maken.
OPMERKING: Insert moet worden gekloond in frame met het virale polyproteïne. - Voer PCR-zuivering uit met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de specificaties van de kit.
- Verteer het PCR-product en de SCMV-EV met de restrictie-enzymen PspOMI en SbfI, zoals beschreven in 1.1.3.
- Ligate het verteerde PCR-product en SCMV-EV samen met T4 DNA-ligase volgens het protocol van de fabrikant.
- Transformeer het product in DH5α chemisch competente E. coli-cellen met behulp van de hitteschokmethode zoals beschreven in 1.1.5. Plaat op kan selectieve LB media en incubeer bij 37 °C gedurende de nacht.
- Scherm kolonies voor nauwkeurige klonen door Sanger sequencing zoals beschreven in 1.1.6 met behulp van de primers SC-745F en HCProR1 (aanvullende tabel 1).
- Ent 2 ml vloeibare LB met de gekozen kolonie en incubeer bij 37 °C 's nachts met schudden bij 225 tpm. Extraheer het plasmide-DNA uit de nachtkweek door middel van een alkalisch lysisplasmide DNA-preparaat52.
- Transformeer het plasmide-DNA in Agrobacterium stam GV3101 chemisch competente cellen met behulp van de vries-dooimethode zoals beschreven in 1.1.8. Plaat op rif, gent en kan selectieve LB media en incubeer bij 28 °C gedurende 2 dagen.
- Scherm kolonies op aanwezigheid van insert met kolonie PCR met de primers SC-745F en HCProR1 zoals beschreven in 1.1.9.
- Ent 2-5 ml vloeibare LB (rif, gent, kan) met de juiste Agrobacterium-kolonie . Schud 's nachts bij 225 rpm bij 28 °C.
- Meng de nachtcultuur met een 50% glyceroloplossing 1:1. Bewaren bij -80 °C voor langdurige opslag.
- PCR versterkt het gen van belang (bijv. GFP) met uitzondering van het stopcodon zoals beschreven in 1.1.1, inclusief een PspOMI-verteringsplaats op de voorwaartse primer en een SbfI-verteringsplaats op de omgekeerde primer om directioneel klonen in de SCMV-pCAMBIA1380 binaire vector mogelijk te maken.
2. Zaailing voorbereiding
- Plant 1-2 maïszaden ('Golden Bantam' suikermaïs, FR1064, B73, enz.) in een op turf gebaseerd groeimedium in kleine inserts die 4-7 dagen voor injectie in trays worden geplaatst. Plaats in een groeikamer onder 16 uur dagen bij 25 °C en 8 uur 's nachts bij 22 °C (~185 fotosynthetisch actieve straling (PAR)) of in een kas onder 16 uur dagen bij 22-25 °C en 8 uur 's nachts bij 22-25 °C (350-400 PAR).
OPMERKING: De gevoeligheid voor Agrobacterium varieert tussen maïsgenotypes, wat van invloed is op de slagingspercentages. Bovendien kunnen sommige virale vectoren onverenigbaar zijn met bepaalde maïsgenotypes. - Geef regelmatig water en bemest eenmaal per week met 15-5-15 vloeibare meststof bij 330 delen per miljoen (PPM).
3. Bereiding van Agrobacterium
- Bereid een dag voor de injectie LB vloeibare media met het juiste antibioticum (rif, gent, kan) en en ent met de Agrobacterium-stam die de gewenste virale constructie draagt. Het wordt aanbevolen om 20 μL glycerolbouillon toe te voegen aan 50 ml LB, wat voldoende bacteriecultuur zou moeten opleveren om >100 planten te enten en naar behoefte kan worden opgeschaald of verlaagd.
OPMERKING: Bereid voldoende entmateriaal voor op een uiteindelijke hoeveelheid bacteriële suspensie van ten minste 1 ml bij een optische dichtheid van 600 nm (OD600) van 1,0 voor elke 4-5 planten. - Schud bij 225 tpm bij 28 °C gedurende 24 uur.
- Pelletbacteriën gedurende 10 min bij 4.000 x g bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.
- Was de pellet grondig met 1 ml gedeïoniseerd (DI) water door pipetteren of zacht vortexen.
- Herhaal stap 3.3 om bacteriën te pelleteren.
- Resuspend de pellet in 1 ml 10 mM MgSO4-oplossing door pipetteren of zacht vortexen.
- Voeg eventueel 200 μM acetosyringon toe aan de oplossing. Hoewel vaak gebruikt, verbetert acetosyringon alleen het transformatievermogen van sommige Agrobacterium-stammen . De auteurs hebben niet gevonden dat de toevoeging van acetosyringon de efficiëntie in dit protocol beïnvloedt (aanvullende tabel 2).
OPMERKING: 10 mM MgSO4-oplossing kan worden gemaakt van een 1 M-stamoplossing met een pH van 6,3, bewaard bij kamertemperatuur. Oplossing vereist waarschijnlijk geen pH-aanpassing.
- Voeg eventueel 200 μM acetosyringon toe aan de oplossing. Hoewel vaak gebruikt, verbetert acetosyringon alleen het transformatievermogen van sommige Agrobacterium-stammen . De auteurs hebben niet gevonden dat de toevoeging van acetosyringon de efficiëntie in dit protocol beïnvloedt (aanvullende tabel 2).
- Meet OD600 van het monster met een spectrofotometer en verdun tot 1,0 OD600 met 10 mM MgSO4-oplossing .
OPMERKING: Dit is een veilige stopplaats. Bacteriële suspensie kan tot 5 uur vóór injectie bij kamertemperatuur worden gehouden.
4. Injectie
OPMERKING: Maïszaailingen van 4-7 dagen oud kunnen worden gebruikt voor injectie. De groeisnelheid van zaailingen wordt sterk beïnvloed door groeiomstandigheden, hoeveelheid PAR (d.w.z. hogere PAR in kas dan in groeikamer) en genotype, onder andere dat moeilijk te beheersen kan zijn in kasomstandigheden. Planten kunnen worden geïnjecteerd zo jong als 4 dagen oud wanneer ze 2-3 cm hoog zijn zonder uitgevouwen bladeren en zo oud als 7 dagen wanneer het onderste afgeronde puntblad wordt uitgebreid. Het succespercentage van deze inentingsmethoden daalt snel naarmate planten ouder worden dan 7 dagen na het zaaien. De injectieplaats is hetzelfde, ongeacht de leeftijd van de zaailingen.
- Draag een veiligheidsbril en injecteer de bacteriële suspensie in de zaailingen 2-3 mm boven de coleoptilar node met behulp van een 25G x 5/8 "naald bevestigd aan een 1 ml wegwerpspuit.
