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Bioengineering

इन विट्रो 3 डी सेल-सुसंस्कृत धमनी मॉडल प्रवाह के तहत लक्ष्यीकरण संवहनी दवा का अध्ययन करने के लिए

Published: March 14, 2021 doi: 10.3791/62279
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Technion - IIT

Summary

यहां, हम शारीरिक प्रवाह के तहत निर्मित, वास्तविक आकार, त्रि-आयामी मानव धमनी मॉडल में एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए दवा वाहकों के लक्षित जमाव का अध्ययन और मानचित्रण करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तुत विधि संवहनी प्रणाली के भीतर दवा वाहकों को लक्षित करने के लिए एक नए मंच के रूप में काम कर सकती है।

Abstract

मानव धमनियों के त्रि-आयामी (3 डी) मॉडल का उपयोग, जो सही आयामों और शरीर रचना विज्ञान के साथ डिजाइन किए गए हैं, हृदय प्रणाली में विभिन्न महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं के उचित मॉडलिंग को सक्षम बनाता है। हाल ही में, यद्यपि मानव धमनियों के ऐसे 3 डी मॉडलों का उपयोग करके कई जैविक अध्ययन किए गए हैं, लेकिन उन्हें संवहनी लक्ष्यीकरण का अध्ययन करने के लिए लागू नहीं किया गया है। यह पेपर 3 डी प्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके वास्तविक आकार, पुनर्निर्मित मानव धमनी मॉडल बनाने के लिए एक नई विधि प्रस्तुत करता है, उन्हें मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस) के साथ लाइन करता है, और शारीरिक प्रवाह के तहत कण को लक्षित करता है। इन मॉडलों को कम लागत वाले घटकों का उपयोग करके मानव शरीर में रक्त वाहिकाओं के शारीरिक आकार और स्थितियों को दोहराने का लाभ होता है। यह तकनीक हृदय प्रणाली में दवा लक्ष्यीकरण का अध्ययन और समझने के लिए एक नए मंच के रूप में काम कर सकती है और नए इंजेक्शन नैनोमेडिसिनों के डिजाइन में सुधार कर सकती है। इसके अलावा, प्रस्तुत दृष्टिकोण रोगी-विशिष्ट प्रवाह और शारीरिक स्थितियों के तहत हृदय रोगों के लिए विभिन्न एजेंटों के लक्षित वितरण के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान कर सकता है।

Introduction

हाल ही में मानव धमनियों के 3डी मॉडल1, 2 , 3 ,4,5का उपयोग करते हुए कई दृष्टिकोण लागू किए गए हैं । ये मॉडल मानव शरीर में विभिन्न धमनियों के शारीरिक शरीर रचना विज्ञान और पर्यावरण को विट्रो मेंदोहराते हैं । हालांकि इनका इस्तेमाल मुख्य रूप से सेल बायोलॉजी स्टडीज में किया गया है। एंडोथेलियम के कणों के संवहनी लक्ष्यीकरण पर वर्तमान अध्ययनों में सिलिको कंप्यूटेशनल सिमुलेशन6,7,8, इन विट्रो माइक्रोफ्लुइडिक मॉडल 9 ,10,11और वीवो पशु मॉडल12में शामिल हैं। उनके द्वारा प्रदान की गई अंतर्दृष्टि के बावजूद, ये प्रायोगिक मॉडल मानव धमनियों में होने वाली लक्ष्यीकरण प्रक्रिया को सटीक रूप से अनुकरण करने में विफल रहे हैं, जिसमें रक्त प्रवाह और हीमोडायनामिक्स प्रमुख कारकों का गठन करते हैं। उदाहरण के लिए, कैरोटिड धमनी विभाजन में एथेरोस्क्लेरोटिक क्षेत्रों को लक्षित करने वाले कणों का अध्ययन, जो उनके जटिल रिसर्चर प्रवाह पैटर्न और दीवार कतरनी तनाव ढाल के लिए जाना जाता है,एंडोथेलियम13, 14,15,16तक पहुंचने से पहले कणों द्वारा ली गई यात्रा को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, इन अध्ययनों को ऐसी परिस्थितियों में किया जाना चाहिए जो शारीरिक वातावरण, यानीआकार, आयाम, शरीर रचना और प्रवाह प्रोफ़ाइल को दोहराते हैं।

हाल ही में, इस शोध समूह ने17के कणों के बयान और लक्ष्यीकरण का अध्ययन करने के लिए 3डी-खंगाला मानव धमनी मॉडल गढ़े। मॉडल मानव रक्त वाहिकाओं की ज्यामितीय 3 डी प्रतिकृतियों पर आधारित थे, जिन्हें तब मानव ईसीएस के साथ सुसंस्कृत किया गया था जो बाद में उनकी आंतरिक दीवारों को रेखांकित करते थे। इसके अलावा, जब एक पर्फ्यूजन प्रणाली के अधीन होता है जो शारीरिक प्रवाह पैदा करता है, तो मॉडल ने शारीरिक स्थितियों को सटीक रूप से दोहराया। पर्फ्यूजन सिस्टम को बंद और ओपन-सर्किट कॉन्फ़िगरेशन(चित्रा 1)दोनों में एक परिष्टक पंप का उपयोग करके निरंतर प्रवाह दर पर तरल पदार्थ को दूर करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। सिस्टम का उपयोग कण जमाव को मैप करने और कैरोटिड मॉडल के अंदर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक क्लोज-सर्किट के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रयोगों के अंत में गैर-अनुयायी कणों को धोने और सिस्टम को साफ करने और बनाए रखने के लिए इसे एक खुले सर्किट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। यह पेपर मानव कैरोटिड विभाजन के 3 डी मॉडल के निर्माण, परफ्यूजन सिस्टम के डिजाइन और मॉडल के अंदर लक्षित कणों के जमाव की मैपिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

