हम तीव्र अग्नाशयी ऊतक स्लाइस की तैयारी और कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी में उनके उपयोग को बड़ी संख्या में जीवित कोशिकाओं में एक साथ कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रस्तुत करते हैं, लंबे समय तक, और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ।
तीव्र माउस अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा संरक्षित अंतरकोशिकीय संचार और ऊतक वास्तुकला के साथ सीटू तैयारी में एक अद्वितीय है जो इन विट्रो अध्ययनों में विशिष्ट में वर्णित पृथक आइलेट्स, एसिनी, नलिकाओं या छितरी हुई कोशिकाओं की तुलना में काफी कम तैयारी-प्रेरित परिवर्तनों पर जोर देता है। कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) में लाइव-सेल कैल्शियम इमेजिंग के साथ तीव्र अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा के संयोजन से, कैल्शियम संकेतों का अध्ययन बड़ी संख्या में अंतःस्रावी और एक्सोक्राइन कोशिकाओं में एक साथ, एकल-कोशिका या यहां तक कि उपकोशिकीय संकल्प के साथ किया जा सकता है। संवेदनशीलता परिवर्तनों का पता लगाने की अनुमति देती है और अंतरकोशिकीय तरंगों और कार्यात्मक कनेक्टिविटी के अध्ययन के साथ-साथ अन्य कोशिकाओं के साथ आइलेट और पैराक्राइन संबंधों के भीतर उनके स्थानीयकरण पर कोशिकाओं की शारीरिक प्रतिक्रियाओं की निर्भरता के अध्ययन को सक्षम बनाती है। अंत में, पशु कल्याण के परिप्रेक्ष्य से, एक समय में बड़ी संख्या में कोशिकाओं से सिग्नल रिकॉर्ड करना प्रयोगों में आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है, 3 आर-प्रतिस्थापन, कमी और शोधन-सिद्धांत में योगदान देता है।
स्तनधारी अग्न्याशय एक बड़ी एक्सोक्राइन और अंतःस्रावी ग्रंथि है। एक्सोक्राइन भाग कुल अग्न्याशय की मात्रा का 96-99% बनाता है और इसमें एसिनी और नलिकाएं होती हैं। अंतःस्रावी भाग लैंगरहैंस के बड़ी संख्या में आइलेट्स से बना है जो कुल अग्न्याशय मात्रा 1 के शेष1-4% के लिए लेखांकन करता है। एक्सोक्राइन भाग प्रमुख पाचन एंजाइमों को स्रावित करता है जो भोजन में ऊर्जा समृद्ध पॉलिमर को तोड़ते हैं, साथ ही एक बाइकार्बोनेट युक्त तरल पदार्थ, जो एंजाइमों की कार्रवाई के लिए उपयुक्त वातावरण प्रदान करने के लिए अन्य गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्राव के साथ जोड़ता है। अंतःस्रावी भाग हार्मोन को स्रावित करता है जो ऊर्जा युक्त पोषक तत्वों के पोस्टप्रैंडियल वितरण, भंडारण और इंटरप्रैंडियल रिलीज को विनियमित करता है। यद्यपि एक्सोक्राइन ऊतक अपेक्षाकृत अविकसित होता है और अंतःस्रावी जन्म के समय अपेक्षाकृत अच्छी तरह से विकसित होता है, पूर्वजल्दी से 2,3,4 को छुड़ाने पर उत्तरार्द्ध को ओवरग्रो करता है। अग्नाशयी कार्य के प्रारंभिक अध्ययनों ने आधुनिक शरीर विज्ञान के जन्म को चिह्नित किया, और क्षेत्र में प्रमुख पद्धतिगत प्रगति के बाद प्रमुख वैज्ञानिक ब्रेकट्रॉज5. ग्रंथि की जटिल संरचना के कारण अग्न्याशय के साथ काम करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, लेकिन अग्नाशय के कैंसर, अग्नाशयशोथ और मधुमेह जैसी बीमारियों के कारण भी एक बड़ी प्रेरणा है जो सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए प्रमुख खतरे पेश करते हैं, और जिसके लिए उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।
पृथक आइलेट्स6, एसिनी 7,8, और डक्टल टुकड़े दशकों से सेल लाइनों और प्राथमिक बिखरे हुए अंतःस्रावी, एसीनार और डक्टल कोशिकाओं 9,10 की तुलना में उनके फायदे के कारण सोने के मानक तरीकों के रूप में विकसित और उपयोग किए गए थे। पृथक सेल समूहों के स्पष्ट रूप से बेहतर कार्य के बावजूद, इन विधियों में अभी भी काफी यांत्रिक और एंजाइमेटिक तनाव शामिल है, आसपास के ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करना और इस प्रकार पैराक्राइन इंटरैक्शन और यांत्रिक समर्थन की कमी है, और सबसे महत्वपूर्ण बात, सामान्य शरीर विज्ञान 11,12,13 में महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ हैं . तीव्र माउस अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा 2001 में संरक्षित अंतरकोशिकीय संपर्कों, पैराक्राइन इंटरैक्शन, मेसेनकाइम और ऊतक वास्तुकला के साथ मस्तिष्क, पिट्यूटरी और अधिवृक्क स्लाइस के समान एक प्रयोगात्मक मंच विकसित करने की कथित आवश्यकता से विकसित किया गया था, साथ ही साथ उस समय के आइलेट अनुसंधान में स्वर्ण मानक विधि की कुछ सबसे महत्वपूर्ण कमियों के बिना- पृथक आइलेट्स12, 14. इन कमियों में सबसे बाहरी परतों को नुकसान, कोर आइलेट क्षेत्रों की पहुंच की कमी, और सेल पहचान और शरीर विज्ञान12,15 पर संभवतः महत्वपूर्ण प्रभावों के साथ खेती की आवश्यकता है। इसके अलावा, ऊतक टुकड़ा विधि बेहद विक्षिप्त आइलेट आर्किटेक्चर के साथ पशु मॉडल पर अध्ययन करने में सक्षम बनाती है जहां आइलेट्स को अलग करना असंभव है, या जब पारंपरिक अलगाव16,17,18,19,20,21 द्वारा आइलेट उपज बेहद कम है।