OPMERKING: De coleoptilar node is waar kroonwortels zich uiteindelijk zullen vormen. Dit is het laagste knooppunt op de plant. Meestal zal er een kleurverandering zijn van groen naar wit op en onder het knooppunt. De injectieplaats ligt net boven het meristeem. Het ontleden van een paar zaailingen in dit stadium kan helpen bij het visualiseren van de locatie van het meristeem en bijgevolg de juiste injectieplaats. - Oefen zachte druk uit op de spuit totdat de suspensie de coleoptile vult of zichtbaar is in de krans, afhankelijk van het groeistadium van de planten. Dit is ongeveer 100-200 μL suspensie.
OPMERKING: Als het moeilijk is om de suspensie in de zaailing te injecteren, kan de injectieplaats te laag zijn. Matige druk is alles wat nodig zou moeten zijn om de suspensie te injecteren. - Injecteer alle zaailingen en vervang spuiten en naalden voor elk construct.
5. Continue plantenverzorging
- Verplant de geïnjecteerde zaailingen naar 13 x 13 x 15 cm of grotere potten wanneer ze 7-8 dagen oud zijn.
- Zorg voor groeiomstandigheden (16 uur fotoperiode en één keer per week bemesten).
6. Bevestiging van infectie (Fenotypisch en RT-PCR)
- Fenotypisch scoren planten tussen 14-21 DPI. Laesies van het uitschakelen van de controlegenen laesie bootsen 22 of fytoeen desaturase na op de bladeren en zijn te onderscheiden van FoMV-symptomen. GFP-expressie kan worden gedetecteerd via fluorescerende microscoopbeeldvorming of andere UV-lichtbeeldvorming.
OPMERKING: Sommige constructen/virale vectoren kunnen langer duren om symptomen te vertonen of kunnen helemaal geen symptomen vertonen. Hoge lichtomstandigheden verhogen de fenotypen die worden veroorzaakt door het uitschakelen van laesies die 22 en fytoeendesaturase nabootsen. Laesies kunnen minder zichtbaar of afwezig zijn als planten in omstandigheden met minder licht worden gehouden, zoals een groeikamer, maar de werkelijke infectiegraad zoals bepaald door RT-PCR mag niet worden beïnvloed (tabel 1). - Om de infectie moleculair te bevestigen, monster blad 6 tussen 14-21 DPI en extraheer totaal RNA met behulp van een fenol-chloroform extractie volgens de instructies van de fabrikant.
- Het geëxtraheerde RNA gebruiken als sjabloon om eerste-streng cDNA te genereren.
- Stel de cDNA-reactie in met maximaal 5 μg totaal RNA, 1 μL willekeurige hexameerprimers, 1 μL oligo (dT)18 primers, 1 μL dNTPs, 1 μL reverse transcriptase en water voor een eindvolume van 14,5 μL.
- Gebruik primers die zijn ontworpen voor het virale construct en het cDNA als sjabloon, voer PCR uit op elk monster om virale infectie te bevestigen en de integriteit van het gen of genfragment van belang te bepalen zoals beschreven in 1.1.1, behalve cycli te verminderen tot 25 voor FoMV en 30 voor SCMV om valse positieven te voorkomen.
- Gebruik voor FoMV-dempingsconstructies primers FM-5840F en FM-6138R om te versterken over de MCS1*, die het maïsgenfragment bevat. Gebruik voor FoMV-expressieconstructies primers 5AmuS2 en 5AmuA2 om te versterken over de MCS2, die het ingebrachte gen bevat.
- Gebruik voor SCMV-expressieconstructies primers SC745-F en HCProR1 om te versterken over het MCS, dat het ingebrachte gen bevat (aanvullende figuur 3).
- Gebruik voor een endogeen controlegen primers ZmActS en ZmActA, die een mRNA-fragment van maïsactine (GRMZM2G126010) of primers ZmUbiF en ZmUbiR versterken, die een mRNA-fragment van maïspolyubiquitine (GRMZM2G409726_T01) versterken.
- Visualiseer het PCR-product op een 1% agarosegel met een nucleïnezuurkleuring om de aan- of afwezigheid van virus en gen- of genfragment te bepalen.
Representative Results
Het doel van deze studie was om een eenvoudig protocol te ontwikkelen voor het direct introduceren van recombinante virussen die zijn ontworpen voor gen-uitschakeling of genexpressie in maïszaailingen (figuur 2). De virusvectoren met inserts zijn ontworpen en gekloond met behulp van standaard moleculair biologische technieken. Genfragmenten voor uitschakeling worden in MCS1* inGebracht in FoMV-EV en coderende sequenties voor expressie worden ingevoegd in FoMV-EV bij MCS2 of SCMV-EV bij MCS. De resulterende plasmiden worden overgebracht naar Agrobacterium stam GV3101. Vervolgens worden maïszaailingen binnen een week of minder na het planten geïnjecteerd. Twee weken na injectie kunnen planten zowel fenotypisch als moleculair worden beoordeeld op virale infectie, gen-uitschakeling en genexpressie.
Maïsplanten worden gedurende 4-7 dagen gekweekt in een medium op basis van turf. In dit stadium bevindt het scheut-apicale meristeem zich net boven de coleoptilar-knoop (figuur 3A). Nadat de coleoptiel 2-3 centimeter of tot 7 dagen na het zaaien is uitgeschoven, worden planten 2-3 mm boven de coleoptilar node geïnjecteerd (figuur 3B-F). Ongeveer 12 dagen na injectie beginnen planten fenotypen op hun bladeren te vertonen, vaak waargenomen in de buurt van vasculair weefsel, en deze laesies zijn visueel verschillend van FoMV virale mozaïeksymptomen (figuur 4). Zowel de aanwezigheid van FoMV als het uitschakelen van doelgenen is detecteerbaar in geïnjecteerde planten (figuur 5). GFP-expressie kan 2 weken na injectie worden gedetecteerd onder een fluorescerende microscoop en is het sterkst op bladeren 5-7 (figuur 6). Wanneer waargenomen onder een fluorescentiebeeldvormingssysteem, kan GFP-expressie van FoMV worden gevisualiseerd als vele kleine, punctate gebieden van fluorescentie verdeeld over bladeren in de buurt van vasculair weefsel, terwijl GFP-expressie van SCMV bestaat uit grotere vlekken (figuur 6, aanvullende figuur 1). Hoewel virale mozaïeksymptomen vaak zichtbaar zijn op planten die zijn geïnfecteerd met FoMV-uitschakelingsconstructies, hebben planten die zijn geïnjecteerd met GFP-expressieconstructies die met succes GFP tot expressie brengen, deze symptomen vaak niet. Als gevolg hiervan kan een plant zonder zichtbare symptomen nog steeds positief zijn voor virus- en GFP-expressie. Bovendien moet het doorboren van het meristeem tijdens de agro-injectieprocedure worden vermeden, omdat dit morfologische defecten kan veroorzaken, maar de resulterende planten overleven en zijn vaak symptomatisch (figuur 7).