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Protocol

नोट: यह प्रोटोकॉल कैरोटिड धमनी के 3 डी मॉडल के निर्माण का वर्णन करता है और ज्यामितीय मापदंडों को संशोधित करके ब्याज की किसी भी अन्य धमनी को उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है।

1. मानव कैरोटिड धमनी मॉडल के 3 डी विभाजन का डिजाइन और निर्माण

  1. रोगियों से छवियों का चयन करें या पहले मानव कैरोटिड धमनी विभाजन की ज्यामिति का अध्ययन किया, और मोल्ड का एक कंप्यूटर-सहायता प्राप्त डिजाइन मॉडल बनाएं जिसे मुद्रित करने की आवश्यकता है।
    नोट: कैरोटिड धमनी विभाजन में एक इनलेट और दो आउटलेट हैं। धमनी के चारों ओर 3डी मोल्ड फ्रेम डिजाइन करना महत्वपूर्ण है और फ्रेम और धमनी मोल्ड(चित्रा 2A-C)के बीच अस्थायी मुद्रण समर्थन करताहै।
  2. 3डी प्रिंटर का उपयोग करके ज्यामिति को प्रिंट करें। अस्थायी प्रिंटिंग समर्थनों को काटें, और मोल्डों को पॉलिश और चिकनी करने के लिए सैंडपेपर का उपयोग करें, विशेष रूप से उन क्षेत्रों में जहां समर्थन काटा गया था। प्लास्टिक धूल को हटाने के लिए आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ सैंडेड मॉडल को कुल्ला करें, और 2-3 घंटे के लिए रासायनिक हुड में पूरी तरह से सूखने की अनुमति दें।
    नोट: यहां, मुद्रित मोल्ड स्पष्ट राल v4(चित्रा 2D,ई)से बने थे ।
  3. प्लास्टिक को आसानी से भंग करने के लिए, रासायनिक हुड के अंदर पारदर्शी लाह के साथ मोल्डों को स्प्रे करें, और 1 घंटे के लिए हवा-सूखी होने दें। इस 3x दोहराएं।
    नोट: यहां, 2X अल्ट्रा कवर क्लियर स्प्रे का उपयोग किया गया था, लेकिन किसी भी अन्य प्रकार का उपयोग तब तक उपयुक्त होना चाहिए जब तक कि यह लकड़ी के लाह नहीं है। पुष्टि करें कि कोई उजागर प्लास्टिक नहीं बचा है क्योंकि प्लास्टिक सिलिकॉन के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है और इसे ठीक से जमना से रोक सकता है। छिड़काव की सतह की गुणवत्ता अंतिम सिलिकॉन मॉडल की सतह की गुणवत्ता निर्धारित करेगी।
  4. मोल्ड फ्रेम के समान आयामों के चिकनी प्लास्टिक की पारदर्शी आयताकार स्लाइड/स्ट्रिप्स को काटें, और उन्हें सभी तरफ और फ्रेम के एक तरफ से फ्रेम में लाह का उपयोग करके गोंद करें, जैसे कि इसे नीचे सील कर दिया जाएगा और शीर्ष पर खुला होगा। एक रासायनिक हुड के अंदर एक पेंट ब्रश का उपयोग कर लाह लागू करें, और स्लाइड को कम से कम 24 घंटे(चित्रा 2F)के लिए पूरी तरह से सूखने की अनुमति दें।
  5. सिलिकॉन रबर मिश्रण तैयार करने के लिए, एक प्लास्टिक की थाली में अपने इलाज एजेंट (मास रेशियो 1:10) के साथ तरल सिलिकॉन जोड़ें, और पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से हलचल करें। कैरोटिड मॉडल के लिए, सिलिकॉन के 54 ग्राम और इसके इलाज एजेंट के 6 ग्राम जोड़ें।
  6. मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट तक ठंडा करें, फिर इसे वैक्यूम डेसीकेटर में डेगास करें जब तक कि सभी हवा के बुलबुले समाप्त न हो जाएं। मोल्ड को डिसिकेटर (खुले पक्ष के साथ सामना करना पड़ रहा) में रखें, धीरे-धीरे सिलिकॉन मिश्रण को मोल्ड में डालें, और मिश्रण स्पष्ट होने तक हवा के बुलबुले को फिर से हटा दें।
  7. मोल्ड को कमरे के तापमान पर रात भर सिलिकॉन के साथ खड़े होने दें (यदि संभव हो, तो इसे वैक्यूम के बिना डिसिकेटर में छोड़ दें)। यदि मिश्रण पूरी तरह से सूख नहीं गया है, तो इसे कुछ घंटों के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. एक बार जब मिश्रण पूरी तरह से सूख जाता है, तो पारदर्शी स्लाइडों को हटा दें, और प्लास्टिक के पूरी तरह से भंग होने तक एक रासायनिक हुड में 48 घंटे के लिए मॉडल को पूर्ण एसीटोन में विसर्जित कर दें। किसी भी प्लास्टिक के बचे हुए को लकड़ी की छड़ी से हटा दें। मॉडल के अंदर फंसे एसीटोन को वाष्पित करने के लिए, सेल सीडिंग से पहले कम से कम 4 दिनों के लिए इसे 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