इसके अतिरिक्त, स्लाइस मधुमेह और अग्नाशयशोथ के विकास के दौरान रूपात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए अधिक उपयुक्त है, उदाहरण के लिए, क्योंकि यह पूरे ऊतक का बेहतर अवलोकन करने में सक्षम बनाता है और क्षेत्रीय मतभेदों का अध्ययन करने के साथ भी संगत है। महत्वपूर्ण बात यह है कि अंतःस्रावी भाग पर शुरुआती ध्यान देने के बावजूद, ऊतक टुकड़ा विधि स्वाभाविक रूप से एक्सोक्राइन घटकों 9,22,23 के अध्ययन को सक्षम बनाती है। इसकी शुरूआत के बाद पहले दशक के दौरान, इस विधि को बीटा 14,24,25,26,27,28,29 और अल्फा30,31 कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के साथ-साथ अग्न्याशय 2,3 की रूपात्मक और कार्यात्मक परिपक्वता की जांच के लिए नियोजित किया गया था . एक दशक बाद 2013 में, विधि को ग्लूकोज32, उनके कार्यात्मक कनेक्टिविटी पैटर्न 33, और झिल्ली संभावित डाई34 के साथ फ्लोरोसेंट कैल्शियम डाई के संयोजन से झिल्ली क्षमता और इंट्रासेल्युलर कैल्शियम के बीचसंबंधों को चिह्नित करने के लिए सीएलएसएम का उपयोग करके आइलेट कोशिकाओं के लाइव-सेल कैल्शियम इमेजिंग के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया था। बाद में उसी वर्ष, इस विधि का उपयोग एसीनार कोशिकाओं22,35 में कैल्शियम गतिशीलता का आकलन करने के लिए भी किया गया था। बाद के वर्षों में, अग्नाशयी ऊतक स्लाइस का उपयोग कई अलग-अलग अध्ययनों में किया गया है और सुअर और मानव ऊतक 9,36,37,38,39,40,41 के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया है। हालांकि, एक साथ लिया गया, कैल्शियम इमेजिंग-सामान्य रूप से माउस अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में और विशेष रूप से आइलेट्स में-अभी भी ज्यादातर इस समूह द्वारा किया जाता है। इसके मुख्य कारणों में से एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण ऊतक टुकड़ा तैयारी, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता और बल्कि जटिल डेटा विश्लेषण के संयोजन में निहित हो सकता है। वर्तमान पेपर का मुख्य उद्देश्य इस शक्तिशाली विधि को अन्य संभावित उपयोगकर्ताओं के लिए अधिक सुलभ बनाना है।
ऊतक टुकड़ा तैयारी और संरचनात्मक और स्राव अध्ययन के लिए स्लाइस के उपयोग के साथ विस्तार से निपटने वाले कुछ उत्कृष्ट पद्धतिगत लेख पहले से ही हैं, लेकिन कॉन्फोकल कैल्शियम इमेजिंग 9,42,43 के लिए नहीं। इसलिए, यह पेपर स्लाइस की तैयारी के दौरान कुछ अतिरिक्त युक्तियों और चालों पर केंद्रित है, सफल डाई लोडिंग, छवि अधिग्रहण के साथ-साथ बुनियादी कैल्शियम डेटा विश्लेषण के मुख्य चरणों के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर। इसलिए, इस योगदान को उपर्युक्त विधि के विकल्प के बजाय पूरक के रूप में देखा जाना चाहिए। इसी तरह, माउस अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में कैल्शियम इमेजिंग को विशिष्ट प्रश्नों के उत्तर देने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के रूप में देखा जाएगा और इस प्रकार अग्नाशयी शरीर विज्ञान में अन्य कैल्शियम इमेजिंग दृष्टिकोणों के लिए एक पूर्ण विकल्प के बजाय पूरक है जैसे कि पृथक नलिकाएं या एसिनी, पृथक आइलेट्स, ऑर्गेनोइड, आइलेट्स आंख के पूर्वकाल कक्ष में प्रत्यारोपित, और वीवो 11,44,45,46,47,48 में रिकॉर्डिंग। माउस अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में कैल्शियम इमेजिंग का वादा शायद आइलेट मेसेनकाइमल कोशिकाओं जैसे पेरिसाइट्स49 और मैक्रोफेज50 में कैल्शियम गतिशीलता की हालिया सफल रिकॉर्डिंग के साथ-साथ डक्टल कोशिकाओं23 में सबसे अच्छा सचित्र है।
अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा विधि एक अधिक संरक्षित, सीटू तैयारी में अग्न्याशय के अंतःस्रावी और एक्सोक्राइन भागों की आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक तेज़ प्रयोगात्मक विधि है। परिचय में कई फायदे पहले ही बताए जा चुके हैं। यह इंगित करने योग्य है कि सामान्य रूप से (यानी, न केवल कैल्शियम इमेजिंग के लिए), अग्नाशयी शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए टुकड़ा दृष्टिकोण समय बचाता है क्योंकि इसमें अलगाव के बाद वसूली अवधि शामिल नहीं होती है। उत्तरार्द्ध सभी प्रकार के प्रयोगों और विभिन्न प्रजातियों से पृथक द्वीपों के उपयोग के साथ बिल्कुल आवश्यक नहीं है, लेकिन आमतौर पर शुद्धता बढ़ाने, व्यवहार्यता और कार्यक्षमता को बहाल करने और कभी-कभी कई दाताओं से आइलेट्स इकट्ठा करने के लिए नियोजित किया जाता है 59,60,61,62,63,64 . हालांकि, कैल्शियम इमेजिंग के संदर्भ में, बीटा सेल प्रतिक्रियाओं को संस्कृति की अवधि और स्थितियों पर निर्भर पाया गया है, और यह भिन्नता का एक महत्वपूर्ण स्रोत है जिसे पृथक आइलेट्स15,65 का उपयोग करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। ऊतक स्लाइस के लिए एक ही मुद्दे पर विचार किया जाना चाहिए यदि उनकी दीर्घकालिक संस्कृति भविष्य22,36 में व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला विकल्प बन जाती है। ऊतक टुकड़ा विधि में भी उच्च उपज होती है और इस प्रकार संभावित रूप से पशु पीड़ा को कम करता है और सांख्यिकीय शक्ति को बढ़ाता है। इसके अलावा, एक ही जानवर से कई स्लाइस तैयार किए जा सकते हैं और क्योंकि स्लाइस लंबे समय तक जीवित रहते हैं, जिसमें एक ही जानवर या यहां तक कि प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों दोनों में एक ही आइलेट भी शामिल है।
चूंकि मूल वास्तुकला और सेल-टू-सेल संचार संरक्षित हैं, और क्योंकि यह कई संरचनात्मक विश्लेषणों, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल, इमेजिंग विधियों और हार्मोन स्राव परखों के साथ संगत है, यह विधि अग्नाशयी कार्यों का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच निर्बाध बातचीत पर निर्भर करती हैं, उदाहरण के लिए, विभिन्न सेल प्रकारों के बीच स्राव, पैराक्राइन और प्रतिरक्षा बातचीत के प्रति संवेदनशीलता, विद्युत गतिविधि के पैटर्न, कैल्शियम गतिशीलता के गुण, और विभिन्न हार्मोन का स्राव। विशेष रूप से कैल्शियम इमेजिंग के लिए, स्लाइस का उपयोग करने के मुख्य फायदे आइलेट कोर के संपर्क में हैं और उच्च रिज़ॉल्यूशन वाले कई अलग-अलग सेल प्रकारों से संकेत प्राप्त करने की संभावना है। प्रयोग की आवश्यकताओं और जानवरों की उम्र के आधार पर, मोटाई विविध हो सकती है, स्लाइस को ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है, या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड पत्रकारों वाले जानवरों से प्राप्त किया जा सकता है। जैसा कि नीचे अधिक विस्तार से बताया गया है, बाद के दो दृष्टिकोण गैर-बीटा कोशिकाओं 31,66 से प्रतिक्रियाओं की विशिष्ट कार्यात्मक पहचान और लक्षण वर्णन को भी सक्षम करते हैं। इसके अलावा, अंग के अच्छी तरह से परिभाषित भागों से आइलेट्स का अध्ययन रोग के प्रति जवाबदेही या संवेदनशीलता में अंतर के लिए किया जा सकता है। यद्यपि उन्हें इनक्यूबेशन वसूली की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन उन्हें आसानी से विभिन्न औषधीय एजेंटों, फैटी एसिड, उच्च ग्लूकोज और साइटोकिन्स के साथ ऊष्मायन किया जा सकता है।
सबसे महत्वपूर्ण बात, जैसा कि उच्च रिज़ॉल्यूशन एकल-कोशिका या यहां तक कि उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन के साथ संयोजन में प्राप्त करने योग्य है, स्लाइस में कॉन्फोकल कैल्शियम इमेजिंग कैल्शियम तरंगों, कार्यात्मक कनेक्टिविटी और आइलेट54,67 के अलग-अलग हिस्सों में कोशिकाओं की विभिन्न कार्यात्मक भूमिकाओं का विश्लेषण करने के लिए सबसे उपयुक्त तरीकों में से एक है। कई फायदों के बावजूद, ऊतक टुकड़ा दृष्टिकोण की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। सबसे पहले, यह अभी भी आइलेट और एक्सोक्राइन आर्किटेक्चर के लिए कम से कम आंशिक रूप से विघटनकारी है, विशेष रूप से कट सतह पर, और अतिरिक्त यांत्रिक और अंतर्जात एंजाइमी क्षति को रोकने के लिए तैयारी के दौरान कम तापमान, समाधानों का लगातार आदान-प्रदान और कोमल और त्वरित हेरफेर जैसी सावधानियों की आवश्यकता होती है। दूसरा, पोषक तत्व और स्रावी वितरण के पैटर्न अभी भी विवो मार्ग से नीच हैं, तैयारी प्रणालीगत अंतर्वेशन से अलग है, और अंतर-अंग प्रतिक्रिया, जैसे कि आइलेट और इसके