Summary
Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind häufig mit Gedächtnisstörungen verbunden. Hier stellen wir ein Protokoll zur Bewertung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses nach TBI über eine metrische Aufgabe vor. Ein Metriktest ist ein nützliches Werkzeug, um räumliche Arbeitsgedächtnisstörungen nach TBI zu untersuchen.
Abstract
Beeinträchtigungen des sensorischen, Kurzzeit- und Langzeitgedächtnisses sind häufige Nebenwirkungen nach traumatischen Hirnverletzungen (TBI). Aufgrund der ethischen Einschränkungen von Humanstudien bieten Tiermodelle geeignete Alternativen, um Behandlungsmethoden zu testen und die Mechanismen und damit verbundenen Komplikationen der Erkrankung zu untersuchen. Experimentelle Nagetiermodelle waren in der Vergangenheit aufgrund ihrer Zugänglichkeit, niedrigen Kosten, Reproduzierbarkeit und validierten Ansätze am weitesten verbreitet. Ein metrischer Test, der die Fähigkeit testet, sich an die Platzierung von zwei Objekten in verschiedenen Abständen und Winkeln voneinander zu erinnern, ist eine Technik, um Beeinträchtigungen im räumlichen Arbeitsgedächtnis (SWM) nach TBI zu untersuchen. Zu den wesentlichen Vorteilen metrischer Aufgaben gehören die Möglichkeit der dynamischen Beobachtung, niedrige Kosten, Reproduzierbarkeit, relative Einfache Implementierung und eine umgebung mit geringer Belastung. Hier stellen wir ein metrisches Testprotokoll zur Messung der Beeinträchtigung von SWM bei erwachsenen Ratten nach TBI vor. Dieser Test bietet eine praktikable Möglichkeit, die Physiologie und Pathophysiologie der Gehirnfunktion effektiver zu bewerten.
Introduction
Die Prävalenz neurologischer Defizite wie Aufmerksamkeit, exekutive Funktion und bestimmte Gedächtnisdefizite nach mittelschwerer traumatischer Hirnverletzung (TBI) beträgt mehr als 50 Prozent1,2,3,4,5,6,7,8. TBI kann zu schweren Beeinträchtigungen des räumlichen Kurzzeit-, Langzeit- und Arbeitsgedächtnisses führen9. Diese Gedächtnisstörungen wurden in Nagetiermodellen von TBI beobachtet. Nagetiermodelle haben die Entwicklung von Techniken zum Testen des Gedächtnisses ermöglicht, was tiefere Untersuchungen der Wirkung von TBI auf die Gedächtnisverarbeitung in neuronalen Gedächtnissystemen ermöglicht.
Zwei Tests, die sich auf die topologische bzw. metrische räumliche Informationsverarbeitung beziehen, helfen bei der Messung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses (SWM). Der topologische Test hängt von der Änderung der Größe des Umgebungsraums oder verwandter Verbindungs- oder Umschließungsräume um ein Objekt ab, während der metrische Test Änderungen der Winkel oder des Abstands zwischen Objekten10,11bewertet. Goodrich-Hunsaker et al. adaptierten zunächst den humanen topologischen Test für Ratten10 und wandten die metrische Aufgabe an, um die Rollen des parietalen Kortex (PC) und des dorsalen Hippocampus in der räumlichen Informationsverarbeitung zu dissoziieren11. In ähnlicher Weise bewerteten Gurkoff und Kollegen metrische, topologische und zeitliche Ordnungsgedächtnisaufgaben nach einer Verletzung der lateralen Flüssigkeitsperkussion9. Es besteht ein Zusammenhang zwischen der Schädigung bestimmter Regionen des Gehirns und der Beeinträchtigung des metrischen oder topologischen Gedächtnisses. Es wurde vermutet, dass eine metrische Gedächtnisstörung mit Läsionen im bilateralen gyrus dorsalis dentatus und der Cornu ammonis (CA) -Subregion CA3 des Hippocampus zusammenhängt und dass die topologische Gedächtnisstörung mit bilateralen parietalen Kortexläsionen zusammenhängt10,12.
Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, das räumliche Gedächtnisdefizit in einer Rattenpopulation über eine metrische Aufgabe zu bewerten. Diese Methode ist eine geeignete Alternative, um Mechanismen von SWM nach Hirnverletzungen zu untersuchen, und ihre Vorteile umfassen die relative Leichtigkeit der Implementierung, hohe Empfindlichkeit, niedrige Reproduzierbarkeitskosten, die Möglichkeit der dynamischen Beobachtung und eine umgebungsarm. Im Vergleich zu anderen Verhaltensaufgaben wie dem Barnes-Labyrinth13,14, Morris-Wassernavigationsaufgabe15,16,17oder den räumlichen Labyrinthaufgaben18,19ist dieser Metriktest weniger kompliziert. Aufgrund seiner einfachen Implementierung erfordert der Metriktest eine kürzere und weniger stressige Trainingszeit und findet über nur 2 Tage9: 1 Tag für die Gewöhnung und 1 Tag für die Aufgabe statt. Darüber hinaus ist unser vorgeschlagener Test einfacher durchzuführen als andere Tests mit geringer Belastung, wie z. B. die Aufgabe der neuartigen Objekterkennung (NOR), und erfordert keinen zusätzlichen Tag der Gewöhnung20.
Dieses Papier bietet ein einfaches Modell zur Bewertung von SWM nach Hirnverletzungen. Diese Bewertung von Post-TBI-SWM kann zu einer umfassenderen Untersuchung seiner Pathophysiologie beitragen.
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Protocol
Die Versuche wurden gemäß den Empfehlungen der Erklärungen von Helsinki und Tokio und den Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Die Experimente wurden vom Animal Care Committee der Ben-Gurion-Universität des Negev genehmigt. Eine Protokollzeitleiste ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Chirurgische Eingriffe und Fluid Percussion TBI
- Wählen Sie männliche und weibliche erwachsene Sprague-Dawley-Ratten, die bei einer Raumtemperatur von 22 ± 1 ° C und einer Luftfeuchtigkeit von 40% -60% mit 12-12 h Hell-Dunkel-Zyklen untergebracht sind.
- Stellen Sie Nahrung als Chow und Wasser ad libitum zurVerfügung. Führen Sie Experimente zwischen den Morgenstunden durch, d.h. 6:00 Uhr.m und 12:00 Uhr.m.
- Führen Sie vor Beginn des Experiments eine neurologische Ausgangsbewertung sowohl für die Kontroll- als auch für die TBI-Gruppe durch (siehe Abschnitt 2 unten).
- Betäuben Sie die Ratten mit eingeatmeten 4% Isofluran zur Induktion und 1,5% zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Stellen Sie sicher, dass die Ratte immobilisiert wird, indem Sie den Pedalreflex oder die Bewegung als Reaktion auf ein Reizmittel testen.
HINWEIS: Verwenden Sie ein kontinuierliches Isofluran-Verabreichungssystem für die Anästhesie. Führen Sie alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen durch. - Führen Sie parasagittale Flüssigkeits-Percussion-Verletzungen wie zuvor beschrieben21,22 durch.
- Subkutan injiziert 0,2 ml 0,5% Bupivacain entlang der prospektiven Inzisionsstelle vor dem Schnitt. Ransfer die Ratte in den Aufwachraum und überwacht weiterhin den neurologischen (z. B. Lähmung), Atemwegszustand (z. B. Atemstillstand) und kardiovaskulären Zustand (z. B. Abnahme der Weichteilperfusion, Veränderungen der Pupillenfarbe und Bradykardie) für 24 h. Vor dem Auftreten aus der Anästhesie 0,01 - 0,05 mg/kg intramuskuläres Buprenorphin als postoperative Analgesie verabreichen. Wiederholen Sie die Dosen alle 6 - 12 h für mindestens 48 h.
2. Bewertung des Neurologischen Schweregrad-Scores (NSS)
HINWEIS: Die Beurteilung des neurologischen Defizits wurde mit einem NSS durchgeführt und abgestuft, wie zuvor beschrieben23,24. Die maximale Punktzahl der Veränderung der motorischen Funktion und des Verhaltens beträgt 24 Punkte. Ein Score von 0 zeigt einen intakten neurologischen Status an und 24 zeigt eine schwere neurologische Dysfunktion an, wie zuvor beschrieben24.
