Summary
我们介绍了急性胰腺组织切片的制备及其在共聚焦激光扫描显微镜中的应用，以研究大量活细胞中钙动力学，时间长，时空分辨率高。
Abstract
急性小鼠胰腺组织切片是一种独特的原位制剂，具有保留的细胞间通讯和组织结构，与典型体外研究中描述的分离胰岛，acini，导管或分散细胞相比，其需要的制剂诱导的变化显着更少。通过在共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）中将急性胰腺组织切片与活细胞钙成像相结合，可以同时在大量内分泌和外分泌细胞中研究钙信号，具有单细胞甚至亚细胞的分辨率。灵敏度允许检测变化，并能够研究细胞间波和功能连接，以及研究细胞生理反应对胰岛内定位的依赖性以及与其他细胞的旁分泌关系。最后，从动物福利的角度来看，一次记录来自大量细胞的信号可以降低实验中所需的动物数量，从而有助于3R替代，减少和细化原理。
Introduction
哺乳动物胰腺是一个大的外分泌和内分泌腺。外分泌部分占胰腺总体积的96-99%，由acini和导管组成。内分泌部分由大量的朗格汉斯胰岛组成，占胰腺总体积的1-4%1。外分泌部分分泌主要的消化酶，分解食物中富含能量的聚合物，以及富含碳酸氢盐的液体，与其他胃肠道分泌物结合，提供适合酶作用的环境。内分泌部分分泌激素，调节餐后分布，储存和餐间富含能量的营养素的释放。虽然外分泌组织相对不发达，内分泌在出生时相对发达，但前者在断奶后迅速过度生长2，3，4。对胰腺功能的早期研究标志着现代生理学的诞生，该领域的主要方法学进步之后是主要的科学突破5。由于腺体结构错综复杂，与胰腺一起工作在技术上具有挑战性，但由于胰腺癌，胰腺炎和糖尿病等疾病对公共卫生构成重大威胁，因此也是一个很大的动机，并且需要新的治疗方法。
分离的胰岛6，acini7，8和导管碎片已被开发并用作金标准方法，因为它们与细胞系和原代分散的内分泌，腺泡和导管细胞相比具有优势9，10。尽管分离的细胞集合体的功能显着改善，但这些方法仍然涉及相当大的机械和酶应激，从周围组织中分离细胞，因此缺乏旁分泌相互作用和机械支持，最重要的是，伴随着正常生理学的显着变化11，12，13.急性小鼠胰腺组织切片是在2001年开发的，因为人们认为需要开发一种类似于大脑，垂体和肾上腺切片的实验平台，具有保留的细胞间接触，旁分泌相互作用，间充质和组织结构，并且没有一些最重要的缺点金标准方法在那个时间的胰岛研究中 - 分离的胰岛12，14.这些缺点包括对最外层的破坏，核心胰岛区域缺乏可及性，以及需要培养可能对细胞身份和生理学有重要影响12，15。此外，组织切片方法能够研究具有严重紊乱的胰岛结构的动物模型，其中不可能分离胰岛，或者当胰岛产量极低时，传统分离16，17，18，19，20，21。
此外，切片更适合研究糖尿病和胰腺炎发展过程中的形态变化，例如，因为它可以更好地概述整个组织，并且还与研究区域差异相容。重要的是，尽管早期关注内分泌部分，但组织切片方法固有地能够研究外分泌成分9，22，23。在引入后的第一个十年中，该方法被用于β14，24，25，26，27，28，29和α30，31细胞的电生理学研究以及检查胰腺的形态和功能成熟2，3.十年后的2013年，该方法成功地适用于胰岛细胞的活细胞钙成像，使用CLSM表征其对葡萄糖32的反应，其功能连接模式33，以及膜电位与细胞内钙之间的关系，通过将荧光钙染料与膜电位染料34相结合。同年晚些时候，该方法还用于评估腺泡细胞22，35中的钙动力学。在接下来的几年中，胰腺组织切片已被用于许多不同的研究，并成功地适应了猪和人体组织的9，36，37，38，39，40，41。然而，综合来看，钙成像 - 在小鼠胰腺组织切片中，特别是在胰岛中 - 仍然主要由该组进行。其中一个主要原因可能在于技术上具有挑战性的组织切片制备，对共聚焦显微镜的需求以及相当复杂的数据分析的组合。本文件的主要目的是使其他潜在用户更容易获得这种强大的方法。