लक्ष्य ऊतकों के बीच, विवो दृष्टिकोणों के विपरीत असंभव है। तीसरा, अधिकतम टुकड़ा मोटाई ~ 200 μm9 पर ऑक्सीजन, पोषक तत्व वितरण और पीएच विनियमन द्वारा सीमित है। इसके अलावा, स्लाइस और इमेजिंग दोनों की तैयारी के लिए बहुत सारे प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, और लंबे समय तक श्रृंखला और कई कोशिकाओं से कैल्शियम डेटा के गहन विश्लेषण के लिए विशेष ज्ञान की आवश्यकता होती है जो अक्सर शास्त्रीय फिजियोलॉजिस्ट के टूलकिट में शामिल नहीं होता है और भौतिकविदों या डेटा वैज्ञानिकों से मदद की आवश्यकता होती है। लाभ यह है कि होमो- और हेटेरोटाइपिक इंटरैक्शन संरक्षित हैं, ब्याज के क्षेत्रों में अन्य कोशिकाओं से संकेतों की उपस्थिति के कारण नमूनों के विश्लेषण को भी जटिल कर सकते हैं। प्रोटोकॉल के आधार पर, अन्य कोशिकाओं की सक्रियता अप्रत्यक्ष अतिरिक्त उत्तेजना या एक मनाया सेल के निषेध के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
यह केवल डिकॉन्वोल्यूशन दृष्टिकोण द्वारा निर्णायक रूप से हल किया जा सकता है, अधिक जटिल उत्तेजना प्रोटोकॉल द्वारा जिसमें कुछ अप्रत्यक्ष प्रभावों को अवरुद्ध करने वाले पदार्थ शामिल हैं, विशिष्ट नॉक-आउट जानवरों का उपयोग करके, और अधिक न्यूनीकरणवादी पद्धतियों को नियोजित करने वाले अन्य अध्ययनों के परिणामों के साथ परिणामों की सावधानीपूर्वक तुलना करके। इसके अतिरिक्त, यदि स्राव माप आवश्यक हैं, तो यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कुछ स्लाइस में आइलेट्स की कमी हो सकती है, और एक टुकड़े में अंतःस्रावी ऊतक का कुल द्रव्यमान आमतौर पर कम होता है। इमेजिंग के लिए तीव्र अग्नाशयी ऊतक स्लाइस की तैयारी में निम्नलिखित अनुभागों में चर्चा किए गए कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं और तालिका 1 में संक्षेप ति किया गया है, जहां पाठक समस्या निवारण के लिए संक्षिप्त, लेकिन महत्वपूर्ण सुझाव भी पा सकता है। सबसे पहले, एगरोज़ समाधान तैयार करते समय, एगरोज़ पाउडर को पूरी तरह से भंग करना चाहिए, अन्यथा अविघटित कण इंजेक्शन को बाधित कर सकते हैं। सजातीय एगरोज़ समाधान को 37-45 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि एक तरफ बहुत कम तापमान के कारण एगरोज़ के सख्त होने से रोका जा सके और दूसरी ओर बहुत अधिक तापमान के कारण ऊतक क्षति को रोका जा सके। उपयोग के बाद, शेष एगरोज़ को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और फिर से गरम किया जा सकता है, हालांकि बार-बार फिर से गर्म करने से पानी के वाष्पीकरण के कारण घनत्व में वृद्धि हो सकती है, अंततः इंजेक्शन मुश्किल या असंभव हो जाता है।
तैयारी में अगला महत्वपूर्ण कदम प्रमुख ग्रहणी पैपिला को सही ढंग से क्लैंप करना है। ग्रहणी पर एक सफेद धब्बा सामान्य पित्त नली और ग्रहणी के जंक्शन को इंगित करता है। बहुत समीपस्थ रूप से रखे गए क्लैंप के परिणामस्वरूप सामान्य वाहिनी की कुछ पार्श्व अग्नाशयी शाखाओं में रुकावट आएगी, इन भागों के इंजेक्शन को अक्षम कर दिया जाएगा, जबकि बहुत अलग रखा गया क्लैंप के परिणामस्वरूप निचले प्रतिरोध पथ के माध्यम से सीधे ग्रहणी में रिसाव होगा। आम पित्त नली के कैनुलेशन से पहले, इंजेक्शन के दौरान वाहिनी के बेहतर दृश्य और अधिक नियंत्रण के लिए आसपास के वसा ऊतक को सावधानीपूर्वक हटाया जा सकता है। आसपास के ऊतक को हटाने के दौरान अपर्याप्त परिशुद्धता के परिणामस्वरूप वाहिनी का छिद्र हो सकता है। अगारोज इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली सुई व्यास का चयन भी महत्वपूर्ण है। चूहों में, एक 30 जी सुई अधिमानतः उपयोग किया जाता है; छोटे (32 या 33 जी) सुइयों को एग्रोस समाधान की उच्च चिपचिपाहट के कारण अधिक प्रयास की आवश्यकता होती है और रुकावट के लिए अधिक प्रवण होते हैं। हालांकि, यदि कम घनत्व वाले एगरोज़ समाधान के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो वे छोटे माउस उपभेदों और छोटे जानवरों में बहुत सहायक हो सकते हैं। प्रारंभिक प्रसवोत्तर दिनों के दौरान, एगरोज़ को वैकल्पिक रूप से इंट्राडक्टली2 के बजाय सबकैप्सुलर रूप से इंजेक्ट किया जा सकता है। चूहों में अधिक व्यास के साथ सुइयों का उपयोग करने से संभवतः आम पित्त नली को नुकसान पहुंचेगा। यह सही सुई व्यास के साथ भी हो सकता है, और एक संदंश इंजेक्शन के दौरान सुई को जगह में रखने में मदद कर सकता है। बड़ी नलिकाओं के मामले में बड़े व्यास की सुइयां एकमात्र समाधान हो सकती हैं, जैसा कि चूहों में पाया जाता है। यदि सुई बैक-रिसाव को रोकने वाली एक तंग मुहर सुनिश्चित करने के लिए बहुत संकीर्ण है, तो वाहिनी में सफल प्रवेश पर इसके चारों ओर एक संयुक्ताक्षर रखा जा सकता है।
