Summary
여기서, 우리는 생리적 흐름하에서 제조된 실제 크기의 3차원 인간 동맥 모델에서 내피 세포에 약물 운반대의 표적 증착을 연구하고 매핑하는 새로운 프로토콜을 제시한다. 제시된 방법은 혈관 시스템 내의 약운반체를 표적으로 하는 새로운 플랫폼역할을 할 수 있다.
Abstract
올바른 치수와 해부학으로 설계된 인간 동맥의 3차원 (3D) 모델을 사용하면 심혈관 시스템에서 다양한 중요한 과정을 적절하게 모델링 할 수 있습니다. 최근, 여러 생물학적 연구가 인간 동맥의 이러한 3D 모델을 사용하여 수행되었지만 혈관 표적을 연구하기 위해 적용되지 않았습니다. 이 논문은 3D 프린팅 기술을 사용하여 실제 크기의 재구성된 인간 동맥 모델을 제조하고, 인간 내피 세포(EC)와 정렬하고, 생리적 흐름하에서 입자 타겟팅을 연구하는 새로운 방법을 제시합니다. 이러한 모델은 저비용 성분을 사용하여 인체에서 혈관의 생리적 크기와 상태를 복제하는 장점이 있습니다. 이 기술은 연구 하 고 심장 혈관 시스템에서 약물 타겟팅을 이해 하기 위한 새로운 플랫폼 역할을 할 수 있습니다 및 새로운 주 사용 나노 의약품의 디자인을 향상 시킬 수 있습니다. 더욱이, 제시된 접근은 환자 특정 흐름 및 생리적 조건하에서 심혈관 질병을 위한 다른 에이전트의 표적 납품의 연구 결과에 중요한 공구를 제공할 수 있습니다.
Introduction
최근 인간 동맥1,2,3,4,5의3D 모델을 활용하여 여러 가지 접근 법이 적용되었습니다. 이러한 모델은 생체 내인체에 있는 다른 동맥의 생리해부학 및 환경을 복제합니다. 그러나, 그(것)들은 주로 세포 생물학 연구 결과에서 이용되었습니다. 내피성으로 입자의 혈관 표적화에 대한 현재 연구는 실리코 전산 시뮬레이션6,7,8, 체외 미세 유체 모델9,10,11및 생체 내 동물모델(12)에포함된다. 그들이 제공 한 통찰력에도 불구하고, 이러한 실험 모델은 정확하게 혈액 흐름과 혈역학이 지배적 인 요인을 구성하는 인간의 동맥에서 발생하는 타겟팅 프로세스를 시뮬레이션하는 데 실패했습니다. 예를 들어, 복잡한 재순환 흐름 패턴 및 벽 전단 응력 그라데이션으로 알려진 경동맥 분열에서 죽상 경화성 영역을 표적으로 하는 입자의 연구는내피(13),14,15,16에도달하기 전에 입자가 취한 여행에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 이러한 연구는 생리적 환경, 즉크기, 치수, 해부학 및 유동 프로필을 복제하는 조건하에서 수행해야 합니다.
최근에, 이 연구 그룹은 3D 재구성된 인간 동맥 모델을 제조하여혈관(17)에입자의 증착 및 표적을 연구하였다. 모델은 인간 혈관의 기하학적 3D 복제본을 기반으로 했으며, 그 후 내부 벽을 줄지어 있는 인간 적인 IC로 배양되었습니다. 또한 생리적 흐름을 생성하는 관류 시스템을 실시하면 모델은 생리적 상태를 정확하게 복제했습니다. 관류 시스템은 폐쇄 및 개방 회로 구성 모두에서 연동 펌프를 사용하여 일정한 유량으로 유체를 퍼퓨즈하도록설계되었습니다(그림 1). 이 시스템은 경동맥 모델 내부에 시드된 셀에 파티클 증착 및 타겟팅을 매핑하는 폐쇄 회로로 사용할 수 있습니다. 또한, 실험의 끝에서 비부착 입자를 세척하고 시스템을 청소하고 유지하기 위해 개방 회로로 사용될 수 있다. 이 백서는 인간 경동맥 분기의 3D 모델 제조, 관류 시스템의 설계 및 모델 내부의 표적 입자의 증착 매핑을 위한 프로토콜을 제시합니다.