已经有一些优秀的方法学文章详细处理了组织切片的制备和使用切片进行结构和分泌研究，但没有用于共聚焦钙成像9，42，43。因此，本文重点介绍了切片制备过程中的一些额外技巧和窍门，成功上浆染料、图像采集的关键步骤，以及基础钙数据分析的主要步骤。因此，应将这种贡献视为对上述方法的补充，而不是替代。同样，小鼠胰腺组织切片中的钙成像应被视为一种用于回答特定问题的实验方法，因此是对胰腺生理学中其他钙成像方法的补充，而不是绝对的替代方案，例如孤立的导管或acini，孤立的胰岛，类器官，移植到眼睛前房的胰岛， 和体内记录11，44，45，46，47，48。钙成像在小鼠胰腺组织切片中的前景可能最好地说明，最近成功记录了胰岛间充质细胞（如周细胞49 和巨噬细胞50）以及导管细胞23中的钙动力学。
Protocol
注意：所有实验均严格按照研究中护理和使用动物的机构指南进行。该协议由斯洛文尼亚共和国食品安全，兽医部门和植物保护管理局批准（许可证号：34401-35-2018 / 2）。
1. 胰腺组织切片的制备
注意：使用CLSM制备用于钙成像的急性小鼠胰腺组织切片需要许多仪器，不同的解决方案，并按照一系列关键步骤进行，这些步骤在 图1 中示意性地呈现并在下面详细描述。
图 1：工作流程图。 胰腺组织切片制备过程中所有步骤的示意图，从将琼脂糖注射到胆总管开始，然后提取胰腺和切片。制备的切片可用于用活/死试剂盒评估组织的活力或用钙传感器染色。一旦染色，它们就可以进行成像了。然后，从成像过程中获得的记录将用于数据分析。 请点击此处查看此图的大图。
- 溶液的制备
注意：所有溶液都应提前准备好，并且可以在4-8°C的冰箱中储存长达一个月。为了制备和储存组织切片，需要约0.5L含有6mM葡萄糖的细胞外溶液（ECS）和0.3L的4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙烷磺酸（HEPES）缓冲液。对于以1-2 mL / min流速设置的灌注系统进行1天的钙成像，需要约0.5 L的ECS。- 含有6 mM葡萄糖的细胞外溶液
- 制备1升ECS，其中含有125 mM NaCl，26 mM NaHCO3，6 mM葡萄糖，6 mM乳酸，3 mM肌醇，2.5 mM KCl，2 mM丙酮酸钠，2 mM CaCl2，1.25 mM NaH2PO4，1 mM MgCl2和0.5 mM抗坏血酸。彻底混合，直到所有成分完全溶解。将50μLECS放入0.5mL微量离心管中，根据制造商的说明将其置于渗透压计上，并检查渗透压。
注意：渗透压应为 300-320 mOsm。为了刺激β细胞，使用葡萄糖浓度较高的溶液。为了在切片和实验过程中确保生理pH值为7.4，在气压下用碳原（即95%O2 和5%CO2的气体混合物）不断鼓泡ECS。通过将5毫米硅管的一端连接到碳原源（即加压气瓶），并将管子的另一端直接放入装有ECS的瓶子中，可以设置简单的鼓泡系统。 - 或者，制备含有1250 mM NaCl，260 mM NaHCO3，30 mM肌醇，25 mM KCl，20 mM丙酮酸Na，12.5 mM NaH2PO4和5 mM抗坏血酸的10x储备液。当需要含有6 mM葡萄糖的ECS时，将100 mL储备液与2 mL 1 M CaCl2，1 mL 1 M MgCl2，0.455 mL 13.2 M乳酸和1.08 g葡萄糖混合，并填充双蒸馏水至1 L。如果需要，使用不同量的葡萄糖来获得其他葡萄糖浓度。
