Summary
ترتبط إصابة الدماغ الرضية (TBI) عادة بضعف الذاكرة. هنا، نقدم بروتوكول لتقييم الذاكرة المكانية العاملة بعد TBI عبر مهمة مترية. اختبار متري هو أداة مفيدة لدراسة ضعف الذاكرة العاملة المكانية بعد TBI.
Abstract
تعد الإعاقات في الذاكرة الحسية والقصيرة الأجل والطويلة الأجل من الآثار الجانبية الشائعة بعد إصابة الدماغ الرضية (TBI). نظرا للقيود الأخلاقية للدراسات البشرية ، توفر النماذج الحيوانية بدائل مناسبة لاختبار طرق العلاج ، ودراسة الآليات والمضاعفات ذات الصلة للحالة. كانت نماذج القوارض التجريبية تاريخيا الأكثر استخداما نظرا لسهولة الوصول إليها ، وانخفاض التكلفة ، وإعادة الإنتاج ، والنهج المعتمدة. اختبار متري، الذي يختبر القدرة على تذكر وضع كائنين على مسافات وزوايا مختلفة من بعضها البعض، هو تقنية لدراسة ضعف في الذاكرة العاملة المكانية (SWM) بعد TBI. وتشمل المزايا الهامة للمهام المترية إمكانية المراقبة الديناميكية، وانخفاض التكلفة، والاستنساخ، وسهولة التنفيذ النسبية، وانخفاض بيئة الإجهاد. هنا ، نقدم بروتوكول اختبار متري لقياس ضعف SWM في الفئران البالغة بعد TBI. يوفر هذا الاختبار طريقة مجدية لتقييم علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية لوظيفة الدماغ بشكل أكثر فعالية.
Introduction
انتشار العجز العصبي مثل الاهتمام، وظيفة التنفيذية، وبعض العجز في الذاكرة بعد إصابات الدماغ الرضية المعتدلة (TBI) هو أكثر من 50 في المئة1،2،3،4،5،6،7،8. يمكن أن يؤدي TBI إلى إعاقات شديدة في الذاكرة المكانية قصيرة الأجل وطويلة الأجل والعمل9. وقد لوحظت هذه الاختلالات الذاكرة في نماذج القوارض من TBI. وقد مكنت نماذج القوارض تطوير تقنيات لاختبار الذاكرة، مما يسمح لإجراء فحوصات أعمق في تأثير TBI على معالجة الذاكرة في أنظمة الذاكرة العصبية.
يساعد اختباران، يتعلقان بمعالجة المعلومات المكانية الطوبولوجية والمقاييس على التوالي، في قياس الذاكرة الحيزية العاملة (SWM). يعتمد الاختبار الطوبولوجي على تغيير حجم الفضاء البيئي أو المساحات ذات الصلة من الاتصال أو الضميمة حول الجسم ، في حين أن الاختبار المتري يقيم التغيرات في الزوايا أو المسافة بين الأجسام10،11. Goodrich-Hunsaker وآخرون تكييف أول اختبار طوبولوجي الإنسان للفئران10 وتطبيق المهمة المترية نأي أدوار القشرة الجدارية (PC) وفرس النهر الظهري في معالجة المعلومات المكانية11. وبالمثل، قام جوركوف وزملاؤه بتقييم مهام الذاكرة المترية والت طوبولوجية والزمنية بعد إصابة قرع السائل الجانبي9. هناك علاقة بين الضرر الذي لحق ببعض مناطق الدماغ وضعف الذاكرة المترية أو الطوبولوجية. وقد اقترح أن ضعف الذاكرة المترية يرتبط الآفات في ثنائي الظهر dentate جيروس وكورنو ammonis (CA) المنطقة الفرعية CA3 من قرن آمون, ويرتبط أن ضعف الذاكرة الطوبولوجية لآفات القشرة الجدارية الثنائية10,12.
الغرض من هذا البروتوكول هو تقييم نقص الذاكرة المكانية في مجموعة الفئران من خلال مهمة مترية. هذه الطريقة هي بديل مناسب للتحقيق في آليات SWM بعد إصابة الدماغ ، وتشمل مزاياها السهولة النسبية للتنفيذ ، والحساسية العالية ، وانخفاض تكلفة الاستنساخ ، وإمكانية الملاحظة الديناميكية ، وبيئة الإجهاد المنخفض. بالمقارنة مع المهام السلوكية الأخرى مثل متاهة بارنز13،14، موريس الملاحة المائية المهمة15،16،17، أو مهام المتاهة المكانية18،19، وهذا الاختبار متري هو أقل تعقيدا. نظرا لسهولة التنفيذ ، يتطلب الاختبار المتري فترة تدريب أقصر وأقل إرهاقا ويتم على مدى يومين فقط9: 1 يوم للتعود ويوم واحد للمهمة. وعلاوة على ذلك، لدينا اختبار المقترحة أسهل لأداء من اختبارات الإجهاد المنخفض الأخرى، مثل مهمة التعرف على كائن جديد (NOR)، ولا يتطلب يوم إضافي من التعود20.