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Protocol
참고: 이 프로토콜은 경동맥의 3D 모델의 제조를 설명하고 기하학적 매개 변수를 수정하기만 하면 관심 있는 다른 동맥을 생성하기 위해 적용할 수 있습니다.
1. 인간 경동맥 모델의 3D 분기의 설계 및 제조
- 환자 또는 이전에 연구된 인간 경동맥 분기의 형상에서 이미지를 선택하고 인쇄해야 하는 금형의 컴퓨터 지원 설계 모델을 만듭니다.
참고: 경동맥 분비화에는 하나의 입구와 2개의 콘센트가 있습니다. 동맥 주위의 3D 금형 프레임을 설계하고 프레임과 동맥 금형(도2A-C)사이에 임시 인쇄 지지체를 설계하는 것이 중요합니다. - 3D 프린터를 사용하여 형상을 인쇄합니다. 임시 인쇄 지지대를 자르고 사포를 사용하여 금형을 연마하고 매끄럽게 합니다. 이소프로필 알코올로 샌드 모델을 헹구고 플라스틱 먼지를 제거하고 2-3 시간 동안 화학 후드에서 완전히 건조할 수 있습니다.
참고 : 여기에 인쇄 된 금형은 명확한 수지 v4(그림 2D,E)로만들어졌습니다. - 플라스틱을 쉽게 녹여화학 후드 내부에 투명 한 옻칠으로 금형을 스프레이하고 1 시간 동안 공기 건조를 허용합니다. 이 3x를 반복합니다.
참고 : 여기에 2X 울트라 커버 클리어 스프레이가 사용되었지만 나무 옻칠이 아닌 한 다른 종류는 적합해야합니다. 플라스틱이 실리콘과 반응하여 제대로 응고되는 것을 방지할 수 있기 때문에 노출플라스틱이 남아 있지 않은지 확인합니다. 분무 된 표면의 품질은 최종 실리콘 모델의 표면품질을 결정합니다. - 금형 프레임과 동일한 치수의 매끄러운 플라스틱의 투명 직사각형 슬라이드 / 스트립을 잘라, 그것은 바닥에 밀봉하고 상단에 열려 있도록, 모든 면과 프레임의 한쪽에서 프레임에 옻칠을 사용하여 접착제. 화학 후드 내부에 페인트 브러시를 사용하여 래커를 바르고 슬라이드가 적어도 24 시간(그림 2F)에완전히 건조되도록하십시오.
- 실리콘 고무 혼합물을 준비하려면 플라스틱 판에 경화제(질량 비율 1:10)가 있는 액체 실리콘을 추가하고 완전히 혼합되도록 철저히 저어줍니다. 경동맥 모델의 경우 실리콘 54g과 경화제 6g을 추가합니다.
- 혼합물을 4°C에서 15분간 식힌 다음 모든 기포가 제거될 때까지 진공 건조기에서 분해합니다. 건조기 (열린 면이 위로 향하여)에 금형을 놓고 실리콘 혼합물을 금형에 천천히 붓고 혼합물이 명확해질 때까지 기포를 다시 제거합니다.
- 금형이 실온에서 하룻밤 동안 실리콘으로 서게하십시오 (가능하면 진공없이 건조기에 둡니다). 혼합물이 완전히 건조되지 않은 경우, 또 다른 몇 시간 동안 60 °C에서 배양.
- 혼합물이 완전히 건조되면 투명 슬라이드를 제거하고 플라스틱이 완전히 용해 될 때까지 화학 후드에 48 h의 절대 아세톤에 모델을 담그십시오. 나무 막대기로 플라스틱 남은 것을 제거하십시오. 모델 내부에 갇힌 아세톤을 증발시키기 위해 세포 파종 전에 적어도 4일 동안 60°C에서 배양한다.
2. 모델의 세포 배양 및 시드
- 경동맥 모델에 대한 세 개의 커넥터를 준비합니다: 입구에 대한 커넥터와 콘센트에 대한 두 개의 커넥터(재료 표참조). 생물학적 후드에서 자외선 조사로 모델과 커넥터를 20분 동안 살균합니다.