- 制备1升ECS，其中含有125 mM NaCl，26 mM NaHCO3，6 mM葡萄糖，6 mM乳酸，3 mM肌醇，2.5 mM KCl，2 mM丙酮酸钠，2 mM CaCl2，1.25 mM NaH2PO4，1 mM MgCl2和0.5 mM抗坏血酸。彻底混合，直到所有成分完全溶解。将50μLECS放入0.5mL微量离心管中，根据制造商的说明将其置于渗透压计上，并检查渗透压。
- 含 6 mM 葡萄糖的 HEPES 缓冲液
- 制备0.5升含有150mM NaCl，10mM HEPES，6 mM葡萄糖，5 mM KCl，2 mM CaCl 2和1 mM MgCl2的HEPES缓冲溶液（HBS）;滴定至pH = 7.4，含1 M NaOH。
注意：如果碳原不可用，则可以将此缓冲液用于所有步骤，而不是 ECS。
- 制备0.5升含有150mM NaCl，10mM HEPES，6 mM葡萄糖，5 mM KCl，2 mM CaCl 2和1 mM MgCl2的HEPES缓冲溶液（HBS）;滴定至pH = 7.4，含1 M NaOH。
- 琼脂糖（1.9%w/w）
- 将水浴预热至40°C。
- 将0.475克低熔点琼脂糖和25毫升含有6 mM葡萄糖的ECS加入锥形瓶中，并将烧瓶以最大功率放入微波炉中几秒钟，直到它开始沸腾。将烧瓶从烤箱中取出并旋转几次，直到琼脂糖完全溶解。将装有液体琼脂糖的烧瓶转移到40°C的预热水浴中，将琼脂糖冷却到所需温度并保持液态直到注射。用稳定引线环固定烧瓶。
注意：琼脂糖可以提前准备并保存在冰箱中。使用前，在微波炉中加热琼脂糖直至液化，并将锥形瓶转移到预热至40°C的水浴中。 琼脂糖可以重复使用多达5倍。如果重复使用超过5倍，它将变得密集且难以注射。
- 含有6 mM葡萄糖的细胞外溶液
- 用琼脂糖注射胰腺
注：第1.2和1.3节解释了可用于不同实验目的的组织切片的制备，例如钙成像，电生理学，免疫组织化学，分泌研究和结构/微观解剖学研究。- 在步骤1.1.3.2的水浴中，用锥形瓶中的液体琼脂糖填充5 mL注射器，除去任何气泡，然后安装30G针头。用盖子保护针头，并将填充的注射器保持在水浴中，针头朝下，整个琼脂糖体积低于水面。用稳定铅环固定注射器，使环将注射器压在水浴池的壁上。
注意：注意不要将任何琼脂糖推入针头中，因为它会迅速变硬并堵塞针头。如果室温较低，并且如果注射由经验不足的人进行，请将水浴的温度提高到42°C，以获得一些额外的注射时间。 - 在冰桶中装满冰块，然后将装有 ECS 的瓶子放入其中。在气压和室温下以1.5 mL / min的速度用碳原不断冒泡ECS，以确保氧合和7.4的pH值。
- 通过施用高浓度的CO2 然后宫颈脱位来处死小鼠。尽一切努力减少动物的痛苦。
- 在立体显微镜下工作，通过剖腹手术进入腹部（图2A）。轻轻地将肠道翻转到小鼠的左侧（从小鼠的解剖学角度）以暴露胆总管。使用镊子稍微抬起十二指肠部分，并找到Vater的主要十二指肠-。使用止血剂（图2B，C）将胆总管夹在十二指肠处，以防止琼脂糖从胆管渗漏到十二指肠中。
注意：为了防止琼脂糖渗漏到十二指肠中并在胃肠道中进一步上下，将止血剂置于其近端和远端与的紧端和远端夹住十二指肠的方式。为此，最好使用弯曲的止血剂。 - 用小的尖锐镊子，到达胆总管下方，并打破将胆管连接到胰腺组织的膜。为了更好的视觉控制和更容易注射，从导管中清除尽可能多的脂肪和结缔组织。
- 将胆管垂直于大镊子上（图2D），并将制备的液体琼脂糖注射到胆总管的近端部分（图2D）。一定要用力挤压注射器，因为琼脂糖是粘稠的。继续填充胰腺，直到它变白并略微膨胀或至少20-30秒。