توفر هذه الورقة نموذجا مباشرا لتقييم SWM بعد إصابة الدماغ. قد يساعد هذا التقييم ل SWM ما بعد TBI في إجراء تحقيق أكثر شمولا في الفيزيولوجيا المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت التجارب بناء على توصيات إعلان هلسنكي وطوكيو والمبادئ التوجيهية لاستخدام الحيوانات التجريبية للجماعة الأوروبية. وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان بجامعة بن غوريون في النقب على هذه التجارب. يتم توضيح جدول زمني للبروتوكول في الشكل 1.
1. العمليات الجراحية وقرع السوائل TBI
- حدد الفئران سبراغ دولي البالغين من الذكور والإناث، وتقع في درجة حرارة الغرفة من 22 ± 1 درجة مئوية، والرطوبة من 40٪-60٪، مع 12-12 ساعة دورات ضوء الظلام.
- توفير الطعام كما تشاو والمياه الإعلانية libitum. إجراء التجارب بين ساعات الصباح، أي الساعة 6:00 صباحا .m والساعة 12:00 ظهرا.m.
- إجراء تقييم عصبي أساسي لكل من مجموعتي التحكم و TBI قبل بدء التجربة (انظر القسم 2 أدناه).
- تخدير الفئران مع استنشاق 4٪ isoflurane للتحريض و 1.5٪ للحفاظ على التخدير. تأكد من أن الجرذ معطل عن طريق اختبار منعكس الدواسة أو الحركة استجابة لمهيجة.
ملاحظة: استخدام نظام إدارة isoflurane المستمر للتخدير. تنفيذ كافة الإجراءات في ظروف مطهرة. - أداء إصابة parasagittal السائل قرع كما هو موضح سابقا21,22.
- حقن تحت الجلد 0.2 مل من 0.5٪ bupivacaine على طول موقع شق المحتملين، قبل شق. ransfer الجرذ إلى غرفة الإنعاش ومواصلة رصد العصبية (مثل الشلل) ، والجهاز التنفسي (على سبيل المثال ، توقف التنفس) وحالة القلب والأوعية الدموية (على سبيل المثال ، انخفاض في الأنسجة الرخوة التشوه ، والتغيرات في لون التلاميذ ، وبطء القلب) لمدة 24 ساعة. قبل ظهورها من التخدير، وإدارة 0.01 - 0.05 ملغم / كغ البوبرينورفين العضلي كما مسكن بعد الجراحة. تكرار الجرعات كل 6 - 12 ساعة لمدة 48 ساعة على الأقل.
2. تقييم درجة الخطورة العصبية (NSS)
ملاحظة: تم إجراء تقييم العجز العصبي وتصنيفه باستخدام NSS، كما هو موضح سابقا23،24. الحد الأقصى لدرجة التغيير في وظيفة المحرك والسلوك هو 24 نقطة. درجة 0 تشير إلى حالة عصبية سليمة و 24 يشير إلى خلل عصبي حاد، كما هو موضح سابقا24.
- اختبار عدم قدرة الفئران على ترك دائرة (50 سم في القطر) عند وضعها في مركزها. قم بأداء هذه المهمة ثلاث مرات، مع كل جلسة تستمر 30 دقيقة و 60 دقيقة وأكثر من 60 دقيقة لكل منها.
ملاحظة: إذا التقاط الفئران من الذيل، عقد قاعدة الذيل. - اختبار الفئران لفقدان حق منعكس.
- ضع الحيوان على ظهره في راحة يد الباحث. إعطاء درجة من 1 إذا كان الحيوان قادرا على حق نفسه25 (يقف على جميع الكفوف الأربعة).
- اختبار الفئران ل hemiplegia، وعدم قدرة الفئران لمقاومة تحديد المواقع القسري.
- رفع الفئران من ذيله لاختبار الانحناء انعكاسي من hindlimb.
- ضع الجرذ على الأرض لاختبار قدرته على المشي مباشرة.
- إجراء اختبار لثلاثة سلوكيات انعكاسية: رد الفعل بينا، منعكس القرنية، ومنعكس الذهول.
- لردود الفعل pinna، أداء التحفيز اللمسي الخفيف لاختبار تراجع الأذن كما هو موضح سابقا25.
- لاختبار رد الفعل القرنية، رصد استجابة وميض عند تطبيق عصا ناعمة طفيفة على العين وقياس على مقياس من 0 (أي استجابة) إلى طرفة عين ثلاثية (3)، كما هو موضح سابقا25.