- Testen Sie die Unfähigkeit der Ratte, einen Kreis (50 cm Durchmesser) zu verlassen, wenn sie in der Mitte platziert wird. Führen Sie diese Aufgabe dreimal aus, wobei jede Sitzung jeweils 30 Minuten, 60 Minuten und mehr als 60 Minuten dauert.
HINWEIS: Wenn Sie Ratten am Schwanz aufnehmen, halten Sie die Basis des Schwanzes. - Testen Sie die Ratte auf einen Verlust des Aufrußeflexes.
- Legen Sie das Tier auf den Rücken in die Handfläche des Forschers. Geben Sie eine Punktzahl von 1 an, wenn das Tier in der Lage ist, sichselbst 25 zu rechtzugeben (auf allen vier Pfoten stehend).
- Testen Sie die Ratte auf Hemiplegie, die Unfähigkeit der Ratte, einer erzwungenen Positionierung zu widerstehen.
- Heben Sie die Ratte an ihrem Schwanz an, um die reflexive Biegung der Hinterbeine zu testen.
- Legen Sie die Ratte auf den Boden, um ihre Fähigkeit zu testen, gerade zu gehen.
- Führen Sie Tests für drei reflexive Verhaltensweisen durch: den Pinna-Reflex, den Hornhautreflex und den Schreckreflex.
- Führen Sie für den Pinna-Reflex eine leichte taktile Stimulation durch, um den Rückzug des Ohres zu testen, wie zuvor beschrieben25.
- Um den Hornhautreflex zu testen, überwachen Sie die Blinkreaktion, wenn Sie einen weichen Stick leicht auf das Auge auftragen, und messen Sie auf einer Skala von 0 (keine Reaktion) auf dreifaches Augenblinzeln (3), wie zuvor beschrieben25.
- Für den Schreckreflex ziehen Sie einen Stift über die Oberseite des Drahtkäfigs und zeichnen die Reaktion mit einer Skala von 0 (keine Reaktion) bis 3 (1 cm Sprung oder mehr) auf, wie zuvor beschrieben25.
- Bewerten Sie die Ratte basierend auf dem Verlust des Suchverhaltens und der Prostration (nicht ihre Schnurrhaare bewegen, schnüffeln oder rennen, nachdem sie in eine neue Umgebung verlegt wurden)24.
- Testen Sie Gliedmaßenreflexe für die Platzierung auf den linken und rechten Vorderbeinen und dann die linken und rechten Hinterbeine.
- Analysieren Sie die Funktionalität über die Strahlausgleichsaufgabe mit einem 1,5 cm breiten Strahl. Führen Sie den Test für Sitzungen durch, die 20 Sekunden, 40 Sekunden und mehr als 60 Sekunden dauern.
- Führen Sie den Balkenlauftest mit drei verschiedenen Balken durch: 8,5 cm breit, 5 cm breit und 2,5 cm breit.
3. Vorbereitung auf die metrische Aufgabe
- Ausrüstung
- Stellen Sie eine schwarze runde Plattform mit einem Durchmesser von 200 cm und einer Dicke von 1 cm auf einen Tisch. Die Höhe des Tisches sollte 80 cm über dem Boden liegen.
- Stellen Sie zwei verschiedene Objekte in der Mitte der kreisförmigen Plattform 68 cm voneinander entfernt auf.
HINWEIS: In diesem Experiment wurden zwei Glasflaschen für Objekte verwendet, eine runde Flasche mit einer Höhe von 13,5 cm und eine weitere facettierte Flasche mit einer Höhe von 20 cm. Füllen Sie Flaschen mit Wasser, um die Stabilität zu gewährleisten. - Bereiten Sie eine Kamera vor und installieren Sie die erforderliche Computersoftware zum Erfassen, Speichern und Verarbeiten von Daten. Installieren Sie die Kamera in einer Höhe von 290 cm vom Boden.