注意：这是切片制备中最关键的步骤。如果胰腺导管树有任何扭结，请轻轻抬高胰腺或将胰腺从注射器中拉出以使其水平。不要根据注射器注射的体积决定何时停止注射，因为注射点的回流和向前渗漏到十二指肠的体积通常远高于注射到胰腺导管树中的体积。重要的是，成功的注射可以在注射器体积几乎不明显变化的情况下进行。 - 取出注射器，并在0-4°C下将20mL起泡的冰冷ECS从瓶子上倒入胰腺上以冷却组织并使琼脂糖变硬。
- 使用镊子和细小的坚韧剪刀轻轻提取胰腺。将提取的胰腺放入含有约40 mL冰冷ECS的100 mm培养皿中，然后轻轻移动以清洗。将胰腺转移到含有约40毫升冰冷ECS的新鲜100毫米培养皿中。
- 从看起来发白的胰腺注射良好的部分（图3A），使用镊子和坚韧的剪刀切割多达6块组织，大小为0.1-0.2 cm3 。清除它们的任何结缔组织和脂肪组织。
- 在40°C下用约5mL液体琼脂糖填充35mm不粘的底部培养皿，将组织块转移到其中，并立即将培养皿放在冰上以冷却并硬化琼脂糖。
注意：胰腺块被困在琼脂糖中的方式决定了它们在切片过程中的切割方式。经验丰富的实验者可以尝试在琼脂糖在冰上变硬之前的几分钟内微调块的位置。 - 在带有组织块的琼脂糖变硬后，将培养皿倒置到平坦光滑的表面上，例如100mm培养皿的盖子，并通过用剃须刀片的一半轻轻切入培养皿的侧壁和琼脂糖之间的边缘来除去琼脂糖。用剃须刀片切割单独的琼脂糖块，每个琼脂糖块包含一个组织块，注意每个组织块被琼脂糖包围。用氰基丙烯酸酯胶将琼脂糖块粘在振动切片机的样品板上（图3B）。
- 在步骤1.1.3.2的水浴中，用锥形瓶中的液体琼脂糖填充5 mL注射器，除去任何气泡，然后安装30G针头。用盖子保护针头，并将填充的注射器保持在水浴中，针头朝下，整个琼脂糖体积低于水面。用稳定铅环固定注射器，使环将注射器压在水浴池的壁上。
图2：将琼脂糖注射到胆总管 中。（A）打开腹腔，露出腹腔内的器官。（B） 面板 A 中矩形所包围区域的放大部分。十二指肠上的白点（由箭头表示）表示Vater的壶腹。朗格汉斯的小岛用箭头表示。（C）用弯曲的止血器夹住Vater的壶腹，并稍微抬起以暴露并轻轻拉伸胆总管（箭头）。（D）使用5mL注射器和30G针头对胆总管进行插管和注射1.9%琼脂糖溶液。 请点击此处查看此图的大图。
- 切片
- 用〜0.15 L冰冷的ECS填充振动切片机的切割室，并用碳原不断起泡。用冰包围切割室，并将2个由ECS制成的具有6 mM葡萄糖的冰块（每个约10 mL）加入切割室。将用于切割的剃须刀片安装到振动筛上，并用琼脂糖块将样品板拧紧到位。
- 设置切片机，以0.05至1 mm / s和70 Hz的速度将琼脂糖块切割成表面积为20-100 mm2的140μm厚的切片。对于切片器设置，请按照制造商的说明进行操作。
- 在每个切割步骤之后，立即暂停切片机，用细油漆刷轻轻收集切片，并将它们转移到100mm培养皿中，其中装有40mL HEPES缓冲液，室温下6mM葡萄糖（图3C）。
注意：切片可以在室温下在HEPES缓冲液中保存至少12小时，缓冲液应每2小时更换一次。
图3：胰腺组织制备和切片（A）琼脂糖注射后提取的小鼠胰腺。左侧的白色组织表示注射良好的部分（十二指肠部分），而右侧较红的部分表示胰腺注射不足的部分（脾部）。（B）将两块胰腺组织嵌入琼脂糖的振动切片。（C）急性胰腺组织切片，带有由箭头表示的朗格汉斯胰岛。（D）在光学显微镜下切开急性胰腺组织切片，用箭头表示朗格汉斯胰岛，星号表示胰管。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的放大版本。
2. 使用活/死活力/细胞毒性试剂盒对哺乳动物细胞进行活/死测定