- لرد الفعل الذهول، اسحب قلم عبر الجزء العلوي من قفص الأسلاك والاستجابة سجل مع مقياس من 0 (أي استجابة) إلى 3 (1 سم القفز أو أكثر)، كما هو موضح سابقا25.
- الصف الجرذ على أساس فقدان السعي السلوك والسجود (عدم تحريك شعيرات بهم، شم، أو تشغيل بعد نقلها إلى بيئة جديدة)24.
- اختبار ردود الفعل أطرافه لوضع على الأطراف الأمامية اليسرى واليمينية، ومن ثم الخلفيات اليسار واليمين.
- تحليل الوظائف من خلال مهمة موازنة الحزمة مع شعاع بعرض 1.5 سم. قم بإجراء الاختبار لجلسات العمل التي تستمر لمدة 20 ثانية و40 ثانية وأكثر من 60 ثانية.
- قم بتشغيل اختبار المشي الحزمي بثلاثة حزم مختلفة: 8.5 سم وعرض 5 سم وعرض 2.5 سم.
3. التحضير للمهمة المترية
- معدات
- ضع منصة دائرية سوداء قطرها 200 سم وسماكة 1 سم على الطاولة. يجب أن يكون ارتفاع الجدول 80 سم فوق الأرض.
- إنشاء كائنين مختلفين في وسط منصة دائرية 68 سم بعيدا عن بعضها البعض.
ملاحظة: في هذه التجربة، تم استخدام زجاجتين للأشياء، زجاجة مستديرة واحدة بارتفاع 13.5 سم وزجاجة أخرى ذات جوانب بارتفاع 20 سم. ملء زجاجات بالماء لضمان الاستقرار. - قم بإعداد الكاميرا وتثبيت برامج الكمبيوتر المطلوبة لالتقاط البيانات وحفظها ومعالجتها. تثبيت الكاميرا على ارتفاع 290 سم من الأرض.
ملاحظة: تعتمد المسافة بين المنصة والكاميرا على مواصفات الكاميرا. يجب أن يغطي إطار الكاميرا كامل مساحة الحلبة التي يتم فيها إجراء الاختبار. كانت المسافة لتجربة بين المنصة والكاميرا 210 سم.
- التعود
- في اليوم السابق للمهمة ، تعود الجرذ على البيئة الجديدة لمدة 10 دقائق عن طريق وضعه على الحلبة دون تسجيل فيديو.
ملاحظة: لا تقم بتنفيذ المهام العصبية والمهام المترية في نفس اليوم.
ملاحظة: إجراء اختبارات مترية في منطقة الضوء الأحمر.
- في اليوم السابق للمهمة ، تعود الجرذ على البيئة الجديدة لمدة 10 دقائق عن طريق وضعه على الحلبة دون تسجيل فيديو.
4. تنفيذ المهمة المترية
ملاحظة: تنفيذ المهمة المترية يتكون من فترتين: 1) التعود (15 دقيقة) و 2) اختبار (5 دقائق) الفترة.
- فترة التعود
- إنشاء كائنين مختلفين في وسط المنصة الدائرية على بعد 68 سم من بعضهما البعض.
- ضع الجرذ على نهاية المنصة متساوي البعد عن الأشياء لمدة 15 دقيقة ، وسجل الفيديو.
- إزالة الفئران من المنصة ومكان في قفص الفردية لمدة 5 دقائق.
- تنظيف المنصة مع الكحول 5٪-10٪.
ملاحظة: يمكن استخدام الكحول بنسبة تصل إلى 70٪ لتنظيف المنصة في المناطق جيدة التهوية.
- فترة الاختبار
- تقليل المسافة بين الكائنات إلى 34 سم.
- ضع الجرذ على المنصة لمدة 5 دقائق وسجل نشاط استكشاف الفئران على الفيديو.
- تنظيف المنصة مع الكحول 5٪-10٪.
5. تحليل البيانات
ملاحظة: يتم إجراء تحليل البيانات بواسطة برنامج تتبع الفيديو المصمم خصيصا لدراسات السلوك الحيواني التي تسجل تلقائيا النشاط والحركة الحيوانية(انظر جدول المواد ). يعمل هذا البرنامج على أتمتة مجموعة من المتغيرات السلوكية، بما في ذلك التنقل والنشاط والسلوك الاستكشافي.
- قبل تحليل ملفات الفيديو، أدخل مفتاح جهاز البرنامج. بدء تشغيل برنامج تتبع الفيديو وفتح قالبمسبقا .
- في قسم الإعداد، تحقق من الإعدادات كما يلي: Arena، والتحكم التجريبي، وإعدادات الكشف (انظر الشكل 2a) .