HINWEIS: Der Abstand zwischen Plattform und Kamera hängt von den Kameraspezifikationen ab. Der Kamerarahmen sollte den gesamten Bereich der Arena abdecken, in der der Test durchgeführt wird. Der Abstand für unser Experiment zwischen der Plattform und der Kamera betrug 210 cm.
- Gewöhnung
- Gewöhnen Sie die Ratte am Tag vor der Aufgabe für 10 Minuten an die neue Umgebung, indem Sie sie ohne Videoaufzeichnung auf die Arena legen.
HINWEIS: Führen Sie die neurologischen Aufgaben und die metrische Aufgabe nicht am selben Tag aus.
HINWEIS: Führen Sie Metriktests in einem Rotlichtbereich durch.
- Gewöhnen Sie die Ratte am Tag vor der Aufgabe für 10 Minuten an die neue Umgebung, indem Sie sie ohne Videoaufzeichnung auf die Arena legen.
4. Ausführen der Metrikaufgabe
HINWEIS: Die Durchführung der metrischen Aufgabe besteht aus zwei Perioden: 1) Gewöhnung (15 min) und 2) Testperiode (5 min).
- Gewöhnungszeit
- Stellen Sie zwei verschiedene Objekte in der Mitte der kreisförmigen Plattform 68 cm voneinander entfernt auf.
- Platzieren Sie die Ratte für einen Zeitraum von 15 Minuten am Ende der Plattform, die gleich weit von den Objekten entfernt ist, und nehmen Sie das Video auf.
- Entfernen Sie die Ratte von der Plattform und legen Sie sie für 5 Minuten in einen einzelnen Käfig.
- Reinigen Sie die Plattform mit 5%-10% Alkohol.
HINWEIS: Bis zu 70% Alkohol kann verwendet werden, um die Plattform in gut belüfteten Bereichen zu reinigen.
- Testzeitraum
- Reduzieren Sie den Abstand zwischen Objekten auf 34 cm.
- Platzieren Sie die Ratte für 5 Minuten auf der Plattform und zeichnen Sie die Explorationsaktivitäten der Ratte auf Video auf.
- Reinigen Sie die Plattform mit 5%-10% Alkohol.
5. Datenanalyse
HINWEIS: Die Datenanalyse wird von einer Video-Tracking-Software durchgeführt, die speziell für Tierverhaltensstudien entwickelt wurde und automatisch die Aktivität und Bewegung von Tieren aufzeichnet (siehe Materialtabelle). Diese Software automatisiert eine Reihe von Verhaltensvariablen, einschließlich Mobilität, Aktivität und explorativem Verhalten.
- Legen Sie vor der Analyse der Videodateien den Softwarehardwareschlüssel ein. Starten Sie die Video-Tracking-Software und öffnen Sie die voreingestellte Vorlage.
- Überprüfen Sie im Abschnitt Setup die Einstellungen wie folgt: Arena, Teststeuerungund Erkennungseinstellungen (siehe Abbildung 2a).
HINWEIS: Für dieses Experiment werden die Parameter für das Explorationsgebiet als 6 cm um das objekt herum definiert. Die Zeit, in der die Ratte in dieses Gebiet eintrat, wurde gemessen. - Nachdem Sie die Einstellungen überprüft haben, duplizieren und benennen Sie sie um.
- Auf dem allgemeinen Bildschirm des Programms greifen Sie Hintergrund, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken.
- Wählen Sie eine Videodatei für das Hintergrundbild aus. Wählen Sie im Menü Durchsuchen den Speicherort der Videodatei aus.
- Erfassen Sie das Bild und markieren Sie die untersuchten Bereiche und Zonen, um das Bild für die Analyse zu kalibrieren. Führen Sie die gleichen Schritte für Teststeuerung und Erkennungseinstellungen aus.
- Wählen Sie im menü allgemein die Option Testliste aus und laden Sie die Liste der Videodateien zur Analyse herunter.
- Fügen Sie die Videos hinzu und geben Sie den Standort mit den erforderlichen Einstellungen an.