एगरोज़ इंजेक्शन समाधान की चिपचिपाहट के कारण कुछ प्रयास करता है, और एक बार इंजेक्शन प्रक्रिया शुरू हो जाने के बाद, इसे बाधित नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि इंजेक्शन पूरा होने से पहले सुई या डक्टल पेड़ के सबसे बड़े हिस्सों में कम पिघलने-बिंदु एगरोज़ समाधान जम सकता है। इसके परिणामस्वरूप खराब ऊतक प्रवेश और काटने के दौरान बदतर समर्थन होगा। वाहिनी को हमेशा उस बिंदु पर कैनुलेट किया जाना चाहिए जहां बाएं यकृत वाहिनी और सिस्टिक वाहिनी आम पित्त नली बनाने के लिए जुड़ती हैं .. यदि सामान्य पित्त नली छिद्रित हो जाती है, तो बार-बार ग्रहणी के करीब कैनुलेटिंग का प्रयास करें। जब अग्न्याशय को एगरोज़ समाधान के साथ पर्याप्त रूप से स्थिर किया जाता है और पेरिटोनियल गुहा से निकाला जाता है, तो अच्छी तरह से इंजेक्शन वाले ऊतक के छोटे टुकड़े काट दिए जाते हैं। उन्हें एगरोज़ में एम्बेड करने से पहले, सभी वसा और संयोजी ऊतकों को हटाना महत्वपूर्ण है क्योंकि उनके अवशेष टुकड़ा करने की क्रिया को और अधिक चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। वही रक्त वाहिकाओं और वाहिनी अवशेषों पर लागू होता है, सिवाय इसके कि जब वे प्रयोग का ध्यान केंद्रित करते हैं। इस मामले में, उन्हें इस तरह से स्थिति देना सुनिश्चित करें कि वांछित क्रॉस-सेक्शन प्राप्त किया जाएगा। एगरोज़ में ऊतक को एम्बेड करते समय, सुनिश्चित करें कि तापमान उपयुक्त है (37 डिग्री सेल्सियस), और यह कि ऊतक पूरी तरह से एगरोज़ से घिरा हुआ है, क्योंकि वाइब्रेटोम स्लाइसिंग के दौरान बल अग्न्याशय के ऊतकों को अगारोज़ ब्लॉक से चीर सकते हैं।
उन्हें कागज के ऊतक पर संक्षेप में रखकर उन्हें एगरोज में रखने से पहले ऊतक ब्लॉकों को जल्दी से सुखाने से इस चरण के दौरान ऊतक और एगरोज के बीच खराब संपर्क को रोकने में मदद मिल सकती है। एगरोज़ ब्लॉक के जमने के दौरान, पेट्री डिश को क्षैतिज रूप से रखें, और अग्न्याशय ऊतक और पेट्री डिश के नीचे के बीच संपर्क को रोकें। यदि अग्न्याशय को पूरी तरह से इंजेक्ट नहीं किया जाता है, तो काटने की प्रक्रिया चुनौतीपूर्ण होगी। इसलिए, ऊतक स्लाइस प्राप्त करने के लिए काटने की गति को कम करने का प्रयास करें। वाइब्रेटोम स्लाइसिंग के दौरान सेल क्षति को कम करने के लिए, नियमित रूप से टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में ईसीएस (और ईसीएस से बने बर्फ के टुकड़े) को बदलें। उत्तरार्द्ध टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान एसिनार ऊतक से जारी अग्नाशयी एंजाइमों की गतिविधि को कम कर देगा। स्लाइस की मोटाई भी महत्वपूर्ण महत्व की है। कैल्शियम गतिशीलता और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए, 140 μm स्लाइस आमतौर पर काटे जाते हैं; हालांकि, अध्ययन के उद्देश्य के अनुसार, टुकड़ा मोटाई 90 μm से 200 μm तक हो सकती है। ध्यान रखें कि मोटे स्लाइस में, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों का प्रसार सीमित होगा, लेकिन उनमें अधिक ऊतक शामिल होंगे। इसके अतिरिक्त, स्लाइस मोटाई बढ़ने के साथ बिना खतना के आइलेट्स का अनुपात बढ़ने की उम्मीद की जा सकती है। स्लाइस को कई घंटों तक कमरे के तापमान पर नियमित रूप से आदान-प्रदान किए गए ईसीएस में संग्रहीत किया जा सकता है या यहां तक कि कई दिनों तक एक उपयुक्त सेल माध्यम में खेती की जा सकती है; हालाँकि, यह अंततः सामान्य आइलेट सेल फिजियोलॉजी 3,22 को प्रभावित कर सकता है।
डाई समाधान तैयार करते समय, सभी घटकों के सावधानीपूर्वक मिश्रण को सुनिश्चित करें, और परिवेश प्रकाश के संपर्क से बचें। अग्नाशयी टुकड़ा कई सेल परतों से बना है, और कैल्शियम डाई का उत्थान पहले कुछ सबसे सतही सेल परतों तक सीमित है, जैसा कि पहले पृथक आइलेट्स58,68 और पिट्यूटरी स्लाइस 69 के लिए वर्णित है। हालांकि, पृथक द्वीपों के विपरीत जहां आसपास के कैप्सूल और बाहरी सेल परतें गहरी परतों में डाई के प्रवेश में बाधा डालती हैं, ऊतक स्लाइस आइलेट की पूरी क्रॉस-सेक्शनल सतह तक पहुंच की अनुमति देते हैं, जिससे आइलेट की सभी परतों से सैकड़ों कोशिकाओं में कैल्शियम गतिशीलता के एक साथ माप को