2. सेल संस्कृति और मॉडल में सीडिंग

  1. कैरोटिड मॉडल के लिए तीन कनेक्टर तैयार करें: एक इनलेट के लिए और दो आउटलेट के लिए (सामग्री की तालिकादेखें)। 20 मिनट के लिए जैविक हुड में पराबैंगनी विकिरण द्वारा मॉडल और कनेक्टर्स को स्टरलाइज करें।
  2. 100 μg/mL फाइब्रोनेक्टिन के 4 एमएल के साथ मॉडल कोट (1x फॉस्फेट-बफर नमकीन में, (पीबीएस)) 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर। 5 या 10 एमएल प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग करके इनलेट के माध्यम से मॉडल में फाइब्रोनेक्टिन समाधान इंजेक्ट करें। आउटलेट के माध्यम से फाइब्रोनेक्टिन निकालें, और ईसी माध्यम के साथ मॉडल धोएं।
  3. 2.5 × 106 कोशिकाओं/एमएल मानव नाल नसों एंडोथेलियल कोशिकाओं (HUVECs, 6 < पारित) को निलंबित करें, और 5 या 10 मिलीएल प्लास्टिक सिरिंज(चित्रा 3A)का उपयोग करके सेल निलंबन के 4 एमएल के साथ मॉडल को भरें। सजातीय सीडिंग सुनिश्चित करने के लिए 48 घंटे के लिए 1 आरपीएम की गति से एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) के अंदर एक रोटेटर पर मॉडल रखें। सुनिश्चित करें कि मॉडल रोटेटर(चित्रा 3B)से अच्छी तरह से जुड़ा हुआ है। एक जैविक हुड के अंदर 24 घंटे के बाद माध्यम बदलें, और एक और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर के अंदर रोटेटर पर लौटें।
    नोट: 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को वरीयता दी जाती है और एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि की जा सकती है ।
  4. रोटेटर से मॉडल निकालें, और 10 एमएल प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग कर 1x PBS के साथ धो । कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, एक रासायनिक हुड के अंदर 15 मिनट के लिए मॉडल के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 4 एमएल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और फिर पीबीएस के साथ 3x कुल्ला करें। पीबीएस के 4 एमएल जोड़ें, और प्रयोग(चित्रा 3C)तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। मानक धुंधला प्रोटोकॉल(उदाहरण के लिए, 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), चित्रा 3 डी)के साथ परमाणु धुंधला) का उपयोग कर मॉडल के अंदर कोशिकाओं को दाग ।

3. परफ्यूजन सिस्टम का डिजाइन

  1. परफ्यूजन सिस्टम में दो इनलेट्स और दो आउटलेट ट्यूब हैं। दो इनलेट्स को एक ही 4 एमएम आईडी ट्यूब में मर्ज करें और फिर से दो 6 एमएम आईडी ट्यूब में, जो पेरिस्टाल्टिक पंप से कनेक्ट होते हैं। पेरिस्टाल्टिक पंप से बाहर आने वाली दो 6 मिमी आईडी ट्यूब को एक 4 मिमी ट्यूब में मर्ज करें, और पंप से किसी भी दोलन को खत्म करने के लिए इसे दोलन स्पंज से कनेक्ट करें। स्पंज के रूप में तीन-छिद्र ढक्कन के साथ 250 एमएल संकीर्ण मुंह वाली बोतल का उपयोग करें।
  2. पंप से इनलेट के लिए एक छिद्र कनेक्ट करें, एक कॉर्क के साथ दूसरे को बंद करें जिसका उपयोग आपात स्थिति में दबाव निकालने के लिए किया जाता है, और बोतल के नीचे तीसरे छिद्र (जो आउटलेट है) का विस्तार करें।
  3. आउटलेट टयूबिंग का उपयोग कर सुसंस्कृत कैरोटिड मॉडल के इनलेट से स्पंज कनेक्ट करें। मॉडल के दो आउटलेट्स को एक ट्यूबिंग में मर्ज करें, जो सिस्टम का आउटलेट होगा (सभी ट्यूबिंग 4 एमएम आईडी हैं)।
  4. आउटलेट ट्यूबिंग को दो आउटलेट ट्यूबों में विभाजित करें (एक बंद सर्किट के लिए और दूसरा खुले सर्किट में अपशिष्ट कंटेनर के लिए)। प्रत्येक ट्यूब के लिए एक प्लास्टिक क्लैंप संलग्न करें।
    नोट: खुले/बंद क्लैंप का संयोजन यह निर्धारित करेगा कि सिस्टम बंद या ओपन सर्किट कॉन्फ़िगरेशन में है या नहीं। जैसा कि चित्रा 1में दिखाया गया है, यदि क्लैंप ए और डी करीब हैं, जबकि बी और सी खुले हैं, तो सिस्टम एक बंद सर्किट है; रिवर्स सर्किट विन्यास खोलने के लिए प्रणाली लाता है।
  5. तीन कंटेनर तैयार करें: एक जो 300 एमएल तरल पदार्थ (क्लोज-सर्किट के लिए) और 1 एल प्रत्येक के दो अन्य को पकड़ सकता है: एक धोने के लिए और दूसरा कचरे के लिए (खुले सर्किट के लिए)।