- Wählen Sie Die Erfassung und starten Sie die Testversion (siehe Abbildung 2b, c). Exportieren Sie alle Daten als Excel-Dateien (siehe Abbildung 2d).
HINWEIS: Führen Sie alle Berechnungen für die Gewöhnungs- und Testperioden durch. Die Bewertung von Metrikaufgaben wird mit einer erweiterten Vorlage vorbereitet.
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Representative Results
Die Signifikanz von Vergleichen zwischen Gruppen wurde mit dem Mann-Whitney-Test bestimmt. Die statistische Signifikanz der Ergebnisse wurde bei P < 0,05 betrachtet, während die statistisch hohe Relevanz bei P < 0,01 gemessen wurde.
Die Ergebnisse zeigten keine Unterschiede in der NSS zwischen allen Gruppen vor der Intervention und 28 Tage nach TBI. Jede Gruppe bestand aus 12 weiblichen oder 12 männlichen Ratten. Die NSS-Werte, die 48 h nach dem TBI erhalten wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt. Ratten aus der TBI-Gruppe, die am 28. Tag nach einer Verletzung ein signifikantes neurologisches Defizit zeigten, wurden vom Experiment ausgeschlossen. Die Daten werden als Zählungen gemessen und als medianer ± Dargestellt.
Die schein-operierte Kontrollgruppe zeigte nach 48 h nach dem ersten Tag der Studie kein neurologisches Defizit (NSS-0). Neurologisches Defizit nach 48 h nach TBI war bei den männlichen TBI-Ratten signifikant größer als bei den männlichen scheinbetriebenen Ratten (5,5(4-7) vs. 0(0-0), U = 0, p < 0,01, r = -0,89) und bei den weiblichen TBI-Ratten als bei den weiblichen Scheinratten (4,5(3,25-6) vs. 0(0-0), U = 0, p < 0,01, r = -0,91), nach dem Mann-Whitney-Test (Tabelle 1).
Ein Mann-Whitney-Test zeigte, dass die Objekterkundungszeit während der metrischen Aufgabe für die männlichen TBI-Ratten im Vergleich zu männlichen scheinbetriebenen Ratten signifikant kürzer war (130% ± 44,3% vs. 1978% ± 59,2%), U = 0, p < 0,01, r = -0,85 (siehe Abbildung 3a,b). Die Daten werden in Sekunden gemessen, ausgedrückt in % des Ausgangspunkts, und als Mittelwert ± REM dargestellt. Baseline wird als die Zeit der Exploration während der ersten 5 Minuten der Gewöhnungsperiode gemessen. Die verbleibenden drei Zeitpunkte (5-10 min, 10-15 min und 20-25 min) wurden als Prozentsatz der Baseline berechnet.
Ein Mann-Whitney-Test zeigte, dass die Objekterkundungszeit während der metrischen Aufgabe für die weiblichen TBI-Ratten im Vergleich zu weiblichen Scheinratten signifikant kürzer war (89% ± 43,5% vs. 2160% ± 43,6%), U = 0, p < 0,01, r = -0,85 (siehe Abbildung 4a,b). Die Daten werden als Sekunden gemessen, ausgedrückt in % des Ausgangspunkts, und als Mittelwert ± SEM dargestellt.
Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Gruppen gefunden.