सक्षम किया जाता है। फ्लोरोसेंट सीए2+ संकेतक कैल्शियम गतिशीलता को मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, और सीएलएसएम के साथ, वे उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ रिकॉर्डिंग को सक्षम करते हैं, कई सौ हर्ट्ज तक पहुंचते हैं। सबसे उपयुक्त फ्लोरोसेंट सीए2 + सूचक का चयन करते समय, सूचक रूप सहित विभिन्न कारकों पर विचार करें, जो सेल लोडिंग विधि, माप मोड (गुणात्मक या मात्रात्मक), और पृथक्करण स्थिरांक (केडी) को प्रभावित करता है जिसे सीए2 + ब्याज की एकाग्रता सीमा में होना चाहिए और पीएच, तापमान, एमजी2 + और अन्य आयनों की उपस्थिति पर निर्भर करता है, साथ ही प्रोटीन बाइंडिंग भी। चूंकि सेलुलर सीए2+ सिग्नल आमतौर पर क्षणिक होते हैं, इसलिए सीए2 + बाध्यकारी दर स्थिर पर भी विचार किया जाना चाहिए। अग्नाशयी कोशिकाओं में [सीए2 +] आईसी गतिशीलता को मापने के लिए, यह समूह मुख्य रूप से इस प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) में वर्णित सेल-पारगम्य सीए 2 + संकेतक डाई का उपयोग करता है क्योंकि यह स्पेक्ट्रम में उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक लंबा तरंग दैर्ध्य संकेतक है जहां सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस आमतौर पर कम समस्याग्रस्त होता है, और उत्तेजना प्रकाश की ऊर्जा कम होती है, जो सेलुलर फोटोडैमेज की क्षमता को कम करती है। क्योंकि यह डाई कम सीए2 + सांद्रता पर फ्लोरोसेंट है, यह बेसलाइन [सीए2 +] आईसी के निर्धारण की सुविधा प्रदान करता है और उत्तेजना से पहले सेलुलर दृश्यता बढ़ाता है। बाध्यकारी सीए2+ के बाद, डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता 14 गुना बढ़ जाती है, जिससे [सीए2 +] आईसी में मामूली बदलाव का पता लगाने में सक्षम होता है।
सफल लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग के लिए, प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में कई महत्वपूर्ण हार्डवेयर मापदंडों पर विचार किया जाना चाहिए। लाइव-सेल इमेजिंग के लिए जिसमें सिग्नल आयाम कम होते हैं और फोटोटॉक्सिसिटी की संभावना अधिक होती है, उच्च एनए वाले उद्देश्यों का उपयोग अधिमानतः नमूने से अधिक प्रकाश एकत्र करने के लिए किया जाता है। यदि कैल्शियम गतिशीलता को उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ दर्ज किया जाना चाहिए, तो रैखिक गैल्वेनोमीटर के बजाय गुंजयमान स्कैनर का उपयोग करें। सही उद्देश्य चुनने के अलावा, अत्यधिक संवेदनशील डिटेक्टरों का उपयोग- जैसे हाइब्रिड डिटेक्टर जिन्हें कम लेजर पावर की आवश्यकता होती है- फोटोटॉक्सिसिटी और फोटोब्लीचिंग से बचते हैं। लंबे समय तक चलने वाले कैल्शियम इमेजिंग के लिए इसका विशेष महत्व है। कैल्शियम इमेजिंग में अन्य महत्वपूर्ण कदम समय श्रृंखला अधिग्रहण के लिए छवि गुणवत्ता की पैरामीटर सेटिंग्स हैं। सबसे महत्वपूर्ण लौकिक और स्थानिक संकल्प हैं। चूंकि कैल्शियम गतिशीलता प्रति से सबसे कम स्वीकार्य अस्थायी रिज़ॉल्यूशन निर्धारित करती है, इसलिए सिग्नल का पता लगाने के लिए नमूना दर अपेक्षित सिग्नल आवृत्ति से कम से कम दो गुना अधिक होनी चाहिए या सिग्नल के आकार का मज़बूती से पता लगाने के लिए 10 गुना अधिक होनी चाहिए। तीव्र अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में, कैल्शियम गतिशीलता को एक साथ सैकड़ों कोशिकाओं में मापा जा सकता है और इसलिए, स्थानिक संकल्प भी महत्वपूर्ण है। इसे पिक्सेल की संख्या बढ़ाकर या लाइव अधिग्रहण के दौरान औसत लाइन बढ़ाकर बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, स्थानिक और लौकिक संकल्प के बीच व्युत्क्रम संबंध के कारण, दोनों सेटिंग्स के बीच एक व्यापार-बंद की आवश्यकता होती है।
यदि कैल्शियम इमेजिंग को अग्न्याशय के भीतर एक विशिष्ट कोशिका आबादी में किया जाना है, तो टुकड़े के भीतर कोशिकाओं को कार्यात्मक रूप से अलग करने में सक्षम एक उत्तेजना आवश्यक है। उच्च ग्लूकोज मज़बूती से और जल्दी से बीटा कोशिकाओं को एक दोलन पैटर्न में सक्रिय करता है जो एक ऊंचे कैल्शियम स्तर पर आरोपित होता है और एक आइलेट 32,58,70 के भीतर सभी कोशिकाओं के बीच अत्यधिक सिंक्रनाइज़ होता है। बीटा कोशिकाएं एक आइलेट के भीतर सबसे अधिक सेल प्रकार हैं और ज्यादातर चूहों में आइलेट कोर में स्थित हैं। एक ही उत्तेजना प्रोटोकॉल कम हो जाता है और कभी-कभी अल्फा कोशिकाओं30,32,58,70,71,72 में फटने को सराहनीय