4. क्लोज सर्किट कॉन्फ़िगरेशन: परफ्यूजन प्रयोग और इमेजिंग

  1. बंद सर्किट कंटेनर में पीबीएस के 300 एमएल जोड़ें, जो ट्यूबिंग और मॉडल सहित पूरे सिस्टम को भरने के लिए पर्याप्त है। कंटेनर के अंदर एक इनलेट ट्यूब और एक आउटलेट ट्यूब (ओपन क्लैंप बी और सी) रखें।
  2. आसुत पानी के साथ 1 एल धोने कंटेनर भरें (प्रयोग के अंत में धोने के लिए), और अन्य 1 एल अपशिष्ट कंटेनर खाली छोड़ दें। क्रमशः धुलाई और अपशिष्ट कंटेनरों में अन्य इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग (क्लोज क्लैंप ए और डी) रखें।
  3. फिक्स्ड सेल सुसंस्कृत कैरोटिड मॉडल को 4 डिग्री सेल्सियस स्टोरेज से बाहर निकालें, और पीबीएस को खाली करें। कदम 3.3-3.4 में वर्णित कैरोटिड के इनलेट और आउटलेट कनेक्ट करें। मॉडल को लंबे समय तक सूखा न छोड़ें। एक बार मॉडल कनेक्ट हो जाने के बाद, तरल पदार्थ को छिद्रित करने के लिए पंप को सक्रिय करें।
  4. कैरोटिड मॉडल को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। इनलेट से पहले और कैरोटिड मॉडल के आउटलेट के बाद ट्यूबिंग खोलें। 10 आरपीएम पर पेरिस्टाल्टिक पंप सेट करें, और इसे चालू करें। हर 4-5 मिनट में 5 आरपीएम की वेतन वृद्धि में गति बढ़ाएं। सुनिश्चित करें कि कोई लीकेज नहीं हैं।
  5. 100 आरपीएम पर, जो मानव कैरोटिड धमनी (~ 400 एमएल/न्यूनतम) के शारीरिक तरंग की अधिकतम प्रवाह दर के बराबर है, बंद सर्किट कंटेनर में पीबीएस के 300 μg/mL की एकाग्रता पर फ्लोरोसेंट कार्बोक्सिलेटेड पॉलीस्टीरिन (पीएस) कण (2 माइक्रोन) जोड़ें। 1.5 घंटे के लिए हर 10 एस ब्याज के क्षेत्र छवि (अभी भी एक छवियां या जरूरत के रूप में वीडियो) ।

5. ओपन सर्किट विन्यास: वाशिंग कदम

  1. 1 एल कंटेनरों (क्लैंप ए और डी) में धोने और अपशिष्ट ट्यूबों के क्लैंप खोलें, और सिस्टम को बंद से ओपन सर्किट कॉन्फ़िगरेशन में बदलने के लिए 300 एमएल कंटेनर (क्लैंप बी और सी) में इनलेट और आउटलेट ट्यूब दोनों के क्लैंप को तुरंत बंद कर दें।
  2. 100 आरपीएम पर वाशिंग कंटेनर से कचरा कंटेनर तक अधिकांश पानी का प्रवाह होने दें। इससे पहले कि यह पूरी तरह से स्थानांतरित हो जाए, पेरिस्टाल्टिक पंप पर दबाएं, और इनलेट से पहले और कैरोटिड मॉडल के आउटलेट के बाद ट्यूब क्लैंप बंद करें।
  3. उपयुक्त फ़िल्टर का उपयोग करके, कोशिकाओं को कणों के जमाव और आसंजन को दिखाने के लिए ब्याज के क्षेत्र में मॉडल की छवियों को कैप्चर करें। कैरोटिड मॉडल को डिस्कनेक्ट करें। ध्यान से और धीरे-धीरे मॉडल के इनलेट के माध्यम से 10 एमएल सिरिंज के साथ पीबीएस के 4 एमएल जोड़ें।
  4. कैरोटिड मॉडल के बजाय एक "डमी मॉडल" कनेक्ट करें, (जो केवल धोने के लिए उपयोग किया जाने वाला सिलिकॉन रबर 3 डी कैरोटिड मॉडल है, सुसंस्कृत कोशिकाओं के बिना) और सिस्टम को कुल्ला। पानी की एक और 1 एल जोड़ें, और प्रणाली को फिर से धोएं जब तक कि सभी पानी को धोने के कंटेनर से कचरे में स्थानांतरित न कर दिया जाए। पेरिस्टाल्टिक पंप बंद कर दें।

6. डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण

  1. एक अनुकूलित सॉफ्टवेयर कोड (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके प्रयोग के दौरान ली गई छवियों के साथ ब्याज के क्षेत्र में कण जमाव की एक डिजिटल फिल्म प्राप्त करें।
  2. मॉडल के साथ कणों के बयान के मानचित्रण के लिए, ब्याज की जांच किए गए क्षेत्र(चित्रा 4 ए,बी)को कवर करने के लिए कई छवियों को टाइल करें।
    नोट: ब्याज की साइट पर पालन कणों की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक अनुकूलित सॉफ्टवेयर कोड लिखा जा सकता है (एक नमूना फ़ाइल पूरक जानकारीके रूप में प्रदान की गई है)17।

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Representative Results

यह पेपर वास्तविक आकार के 3 डी मानव धमनी मॉडल के अंदर कणों के जमाव को मैप करने के लिए एक नया प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जो दवा वितरण अनुसंधान के लिए एक नया मंच प्रदान कर सकता है। 3डी प्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके, मानव कैरोटिड विभाजन धमनी का एक मॉडल निर्मित(चित्रा 2)था। मॉडल सिलिकॉन रबर से बना था और मानव ECs(चित्रा 3)के साथ वरीयता प्राप्त किया गया था । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल ने विशेष रूप से द्रव गतिशीलता के संबंध में शारीरिक स्थितियों की प्रतिकृति को सक्षम किया। कैरोटिड की शारीरिक तरंग विशेषता के परिमाण में निरंतर प्रवाह के तहत कैरोटिड विभाजन के कणों को बढ़ावा देने के लिए एक पर्फ्यूजन सिस्टम तैयार किया गया था। चित्रा 1 परफ्यूजन सिस्टम प्रस्तुत करता है, जिसमें पेरिस्टाल्टिक पंप, एक दोलन स्पंज, सुसंस्कृत विभाजन मॉडल, टयूबिंग और द्रव कंटेनर होते हैं।

पर्फ्यूज किए गए कणों के बयान और आसंजन को मैप करने के लिए, धमनी मॉडल को प्रयोग के अंत में और धोने के बाद (चरण 5.3) दोनों में एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत चित्रित किया गया था। छवियों को 2x उद्देश्य का उपयोग करके कैप्चर किया गया था और मॉडल की एक पूरी छवि बनाने के लिए एक साथ टाइल किया गया था। फिर, एक अनुकूलित सॉफ्टवेयर कोड का उपयोग करके पालन किए गए कणों की संख्या की गणना की गई। विभाजन में रिसर्चर पैटर्न के गठन की जांच करने के लिए, मॉडल में 10 माइक्रोन फ्लोरोसेंट ग्लास मोतियों का संचार किया गया था। चित्रा 4A रिसर्चर से पता चलता है, जो पता चलता है कि मॉडल के अंदर की स्थिति शारीरिक स्थितियों की नकल करती है ।