Abbildung 1: Protokollschema mit Zeitachsen. Diese Abbildung zeigt die Protokollzeitleiste. Gruppen von Ratten zu verschiedenen Zeiten umfassten eine scheinbetriebene Kontrollgruppe und eine TBI-Gruppe und wurden anhand des NSS-Scores bei -1 h, 48 h und 28 Tagen nach der Verletzung bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Datenanalyse. Bildschirmaufnahmen der Video-Tracking-Software für (A) Teststeuerungseinstellungen (B) Testliste und (C) Erfassung sowie beispielhafte Daten, die nach Excel exportiert werden (D). Weitere Informationen finden Sie in Text und Video. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Metrische Aufgabe für männliche Ratten. Die Objekterkundungszeit während der metrischen Aufgabe war für die männlichen TBI-Ratten im Vergleich zu den männlichen scheinbetriebenen Ratten signifikant kürzer (siehe Abbildung 3a,b, die die Daten auf verschiedenen Y-Achsen-Skalen veranschaulicht). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Metrische Aufgabe für weibliche Ratten. Die Objekterkundungszeit während der metrischen Aufgabe war für weibliche TBI-Ratten signifikant kürzer als für weibliche Scheinratten (siehe Abbildung 4a,b, die die Daten auf verschiedenen Y-Achsen-Skalen veranschaulicht). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| NSS-Werte der Studiengruppen um 48 h nach TBI | Median (Bereich) | |||||
| Tiergruppe | N | Grundlinie | 48h | 1 W | 2 W | 4 W |
| Schein-betriebene weibliche/männliche Ratten | 12 | 0(0-0) | 0(0-0) | 0(0-0) | 0(0-0) | 0(0-0) |
| TBI männliche Ratten | 12 | 0(0-0) | 5.5(4-7)* | 2(1-6)* | 1.5(0-2)* | 0(0-2) |
| TBI weibliche Ratten | 12 | 0(0-0) | 4.5(3.25-6)* | 1.5(0.25-2.8)* | 1(0-2)* | 0(0-0.8) |
Tabelle 1: Bestimmung der neurologischen Leistungsfähigkeit. Das neurologische Defizit nach 48 h nach TBI war bei den männlichen TBI-Ratten signifikant größer als bei den männlichen schein-operierten Ratten und weiblichen TBI-Ratten als bei den weiblichen schein-operierten Ratten.
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Discussion
Durch die gezielte Ausrichtung auf den metrischen räumlichen Informationsprozess bietet dieser Metriktest ein notwendiges Werkzeug zum Verständnis von Gedächtnismangel nach TBI. Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll ist eine Modifikation der zuvor beschriebenen Verhaltensaufgaben11. Eine zuvor beschriebene metrische Aufgabe verwendete zwei verschiedene Paradigmen, die jeweils aus drei Gewöhnungssitzungen und einer Testsitzung bestehen. Das erste Paradigma bestand darin, die vertrauten Objekte nach der Gewöhnung näher zusammenzubringen, und das zweite Paradigma bewegte die Objekte weiter weg11.
Im Vergleich zum Barnes-Labyrinth, das über fünf13 oder vierzehn14 Tage ausgeführt wird, wird die hier vorgestellte metrische Aufgabe innerhalb von 2 Tagen ausgeführt, dem ersten Tag für die Gewöhnung und dem zweiten Tag für die Aufgabe9. Die Aufgabe in diesem Protokoll ist weniger stressig als vergleichbare Verhaltensaufgaben wie das Morris-Wasserlabyrinth, aufgrund des Stresses, der durch das Schwimmen im Labyrinth induziert wird, und der längeren Dauer der Aufgabe15,16,17. Labyrinthtests für das räumliche Gedächtnis erfordern eine signifikante Lernzeit; selbst ein einfaches T-Labyrinth erfordert mindestens 5 Tage Training18. Für komplexere radiale Labyrinthe werden 15-20 Tage tägliche Tests empfohlen19.
Dieses Protokoll enthält mehrere kritische Schritte. Eine entscheidende Komponente ist die Notwendigkeit, die Arena mit einer Alkohollösung sowie den darauf enthaltenen Gegenständen zu behandeln. Es ist auch notwendig, dass die Oberfläche der Arena trocken und sauber ist, da der Geruch von Alkohol und Düften, die von früheren Tieren übrig geblieben sind, das Verhalten des untersuchten Tieres verändern kann. Darüber hinaus ist eine ständig ausreichende Belüftung des Verhaltensraums von entscheidender Bedeutung. Da Lärm einer der Stressfaktoren ist, die das Verhalten von Tieren verändern können, empfehlen wir eine angemessene Schalldämmung. Darüber hinaus ist die Plattformhöhe von 80 cm und der relative Abstand der Plattform von anderen Objekten notwendig, damit die Ratte nicht auf ein anderes Objekt springen oder klettern kann. Darüber hinaus hilft die Aufrechterhaltung konsistenter Einstellungen bei der Verarbeitung aufgezeichneter Videodateien während der Einrichtung, eine falsche Interpretation der Daten zu vermeiden.