Hoewel dit protocol oorspronkelijk is ontwikkeld met behulp van suikermaïs, kunnen verschillende maïsinteeltlijnen met succes worden ingeënt met FoMV-gen-uitschakelingsconstructies met behulp van agro-injectie. FR1064 en B73 hebben bijvoorbeeld meestal hoge percentages virale infecties (tabel 2). Met name Mo17, een lijn met bekende genetische resistentie tegen FoMV, had een infectie-efficiëntie van 0% zoals verwacht36,53. Bovendien beïnvloedt het gebruikte construct de infectie-efficiëntie (tabel 3). In het geval van FoMV hebben FoMV-EV en FoMV-LES22 doorgaans de hoogste infectie-efficiëntie met respectievelijk 53% en 54%. FoMV-PDS heeft een iets lager rendement met 38% en FoMV-GFP is het laagst met 17%. SCMV-GFP heeft een infectie-efficiëntie van 8%. Deze percentages zijn gemiddelden over verschillende experimenten; individuele experimenten kunnen een hogere of lagere infectie-efficiëntie hebben.
Figuur 1: Schematische weergaven van de FoMV- en SCMV T-DNA-klonen die worden gebruikt voor agro-injectie in maïs. De FoMV-vector bevat twee meerdere kloonlocaties (MCS1* en MCS2). De lege vector, FoMV-EV, is 7.269 bp en bevat geen inserts in beide MCS. (A) Gen-uitschakeling met behulp van de FoMV-vector kan worden bereikt door genfragmenten in MCS1* in te brengen, aangeduid als sequence of interest (SOI), meestal in de anti-zintuiglijke oriëntatie. (B) Genexpressie met behulp van de FoMV-vector kan worden bereikt door gen-ORF's in de MCS2 in te brengen in de zinsoriëntatie, aangeduid als SOI. (C) De SCMV-vector is ontworpen om één MCS tussen P1 en HCPro te hebben. De lege vector, SCMV-EV, is 11.015 bp en bevat geen inserts in de MCS. Gen ORF's die in het MCS worden ingebracht en die in beeld zijn met het SCMV-polyproteïne, zullen tot expressie worden gebracht als eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematische samenvatting van het agro-injectieprotocol. (A) Kloon SOI, hetzij een CDS- of genfragment, in de virale vector en transformeer in Agrobacterium stam GV3101. (B) Plant maïs en kweek gedurende 4-7 dagen. (C) Kweek GV3101 's nachts in vloeibare cultuur bij 28 °C. (D) Bereid bacteriële suspensie voor injectie. (E) Injecteer zaailingen 2-3 mm boven de coleoptilar node met 100-200 μL suspensie. (F) Transplanteer zaailingen wanneer ze 7 dagen oud zijn naar grotere potten en groei gedurende 2-3 weken totdat het 5e blad zichtbaar is. Fenotype indien gewenst. (G) Monster blad 5 en extraheer RNA. (H) Maak cDNA en voer PCR uit om virus/SOI te versterken. (I) Voer uit op gel voor kwalitatieve analyse om de aan- en afwezigheid van virus en een afgeknotte of intacte SOI te bepalen. Deze figuur is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Agro-injectiemethode voor het inenten van zaailingen net boven de coleoptile node. (A) 4-5 dagen oude planten. De coleoptiel is volledig uitgezet en het eerste echte blad kan gedeeltelijk zichtbaar zijn, maar wordt niet ontvouwd. (B) Planten van 6 tot 7 dagen oud. Het eerste blad kan worden uitgebreid, maar er zullen geen kragen zichtbaar zijn. Het tweede blad zal ook zichtbaar zijn en kan zich in dit stadium beginnen te ontvouwen. (C) Dissectie van 6-7 dagen oude planten die de locatie van het scheut apicale meristeem ten opzichte van de coleoptiele knoop laten zien. (D) Injectie van 4-5 dagen oude planten. (E) Injectie van 6-7 dagen oude planten. (F) Injectie van 6-7 dagen oude planten met behulp van een verfoplossing, met geverfd entmateriaal dat uit de krans van de zaailing komt. (G) Close-up van de injectieplaats van 6-7 dagen oude planten ten opzichte van de coleoptielknoop. (H) Close-up van een 6-7 dagen oude plant na injectie, met geverfd entmateriaal in de krans van de plant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Symptomen van de dempingscontrolegenen die worden gebruikt in de agro-injectie-experimenten. (A) Een blad gefotografeerd bij 17 DPI nadat de plant was geïnjecteerd met FoMV-LES22. FoMV-LES22 draagt een 329 bp insert van de 3' CDS van de laesie bootst 22 maïs gen na in de antisense oriëntatie. Uitschakeling resulteert in de accumulatie van een toxische metaboliet die op zijn beurt de necrotische laesies veroorzaakt die eerst verschijnen als strepen langs vasculatuur en uitgroeien tot grotere vlekken zoals hier getoond. (B) Een blad gefotografeerd bij 17 DPI nadat de plant was geïnjecteerd met FoMV-PDS. FoMV-PDS draagt een 313 base pair insert van de 3' CDS van het sorghum fytoeen desaturase gen in de antisense oriëntatie. Het uitschakelen van pds in maïs veroorzaakt een systemisch fotobleaching fenotype dat begint als kleine, dunne strepen langs vasculatuur die uitgroeien tot langere strepen over de lengte van het blad zoals hier afgebeeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: qRT-PCR van planten geïnjecteerd met FoMV gen-uitschakelingsconstructies. Bevestiging van systemische FoMV-infectie en gen-uitschakeling geïnduceerd door de FoMV-LES22- en FoMV-PDS-constructies die worden geleverd via agro-injectie in suikermaïsplanten (Golden x Bantam). (A) De gelbeelden tonen RT-PCR-analyses die de aanwezigheid bevestigen van FoMV-MCS1* lege vector (315 bp amplicon) en FoMV-PDS (625 bp amplicon) in blad 6 van vijf afzonderlijke planten. De gebruikte PCR-primers produceren een amplicon dat MCS1* overspant. Het maïsgen actine (Zm-Actin) amplicon dient als referentiegen. Het staafdiagram vertegenwoordigt de qRT-PCR relatieve expressiewaarden voor pds-expressie in blad 6 na 37 dagen na inenting (DPI) door agro-injectie met FoMV-MCS1* of FoMV-PDS. Onderdrukking van pds is detecteerbaar in elk van de vijf biologische replicaties (p = 0,003; post hoc Dunnett's test; foutbalken geven standaarddeviatie (SD) van drie technische replicaties aan). (B) De gelbeelden tonen RT-PCR-analyses die de aanwezigheid van FoMV-MCS1* (315 bp amplicon) in blad 6 van vijf afzonderlijke planten bevestigen. FoMV-LES22 (625 bp amplicon) werd gedetecteerd in blad 6 weefsel (monsters FoMV-LES22 1-5, 38 DPI) en blad 4 (monsters FoMV-LES22 6-10, 20 DPI) voor tien individuele planten. Het Zm-Actine amplicon diende als referentiegen. Het staafdiagram vertegenwoordigt de qRT-PCR relatieve expressiewaarden voor les22-expressie in maïsweefsels door agro-injectie van FoMV-MCS1* of FoMV-LES22 virale constructen. Les22-onderdrukking treedt op in 9 van de 10 biologische replicaties (p = <0,0001; post hoc Dunnett's test; foutbalken geven SD aan voor drie technische replicaties). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Fenotypen van verschillende constructies die worden gebruikt in de agro-injectie-experimenten. Alle afgebeelde planten werden geïnjecteerd toen ze 6-7 dagen oud waren met Agrobacterium stam GV3101 die de aangegeven constructies droeg. Er zijn foto's gemaakt met 16 DPI. (A) Bladsymptomen van pCAMBIA1380 (lege plasmideruggegraat), FoMV-EV, FoMV-GFP en SCMV-GFP in zichtbaar licht, onder het FluorCam-chlorofylfilter bij blootstelling van 250 μs en onder het FluorCam GFP-filter bij blootstelling van 10 ms. (B) Fluorescerende microscopiebeelden van de bladeren van met mock behandelde (alleen geïnjecteerd met MgSO4-oplossing ), FoMV-EV en FoMV-GFP geïnjecteerde planten. De DIC-, DsRed- en EGFP-kanalen worden weergegeven en zijn elk genomen bij een blootstelling van 1500 ms. Schaalbalk is 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Morfologische effecten van injectie. Een voorbeeld van de meer ernstige morfologische effecten die kunnen optreden bij directe injectie in meristematisch weefsel. Deze verwonding kan resulteren in "versnippering" van de bladeren en splijting van de stengel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Virus | Groeiomstandigheden | Genotype | # Geïnfecteerde planten | Totaal aantal planten | % Infectie | Gemiddeld % van de infectie |
| FoMV-EV | Groeikamer | Suikermaïs | 22 | 23 | 96% | 97% |
| B73 | 18 | 18 | 100% | |||
| B104 | 20 | 21 | 95% | |||
| Kas | Suikermaïs | 20 | 23 | 87% | 89% | |
| B73 | 17 | 18 | 94% | |||
| B104 | 16 | 19 | 84% | |||
| SCMV-EV | Groeikamer | Suikermaïs | 14 | 21 | 67% | 47% |
| B73 | 5 | 18 | 28% | |||
| B104 | 10 | 21 | 48% | |||
| Kas | Suikermaïs | 14 | 23 | 61% | 49% | |
| B73 | 0 | 19 | 0% | |||
| B104 | 19 | 22 | 86% |
Tabel 1: Effect van broeikas- en groeikameromstandigheden op de inentingsefficiëntie van agro-injecties. Zaden werden ontkiemd onder identieke groeiomstandigheden. Gekiemde zaailingen werden agro geïnjecteerd en de helft ervan werd verplaatst naar een groeikamer (25 °C 16 uur daglicht / 22C 8 uur 's nachts; 185 PAR) en de andere helft werd verplaatst naar een kas (22-25 °C 16 uur daglicht / 22-25 °C 8 uur nacht; 350-400 PAR). Deze tabel vermeldt de infectiegraad als een percentage, berekend op basis van het aantal planten waarvan rt-PCR heeft bevestigd dat ze besmet zijn met het betreffende virus gedeeld door het totale aantal agro-geïnjecteerde planten. Er is geen statistisch verschil in infectie-efficiëntie tussen groeikamer en broeikasomstandigheden (FoMV two tailed t-test p=0,08; SCMV tweezijdige t-test p=0,96).
| Maïs Genotype | FoMV-EV | FoMV-LES22 | Gecombineerd totaal | ||||
| Besmet | Totaal | % geïnfecteerd | Besmet | Totaal | % geïnfecteerd | % geïnfecteerd | |
| Suikermaïs | 18 | 23 | 78% | 15 | 23 | 65% | 72% |
| Mo47 | 7 | 22 | 32% | 1 | 21 | 5% | 19% |
| K55 | 1 | 15 | 7% | 3 | 17 | 18% | 13% |
| W64A | 10 | 22 | 45% | 8 | 20 | 40% | 43% |
| mo17 | 0 | 16 | 0% | 0 | 13 | 0% | 0% |
| B73 | 10 | 18 | 56% | 7 | 17 | 41% | 49% |
| B101 | 12 | 21 | 57% | 8 | 24 | 33% | 44% |
| fr1064 | 4 | 4 | 100% | 4 | 4 | 100% | 100% |
| B104 | 10 | 22 | 45% | 5 | 21 | 24% | 35% |
| WCC22 | 2 | 7 | 29% | 4 | 6 | 67% | 46% |
| A188 | 0 | 3 | 0% | 4 | 6 | 67% | 44% |
Tabel 2: Infectie-efficiëntie van FoMV-constructies over maïsgenotypes. FoMV-EV en FoMV-LES22 werden agro geïnjecteerd in 11 genotypen van maïs. Na injectie werden de zaailingen naar de kas verplaatst. Deze tabel geeft de infectiegraad als percentage weer, berekend op basis van het aantal planten dat besmet is met FoMV zoals bevestigd door RT-PCR gedeeld door het totale aantal agro-geïnjecteerde planten. De gecombineerde totale infectiegraad toont de gemiddelde infectiepercentages van elk genotype voor beide geteste FoMV-constructies.
| Plantenstadium | 4-5 dagen oude planten | 6-7 dagen oude planten | Gecombineerd totaal | ||||
| Symptomatisch | Totaal planten | % geïnfecteerd | Symptomatisch | Totaal planten | % geïnfecteerd | % geïnfecteerd | |
| FoMV-EV | 42 | 72 | 58% | 80 | 170 | 47% | 53% (A) |
| FoMV-PDS | 65 | 157 | 41% | 66 | 184 | 36% | 39% (B C) |
| FoMV-LES22 | 115 | 195 | 59% | 144 | 292 | 49% | 54% (A B) |
| FoMV-GFP | 16 | 103 | 16% | 37 | 217 | 17% | 16% (C) |
| SCMV-GFP | 10 | 95 | 11% | 5 | 82 | 6% | 8% (C) |
Tabel 3: Samenvatting van injectie-experimenten. Deze tabel geeft een samenvatting van de injectie-experimenten uitgevoerd van augustus 2017 tot augustus 2018 op Golden Bantam zoete maïszaailingen. Planten werden beoordeeld op virale symptomen (FoMV-EV), dempingssymptomen (pds en les22) of GFP-fluorescentie (GFP) door visuele (FoMV-EV, FoMV-PDS en FoMV-LES22) of FluorCam (FoMV-GFP en SCMV-GFP) screening. De resultaten worden individueel getoond voor planten van 4-5 dagen oud en planten van 6-7 dagen oud, evenals een samenvatting voor alle plantleeftijden. Er is geen significant verschil gevonden tussen 4-5 dagen oude planten en 6-7 dagen oude planten (One-way ANOVA, F=0.6513). Er is een verschil gevonden tussen virale constructie (Onaway ANOVA, F = <0.0001), met de letters die het Tukey-Kramer HSD-verbindingslettersrapport vertegenwoordigen.