ملاحظة: لهذه التجربة، يتم تعريف معلمات منطقة الاستكشاف على أنها 6 سم حول الهدف محل الاهتمام. الوقت الذي دخل فيه الجرذ إلى هذه المنطقة تم قياسه - بعد التحقق من الإعدادات، قم بتكرارها وإعادة تسميتها.
- على الشاشة العامة للبرنامج، Grab الخلفية عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن.
- حدد ملف فيديو لصورة الخلفية. في القائمة استعراض حدد موقع ملف الفيديو.
- التقط الصورة وميز المناطق والمناطق التي تم فحصها، معايرة الصورة للتحليل. تنفيذ نفس الخطوات للتحكم التجريبي وإعدادات الكشف عن.
- في القائمة العامة، حدد قائمة التجارب وقم بتنزيل قائمة ملفات الفيديو للتحليل.
- أضف مقاطع الفيديو واذكر الموقع باستخدام الإعدادات المطلوبة.
- حدد اقتناء وبدء المحاكمة (انظر الشكل 2b، ج). تصدير كافة البيانات كملفات Excel (انظر الشكل 2D).
ملاحظة: تنفيذ كافة العمليات الحسابية لفترتي التعود والاختبار. يتم إعداد تقييم المهام المترية باستخدام قالب متقدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تحديد أهمية المقارنات بين المجموعات باستخدام اختبار مان ويتني. وقد تم النظر في الأهمية الإحصائية للنتائج في P < 0.05، في حين تم قياس الأهمية الإحصائية العالية في P < 0.01.
ولم تظهر النتائج أي اختلافات في ال NSS بين جميع المجموعات قبل التدخل وبعد 28 يوما من TBI. وتألفت كل مجموعة من 12 أنثى أو 12 فأرا ذكرا. يتم عرض درجات NSS التي تم الحصول عليها بعد 48 ساعة من TBI في الجدول 1. استبعدت الفئران من مجموعة TBI التي أظهرت عجزا عصبيا كبيرا في اليوم 28 بعد الإصابة من التجربة. يتم قياس البيانات كأعداد وتقديمها على أنها متوسط نطاق ±.
لم تظهر مجموعة التحكم التي تعمل بالشمس أي عجز عصبي عند 48 ساعة بعد اليوم الأول من الدراسة (NSS-0). العجز العصبي في 48 ساعة بعد TBI كان أكبر بكثير للفئران TBI الذكور من للفئران الذكور التي تعمل بالشمس (5.5 (4-7) مقابل. 0 (0-0)، U = 0، ص < 0.01، ص = -0.89)، وبالنسبة للفئران TBI الإناث من الفئران التي تعمل بالعار الإناث (4.5 (3.25-6) مقابل 0 (0-0)، U = 0، p < 0.01، ص = -0.91)، وفقا لاختبار مان ويتني (الجدول 1).
وأشار اختبار مان ويتني إلى أن وقت استكشاف الأجسام خلال المهمة المترية كان أقصر بكثير بالنسبة للفئران الذكور التي تعمل بالشمس مقابل الفئران الذكور التي تعمل بالشمس (130٪ ± 44.3٪ مقابل 1978٪ ± 59.2٪)، U = 0، p < 0.01، r = -0.85 (انظر الشكل 3a،b). يتم قياس البيانات كثواني يتم التعبير عنها في ٪ من نقطة الأساس وتقدم على أنها متوسط ± SEM. يتم قياس خط الأساس على أنه وقت الاستكشاف خلال أول 5 دقائق من فترة التعود. أما النقاط الزمنية الثلاث المتبقية (5-10 دقائق، و10-15 دقيقة، و20-25 دقيقة) فقد حسبت كنسبة مئوية من خط الأساس.
وأشار اختبار مان ويتني إلى أن وقت استكشاف الأجسام خلال المهمة المترية كان أقصر بكثير بالنسبة للفئران الإناث TBI مقابل الفئران التي تعمل بالعار الإناث (89٪ ± 43.5٪ مقابل 2160٪ ± 43.6٪)، U = 0، ص < 0.01، ص = -0.85 (انظر الشكل 4a،b). يتم قياس البيانات كثواني يتم التعبير عنها في ٪ من نقطة الأساس وتقدم على أنها متوسط ± SEM. يتم قياس خط الأساس كفترة الاستكشاف خلال فترة التعود.
ولم يكن هناك فرق كبير بين المجموعات الذكورية والأنثوية.