- 모델의 4mL100 μg/mL 섬유네틴(1x 인산염 완충식식염, (PBS))으로 37°C또는 4°C에서 하룻밤동안 코팅한다. 5 mL 또는 10 mL 플라스틱 주사기를 사용하여 입구를 통해 모델에 섬유 넥틴 용액을 주입하십시오. 콘센트를 통해 섬유네틴을 제거하고 EC 배지로 모델을 세척합니다.
- 2.5 × 106 세포/mL 인간 배빌레정맥 내피 세포(HUVEC, 통로 < 6)를 중단하고, 5 또는 10mL 플라스틱 주사기(도3A)를사용하여 세포 현탁액의 4mL로 모델을 채웁니다. 균일한 파종을 보장하기 위해 48h의 1rpm의 속도로 인큐베이터(37°C) 내부에 회전기 위에 모델을 놓습니다. 모델이 회전기(그림3B)에잘 부착되어 있는지 확인합니다. 생물학적 후드 내부의 24시간 후 배지를 변경하고 인큐베이터 내부의 회전기로 돌아와 24h를 더 한다.
참고: 24시간 후에, 세포는 씨를 제거하고 현미경을 사용하여 심을 수 있습니다. - 회전기에서 모델을 제거하고 10mL 플라스틱 주사기를 사용하여 1x PBS로 세척합니다. 세포를 고치려면 4mL의 파라포름알데히드(PFA)를 화학 후드 내부에 15분 동안 모델로 배양한 다음 PBS로 3배 헹구세요. PBS4mL을 추가하고실험(그림 3C)까지4°C에 저장합니다. 표준 염색프로토콜(예: 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI), 도 3D를사용하여 모델 내부의 세포를 염색합니다.
3. 관류 시스템의 설계
- 관류 시스템에는 두 개의 입구와 두 개의 콘센트 튜브가 있습니다. 두 개의 입구를 단일 4mm ID 튜브로 병합하고 다시 두 개의 6mm ID 튜브로 병합하여 연동 펌프에 연결합니다. 연골 펌프에서 나오는 6mm ID 튜브 2개를 단일 4mm 튜브로 병합하고 진동 댐퍼에 연결하여 펌프의 진동을 제거합니다. 250mL 의 좁은 입병을 3개의 오리피스 뚜껑을 댐퍼로 사용하십시오.
- 펌프에서 입구에 하나의 오리피스를 연결하고, 비상 시 압력 배출에 사용되는 코르크로 두 번째 를 닫고, 제 3 오리피스 (콘센트)를 병의 바닥으로 확장합니다.
- 댐퍼를 콘센트 튜브를 사용하여 배양된 경동맥 모델의 입구에 연결합니다. 모델의 두 콘센트를 하나의 튜브에 병합하면 시스템의 콘센트가 됩니다(모든 튜브는 4mm ID).
- 콘센트 튜브를 두 개의 콘센트 튜브(폐쇄 회로용및 개방 회로의 폐기물 용기에 대한 다른 튜브)로 분할합니다. 각 튜브에 플라스틱 클램프를 부착합니다.
참고: 열린/폐쇄 클램프의 조합은 시스템이 닫힌 회로 구성에 있는지 또는 개방회로 구성인지 여부를 결정합니다. 도 1에도시된 바와 같이, b와 c가 열려 있는 동안 a와 d클램프가 닫히면 시스템은 폐쇄 회로입니다. 역으로 인해 시스템이 회로 구성을 엽니다. - 3개의 용기를 준비하십시오: 300mL 유체(폐쇄 회로용)와 1L의 다른 두 개의 컨테이너를 각각 보관할 수 있습니다: 하나는 세척용이고 다른 하나는 폐기물(개방형 회로용).
4. 폐쇄 회로 구성 : 관류 실험 및 이미징
- 300mL의 PBS를 폐쇄 회로 컨테이너에 추가하여 튜브 및 모델을 포함한 전체 시스템을 채우기에 충분합니다. 용기 내부에 입구 튜브 1개와 콘센트 튜브 1개(열린 클램프 b 및 c)를 놓습니다.