Das neurologische Defizit, das sich als Folge von TBI entwickelt, muss bei der Beurteilung des Gedächtnisses berücksichtigt werden. Neurologische Defizite nach einem Kopftrauma tragen zu dieser Erkrankung bei. Die Beurteilung neurologischer Defizite ist im Nagetiermodell der Hirnverletzung sehr wichtig und ist ein hochempfindliches und häufig verwendetes Ergebnis26. Schwere neurologische Defizite können sich jedoch auf Verhaltenstests auswirken, insbesondere auf Tests, die die Gedächtnisbewertung messen27. Die vergleichbare Morris-Wasserlabyrinth-Aufgabe bewertet auch Gedächtnisstörungen28. Ein niedriger Wert beim Morris-Test bei TBI oder schlaganfallten Ratten korreliert stark mit neurologischen Defiziten und spiegelt in der Tat nicht Gedächtnis oder kognitive Beeinträchtigung wider, sondern die neurologische Leistungsfähigkeit und die Fähigkeit, Stress standzuhalten.
Um die Auswirkungen von TBI-bedingten neurologischen Defiziten auf die Gedächtniswerte zu minimieren, verwendeten wir die folgenden Ansätze: 1) Wir verwendeten Modelle von TBI von leichter bis mittlerer Schwere, die nach 1 Monat spontan die neurologische Leistungsfähigkeit wiederherstellen. 2) Ratten, die 28 Tage nach TBI ein neurologisches Defizit zeigten, wurden von Verhaltensexperimenten ausgeschlossen, basierend auf unseren Beobachtungen, dass sich alle Ratten mit leichter Verletzung erholen. In Gruppen von 10-20 Ratten, die von schwerer TBI betroffen sind, hat eine Ratte im Durchschnitt ein signifikantes neurologisches Defizit, das die Mobilität beeinträchtigen kann. 3) Um das Gedächtnis nach einem Trauma zu beurteilen, haben wir keine Tests im Zusammenhang mit Bewegung verwendet, deren Ergebnisse durch neurologischen Mangel beeinflusst werden können (wie im Morris-Wasserlabyrinth). Während der Barnes-Test und verwandte Tests nützlich sind, um das Gedächtnis in Modellen von TBI und Schlaganfall zu bewerten, ist der Metriktest besser geeignet, um SWM zu bewerten. Somit ist der metrische Test der Test der Wahl zur Beurteilung des SWM von Ratten nach TBI.
Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Verwendung eines metrischen Tests allein anstelle eines topologischen Tests. Wir stellen uns zukünftige Studien vor, die auch topologische Tests zur Messung anderer Aspekte der SWM beinhalten. Überraschenderweise wurde nach unseren Ergebnissen kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Ratten gefunden. Eine große Anzahl von Studien zeigt Geschlechtsunterschiede nach TBI29,viele basierend auf dem Unterschied in den Konzentrationen der Fortpflanzungshormone. Östrogen und Progesteron spielen nach TBI eine neuroprotektive Rolle, von denen gezeigt wird, dass sie den intrakraniellen Druck senken und den neurologischen Funktionsscore verbessern30. Laut einer Meta-Analyse-Studie leiden Männer häufiger an TBI, aber Frauen haben schlechtere Prognosen31. Kognitive Beeinträchtigungen, die häufigste Komplikation nach TBI, tendieren zu Geschlechtsunterschieden, wobei Frauen eine größere Verbesserung bei räumlichen Positionierungsaufgaben zeigen und Männer bei verbalen Aufgaben besser abschneiden32,33,34. Unsere Ergebnisse deuten jedoch auf die Möglichkeit von Unsicherheiten über geschlechtsspezifische räumliche Gedächtnisunterschiede hin.