الشكل 1:تخطيط البروتوكول مع الجداول الزمنية. يوضح هذا الشكل الجدول الزمني للبروتوكول. وشملت مجموعات من الفئران في أوقات مختلفة مجموعة مراقبة تعمل بالشمس ومجموعة TBI وتم تقييمها من قبل NSS درجة في -1 ساعة و 48 ساعة و 28 يوما بعد الإصابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:تحليل البيانات التمثيلية. لقطات الشاشة من برنامج تتبع الفيديو ل (أ) إعدادات التحكم التجريبي (ب) قائمة تجريبية و (C) اكتساب، والبيانات المثال تصديرها إلى Excel (D). راجع النص والفيديو للحصول على التفاصيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مهمة متري للفئران الذكور. كان وقت استكشاف الجسم خلال المهمة المترية أقصر بكثير بالنسبة للفئران الذكور TBI مقابل الفئران الذكور التي تعمل بالشمس (انظر الشكل 3a، b، والذي يوضح البيانات على مقاييس مختلفة محور ص). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مهمة متري للفئران الإناث. كان وقت استكشاف الجسم خلال المهمة المترية أقصر بكثير بالنسبة للفئران الإناث TBI مقابل الفئران التي تعمل بالعار الإناث (انظر الشكل 4a،b، والذي يوضح البيانات على مقاييس مختلفة محور ص). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| قيم NSS لمجموعات الدراسة عند 48 ساعة بعد TBI | متوسط (نطاق) | |||||
| مجموعة الحيوان | N | الاساس | 48h | 1 واط | 2 واط | 4 واط |
| الفئران الأنثوية/الذكورية التي تديرها الشام | 12 | 0(0-0) | 0(0-0) | 0(0-0) | 0(0-0) | 0(0-0) |
| TBI الفئران الذكور | 12 | 0(0-0) | 5.5(4-7)* | 2(1-6)* | 1.5(0-2)* | 0(0-2) |
| TBI الفئران الإناث | 12 | 0(0-0) | 4.5(3.25-6)* | 1.5(0.25-2.8)* | 1(0-2)* | 0(0-0.8) |
الجدول 1: تحديد الأداء العصبي. وكان العجز العصبي في 48 ساعة بعد TBI أكبر بكثير للفئران TBI الذكور من للفئران الذكور التي تديرها صورية والجرذان TBI الإناث من الفئران التي تديرها صورية الإناث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من خلال استهداف عملية المعلومات المكانية المترية على وجه التحديد ، يوفر هذا الاختبار المتري أداة ضرورية لفهم نقص الذاكرة بعد TBI. البروتوكول المعروض في هذه الورقة هو تعديل للمهام السلوكية الموصوفة سابقا11. استخدمت إحدى المهام المترية الموصوفة سابقا نموذجين مختلفين، كل منهما يتكون من ثلاث جلسات تعود وجلسة اختبار واحدة. تألف النموذج الأول من تحريك الأشياء المألوفة أقرب إلى بعضها البعض بعد التعود والنموذج الثاني نقل الكائنات أبعد11.
بالمقارنة مع متاهة بارنز ، والتي يتم تنفيذها على مدى خمسةأيام 13 أو أربعة عشر14 ، يتم تنفيذ المهمة المترية المعروضة هنا في غضون يومين ، واليوم الأول للسكن واليوم الثاني للمهمة9. المهمة في هذا البروتوكول أقل إرهاقا من المهام السلوكية المماثلة مثل متاهة مياه موريس ، بسبب الإجهاد الناجم عن السباحة في المتاهة والمدة الأطول للمهمة15و16و17. اختبارات المتاهة للذاكرة المكانية تتطلب فترة تعلم هامة. حتى متاهة T بسيطة يتطلب ما لا يقل عن 5 أيام من التدريب18. للمتاهات شعاعي أكثر تعقيدا، ينصح 15-20 يوما من الاختبار اليومي19.
يحتوي هذا البروتوكول على عدة خطوات هامة. أحد المكونات الحاسمة هو الحاجة إلى التعامل مع الساحة مع محلول الكحول وكذلك الأشياء على ذلك. من الضروري أيضا أن يكون سطح الحلبة جافا ونظيفا ، نظرا لأن رائحة الكحول والروائح المتبقية من الحيوانات السابقة يمكن أن تغير سلوك الحيوان قيد الدراسة. بالإضافة إلى ذلك ، التهوية الكافية باستمرار لغرفة السلوك أمر حيوي. نظرا لأن الضوضاء هي أحد عوامل الإجهاد التي يمكن أن تغير سلوك الحيوانات ، فإننا نوصي بعازل الصوت المناسب. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ارتفاع المنصة 80 سم والمسافة النسبية للمنصة من الأجسام الأخرى ضرورية حتى لا يقفز الجرذ أو يصعد إلى جسم آخر. علاوة على ذلك، فإن الحفاظ على إعدادات متسقة في معالجة ملفات الفيديو المسجلة أثناء الإعداد سيساعد على تجنب التفسير غير الصحيح للبيانات.