注意：对于某些实验，通过活/死测定检查切片中细胞的活力（图4）是有用的，如下所示。
- 按照制造商的说明，用活/死活力/细胞毒性试剂盒的试剂解冻小瓶，并在使用前准备钙黄绿素AM的工作溶液。在一天内使用解决方案。
- 在15 mL离心管中，混合5μL4mM钙黄绿素AM（组分A），20μL2mM乙锭同源二聚体-1（EthD-1，组分B）和10mLDulbecco的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS），以制备含有约2μM钙黄绿素AM和4μM EthD-1的工作溶液。彻底涡旋。
- 使用细油漆刷，将组织切片轻轻转移到带有新鲜HEPES缓冲液的3mL培养皿中，以稀释血清酯酶活性。取出HEPES缓冲液，并用步骤2.2中的工作溶液的100-200μL（或更多，如有必要）覆盖切片。
- 将切片在室温下在封闭的培养皿中孵育30-45分钟。根据制造商的建议，使用激发/发射滤光片对组织切片进行成像。
3. 钙染料上样
注意：在染料的制备和上样过程中，以及在处理染色组织切片的过程中，荧光染料应避免光照。锡箔可用于覆盖含有钙染料的管子或培养皿。
- 染料制备
- 溶解一小瓶（50μg）细胞渗透性Ca2 + 指示染料（激发/发射495/523nm;见 材料表），7.5μL二甲基亚砜（DMSO）和2.5μLpolaxamer（DMSO中的20%溶液; 材料表）在15 mL螺旋盖管中含有6 mM葡萄糖的6.667 mL HBS中。
注意：该最终溶液含有6μM的Ca2 + 指示染料，0.11%DMSO和0.037%的polaxamer。 - 用移液管在螺旋盖管中反复吸出并排出溶液20秒;将管子浸入超声波浴室中30秒，涡旋30秒以改善增溶性。将步骤3.1.1制备的最终Ca2+ 指示染料溶液的3.333mL等分试样放入5mL培养皿中。
- 溶解一小瓶（50μg）细胞渗透性Ca2 + 指示染料（激发/发射495/523nm;见 材料表），7.5μL二甲基亚砜（DMSO）和2.5μLpolaxamer（DMSO中的20%溶液; 材料表）在15 mL螺旋盖管中含有6 mM葡萄糖的6.667 mL HBS中。
- 染料装载
- 通过使用薄而柔软的油漆刷轻轻提起每个组织切片并将其置于染料溶液中，将制备的组织切片从带有HBS的60mL培养皿转移到装有染料溶液的5mL培养皿中。每个培养皿孵育多达10片组织切片。
- 将切片加载的培养皿置于室温下的轨道振荡器上，设置为每分钟40圈的轨道运动50分钟。在室温下暴露于环境空气的染料溶液中孵育切片，但通过用锡箔覆盖培养皿来屏蔽光线。
- 切片的存储
- 使用细软的油漆刷轻轻提起，将5 mL培养皿中的染色组织切片转移到装有无染料HBS的60 mL培养皿中。每个培养皿最多可储存20片。
注意：此时使用组织切片进行成像。组织切片将保留Ca2 + 指示染料数小时。通过将培养皿置于被冰包围的绝缘容器中，可以提高切片的存活率和染料的保留率。如果要运输装载染料的切片，这一点尤其重要。此外，每2小时更换一次HBS。
- 使用细软的油漆刷轻轻提起，将5 mL培养皿中的染色组织切片转移到装有无染料HBS的60 mL培养皿中。每个培养皿最多可储存20片。
4. 钙成像
- 共聚焦显微镜的设置
- 根据研究的兴趣选择合适的物镜放大倍率。选择 20x 和 25x（数值孔径 [NA] 0.77-1.00）来可视化整个小岛、同时显示多个 acini 或更大的管道。选择更高的放大倍率来研究细胞内动力学。
- 选择延时成像的采集模式（例如， 延时、xyt 或类似模式）。将针孔设置为100-200μm。