- 1 L 세척 용기를 증류수(실험 종료 시 세척)로 채우고 나머지 1L 폐기물 용기를 비워 둡니다. 다른 입구와 콘센트 튜브(클램프 a 및 d 닫기)를 각각 세척 및 폐기물 용기에 놓습니다.
- 고정 된 세포 배양 경동맥 모델을 4 °C 저장에서 꺼내 PBS를 비웁채십시오. 3.3-3.4 단계에 설명된 바와 같이 경동맥의 입구와 콘센트를 연결합니다. 모델을 오랫동안 건조시키지 마십시오. 모델이 연결되면 펌프를 활성화하여 유체를 퍼퓨즈합니다.
- 현미경 아래에 경동맥 모델을 놓습니다. 입구 앞과 경동맥 모델의 출구 후에 튜브를 엽니다. 연동 펌프를 10rpm에 설정하고 켭니다. 4-5분마다 5rpm의 증분 속도를 높입니다. 누출이 없는지 확인합니다.
- 인간 경동맥(~400mL/min)의 생리파형의 최대 유량과 동일한 100rpm에서 형광카박스폴리스티렌(PS) 입자(2μm, 농도 1.6 μg/mL)를 폐쇄 회로 에서 PBS의 300mL에 추가한다. 관심 영역을 1.5h(필요에 따라 여전히 단일 이미지 또는 비디오)에 대해 10s마다 이미지화합니다.
5. 오픈 서킷 구성 : 세척 단계
- 1L 용기(클램프 a 및 d)에서 세척 및 폐관의 클램프를 열고 300mL 용기(클램프 b 및 c)에서 입구와 콘센트 튜브의 클램프를 즉시 닫아 시스템을 폐쇄형에서 개방 회로 구성으로 변경합니다.
- 대부분의 물이 세척 용기에서 100 rpm의 폐기물 용기로 흘러 들어오게하십시오. 완전히 전달되기 전에 연막 펌프에서 멈추고 입구 앞과 경동맥 모델의 출구 후에 튜브 클램프를 닫습니다.
- 적절한 필터를 사용하여 관심 영역에서 모델의 이미지를 캡처하여 세포에 입자의 증착 및 접착력을 표시합니다. 경동맥 모델의 연결을 끊습니다. 모델의 입구를 통해 10mL 주사기로 PBS 4mL을 신중하게 천천히 추가합니다.
- 경동맥 모델 대신 세척에만 사용되는 실리콘 고무 3D 경동맥 모델인 "더미 모델"을 연결하고 시스템을 헹구는 다. 1L의 물을 더 넣고 모든 물이 세척 용기에서 폐기물로 옮겨질 때까지 시스템을 다시 세척합니다. 연동 펌프를 끕니다.
6. 데이터 수집 및 분석
- 사용자 지정된 소프트웨어 코드를 사용하여 실험 중에 촬영한 이미지와 관심 영역에서 파티클 증착의 디지털 동영상을 획득합니다(재료 표참조).
- 모델을 따라 입자의 증착 매핑을 위해, 타일다임 다중 이미지는 관심의 검사 영역을 커버한다(도4A,B).
참고: 관심 있는 사이트의 부착된 입자 수를 정량화하기 위해 사용자 정의 소프트웨어 코드를 작성할 수 있습니다(샘플 파일은 보충 정보로제공되었습니다)17.
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Representative Results
이 논문은 실제 크기의 3D 인간 동맥 모델 내부의 입자증착을 매핑하는 새로운 프로토콜을 제시하며, 이는 약물 전달 연구를 위한 새로운 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 3D 프린팅 기술을 사용하여 인간 경동맥 양면 동맥의 모델을 제조하였다(도2). 모델은 실리콘 고무로 만들어졌으며 인간 적인 EC(그림 3)로시드되었습니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 특히 유체 역학에 관하여 생리적인 조건의 복제를 가능하게 했습니다. 관류 시스템은 경동맥의 생리적 파형 특성의 크기하에서 일정한 흐름하에서 경동맥 양면에 입자를 주입하도록 설계되었습니다. 도 1은 연동 펌프, 진동 댐퍼, 배양 된 분기 모델, 튜브 및 유체 용기로 구성된 관류 시스템을 제시합니다.