يجب النظر في العجز العصبي الذي يتطور نتيجة ل TBI في تقييم الذاكرة. العجز العصبي بعد صدمة الرأس هي عامل مساهم في هذا المرض. تقييم العجز العصبي مهم جدا في نموذج القوارض من إصابات الدماغ وهو نتيجة حساسة للغاية وكثيرا ما تستخدم26. ومع ذلك، يمكن أن يكون للعجز العصبي الحاد تأثير على الاختبارات السلوكية، وخاصة على الاختبارات التي تقيس تقييم الذاكرة27. كما تقيم مهمة متاهة المياه موريس مماثلة ضعف الذاكرة28. درجة منخفضة في اختبار موريس في TBI أو الفئران السكتة الدماغية ترتبط ارتباطا وثيقا مع العجز العصبي، وفي الواقع، لا يعكس الذاكرة أو ضعف الإدراك، ولكن بدلا من الأداء العصبي والقدرة على تحمل الإجهاد.
لتقليل تأثير العجز العصبي المرتبط ب TBI على درجات الذاكرة ، استخدمنا النهج التالية: 1) استخدمنا نماذج من TBI خفيفة إلى معتدلة الشدة ، والتي تتعافى تلقائيا من الأداء العصبي بعد شهر واحد. 2) الفئران التي أظهرت عجزا عصبيا بعد 28 يوما من استبعاد TBI من التجارب السلوكية، استنادا إلى ملاحظاتنا أن جميع الفئران مع إصابة خفيفة استرداد. في مجموعات من 10-20 الفئران المتضررة مع TBI شديدة، فأر واحد في المتوسط لديه عجز عصبي كبير والتي قد تؤثر على الحركة. 3) لتقييم الذاكرة بعد الصدمة، لم نستخدم الاختبارات المتعلقة بالحركة، والتي قد تتأثر نتائجها بنقص عصبي (كما هو الحال في متاهة مياه موريس). في حين أن اختبار بارنز والاختبارات ذات الصلة مفيدة لتقييم الذاكرة في نماذج TBI والسكتة الدماغية ، فإن الاختبار المتري أكثر ملاءمة لتقييم SWM. وبالتالي ، فإن الاختبار المتري هو الاختبار المفضل لتقييم SWM للفئران بعد TBI.
أحد قيود هذا البروتوكول هو استخدام اختبار متري وحده بدلا من اختبار طوبولوجي. نحن نتصور الدراسات المستقبلية التي تتضمن أيضا الاختبارات الطوبولوجية لقياس الجوانب الأخرى من SWM. ومن المدهش، وفقا لنتائجنا، لم يتم العثور على فرق يعتد به إحصائيا بين الفئران الذكور والإناث. وهناك عدد كبير من الدراسات تظهر الاختلافات بين الجنسين بعد TBI29, العديد منها على أساس الفرق في تركيزات الهرمونات الإنجابية. الإستروجين والبروجسترون تلعب دورا في الحماية العصبية بعد TBI, التي تبين أن انخفاض الضغط داخل الجمجمة وتحسين درجة وظيفة العصبية على التوالي30. وفقا لدراسة التحليل التلوي، والرجال يعانون في كثير من الأحيان من TBI، ولكن النساء لديهم أسوأ التكهنات31. الإعاقات الإدراكية، والمضاعفات الأكثر شيوعا بعد TBI، والاتجاه نحو الاختلافات بين الجنسين، مع النساء تظهر تحسنا أكبر على مهام تحديد المواقع المكانية والرجال أداء أفضل علىالمهام اللفظية 32،33،34. ومع ذلك، تشير نتائجنا إلى إمكانية عدم اليقين بشأن الاختلافات في الذاكرة المكانية المرتبطة بنوع الجنس.