Aanvullende tabel 1: Tabel met alle primernamen en -sequenties die in dit protocol worden gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende tabel 2: Acetosyringontest. (A) Initiële acetosyringontest, waarbij de percentages van symptomen van mock-, FoMV-EV- en FoMV-LES22-geïnjecteerde planten tussen inentingsuspensies worden vergeleken met 200 μM acetosyringon (+) of zonder acetosyringon (-). (B) Vergelijking van de infectiepercentages van FoMV-LES22 zoals bepaald door RT-PCR tussen inentingsuspensies zonder acetosyringon (-), met 200 μM acetosyringon (+), en toevoeging van 20 μM acetosyringon aan de bacteriecultuur 4 uur voorafgaand aan resuspensie in buffer samen met de toevoeging van 200 uM acetosyringon aan de eindsuspensie (++). Over het algemeen werd er geen significant verschil gevonden tussen aceotysyringonbehandelingen (Oneway ANOVA, f=0,5452). Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullende figuur 1: Fluorescentiebeeldvorming en moleculaire validatie van agro-geïnjecteerde SCMV en expressie van heterologe eiwitten in maïs. Maïs werd agro geïnjecteerd met een gemodificeerd SCMV-construct dat zowel CDS'en van GFP als nano luciferase (NLuc) bevatte. (A) Fluorcam beeldvorming werd gebruikt voor screening en detectie van GFP. De linker is een nep-geïnjecteerde plant en de rechter is SCMV-NLucGFP geïnjecteerde plant. (B) Bladeiwitextracten werden gescheiden door SDS-PAGE en geëvalueerd op de aanwezigheid van NLuc, GFP en SCMV-coatingeiwit (CP) door in-gel luciferase assay of immunoblot zoals aangegeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Agrobacterium is een essentieel hulpmiddel dat tal van moleculair biologische technieken in plantgerelateerd onderzoek faciliteert. Deze studie biedt een agro-injectieprotocol voor het inenten van FoMV- en SCMV-virale vectoren rechtstreeks in maïsweefsels voor VIGS- en VOX-toepassingen. Het belangrijkste doel is om het gemak en het nut van virusgebaseerde technologieën voor onderzoek in monocot gewasplanten te vergroten. Hoewel directe agroinoculatie van maïs is gemeld voor een paar virussen, zijn de auteurs niet op de hoogte van een gedetailleerd protocol en zijn er geen voorbeelden van VIGS- en VOX-toepassingen in die studies19,22.
Er is gemeld, en werd bevestigd tijdens de ontwikkeling van dit protocol, dat de injectielocatie een belangrijke factor is voor het succesvol lanceren van een systemische virale infectie via agro-injectie19. Het consequent injecteren van de aanbevolen locatie op de plant wordt verondersteld de grootste variabele te zijn, omdat de exacte positie van het meristeem in maïszaailingen vrijwel niet met het oog kan worden gedetecteerd. Om interpersoonlijke variatie te minimaliseren, wordt aanbevolen om een paar maïszaailingen tot aan het meristeem te ontleden om de locatie beter te visualiseren (figuur 3C). De positie van het meristeem ten opzichte van de coleoptilar-knoop zou ongeveer hetzelfde moeten zijn voor planten van 4-7 dagen oud. Bovendien biedt het oefenen van injectie met een geverfde vloeistof een gemakkelijk zichtbare demonstratie van hoe het "entmateriaal" de bladkrans vult, en omdat de injectieplaats is gemarkeerd met kleurstof, kan de nauwkeurigheid van de injectieplaats worden bevestigd (figuur 3G, H). Meristematische weefsels zijn het meest vatbaar voor agro-injectie, maar het injecteren van Agrobacterium-suspensies rechtstreeks in dit weefsel resulteert in ongewenste morfologische effecten (figuur 6)19. Planten met beschadigde meristeem overleven, maar de resulterende defecten zijn ongewenst en daarom moet directe injectie van dit weefsel worden vermeden.
Er zijn verschillende variabelen die van invloed kunnen zijn op de succesvolle lancering van een systemische virale infectie via agro-injectie, omdat drie complexe biologische systemen (plant, virus en Agrobacterium-stam) in coördinatie moeten interageren. Dit complexe samenspel kan worden geholpen door de snel delende cellen van het meristematische gebied, waardoor het een ideale locatie is voor agroinoculatie19. De Agrobacterium-stam moet cellen van de plantenweefsels kunnen infecteren om het T-DNA met het virale genoom af te leveren en de plant moet vatbaar zijn voor het virus om virale replicatie en systemische infectie te initiëren. Maïsgenotypes verschillen in hun gevoeligheid voor virussen (Mo17 is bijvoorbeeld resistent tegen FoMV) of Agrobacterium-stammen, maar de meerderheid die werd getest, lijkt vatbaar te zijn voor zowel FoMV als SCMV (tabel 1 en tabel 2)53. Zo kunnen de inteeltlijn FR1064 en de suikermaïsvariëteit Golden Bantam bijzonder gevoelig zijn voor zowel GV3101 Agrobacterium als FoMV-gebaseerde vectoren.
Het bemonsterde bladnummer en de timing van de bemonstering voor RT-PCR is van cruciaal belang voor een nauwkeurige beoordeling van de virale infectie. In de hier getoonde voorbeelden werd het bladgetal bepaald door te beginnen bij het eerste afgeronde blad (algemeen bekend als het "duimblad") en naar boven te tellen. Bladeren werden bemonsterd zodra ze waren uitgebreid en het volgende blad was begonnen te verschijnen. Welke bladeren optimaal zijn voor bemonstering kan echter variëren op basis van de gebruikte virussoort, groeiomstandigheden en maïsgenotype. Daarom wordt een eerste tijdskuurexperiment aanbevolen bij het toepassen van dit protocol op een nieuw virussysteem om de bemonsteringsstrategie met betrekking tot bladeren en timing te optimaliseren.