रूप से नहीं बदलता है। अल्फा कोशिकाओं को कार्यात्मक रूप से भेदभाव करने के लिए, कम (3 एमएम) ग्लूकोज, ग्लूटामेट या एड्रेनालाईन का उपयोग उनकी आवृत्ति या बेसल [सीए2 +] आईसी 21,72,73,74,75 को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। वे आइलेट कोशिकाओं के 10-20% का प्रतिनिधित्व करते हैं और आइलेट परिधि1 पर पता लगाया जाएगा। परिधि पर डेल्टा कोशिकाएं भी पाई जाती हैं। वे एक आइलेट में अंतःस्रावी कोशिकाओं की कुल संख्या का केवल ~ 5% बनाते हैं और आमतौर पर 6 एमएम ग्लूकोज में सक्रिय होते हैं और बेसलाइन से अनियमित फटने की गतिविधि में वृद्धि के साथ ग्लूकोज उत्तेजना का जवाब देते हैं या थोड़ा ऊंचा कैल्शियम स्तर 1,32,71,76। घ्रेलिन का उपयोग कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों में डेल्टा कोशिकाओं 21,77,78,79 की विशिष्ट उत्तेजना के लिए किया जा सकता है। हालांकि, पीपी और एप्सिलॉन कोशिकाओं की विशिष्ट कार्यात्मक पहचान के लिए प्रोटोकॉल को परिभाषित किया जाना बाकी है। इसके अलावा, 25 एनएम एसिटाइलकोलाइन मज़बूती से 35,80,81 गतिविधि में एसीनार कोशिकाओं को सक्रिय करता है। इसके अतिरिक्त, कई अन्य स्रावी, जैसे सेरुलिन, कोलेसिस्टोकिनिन और कार्बामिलकोलाइन का उपयोग एसीनार कोशिकाओं 22,40,82,83 में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को पैदा करने के लिए किया जा सकता है।
अंत में, 1 एमएम चेनोडोक्सिकोलिक एसिड मज़बूती से ऊतक स्लाइस में डक्टल कोशिकाओं में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को उजागर करता है; एंजियोटेंसिन द्वितीय, एटीपी, और कुछ अन्य स्रावों का उपयोग 11,23,84,85 भी किया जा सकता है। जब भी विशिष्ट स्रावी और अवरोधकों के लिए विशिष्ट प्रतिक्रियाओं के आधार पर एक कार्यात्मक पहचान पर्याप्त नहीं होती है, तो आनुवंशिक रूप से लेबल किए गएजानवरों 31, ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं73, या इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री को विभिन्न सेलप्रकारों की पहचान के लिए नियोजित किया जा सकता है 9,22,71,86 . पिछले कुछ वर्षों के दौरान, ऊतक टुकड़ा विधि को सफलतापूर्वक मानव ऊतक के लिए अनुकूलित किया गया है, जिससे एक्सोक्राइन 41 और अंतःस्रावी शरीर विज्ञान 9,36,37,39 दोनों में कई नए महत्वपूर्ण शोध रास्ते खुल गए हैं। दिलचस्प बात यह है कि मानव द्वीपों में कैल्शियम गतिशीलता का एक विस्तृत मूल्यांकन कुख्यात रूप से कठिन रहा है औरअधिक विस्तार से जांच की जानी बाकी है। उन्नत कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त, अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा विधि ने चूहों में कैल्शियम गतिशीलता में कई नई अंतर्दृष्टि सक्षम की है और उम्मीद है कि मानव ऊतक के लिए भी ऐसा ही होगा।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन में प्रस्तुत कार्य को स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी (अनुसंधान कोर फंडिंग नं. पी 3-0396 और आई0-0029, साथ ही अनुसंधान परियोजनाएं नं। जे 3-9289, एन 3-0048, और एन 3-0133) और ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष / हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मारुसा रोसर, मासा काटर और रूडी म्लाकर को धन्यवाद देते हैं।
Equipment | |||
Analytical balance KERN ALJ 120-4 | KERN & SOHN GmbH | ALJ 160-4A | |
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup | Leica | 5100001578 | |
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup | Leica | ||
Cork pad 15 cm x 15 cm | |||
Corning 15 mL centrifuge tubes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430790 | |
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Fischer Scientific, Leicestershire, UK | 432124 | |
Double edge razor blade | Personna, USA | ||
Dumont #5 – Fine Forceps | FST, Germany | 11254-20 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL | Eppendorf | 0030 121.023 | |
Erlenmeyer flask 200 mL | IsoLab, Germany | 027.01.100 | |
Fine Scissors – ToughCut | FST, Germany | 14058-11 | |
Flat orbital shaker IKA KS 260 basic | IKA | Ident. No.: 0002980200 | |
Glass lab bottle 1000 mL | IsoLab, Germany | 091.01.901 | |
Hartman Hemostat, curved | FST, Germany | 13003-10 | |