- 设置绿色荧光基团的光路：在488nm处激发，在500-700nm处收集发射。优选选择具有高量子效率的探测器（例如，砷化镓磷化物）而不是光电倍增管探测器。
- 设置记录室和灌注系统
- 将记录室安装在显微镜和灌注系统的温度控制台上（重力进给或基于蠕动泵的设置，体积1 mL）。将入口和出口放置在记录室的远端边缘，以避免灌注液在腔内蜿蜒，并将流入和流出设置为相等的值（1-2 mL / min）。避免液体半月板高度和液滴在腹膜中的漂移。
- 将灌注系统的温度控制设置为37°C，用非刺激性溶液开始灌注，并制备刺激溶液。通过电动阀或手动切换为灌注系统供料的溶液来改变溶液。
- 记录钙动力学
- 将单个组织切片转移到记录室中。用U形铂砝码和绷紧尼龙网固定纸巾片（例如，从尼龙长筒袜）。避免将尼龙线定位在感兴趣的结构上。
- 使用明场选项定位胰岛/导管/导管。运行实时成像以将研究的结构定位到视野中，并设置成像参数。通过调整激光功率、检测器放大和线平均/分档来优化信噪比，从而实现单元的可视化，同时保持最小的激光功率。
- 将记录的焦平面调整到切割表面以下约15μm（图5），以避免记录切割表面可能受损的细胞。
- 获取图像。将采样频率设置为1-2 Hz以最初检测单个振荡，并使用能够以更高的采集速率（>10 Hz）进行快速线平均（8-20）的共振扫描仪来记录细胞内Ca2 + （[Ca2 + ]IC）活性。在连续的点照明之间留出一个间隔（例如，总采样时间的30%），以防止光毒性。在时间序列采集之前记录高分辨率图像（例如，1024 x 1024像素，线均>50）（参见第5节）。
注意：对于大多数电池，1-2 Hz的采样频率低于奈奎斯特的采集频率标准，默认情况下，信号的形状将被欠采样。 - 请参阅在线图表（如果成像软件中提供），以获取有关制备响应、过度照明、光漂白和机械漂移的即时反馈。如果在采集过程中漂白率很高，请停止记录并降低激光功率，同时增加检测器增益以保持信噪比。在机械漂移的情况下，检查管道/电缆与显微镜载物台之间的张力以及液体泄漏或记录室中体积的变化。（可选）尝试手动校正采集过程中的漂移;但是，请注意，这本质上会产生有限的结果。
注意：内分泌细胞在接近阈值的浓度下是高度异质的。需要足够长的刺激来检测单个细胞中的活化/失活延迟范围。这对于准确检测高度刺激方案后的不良反应尤为重要。 - 使用钙成像在功能上区分内分泌细胞和外分泌细胞（图6）。要记录激活和停用期间的瞬态活动，请在不停止记录的情况下应用刺激。
- 实验结束后保存数据（考虑使用自动保存功能）。在关闭激光电源之前，请留出一段时间的冷却时间，以免在关断过程中损坏激光器。
5. 数据分析
- 通过重放延时视频，目视检查录制内容。检查来自视场或光学平面的电池漂移。如果光学平面内发生漂移，请使用ImageJ中的漂移校正插件。
- 使用显微镜软件或第三方软件选择感兴趣的区域（ROI）。使用高分辨率图像、最大投影或帧平均值作为选择 ROI 的参考。重放延时成像以可视化在参考图像中不可见的反应细胞。定位投资回报率，使ROI的选定区域不与相邻单元重叠，以避免ROI之间的信号串扰。
- 将时间序列数据导出为每帧的 ROI 平均值。导出 ROI 坐标。
- 通过采用指数和线性拟合的组合来校正漂白的时间序列数据（图7A），如
(1)
其中 x（t） 表示时间点 t 处的荧光信号; xcorr（t） 在相应时间点的校正信号;和 a、 b 和 c 的拟合参数计算为 corr（t） 和 x（t） 之间的最小平方和。 - 分析响应的激活和停用阶段（图7B）。计算时间序列数据的一阶导数，并分别确定激活和失活对应的导数的天顶和最低点。或者，手动选择相位增加的开始时间。保存并导出激活/停用时间和相应的单元格坐标。