침투된 입자의 증착 및 접착력을 매핑하기 위해, 동맥 모델은 실험의 끝과 세척 후(5.3단계)에서 스테레오현미경으로 이미지되었다. 이미지는 2배 의 목표를 사용하여 캡처되고 함께 타일링되어 모델의 전체 이미지를 형성했습니다. 그런 다음 사용자 지정 소프트웨어 코드를 사용하여 부착된 파티클수를 계산하였다. 분기에서 재순환 패턴의 형성을 검사하기 위해 10 μm 형광 유리 구슬이 모델에 주입되었습니다. 도 4A는 재순환을 나타내며, 이는 모델 내부의 조건이 생리적 조건을 모방한다는 것을 시사한다.
모델 내부의 입자의 증착을 매핑하기 위해 2μm 형광 카박스PS 입자가 주입되었고, 이들의 ECS에 대한 접착이 이미지되었다(도4B,C). 이러한 입자는 모델-더 많은 접착력을 따라 다양한 영역에서 다르게 부착되어 벽 전단 응력이 높은 재순환 영역에서 관찰되었다. 이러한 결과는 이전에 입자의 접착이 모델의 형상, 입자 표면 특성 및 전단응력(17)의함수임을 보여주기 위해 논의되었습니다. 이러한 증착 맵은 비교적 간단하며 환자 별 모델에서 생리적 조건하에서 약물 운반대의 친화성 및 표적을 선별하기 위해 신속하게 얻을 수 있습니다.
그림 1: 관류 시스템. 관류 시스템은 일정한 흐름하에서 유체를 침투하도록 설계되었습니다. (1) 연동 펌프, (2) 진동 댐퍼, (3) 배양된 3D 동맥 모델 및 3개의 유리 용기로 구성됩니다: 1L 용량(4 및 6)을 가진 2개 및 300mL 유체(5)를 보유할 수 있다. 시스템은 두 가지 구성으로 작동할 수 있습니다: (i) 클램프a+d가 열려 있고 b+c가 닫히거나(ii) 클로즈회로, 즉 클램프는 +d가 닫히고 b+c가 열려 있는 폐쇄 회로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 3D 경동맥 분기 모델의 제조 공정. (A-C)인간 경동맥 분면화, 동맥 주위의 금형 프레임 및 임시 인쇄 지지대가 설계되었다. (D, E) 형상은 3D 프린터를 사용하여 인쇄되었습니다. (F)임시 인쇄 지지대를 절단하고, 모델은 모래와 옻칠로 살포되었다. 그런 다음 투명 직사각형 슬라이드가 모든 면에서 프레임에 접착되었습니다. 실리콘 고무는 접착제가 건조했을 때 주조되었습니다. 약어: 3D = 3차원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 경동맥의 3D 모델 내부의 C의 파종. (A)실리콘 고무로 만든 인간 경동맥 의 실제 크기의 3D 모델. 이 모델은 인간 적인 EC로 배양되었고 셀 배지로 채워졌습니다. (B)배양모델은 37°C에서 48h.(C) 브라이트필드에서3D 모델 내부의 배양 된 EC의 이미지와(D)파란색으로 핵 염색을 위한 DAPI를 배치하였다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: EC = 내피 세포; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌; 3D = 3차원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 입자의 접착력을 퍼퓨딩하고 매핑합니다. (A)모델을 통해 400mL/min의 일정한 흐름에서 10 μm 형광 유리 입자의 관류시 생성된 유선형 및 재순환(dashed 사각형)의 줄무늬 선 이미지. (B)3D 배양 모델 내부의 2 μm 형광 카박스PS 입자(빨간색)의 증착 지도. 스케일 바 = 2mm.(C)입자의 접착(빨간색) 배양 된 EC (파란색-DAPI) 모델 내부의 10 배율. 스케일 바 = 10 μm. 약어: PS = 폴리스티렌; 3D = 3차원; EC = 내피 세포; DAPI = 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
입자의 혈관 표적을 연구하는 현재접근은 인체에 존재하는 생리적 조건을 복제하는 데 부족합니다. 여기에 제시된 인간 동맥의 3D 재구성 모델을 조작하여 맞춤형 관류 시스템을 사용하여 적용되는 생리적 흐름하에서 동맥을 감싸는 IC에 입자 타겟팅을 연구하는 프로토콜이 여기에 제시된다. 3D 프린팅용 재료를 선택할 때는 투명 플라스틱 모델로의 안료 전달을 피하기 위해 투명 플라스틱을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 또한 아세톤에 용해되지 않는 소재를 선택하는 것이 중요하지만, 대신 부드럽고 부서지기 쉽고 모델에서 쉽게 제거할 수 있습니다.