मॉडल के अंदर कणों के जमाव को मैप करने के लिए, 2 माइक्रोन फ्लोरोसेंट कार्बोक्सिलेटेड पीएस कणों का संचार किया गया था, और आईसी के लिए उनके आसंजन को इमेजेड किया गया था(चित्रा 4B,सी)। इन कणों मॉडल के साथ विभिन्न क्षेत्रों में अलग-अलग पालन किया - अधिक आसंजन रिसर्चर क्षेत्र से बाहर देखा गया था, जहां दीवार कतरनी तनाव अधिक है। इन परिणामों को पहले से पता चलता है कि कणों के आसंजन मॉडल की ज्यामिति, कण सतह विशेषताओं, और कतरनी तनाव17का एक समारोह है पर चर्चा की गई है । ये बयान नक्शे अपेक्षाकृत सरल हैं और रोगी-विशिष्ट मॉडलों में शारीरिक परिस्थितियों में दवा वाहकों की आत्मीयता और लक्ष्यीकरण की स्क्रीनिंग के लिए जल्दी से प्राप्त किए जा सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:परफ्यूजन सिस्टम। एक परफ्यूजन प्रणाली को निरंतर प्रवाह के तहत तरल पदार्थ को दूर करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसमें (1) एक पेरिस्टाल्टिक पंप, (2) एक दोलन स्पंज, (3) सुसंस्कृत 3 डी धमनी मॉडल, और तीन ग्लास कंटेनर शामिल हैं: 1 एल क्षमता (4 और 6) और एक तिहाई के साथ दो जो 300 एमएल तरल पदार्थ (5) पकड़ सकते हैं। सिस्टम दो विन्यासों में काम कर सकता है: (i) एक खुला सर्किट, जिसमें क्लैंप ए + डी खुले होते हैं और बी + सी बंद होते हैं, या (ii) एक बंद सर्किट होता है, जिसमें क्लैंप ए + डी बंद होते हैं और बी + सी खुले होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:3 डी कैरोटिड धमनी विभाजन मॉडल की निर्माण प्रक्रिया। (ए-सी)मानव कैरोटिड विभाजन, धमनी के चारों ओर मोल्ड फ्रेम, और अस्थायी प्रिंटिंग सपोर्ट डिजाइन किए गए थे। (D, ई) ज्यामिति एक 3 डी प्रिंटर का उपयोग कर मुद्रित किया गया। (च)अस्थायी प्रिंटिंग सपोर्ट्स को काटा गया और मॉडल को रेत से उड़ाया गया और लाह से छिड़काया गया । फिर, पारदर्शी आयताकार स्लाइड चारों तरफ से फ्रेम से चिपके हुए थे। गोंद सूखने पर सिलिकॉन रबर डाला गया था। संक्षिप्त नाम: 3 डी = त्रि-आयामी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:कैरोटिड धमनी के 3 डी मॉडल के अंदर ईसीएस की सीडिंग। (A)सिलिकॉन रबर से बने मानव कैरोटिड विभाजन का वास्तविक आकार का 3डी मॉडल। मॉडल मानव ECs के साथ सुसंस्कृत और सेल माध्यम से भरा गया था । (ख)सुसंस्कृत मॉडल को 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर रखा गया था ।(C)ब्राइटफील्ड में 3डी मॉडल के अंदर सुसंस्कृत ईसीएस की छवियां और(डी)नीले रंग में परमाणु धुंधला करने के लिए DAPI के साथ । स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: ECs = एंडोथेलियल कोशिकाएं; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल; 3D = त्रि-आयामी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:कणों के आसंजन को पार करने और मैप करना। (ए)स्ट्रीक-लाइन छवि सुव्यवस्थित और रिसर्चर (धराशायी आयत) मॉडल के माध्यम से 400 मिलीएल/मिनट के निरंतर प्रवाह पर 10 माइक्रोन फ्लोरोसेंट ग्लास कणों के पर्फ्यूजन पर उत्पन्न होती है। (ख)3डी-सुसंस्कृत मॉडल के अंदर 2 माइक्रोन फ्लोरोसेंट कार्बोक्सिल्ड पीएस कणों (लाल रंग में) का जमाव नक्शा। स्केल बार = 2 मिमी (सी)कणों का आसंजन (लाल रंग में) एक 10x आवर्धन पर मॉडल के अंदर सुसंस्कृत ECs (नीले-DAPI में) के लिए । स्केल बार = 10 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: पीएस = पॉलीस्टीरिन; 3डी = त्रि-आयामी; ECs = एंडोथेलियल कोशिकाएं; DAPI = 4', 6-diamidino-2-फेनिलिंडोल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक जानकारी: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

कणों के संवहनी लक्ष्यीकरण का अध्ययन करने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण मानव शरीर में मौजूद शारीरिक स्थितियों को दोहराने में कम हो जाते हैं। यहां प्रस्तुत एक अनुकूलित परफ्यूजन प्रणाली का उपयोग कर लागू शारीरिक प्रवाह के तहत धमनी अस्तर आईसी के लिए लक्ष्यीकरण कण का अध्ययन करने के लिए मानव धमनियों के 3 डी-खंगाला मॉडल बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल है । 3डी प्रिंटिंग के लिए सामग्री चुनते समय, सिलिकॉन मॉडल में वर्णक हस्तांतरण से बचने के लिए एक स्पष्ट प्लास्टिक का उपयोग करना सबसे अच्छा है, जो जितना संभव हो उतना पारदर्शी होना चाहिए। इसके अलावा, एक ऐसी सामग्री चुनना महत्वपूर्ण है जो एसीटोन में भंग नहीं होती है, बल्कि इसके बजाय नरम और भंगुर हो जाती है और बाद में आसानी से मॉडल से हटाया जा सकता है।

प्रस्तुत 3 डी मॉडल सिलिकॉन रबर, एक पारदर्शी सिलिकॉन, अपने इलाज एजेंट के साथ मिश्रित से बना रहे हैं । यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मिश्रण हमेशा कमरे के तापमान पर या नीचे होता है, अन्यथा सिलिकॉन और इलाज एजेंट के बीच क्रॉसलिंकिंग मोल्डों पर डीगैसिंग और कास्टिंग से पहले शुरू हो जाएगा। हालांकि पॉलीडिमेथाइलसिलोक्सेन का उपयोग ऐसे मॉडलों (इसके क्रॉसलिंकर के साथ 1:10 अनुपात) बनाने के लिए भी किया जा सकता है, सिलिकॉन रबर अधिक टिकाऊ है। प्लास्टिक को भंग करने के लिए एसीटोन में मॉडल को विसर्जित करने के बाद, किसी भी एसीटोन अवशेषों का पूर्ण वाष्पीकरण सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 4 दिनों के लिए इसे 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करना महत्वपूर्ण है। यदि कोई एसीटोन मॉडल के अंदर फंसा रहता है, तो कोशिकाएं ठीक से विकसित नहीं होंगी। 24 घंटे के बाद माध्यम बदलना और 48 घंटे के बाद कोशिकाओं का निर्धारण दो चरण हैं जिनमें 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करके तरल पदार्थ का मैनुअल इंजेक्शन शामिल है। इसलिए धीरे-धीरे सोचना महत्वपूर्ण है, अन्यथा कोशिकाओं को धोया जा सकता है।