- 分析平台期（图7C）。通过对原始数据进行阈值或对时间序列数据的一阶导数进行阈值来检测单个振荡。将单个振荡的开始和结束定义为与振荡的半振幅相对应的时间。
- 计算每个单元的持续时间和单个振荡的频率。计算尖峰间间隔的反比值（适用于常规活动模式）。或者，将振荡次数除以记录的时间间隔（适用于不规则活动模式）。
- 计算活动时间。将活动时间表示为持续时间的总和，并将此值除以时间间隔。或者，将与振荡相对应的频率和持续时间相乘。
注意：将持续时间的总和除以时间间隔可提供可靠的结果，但由于每个像元获得单个数据点，因此统计鉴别率较低。将振荡的频率和持续时间相乘可提供振荡到振荡的时间分辨率。
(1)Representative Results
将琼脂糖溶液注射到胰管中是胰腺组织切片制备中最关键的步骤。成功的注射可以通过胰腺组织的增白来识别，如图 3A的左侧所示，而胰腺的不完全注射部分则出现在 图3A的右侧。朗格汉斯胰岛可以通过肉眼或在立体显微镜下识别，这有助于切割胰腺的适当部分，以便随后嵌入琼脂糖块中（图3B）。在新鲜切割的小鼠胰腺组织切片中，可以很容易地将朗格汉斯胰岛与周围的外分泌组织和间充质区分开来，在立体显微镜下为白点（图3C）或在光学显微镜下作为褐色结构（图3D）。胰腺组织切片可用于不同类型的实验，切片后至少12小时。除了在立体显微镜，光学显微镜下的大体形态学评估以及钙成像过程中细胞的功能反应外，还可以评估胰腺组织切片的活力（图4）。
图4：组织切片内细胞的活力。 用活/死测定测定测定细胞的活力。活细胞被钙黄绿素AM染色（以绿色显示），而死细胞用同源二聚体-1染色（以红色显示）。黄线表示 Z 轴堆叠的 X-Y 横截面的位置，显示在底部和右侧。Z 轴堆叠的完整深度为 88 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
对于钙成像实验，荧光钙指示剂需要穿透几层细胞。图5A显示细胞渗透性Ca2 +指示剂染料成功加载到胰腺组织切片中，其中可以识别单个胰岛和腺泡细胞。相比之下，由于染料渗透不成功（图5B），缺乏胰岛细胞（图5C）以及表面上存在大量坏死组织（图5D），图5B-D中的切片不是最佳的。这种切片可以被丢弃，检查是否存在其他被切割或染色更好的胰岛（参见表1进行故障排除），或用于记录外分泌细胞的反应。
图5：可用和不可用制剂的实例。（A）在朗格汉斯胰岛以及导管细胞和周围腺泡组织中具有染色良好的细胞成功制备胰腺组织切片的一个例子。（B）染色不良的组织切片的一个例子。（C）具有结构中断的朗格汉斯小岛的例子。（D）一个包含许多死细胞和大量碎片的朗格汉斯小岛的例子。右侧的“发光，发光下”查找表以绿色显示 0 强度，以蓝色显示饱和度。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的放大版本。
使用细胞渗透性Ca2 +指示剂染料进行钙成像的代表性结果如图6所示。在图6A中，呈现了胰腺组织切片的高分辨率图像，其中包含朗格汉斯胰岛，腺泡组织和胰管。为了更好地区分，图6A中呈现的胰腺组织切片的内分泌，外分泌和导管部分在图6B中着色。使用适当的刺激可以在功能上区分不同的胰岛细胞，或胰岛和非胰岛细胞51。β细胞通常会对葡萄糖的方脉冲刺激作出反应，[Ca2 + ]IC瞬时增加，然后在持续的平台上快速钙振荡（图6C，上图）。