من بين أنواع مختلفة من نماذج TBI، نموذج قرع السوائل الناجمة TBI موثقة جيدا ووصفها، هو استنساخها بسهولة، وأقل تقلبا من النماذج الأخرى35،36. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن الاختبار المتري له فائدة واسعة ويمكن استخدامه بفعالية مع نماذج TBI الأخرى. يسمح الاختبار المتري الموصوف في هذا البروتوكول أيضا بإجراء مزيد من الأبحاث حول ضعف الذاكرة في نماذج مماثلة من الضرر العصبي ، مثل نماذج إصابة الدماغ المحوري المنتشر24و37 والسكتة الدماغية38. قد يكون هذا البروتوكول مفيدا أيضا لدراسة فعالية طرائق العلاج المختلفة في استعادة SWM بعد TBI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ونشكر الأستاذة أولينا سيفيرينوفسكا؛ ونشكر السيد ناينا سيفرينوفسكا، الأستاذة في جامعة ه M.Sc مارينا كوشيريافا؛ ماكسيم كريفونسوف M.Sc؛ دارينا ياكومينكو M.Sc؛ يفجينيا غونكاريك M.Sc; وأولها شابوفال، مرشحة لنيل درجة الدكتوراه في قسم علم وظائف الأعضاء، كلية البيولوجيا، علم البيئة، والطب، جامعة أوليس هونشار دنيبرو، دنيبرو، أوكرانيا لمساهماتها الداعمة والمفيدة. تم الحصول على البيانات كجزء من أطروحة الدكتوراه ديمتري فرانك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | SIGMA - ALDRICH | 500 cc | For general antisepsis of the skin in the operatory field |
| Bupivacaine 0.1 % | |||
| 4 boards of different thicknesses (1.5cm, 2.5cm, 5cm and 8.5cm) | This is to evaluate neurological defect | ||
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Bottles | Techniplast | ACBT0262SU | 150 ml bottles filled with 100 ml of water and 100 ml 1%(w/v) sucrose solution |
| Bottlses (four) for topological an metric tasks | For objects used two little bottles, first round (height 13.5 cm) and second faceted (height 20 cm) shape and two big faceted bottles, first 9x6 cm (height 21 cm) and second 7x7 cm (height 21 cm). | ||
| Diamond Hole Saw Drill 3mm diameter | Glass Hole Saw Kit | Optional. | |
| Digital Weighing Scale | SIGMA - ALDRICH | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | SIGMA - ALDRICH | Z265969 | |
| Ethanol 99.9 % | Pharmacy | 5%-10% solution used to clean equipment and remove odors | |
| EthoVision XT (Video software) | Noldus, Wageningen, Netherlands | Optional | |
| Fluid-percussion device | custom-made at the university workshop | No specific brand is recommended. | |
| Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Gloves (thin laboratory gloves) | Optional. | ||
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | No specific brand is recommended. |
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 | Anesthetic liquid for inhalation |
| Office 365 ProPlus | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | SIGMA - ALDRICH | ||
| Operating Scissors | SIGMA - ALDRICH | ||
| PC Computer for USV recording and data analyses | Intel | Intel® core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system | |
| Plexiglass boxes linked by a narrow passage | Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage | ||
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 |
| Rat cages (rat home cage or another enclosure) | Techniplast | 2000P | No specific brand is recommended |
| Scalpel blades 11 | SIGMA - ALDRICH | S2771 | |
| SPSS | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | 20 package | |
| Stereotaxic Instrument | custom-made at the university workshop | No specific brand is recommended | |
| Timing device | Interval Timer:Timing for recording USV's | Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats | |
| Topological and metric tasks device | Self made in Ben Gurion University of Negev | White circular platform 200 cm in diameter and 1 cm thick on table | |
| Video camera | Logitech | C920 HD PRO WEBCAM | Digital video camera for high definition recording of rat behavior under plus maze test |
| Windows 10 | Microsoft |
References
- Binder, L. M. Persisting symptoms after mild head injury: A review of the postconcussive syndrome. Journal of Clinical and Experimental Neuropsychology. 8 (4), 323-346 (1986).
- Binder, L. M. A review of mild head trauma. Part II: Clinical implications. Journal of Clinical and Experimental Neuropsychology. 19 (3), 432-457 (1997).
- Binder, L. M., Rohling, M. L., Larrabee, G. J. A review of mild head trauma. Part I: Meta-analytic review of neuropsychological studies. Journal of Clinical and Experimental Neuropsychology. 19 (3), 421-431 (1997).
- Leininger, B. E., Gramling, S. E., Farrell, A. D., Kreutzer, J. S., Peck, E. A. Neuropsychological deficits in symptomatic minor head injury patients after concussion and mild concussion. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 53 (4), 293-296 (1990).
- Levin, H. S., et al. Neurobehavioral outcome following minor head injury: a three-center study. Journal of Neurosurgery. 66 (2), 234-243 (1987).
- McMillan, T. M.
- Millis, S. R., et al. Long-term neuropsychological outcome after traumatic brain injury. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 16 (4), 343-355 (2001).
- Stuss, D., et al. Reaction time after head injury: fatigue, divided and focused attention, and consistency of performance. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 52 (6), 742-748 (1989).
- Gurkoff, G. G., et al. Evaluation of metric, topological, and temporal ordering memory tasks after lateral fluid percussion injury. Journal of Neurotrauma. 30 (4), 292-300 (2013).
- Goodrich-Hunsaker, N. J., Howard, B. P., Hunsaker, M. R., Kesner, R. P. Human topological task adapted for rats: Spatial information processes of the parietal cortex. Neurobiology of Learning and Memory. 90 (2), 389-394 (2008).