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) | Leica | 15507701 | |
Measuring cylinder 25 mL | IsoLab, Germany | 015.01.025 | |
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 | Luigs & Neumann | 200-100 900 7311, 200-100 900 9050 | |
Microwave owen | Gorenje, Slovenia | MO20MW | |
Osmometer Gonotec 010 | Gonotec, Berlin, Germany | OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20 | |
Paint brush | Faber-Castell, No.2 | Any thin soft round paint brush No.2, preferably black | |
Paper towels | |||
Perifusion pumps | Ismatec | ISM 827 | Reglo Analog MS – 4/8 |
Petri dish 100/20 mm | Sarstedt | 83.3902 | |
Petri dish 35/10 mm | Greiner bio-one | 627102 | |
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | 153066 | NON-STICKY for agarose blocks |
pH meter inoLab pH Level 1 | WTW, Weilheim, Germany | E163694 | |
Pipette 1000 mL | Eppendorf | 3121 000.120 | |
Pipette 50 mL | Eppendorf | 3121 000.066 | |
Push pins 23 mm | Deli, Ningbo, China | E0021 | |
Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Semken Forceps | FST, Germany | 11008-13 | |
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask | IsoLab, Germany | 027.11.048 | |
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 | Nikon, Melville, NY USA | ||
Syringe Injekt Solo 5 mL | Braun, Melsungen, Germany | 4606051V | |
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") | Braun, Melsungen, Germany | 4656300 | |
Temperature controller | Luigs & Neumann | 200-100 500 0150, 200-150-500-145 | Slice mini chamber, Temperature controller TC 07 |
Tubings for perifusion system | Ismatec | SC0310 | Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD) |
Ultrasonic bath Studio GT-7810A | Globaltronics | ||
Vibrotome Leica VT 1000 S | Leica, Nussloch, Germany | 14047235613 | |
Volumetric flask 1000 mL | IsoLab, Germany | 013.01.910 | |
Vortex mixer Neolab 7-2020 | Neolab | 7-2020 | |
Water bath Thermo Haake open-bath circulator | Thermo Fisher Scientific | Z527912 | |
Material/Reagent | |||
Calcium chloride dihydrate – CaCl2.2H2O | Sigma Aldrich, Germany | C5080-500G | |
D-(+)-glucose | Sigma Aldrich, Germany | G8270-1KG | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540-100ML | |
DL-lactic acid | Sigma Aldrich, Germany | L1250-500ML | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D8662-500ML | |
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure | |||
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 | Wekem GmbH, Bergkamen, Germany | WK 110-020 | |
HEPES | Sigma Aldrich, Germany | H3375-250G | |
L-(+)-ascorbic acid | Sigma Aldrich, Germany | A9,290-2 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | L3224 | |
Magnesium chloride hexahydrate – MgCl2.2H2O | Sigma Aldrich, Germany | M2670-500G | |
Myo-inositol | Sigma Aldrich, Germany | I5125-100G | |
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM | Invitrogen (Thermo FisherScientific) | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm) |
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | P3000MP | polaxamer: nonionic triblock copolymer |
Potassium chloride – KCl | Sigma Aldrich, Germany | 31248 | |
SeaPlaque GTG agarose | Lonza, Rockland, USA | 50111 | |
Sodium bicarbonate – NaHCO3 | Honeywell, Germany | 31437-500G | |
Sodium chloride – NaCl | Honeywell, Germany | 31434-1KG | |
Sodium hydroxide – NaOH | Sigma Aldrich, Germany | 30620 | |
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 | Sigma Aldrich, Germany | S0751-500G | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich, Germany | 15990-100G | |
Software | |||
FIJI | FIJI is an open source project | ||
LASAF | Leica microsystems, Inc. | ||
Matlab | Mathworks | ||
Python | Python Software Foundation | Python is an open source project |