제시된 3D 모델은 실리콘 고무, 투명 실리콘으로 제작되었으며 경화제와 혼합됩니다. 혼합물이 항상 실온 이하인지 확인하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 실리콘과 경화제 사이의 교차 연결이 금형에 탈가싱및 주조하기 전에 시작됩니다. 폴리디메틸실록산은 이러한 모델을 제작하는 데에도 사용할 수 있지만(크로스링커로 1:10 비율), 실리콘 고무는 내구성이 뛰어납니다. 플라스틱을 용해시키기 위해 아세톤에 모델을 침지한 후, 아세톤 잔류물의 완전한 증발을 보장하기 위해 적어도 4 일 동안 60 °C에서 배양하는 것이 중요합니다. 아세톤이 모델 내부에 갇혀 있으면 세포가 제대로 자라지 않습니다. 24h 이후의 배지를 변경하고 48h 이후 세포의 고정은 10mL 주사기를 사용하여 유체의 수동 주입을 포함하는 두 단계이다. 따라서 천천히 퍼퓨즈하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 세포가 씻겨 나올 수 있습니다.
관류 시스템에는 두 개의 입구와 두 개의 콘센트 튜브가 있습니다. 각 튜브에는 유동 제어를 위한 플라스틱 튜브 클램프가 있습니다. 대부분의 튜빙 시스템은 6mm ID 튜브인 펌프에 고정된 튜브를 제외한 4mm 내부 디미터(ID) 튜브로 구성됩니다. 펌프에 고정된 튜브의 ID는 시스템에서 얻을 수 있는 최대 유량을 결정합니다. 이러한 관류 시스템은 또한 연동 펌프에 의해 생성된 일정한 유량에 원하는 파형의 진동 부분을 과소분석기 어셈블리에 댐퍼의 출구를 연결하여 일정한 평균흐름(17)에 진동을 겹침으로써 맥동파형을 생성할 수 있다. 이 구성을 사용하면 발진기 흐름 또는 발진기가 꺼질 때 일정한 흐름 조건에서 작업을 수행할 수 있습니다.
이 논문에서 관류 시스템은 3D 인간 경동맥 분비화를 실험하여 사용자 정의하였다. 따라서 다른 동맥 모델 이나 다른 튜브를 사용 하는 경우 유체 및 유량 조정을 필요로 할 수 있습니다. 이러한 경우 모델 벽에서 셀 분리가 없도록 하면서 시스템 및 유량보정을 해야 합니다. 연동 펌프의 유량을 점진적으로 증가시키는 것이 매우 중요하며, 이는 세포가 흐름으로 씻겨나가지 않도록 보장한다. 더욱이, 튜브, 모델, 컨테이너를 포함한 전체 시스템이 유체로 채워지도록 하는 것이중요합니다(예를 들어,이 경우, 총 300mL의 유체로 채워졌다). 또한 각 실험 전후에 시스템을 개방형 회로 구성에서 증류수로 세척해야 합니다.