- Goodrich-Hunsaker, N. J., Hunsaker, M. R., Kesner, R. P. Dissociating the role of the parietal cortex and dorsal hippocampus for spatial information processing. Behavioral Neuroscience. 119 (5), 1307 (2005).
- Goodrich-Hunsaker, N. J., Hunsaker, M. R., Kesner, R. P. The interactions and dissociations of the dorsal hippocampus subregions: how the dentate gyrus, CA3, and CA1 process spatial information. Behavioral Neuroscience. 122 (1), 16 (2008).
- Rosenfeld, C. S., Ferguson, S. A. Barnes maze testing strategies with small and large rodent models. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (84), e51194 (2014).
- O'leary, T. P., Brown, R. E. The effects of apparatus design and test procedure on learning and memory performance of C57BL/6J mice on the Barnes maze. Journal of Neuroscience Methods. 203 (2), 315-324 (2012).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (53), e2920 (2011).
- Smith, C., Rose, G. M. Evidence for a paradoxical sleep window for place learning in the Morris water maze. Physiology & Behavior. 59 (1), 93-97 (1996).
- Roof, R. L., Zhang, Q., Glasier, M. M., Stein, D. G. Gender-specific impairment on Morris water maze task after entorhinal cortex lesion. Behavioural Brain Research. 57 (1), 47-51 (1993).
- Deacon, R. M., Rawlins, J. N. P.
- Penley, S. C., Gaudet, C. M., Threlkeld, S. W. Use of an eight-arm radial water maze to assess working and reference memory following neonatal brain injury. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (82), e50940 (2013).
- Davis, A. R., Shear, D. A., Chen, Z., Lu, X. -C. M., Tortella, F. C. A comparison of two cognitive test paradigms in a penetrating brain injury model. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 84-87 (2010).
- Jones, N. C., et al. Experimental traumatic brain injury induces a pervasive hyperanxious phenotype in rats. Journal of Neurotrauma. 25 (11), 1367-1374 (2008).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552 (2010).
- Ohayon, S., et al. Cell-free DNA as a marker for prediction of brain damage in traumatic brain injury in rats. Journal of Neurotrauma. 29 (2), 261-267 (2012).
- Frank, D., et al. Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61198 (2020).
- Hunter, A., et al. Functional assessments in mice and rats after focal stroke. Neuropharmacology. 39 (5), 806-816 (2000).
- Yarnell, A. M., et al. The revised neurobehavioral severity scale (NSS-R) for rodents. Current Protocols in Neuroscience. 75, 1-16 (2016).
- Fujimoto, S. T., Longhi, L., Saatman, K. E., McIntosh, T. K. Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 28 (4), 365-378 (2004).
- Hausser, N., et al. Detecting behavioral deficits in rats after traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (131), e56044 (2018).
- Ma, C., et al. Sex differences in traumatic brain injury: a multi-dimensional exploration in genes, hormones, cells, individuals, and society. Chinese Neurosurgical Journal. 5 (1), 1-9 (2019).
- Shahrokhi, N., Khaksari, M., Soltani, Z., Mahmoodi, M., Nakhaee, N. Effect of sex steroid hormones on brain edema, intracranial pressure, and neurologic outcomes after traumatic brain injury. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 88 (4), 414-421 (2010).
- Farace, E., Alves, W. M. Do women fare worse: a metaanalysis of gender differences in traumatic brain injury outcome. Journal of Neurosurgery. 93 (4), 539-545 (2000).
- Basso, M. R., Harrington, K., Matson, M., Lowery, N. FORUM sex differences on the WMS-III: findings concerning verbal paired associates and faces. The Clinical Neuropsychologist. 14 (2), 231-235 (2000).
- Janowsky, J. S., Chavez, B., Zamboni, B. D., Orwoll, E. The cognitive neuropsychology of sex hormones in men and women. Developmental Neuropsychology. 14 (2-3), 421-440 (1998).
- Halari, R., et al. Sex differences and individual differences in cognitive performance and their relationship to endogenous gonadal hormones and gonadotropins. Behavioral Neuroscience. 119 (1), 104 (2005).
- Rowe, R. K., Griffiths, D., Lifshitz, J. Pre-Clinical and Clinical Methods in Brain Trauma Research. , Springer. 97-110 (2018).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
- Losurdo, M., Davidsson, J., Sköld, M. K. Diffuse axonal injury in the rat brain: axonal injury and oligodendrocyte activity following rotational injury. Brain Sciences. 10 (4), 229 (2020).
- Kuts, R., et al. A novel method for assessing cerebral edema, infarcted zone and blood-brain barrier breakdown in a single post-stroke rodent brain. Frontiers in Neuroscience. 13, 1105 (2019).