परफ्यूजन सिस्टम में दो इनलेट्स और दो आउटलेट ट्यूब हैं। प्रत्येक ट्यूब प्रवाह नियंत्रण के लिए एक प्लास्टिक ट्यूब क्लैंप है। अधिकांश ट्यूबिंग सिस्टम में 4 मिमी इनर डिमीटर (आईडी) ट्यूब शामिल हैं, सिवाय पंप में क्लैंप की गई ट्यूबों के अलावा, जो 6 मिमी आईडी ट्यूब हैं। पंप में क्लैंप की गई ट्यूबों की आईडी अधिकतम प्रवाह दर निर्धारित करेगी जिसे सिस्टम में हासिल किया जा सकता है। यह परफ्यूजन सिस्टम एक दोलनकारी असेंबली से स्पंज के आउटलेट को जोड़कर लगातार औसत प्रवाह17 पर दोलनों को सुपरपोसिंग करके एक स्पंदन तरंग भी उत्पन्न कर सकता है, जो पेरिस्टैटिक पंप द्वारा उत्पादित निरंतर प्रवाह दर पर वांछित तरंग के दोलनीय भाग को सुपरपॉज़ करता है। यह विन्यास आदोलनीय प्रवाह के तहत या ऑसिलेटर बंद होने पर निरंतर प्रवाह की स्थिति में ऑपरेशन को सक्षम बनाता है।

इस पेपर में, परफ्यूजन सिस्टम को 3 डी मानव कैरोटिड धमनी विभाजन के साथ प्रयोगों के आधार पर अनुकूलित किया गया था। इसलिए, यदि अन्य धमनी मॉडल या अन्य ट्यूबिंग का उपयोग किया जाता है, तो तरल पदार्थ और प्रवाह दर की मात्रा में समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। ऐसे मामलों में, प्रणाली और प्रवाह दर को अंशांकित करना होगा, जबकि मॉडल दीवारों से कोई सेल टुकड़ी सुनिश्चित नहीं करना होगा। यह गारंटी है कि कोशिकाओं को प्रवाह के साथ बह नहीं कर रहे हैं गारंटी के लिए धीरे-धीरे परिस्टाल्टिक पंप में प्रवाह दर में वृद्धि करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि ट्यूबिंग, मॉडल के साथ-साथ कंटेनर सहित पूरी प्रणाली तरल पदार्थों से भरी हुई है(उदाहरण के लिए,इस मामले में, यह तरल पदार्थ की कुल मात्रा 300 मिलीएल से भरा हुआ था)। इसके अलावा, प्रत्येक प्रयोग से पहले और बाद में, सिस्टम को ओपन-सर्किट कॉन्फ़िगरेशन में आसुत पानी से धोया जाना चाहिए।

परफ्यूजन सिस्टम17का उपयोग करके मॉडलों में रक्त को भी लगाया जा सकता है। इस मामले में, किसी भी रिसाव को रोकने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरती जानी चाहिए, खासकर यदि मानव रक्त का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा, धोने का कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि रक्त से पूर्ण धोने को सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग के अंत में ब्लीच को कम किया जाना चाहिए। ब्लीच के बाद, पानी को प्रोटोकॉल में उल्लिखित के रूप में छिद्रित किया जाना चाहिए। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस पेपर में कार्बोक्सिलेटेड पीएस कणों का उपयोग किया गया था, जिनमें एक समान संरचना और संकीर्ण आकार का वितरण होता है। इसके अलावा, ये कण मुख्य रूप से इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन के माध्यम से कोशिकाओं का पालन करते हैं। हालांकि, अन्य दवा नैनोकैरियर्स का उपयोग किया जा सकता है, और विशिष्ट लक्ष्यीकरण की जांच के साथ-साथ लिगांड-लेबल वाले कणों के साथ भी किया जाना चाहिए, उदाहरणके लिए, एंटी-इंटरसेलुलर आसंजन अणु 1 और एंटी-प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु 1, जो ब्याज की साइट पर ईसीएस के कण संचय में वृद्धि करेगा।

इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में, ईसीएस को मॉडल को परफ्यूजन सिस्टम और कणों के इंजेक्शन से जोड़ने से पहले तय किया गया था। निश्चित कोशिकाओं के लिए कणों का आसंजन बाध्यकारी प्रक्रिया में पहले चरण का प्रतिनिधित्व करता है और इसलिए, जीवित कोशिकाओं के साथ प्रयोग किए जाने की आवश्यकता होती है, जहां आसंजन प्रक्रिया के बाद के चरणों के दौरान कणों का आंतरिककरण हो सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग शारीरिक परिस्थितियों में दवा वाहकों के अध्ययन के लिए 3 डी धमनी मॉडल बनाने के लिए किया जा सकता है। उल्लिखित दृष्टिकोण रोगी-विशिष्ट परिस्थितियों में एजेंटों के वितरण के अध्ययन में सहायता कर सकता है।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