De specifieke constructie die wordt gebruikt, heeft een aanzienlijke invloed op de efficiëntie van dit protocol. Bijvoorbeeld, de lege vectoren, FoMV-EV en SCMV-EV, en FoMV-PDS en FoMV-LES22, die beide kleine inserts bevatten (respectievelijk 313 bp en 329 bp), produceren meestal de hoogste percentages planten met virale symptomen in deze experimenten (tabellen 1 en tabel 2). Recombinante virussen met grotere inserts van de GFP ORF (720 bp) in FoMV-GFP en SCMV-GFP hadden echter veel lagere infectiepercentages in vergelijking met planten die werden geïnjecteerd met de lege vector- of gen-uitschakelingsconstructies. Deze trend kan te wijten zijn aan de negatieve effecten op de virale fitheid veroorzaakt door toenemende hoeveelheden exogene genetisch materiaal in het virale genoom. Verschillende studies hebben aangetoond dat de insertstabiliteit van plant virale vectoren grotendeels afhankelijk is van insertgrootte en sequentie36,54,55,56,57. Bovendien was er een opmerkelijk verschil in percentage planten dat geïnfecteerd raakte na inenting met de FoMV- of SCMV-lege vector, wat suggereert dat er extra werk nodig is om dit protocol voor SCMV te optimaliseren (tabel 1). Deze resultaten geven aan dat enige probleemoplossing nodig kan zijn bij het ontwikkelen van een constructie, omdat de volgorde en lengte van het fragment beide de efficiëntie kunnen beïnvloeden.
Over het algemeen heeft deze studie aangetoond dat agro-injectie van maïszaailingen een effectieve inentingsmethode is voor twee verschillende RNA-plantenvirussen, meerdere vectorconfiguraties en 11 genotypen van maïs. Dit werk met FoMV en SCMV, in combinatie met eerdere werken met behulp van injectie met maïschlorotic mottle virus (MCMV) of MSV, geeft aan dat agro-injectie geschikt is voor het inenten van maïszaailingen met infectieuze klonen van zowel RNA- als DNA-virussen19,20,21,22. Bovendien toont dit werk verder aan dat agro-injectie een haalbare methode is voor VIGS- en VOX-vectoren en kan worden toegepast op planten zo jong als vier dagen oud (tabel 3). Het hier gepresenteerde protocol zal naar verwachting gemakkelijk worden aangepast door maïsbiologen om onderzoek in functionele genomicastudies met transient gene silencing (VIGS) en overexpressie (VOX) te vergemakkelijken. Agroinjectie heeft ook de capaciteit om virusgebaseerde genbewerkingsbenaderingen (VEdGE) te vergemakkelijken die anders zouden worden beperkt door afhankelijkheid van planttransformatie, waardoor de bewerkingsefficiëntie en toegankelijkheid mogelijk worden verbeterd58,59,60. Aangezien de juiste Agrobacterium-stam, maïsgenotypes en virale vectoren zorgvuldig worden gecombineerd, wordt verwacht dat inenting door agro-injectie een waardevol hulpmiddel zal worden voor voorbijgaande genfunctieanalyses in maïs.
Disclosures
De onderzoekers hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Iowa State University maakt deel uit van een team dat DARPA's Insect Allies-programma HR0011-17-2-0053 ondersteunt. Dit werk werd ook ondersteund door het Iowa State University Plant Sciences Institute, Iowa State University Crop Bioengineering Center, USDA NIFA Hatch projectnummer 3808 en State of Iowa Funds. K.L.H. werd ook gedeeltelijk ondersteund door het Iowa State University Predictive Plant Phenomics graduate trainingsprogramma gefinancierd door de National Science Foundation (DGE # 1545453) en door Agricultural and Food Research Initiative grant no. 2019-07318 van het USDA National Institute of Food and Agriculture. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie en verzameling, analyse en interpretatie van gegevens en in het schrijven van het manuscript. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de financiers.
We bedanken Nick Lauter (USDA-ARS, Ames, IA) voor het zaaien van maïsinteeltlijnen, Christian F. Montes-Serey (Iowa State University) voor het maken van de FoMV-GFP-kloon en Tyler Austin (Iowa State University) voor technische assistentie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | Fisher Scientific | 14955450 | alternatively, BD 309659 |
| 15 mL Falcon Tubes | Corning Science | 352059 | |
| 1kb+ Ladder | ThermoFisher Scientific | 10787018 | For assessing sizes of PCR products |
| 25G x 5/8" PrecisionGlide Needles | Becton, Dickinson and Company (BD) | 305122 | |
| 28°C Incubator | For Agrobacterium | ||
| 37°C Incubator | For E. coli | ||
| Acetosyringone | MilliporeSigma | D134406 | Optional |
| Agar | MilliporeSigma | A4800 | |
| Agarose | GeneMate | E-3120 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Agrobacterium tumefaciens Strain GV3101 | Carries vir plasmid encoding T-DNA transfer machinery, RifR, GmR, from lab stock | ||
| Bsu36I | New England Biolabs | R0524 | |
| cDNA Kit | ThermoFisher Scientific | K1672 | Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit with Dnase |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298 | For RNA extraction |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 14955127 | 1.5 mL |
| D-(+)-Glucose | MilliporeSigma | G7528 | Alkaline Lysis |
| DH5alpha Competent E. coli Cells | New England Biolabs | C2987 | |
| DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | K1422 | Rapid DNA Ligation Kit |
| EDTA (Ethylenediamine Tetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate) | Fisher Scientific | S311 | Alkaline Lysis |
| Ethanol | For RNA extraction | ||
| Fertilizer | Peters Fertilizer 15-15-15 Concentrate | ||
| Flat Inserts | T.O. Plastics | 715357C | For germinating seeds in trays |
| Flats | T.O. Plastics | 710245C | For germinating seeds in trays |
| FluorCam | Photon Systems Instruments | To assess maize plants for GFP expression before microscope | |
| Fluorescence Microscope | |||
| Gel Electrophoresis Box | |||
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918 | |
| Glacial Acetate | Fisher Scientific | A38 | Alkaline Lysis |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | For saving frozen stocks of bacteria |
| Go-Taq, 2X | Promega | M7123 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144 | for pHing solutions |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | For RNA extraction |
| Kanamycin, Monosulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| Large Pots | Kordlok | SQL0550 | 5x5x4" or bigger. For transplanting seedlings. |
| Luria Bertani (LB) Broth, Miller | Himedia | M1245 | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Amresco | 662 | |
| Maize Golden Bantam Sweet Corn Seed | American Meadows, West Coast Seeds | ||
| Maize Inbred Seed | Our seed comes from our institution, but we are not able to provide this for other researchers. | ||
| Maxima H Minus Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | EP0753 | |
| MilliQ | Elga | Purelab Ultra | |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | |
| PacI | New England Biolabs | R0547 | |
| Peters Excel 15-5-15 Fertilizer | ICL Specialty Fertilizers | G99140 | |
| Petri Dish, 95 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714G | |
| pH Meter | |||
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | Alkaline Lysis |
| Primers | Our primers were synthesized through our institutional DNA facility or through IDT | ||
| PspOMI | New England Biolabs | R0653 | |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491 | |
| Rifampicin | EMD Millipore Corp | 557303 | |
| Rnase A | ThermoFisher Scientific | 12091021 | Alkaline Lysis |
| SbfI | New England Biolabs | R0642 | |
| Scale | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Fisher Scientific | BP166 | Alkaline Lysis |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318 | Alkaline Lysis |
| Soil Substrate | SunGro Horticulture | SS#1-F1P | Sunshine Mix #1/Fafard-1P, any soil mix that maize grows well in is sufficient |
| Spectrophotometer | For measuring OD600 | ||
| Sybr Safe, 10,000X | Invitrogen | S33102 | For making gels to check for virus/insert stability |
| Thermocycler | For PCR | ||
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154 | Alkaline Lysis |
| Trizol | Ambion | 15596018 | For RNA extraction |
| Weigh Paper | For weighing chemicals for media or buffers | ||
| XbaI | New England Biolabs | R0145 |
References
- Zaidi, S. E. A., Mansoor, S. Viral vectors for plant genome engineering. Frontiers in Plant Science. 8, 539 (2017).