혈액은 또한 관류시스템(17)을사용하여 모델에 침투될 수 있다. 이 경우, 특히 인간의 혈액이 사용되는 경우 누출을 방지하기 위해 추가주의를 기울여야합니다. 또한, 표백제가 혈액에서 완전히 씻겨 나가는 것을 보장하기 위해 실험이 끝날 때 퍼프화되어야 하기 때문에 세척 단계는 매우 중요합니다. 표백제 후에는 프로토콜에 언급된 대로 물을 분산시켜야 합니다. 이 논문에서는 균일한 조성과 좁은 크기 분포를 가진 carboxylated PS 입자가 사용되었다는 점에 유의해야 합니다. 더욱이, 이 입자는 정전기 상호 작용을 통해 주로 세포를 부착합니다. 그러나, 다른 약물 나노캐리어는 리간드 표지입자(예를 들어,항세포간 접착 분자 1 및 항혈소판 내피세포 접착 분자 1)로뿐만 아니라 검사되어야 하며, 이는 관심 있는 현장에서 EC에 입자 축적을 증가시킬 것이다.
또한, 본 프로토콜에서, IC는 모델을 관류 시스템에 연결하고 입자의 주입전에 고정되었다. 고정 된 세포에 입자의 접착은 결합 과정에서 첫 번째 단계를 나타내므로, 살아있는 세포를 가진 실험은 파티클의 내재화가 접착 과정의 후반 단계에서 발생할 수있는 수행될 필요가있다. 이 프로토콜은 생리적 조건하에서 약물 운반선의 연구를 위한 3D 동맥 모델을 제조하는 데 사용될 수 있다. 설명된 접근은 환자 특정 조건의 에이전트의 납품의 연구 결과에 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 이스라엘 과학 재단 (ISF 보조금 # 902/18)에 의해 지원되었다. 마리아 Khoury의 장학금은 바론스 아리안 드 로스차일드 여성 박사 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | FormLabs | PKG-F2-REFURB | |
| Acetone, absolute (AR grade) | |||
| Connectors | Nordson Medical | FTLL013-1 | Female Luer |
| FTLL230-1 | Female Luer | ||
| FTLL360-1 | Female Luer | ||
| LP4-1 | Male Luer Integral Lock | ||
| Damper | Thermo-Fisher Scientific | DS2127-0250 | Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle |
| Damper Cover | Thermo-Fisher Scientific | 2162-0531 | Nalgene Filling/Venting Closures |
| Elastosil Elastosil RT 601 A | Wacker | 60003805 | |
| Elastosil RT 601 B | Wacker | 60003817 | The crosslinker |
| Endothelial Cell Media | ScienCell | 1001 | |
| Fibrontectin | Sigma Aldrich | F0895-5mg | |
| HUVEC | Lonza | CC-2519 | |
| Isopropyl alcohol, AR grade 99.5% | Remove plastic dust from the sanded model | ||
| Lacquer | Rust-Oleum | 2X-Ultra cover Gloss Clear | |
| Matlab | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Microscope | Nikon | SMZ25 | |
| Microscope Camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | 530U IP31 | With 2 pumpheads: 313D |
| Plastic tube clamp | Quickun | 1-2240-stopvalve-2pcs | |
| Polystyrene Particles | Thermo-Fisher Scientific | F8827 | Diameter = 2 µm |
| Printer resin | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Rotator | ELMI Ltd. | Intelli-Mixer RM-2 | |
| Solidworks | SolidWorks Corp., Dassault Systèmes | https://www.solidworks.com/ | |
| Tubing | Watson Marlow | 933.0064.016 | Tubing for the pump: 6.4 mm ID |
| All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID | |||
References
- Chiu, J. J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Martorell, J., et al. Extent of flow recirculation governs expression of atherosclerotic and thrombotic biomarkers in arterial bifurcations. Cardiovascular Research. 103 (1), 37-46 (2014).
- Karino, T., Goldsmith, H. L. Flow behaviour of blood cells and rigid spheres in an annular vortex. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 279 (967), 413-445 (1977).
- Goldsmith, H. L., Karino, T. Platelets in a region of disturbed flow. Transactions - American Society for Artificial Internal Organs. 23, 632-638 (1977).
- Farcas, M. A., Rouleau, L., Fraser, R., Leask, R. L. The development of 3-D, in vitro, endothelial culture models for the study of coronary artery disease. Biomedical Engineering Online. 8, 30 (2009).
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