इस काम को इजरायल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ ग्रांट# 902/18) ने सपोर्ट किया। मारिया खैरी की छात्रवृत्ति को बैरोनेस एरियन डी रोथस्चिल्ड वुमन डॉक्टोरल प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer FormLabs PKG-F2-REFURB
Acetone, absolute (AR grade)
Connectors Nordson Medical FTLL013-1 Female Luer
FTLL230-1 Female Luer
FTLL360-1 Female Luer
LP4-1 Male Luer Integral Lock
Damper Thermo-Fisher Scientific DS2127-0250 Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle
Damper Cover Thermo-Fisher Scientific 2162-0531 Nalgene Filling/Venting Closures
Elastosil Elastosil RT 601 A Wacker 60003805
Elastosil RT 601 B Wacker 60003817 The crosslinker
Endothelial Cell Media ScienCell 1001
Fibrontectin Sigma Aldrich F0895-5mg
HUVEC Lonza CC-2519
Isopropyl alcohol, AR grade 99.5% Remove plastic dust from the sanded model
Lacquer Rust-Oleum 2X-Ultra cover Gloss Clear
Matlab Mathworks https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Microscope Nikon SMZ25
Microscope Camera Nikon DS-Qi2
Peristaltic pump Watson Marlow 530U IP31 With 2 pumpheads: 313D
Plastic tube clamp Quickun 1-2240-stopvalve-2pcs
Polystyrene Particles  Thermo-Fisher Scientific  F8827  Diameter = 2 µm
Printer resin FormLabs RS-F2-GPCL-04
Rotator ELMI Ltd. Intelli-Mixer RM-2
Solidworks  SolidWorks Corp., Dassault Systèmes https://www.solidworks.com/
Tubing Watson Marlow 933.0064.016 Tubing for the pump: 6.4 mm ID
All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID

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References

  1. Chiu, J. J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
  2. Martorell, J., et al. Extent of flow recirculation governs expression of atherosclerotic and thrombotic biomarkers in arterial bifurcations. Cardiovascular Research. 103 (1), 37-46 (2014).
  3. Karino, T., Goldsmith, H. L. Flow behaviour of blood cells and rigid spheres in an annular vortex. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 279 (967), 413-445 (1977).
  4. Goldsmith, H. L., Karino, T. Platelets in a region of disturbed flow. Transactions - American Society for Artificial Internal Organs. 23, 632-638 (1977).
  5. Farcas, M. A., Rouleau, L., Fraser, R., Leask, R. L. The development of 3-D, in vitro, endothelial culture models for the study of coronary artery disease. Biomedical Engineering Online. 8, 30 (2009).
  6. Peng, B., et al. Modeling nanoparticle targeting to a vascular surface in shear flow through diffusive particle dynamics. Nanoscale Research Letters. 10 (1), 942 (2015).
  7. Shah, S., Liu, Y., Hu, W., Gao, J. Modeling particle shape-dependent dynamics in nanomedicine. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 11 (2), 919-928 (2011).
  8. Hossain, S. S., Hughes, T. J., Decuzzi, P. Vascular deposition patterns for nanoparticles in an inflamed patient-specific arterial tree. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 585-597 (2014).
  9. Charoenphol, P., Huang, R. B., Eniola-Adefeso, O. Potential role of size and hemodynamics in the efficacy of vascular-targeted spherical drug carriers. Biomaterials. 31 (6), 1392-1402 (2010).
  10. Ta, H. T., Truong, N. P., Whittaker, A. K., Davis, T. P., Peter, K. The effects of particle size, shape, density and flow characteristics on particle margination to vascular walls in cardiovascular diseases. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (1), 33-45 (2018).
  11. Cooley, M., et al. Influence of particle size and shape on their margination and wall-adhesion: implications in drug delivery vehicle design across nano-to-micro scale. Nanoscale. 10 (32), 15350-15364 (2018).
  12. Jiang, X. Y., et al. Quantum dot interactions and flow effects in angiogenic zebrafish (Danio rerio) vessels and human endothelial cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (3), 999-1010 (2017).
  13. Zarins, C. K., et al. Carotid bifurcation atherosclerosis. Quantitative correlation of plaque localization with flow velocity profiles and wall shear stress. Circulation Research. 53 (4), 502-514 (1983).
  14. Chien, S. Effects of disturbed flow on endothelial cells. Annals of Biomedical Engineering. 36 (4), 554-562 (2008).
  15. Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
  16. Glagov, S., Zarins, C., Giddens, D. P., Ku, D. N. Hemodynamics and atherosclerosis. Insights and perspectives gained from studies of human arteries. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 112 (10), 1018-1031 (1988).
  17. Khoury, M., Epshtein, M., Zidan, H., Zukerman, H., Korin, N. Mapping deposition of particles in reconstructed models of human arteries. Journal of Controlled Release. 318, 78-85 (2020).

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बायोइंजीनियरिंग अंक 169 बायोमेडिकल इंजीनियरिंग 3 डी प्रिंटिंग धमनी मॉडल नैनोमेडिसिन हृदय रोग एथेरोस्क्लेरोसिस वैस्कुलर लक्ष्यीकरण
<em>इन विट्रो</em> 3 डी सेल-सुसंस्कृत धमनी मॉडल प्रवाह के तहत लक्ष्यीकरण संवहनी दवा का अध्ययन करने के लिए
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Khoury, M., Epshtein, M., Korin, N.… More

Khoury, M., Epshtein, M., Korin, N. In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow. J. Vis. Exp. (169), e62279, doi:10.3791/62279 (2021).

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