- Kant, R., Dasgupta, I. Gene silencing approaches through virus-based vectors: speeding up functional genomics in monocots. Plant Molecular Biology. 100, 3-18 (2019).
- Hu, J., et al. A barley stripe mosaic virus-based guide RNA delivery system for targeted mutagenesis in wheat and maize. Molecular Plant Pathology. 20 (10), 1463-1474 (2019).
- Pasin, F., Menzel, W., Daròs, J. A. Harnessed viruses in the age of metagenomics and synthetic biology: an update on infectious clone assembly and biotechnologies of plant viruses. Plant Biotechnology Journal. 17 (6), 1010-1026 (2019).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B. Plant virus vectors 3.0: Transitioning into synthetic genomics. Annual Review of Phytopathology. 57 (1), 211-230 (2019).
- Mei, Y., et al. Protein expression and gene editing in monocots using foxtail mosaic virus vectors. Plant Direct. 3 (11), 00181 (2019).
- Ruiz, M. T., Voinnet, O., Baulcombe, D. C. Initiation and maintenance of virus-induced gene silencing. Plant Cell. 10 (6), 937-946 (1998).
- Bekele, D., Tesfaye, K., Fikre, A. Applications of virus induced gene silencing (VIGS) in plant functional genomics studies. Journal of Plant Biochemistry & Physiology. 07 (01), 1000229 (2019).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Jackson, A. O. Plant virus gene vectors for transient expression of foreign proteins in plants. Annual Review of Phytopathology. 34 (1), 299-323 (1996).
- Holzberg, S., Brosio, P., Gross, C., Pogue, G. P. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. Plant Journal. 30 (3), 315-327 (2002).
- Wang, R., et al. An efficient virus-induced gene silencing vector for maize functional genomics research. Plant Journal. 86 (1), 102-115 (2016).
- Redinbaugh, M. G., et al. Transmission of viral RNA and DNA to maize kernels by vascular puncture inoculation. Journal of Virological Methods. 98 (2), 135-143 (2001).
- Scholthof, H. B. The capsid protein gene of tomato bushy stunt virus is dispensable for systemic movement and can be replaced for localized expression of foreign genes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6 (3), 309 (1993).
- Scholthof, H. B., Scholthof, K. B. G., Kikkert, M., Jackson, A. O. Tomato bushy stunt virus spread is regulated by two nested genes that function in cell-to-cell movement and host-dependent systemic invasion. Virology. 213 (2), 425-438 (1995).
- Scholthof, H. B. Rapid delivery of foreign genes into plants by direct rub-inoculation with intact plasmid dna of a tomato bushy stunt virus gene vector. Journal of Virology. 73 (9), 7823-7829 (1999).
- Zhang, J., et al. Vacuum and co-cultivation agroinfiltration of (germinated) seeds results in tobacco rattle virus (TRV) mediated whole-plant virus-induced gene silencing (VIGS) in wheat and maize. Frontiers in Plant Science. 8, 393 (2017).
- Vaghchhipawala, Z., Rojas, C. M., Senthil-Kumar, M., Mysore, K. S. Agroinoculation and agroinfiltration: simple tools for complex gene function analyses. Methods in Molecular Biology. 678, Clifton, N.J. 65-76 (2011).
- Grimsley, N., Hohn, B., Hohn, T., Walden, R. "Agroinfection," an alternative route for viral infection of plants by using the Ti plasmid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83 (10), 3282-3286 (1986).
- Grimsley, N. H., Ramos, C., Hein, T., Hohn, B. Merisfematic tissues of maize plants are most suscepnsle to agroinfection with maize streak virus. Bio/Technology. 6 (2), 185-189 (1988).
- Martin, D. P., Rybicki, E. P. Improved efficiency of Zea mays agroinoculation with Maize streak virus. Plant Disease. 84 (10), 1096 (2000).
- Martin, D. P., Willment, J. A., Rybicki, E. P. Evaluation of maize streak virus pathogenicity in differentially resistant Zea mays genotypes. Phytopathology. 89 (8), 695-700 (1999).
- Wang, Q., et al. Further characterization of Maize chlorotic mottle virus and its synergistic interaction with Sugarcane mosaic virus in maize. Scientific Reports. 7, 39960 (2017).
- Hsieh, M. H., et al. Optimizing virus-induced gene silencing efficiency with Cymbidium mosaic virus in Phalaenopsis flower. Plant Science. 201-202 (1), 25-41 (2013).
- Hsieh, M. H., et al. Virus-induced gene silencing unravels multiple transcription factors involved in floral growth and development in Phalaenopsis orchids. Journal of Experimental Botany. 64 (12), 3869-3884 (2013).
- Zenna, N. S., et al. Genetic analysis of tolerance to rice tungro bacilliform virus in rice (Oryza sativa L.) through agroinoculation. Journal of Phytopathology. 154 (4), 197-203 (2006).
- Marks, M. S., Kemp, J. M., Woolston, C. J., Dale, P. J. Agroinfection of wheat: A comparison of Agrobacterium strains. Plant Science. 63 (2), 247-256 (1989).
- Dasgupta, I., et al. Rice tungro bacilliform virus DNA independently infects rice after Agrobacterium-mediated transfer. Journal of General Virology. 72 (6), 1215-1221 (1991).