Unter den verschiedenen Arten von TBI-Modellen ist das Modell des fluidperkussionsinduzierten TBI gut dokumentiert und beschrieben, ist leicht reproduzierbar und hat eine geringere Variabilität als andere Modelle35,36. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass der Metriktest einen breiten Nutzen hat und effektiv mit anderen TBI-Modellen verwendet werden kann. Der in diesem Protokoll beschriebene metrische Test ermöglicht auch die weitere Erforschung von Gedächtnisstörungen in vergleichbaren Modellen neurologischer Schäden, wie z. B. Modelle diffuser axonalerHirnverletzungen 24,37 und Schlaganfall38. Dieses Protokoll kann auch nützlich sein, um die Wirksamkeit verschiedener Behandlungsmodalitäten bei der Wiederherstellung von SWM nach TBI zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken Professor Olena Severynovska; Maryna Kuscheriava M.Sc; Maksym Kryvonosov M.Sc; Daryna Yakumenko M.Sc; Evgenia Goncharyk M.Sc; und Olha Shapoval, Doktorandin am Department of Physiology, Faculty of Biology, Ecology, and Medicine, Oles Honchar Dnipro University, Dnipro, Ukraine für ihre unterstützenden und nützlichen Beiträge. Die Daten wurden im Rahmen der Dissertation von Dmitry Frank gewonnen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2% chlorhexidine in 70% alcohol solution | SIGMA - ALDRICH | 500 cc | For general antisepsis of the skin in the operatory field |
| Bupivacaine 0.1 % | |||
| 4 boards of different thicknesses (1.5cm, 2.5cm, 5cm and 8.5cm) | This is to evaluate neurological defect | ||
| 4-0 Nylon suture | 4-00 | ||
| Bottles | Techniplast | ACBT0262SU | 150 ml bottles filled with 100 ml of water and 100 ml 1%(w/v) sucrose solution |
| Bottlses (four) for topological an metric tasks | For objects used two little bottles, first round (height 13.5 cm) and second faceted (height 20 cm) shape and two big faceted bottles, first 9x6 cm (height 21 cm) and second 7x7 cm (height 21 cm). | ||
| Diamond Hole Saw Drill 3mm diameter | Glass Hole Saw Kit | Optional. | |
| Digital Weighing Scale | SIGMA - ALDRICH | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | SIGMA - ALDRICH | Z265969 | |
| Ethanol 99.9 % | Pharmacy | 5%-10% solution used to clean equipment and remove odors | |
| EthoVision XT (Video software) | Noldus, Wageningen, Netherlands | Optional | |
| Fluid-percussion device | custom-made at the university workshop | No specific brand is recommended. | |
| Gauze Sponges | Fisher | 22-362-178 | |
| Gloves (thin laboratory gloves) | Optional. | ||
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | No specific brand is recommended. |
| Horizon-XL | Mennen Medical Ltd | ||
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 | Anesthetic liquid for inhalation |
| Office 365 ProPlus | Microsoft | - | Microsoft Office Excel |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Operating forceps | SIGMA - ALDRICH | ||
| Operating Scissors | SIGMA - ALDRICH | ||
| PC Computer for USV recording and data analyses | Intel | Intel® core i5-6500 CPU @ 3.2GHz, 16 GB RAM, 64-bit operating system | |
| Plexiglass boxes linked by a narrow passage | Two transparent 30 cm × 20 cm × 20 cm plexiglass boxes linked by a narrow 15 cm × 15 cm × 60 cm passage | ||
| Purina Chow | Purina | 5001 | Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 |
| Rat cages (rat home cage or another enclosure) | Techniplast | 2000P | No specific brand is recommended |
| Scalpel blades 11 | SIGMA - ALDRICH | S2771 | |
| SPSS | SPSS Inc., Chicago, IL, USA | 20 package | |
| Stereotaxic Instrument | custom-made at the university workshop | No specific brand is recommended | |
| Timing device | Interval Timer:Timing for recording USV's | Optional. Any timer will do, although it is convenient to use an interval timer if you are tickling multiple rats | |
| Topological and metric tasks device | Self made in Ben Gurion University of Negev | White circular platform 200 cm in diameter and 1 cm thick on table | |
| Video camera | Logitech | C920 HD PRO WEBCAM | Digital video camera for high definition recording of rat behavior under plus maze test |
| Windows 10 | Microsoft |
References
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