- Boulton, M. I., Buchholz, W. G., Marks, M. S., Markham, P. G., Davies, J. W. Specificity of Agrobacterium-mediated delivery of maize streak virus DNA to members of the Gramineae. Plant Molecular Biology. 12 (1), 31-40 (1989).
- Paulsen, A. Q. Purification and properties of foxtail mosaic virus. Phytopathology. 77 (11), 1346 (1977).
- Bancroft, J. B., Rouleau, M., Johnston, R., Prins, L., Mackie, G. A. The entire nucleotide sequence of foxtail mosaic virus RNA. Journal of General Virology. 72 (9), 2173-2181 (1991).
- Bruun-Rasmussen, M., Madsen, C. T., Johansen, E., Albrechtsen, M. Revised sequence of foxtail mosaic virus reveals a triple gene block structure similar to potato virus X. Archives of Virology. 153 (1), 223-226 (2008).
- Rouleau, M., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Partial purification and characterization of foxtail mosaic potexvirus RNA-dependent RNA polymerase. Virology. 197 (2), 695-703 (1993).
- Rouleau, M., Smith, R. J., Bancroft, J. B., Mackie, G. A. Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein. Virology. 204 (1), 254-265 (1994).
- Samuels, T. D., et al. Subcellular targeting and interactions among the potato virus X TGB proteins. Virology. 367 (2), 375-389 (2007).
- Cho, S. Y., Kim, K. H. Identification of the capsid protein-binding region of the SL1(+) RNA located at the 5' region of the potato virus X genome. Plant Pathology Journal. 28 (1), 75-80 (2012).
- Mei, Y., Zhang, C., Kernodle, B. M., Hill, J. H., Whitham, S. A. A foxtail mosaic virus vector for virus-induced gene silencing in maize. Plant Physiology. 171 (2), 760-772 (2016).
- Bouton, C., et al. Foxtail mosaic virus: A viral vector for protein expression in cereals. Plant Physiology. 177 (4), 1352-1367 (2018).
- Mei, Y., Liu, G., Zhang, C., Hill, J. H., Whitham, S. A. A sugarcane mosaic virus vector for gene expression in maize. Plant Direct. 3 (8), 00158 (2019).
- Gal-On, A., Meiri, E., Huet, H., Hua, W. J., Raccah, B., Gaba, V. Particle bombardment drastically increases the infectivity of cloned DNA of zucchini yellow mosaic potyvirus. Journal of General Virology. 76 (12), (1995).
- Gao, R., et al. Construction of an infectious cDNA clone and gene expression vector of Tobacco vein banding mosaic virus (genus Potyvirus). Virus Research. 169 (1), 276-281 (2012).
- López-Moya, J. J., García, J. A. Construction of a stable and highly infectious intron-containing cDNA clone of plum pox potyvirus and its use to infect plants by particle bombardment. Virus Research. 68 (2), (2000).
- Choi, I. R., French, R., Hein, G. L., Stenger, D. C. Fully biologically active in vitro transcripts of the eriophyid mite-transmitted wheat streak mosaic tritimovirus. Phytopathology. 89 (12), (1999).
- Kim, K. S., et al. Infectivity of in vitro transcripts of Johnsongrass mosaic potyvirus full-length cDNA clones in maize and sorghum. Archives of Virology. 148 (3), 563-574 (2003).
- Stewart, L. R., Bouchard, R., Redinbaugh, M. G., Meulia, T. Complete sequence and development of a full-length infectious clone of an Ohio isolate of Maize dwarf mosaic virus (MDMV). Virus Research. 165 (2), 219-224 (2012).
- Wylie, S. J., et al. ICTV virus taxonomy profile: Potyviridae. Journal of General Virology. 98 (3), 352-354 (2017).
- Shukla, D. D. taxonomy of potyviruses infecting maize, sorghum, and sugarcane in Australia and the United States as determined by reactivities of polyclonal antibodies directed towards virus-specific N-termini of coat proteins. Phytopathology. 79 (2), 223 (1989).
- Shukla, D. D., Ward, C. W. Amino Acid sequence homology of coat proteins as a basis for identification and classification of the potyvirus group. Journal of General Virology. 69 (11), 2703-2710 (1988).
- Chung, B. Y. W., Miller, W. A., Atkins, J. F., Firth, A. E. An overlapping essential gene in the Potyviridae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (15), 5897-5902 (2008).
- Jarchow, E., Grimsley, N. H., Hohn, B. virF, the host-range-determining virulence gene of Agrobacterium tumefaciens, affects T-DNA transfer to Zea mays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (23), 10426-10430 (1991).
- Hu, G., Yalpani, N., Briggs, S. P., Johal, G. S. A porphyrin pathway impairment is responsible for the phenotype of a dominant disease lesion mimic mutant of maize. The Plant Cell. 10 (7), 1095 (2007).
- Qin, G., et al. Disruption of phytoene desaturase gene results in albino and dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll, carotenoid, and gibberellin biosynthesis. Cell Research. 17 (5), 471-482 (2007).
- Jones, P. Isolation of plasmid DNA from E. coli. Encyclopedia of Life Sciences. , (2003).
- Ji, Q., Yang, B., Lee, M., Chen, Y., Lübberstedt, T. Mapping of quantitative trait loci/locus conferring resistance to foxtail mosaic virus in maize using the intermated B73-×-Mo17 population. Plant Breeding. 129 (6), 721-723 (2010).
- Pacak, A., et al. The brome mosaic virus-based recombination vector triggers a limited gene silencing response depending on the orientation of the inserted sequence. Archives of Virology. 155 (2), 169-179 (2010).
- Miché, L., Battistoni, F., Gemmer, S., Belghazi, M., Reinhold-Hurek, B. Host-dependent expression of Rhizobium leguminosarum bv. viciae hydrogenase is controlled at transcriptional and post-transcriptional levels in legume nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (5), 1323-1331 (2018).
- Yamagishi, M., Masuta, C., Suzuki, M., Netsu, O. Peanut stunt virus-induced gene silencing in white lupin (lupinus albus). Plant Biotechnology. 32 (3), 181-191 (2015).
- Avesani, L., et al. Stability of Potato virus X expression vectors is related to insert size: Implications for replication models and risk assessment. Transgenic Research. 16 (5), 587-597 (2007).
- Ali, Z., et al. Efficient virus-mediated genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (8), 1288-1291 (2015).
- Cody, W. B., Scholthof, H. B., Mirkov, T. E. Multiplexed gene editing and protein overexpression using a tobacco mosaic virus viral vector. Plant Physiology. 175 (1), 23-35 (2017).
- Ali, Z., Eid, A., Ali, S., Mahfouz, M. M. Pea early-browning virus-mediated genome editing via the CRISPR/Cas9 system in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis. Virus Research. 244, 333-337 (2018).