由于所有β细胞都耦合成单个大的功能性合胞体，因此这些振荡也通过传播[Ca 2 +]IC波32，34，52，53，54在不同细胞之间很好地同步（图7C）。较慢的[Ca2 +]IC振荡，周期为5-15分钟，可能是快速振荡的基础，甚至是响应55，56的主要类型。相同的简单方案可以揭示其他类型的反应，特别是在胰岛的外围（图6C，下图）。由于这些细胞与β细胞不同步，并且以在低葡萄糖条件下已经存在的更快和更不规则的振荡或活性降低的反应，因此这种反应高度提示非β细胞21，32，57，58。然而，它们明确的功能表征需要更复杂的方案，包括额外的刺激步骤或替代方法，这将在下面讨论。腺泡细胞和导管细胞的典型反应分别在图6D和图6E中给出。有关腺泡和导管细胞22，23，35的更多详细信息，请参阅文献。
图6：不同类型的胰腺细胞中钙动力学的代表性结果。 （A）朗格汉斯胰岛的高分辨率图像与周围组织。（B）胰腺组织的不同部分的描绘以黄色显示，一个朗格汉斯胰岛以红色显示，导管树的一段以蓝色显示。（C）在用12mM葡萄糖刺激期间β细胞和推定的非β细胞中钙动力学的典型痕迹;3mM葡萄糖用于非刺激性条件。可用于更特异性地区分非β细胞的协议在讨论部分进行了描述。（D）由25 nM乙酰胆碱刺激的腺泡细胞钙动力学的典型痕迹。（E）由1mM鹅去氧胆酸刺激的导管细胞钙动力学的典型痕迹。 请点击此处查看此图的大图。
在成功的钙成像后，首先通过指数和线性拟合的组合导出数据并进行漂白校正，如方案部分所述。漂白校正前后的时间序列如图7A所示。此后，可以分析响应的活化和失活阶段以及平台阶段的几个参数。刺激后[Ca2 +]IC增加的延迟可以测量，如图7B中的延迟A和单个细胞间延迟的异质性（延迟A1）表示。可以使用相同的参数（延迟D 和延迟D1）来描述停用阶段。在初始瞬态[Ca2+]IC增加之后，胰岛中大多数胰腺β细胞的平台期的特征是相对规则的高频[Ca2 +]IC振荡。平台阶段可以通过分析经典功能参数来描述。[Ca2+]IC振荡持续时间、频率和有效时间百分比的示意图如图7C所示。在采集速率高于10 Hz的钙成像中，也可以清楚地识别在胰岛上反复扩散的钙波（图7C）。
图7：时间序列数据分析。 （A）光漂白时间序列数据的校正。（B）分析刺激后激活和停止用12mM葡萄糖刺激后失活的延迟。刺激的持续时间由图像中的浅灰色阴影条表示。（C）分析平台阶段的几个参数：I）半高处确定的振荡持续时间，II）由间振荡区间确定的振荡频率。III）有功时间是振荡频率和持续时间的乘积。I-IV）在朗格汉斯胰岛传播的任何给定振荡波中振荡之间的延迟，由单个细胞达到振荡的一半高度的时间延迟（Δt）决定。 请点击此处查看此图的大图。
表 1.请点击此处下载此表。
Discussion
胰腺组织切片法是一种快速实验方法，用于研究胰腺内分泌和外分泌部分的形态和生理学，以更保守的原位制备。引言中已经指出了许多优点。值得指出的是，一般来说（即，不仅用于钙成像），研究胰腺生理学的切片方法可以节省时间，因为它不涉及隔离后的恢复期。后者对于所有类型的实验和使用来自不同物种的分离胰岛并不是绝对必要的，但通常用于提高纯度，恢复活力和功能，有时用于从几个供体收集胰岛59，60，61，62，63，64.然而，在钙成像的背景下，已经发现β细胞反应取决于培养的持续时间和条件，这是使用分离的胰岛15，65时应考虑的重要变异源。如果组织切片的长期培养在未来成为广泛使用的选择，则应考虑同样的问题22，36。组织切片方法也具有高产量，因此可以潜在地减少动物痛苦并提高统计能力。此外，由于切片可以从单个动物中制备，并且由于切片可以存活很长时间，包括实验组和对照组中的相同动物甚至相同的胰岛变得可行。
由于保留了原始结构和细胞间通讯，并且由于它与许多结构分析，电生理学，成像方法和激素分泌测定兼容，因此该方法对于研究依赖于单个细胞之间不受干扰的相互作用的胰腺功能特别有用，例如，对分泌物的敏感性，旁分泌和不同细胞类型之间的免疫相互作用， 电活动的模式，钙动力学的性质以及不同激素的分泌。特别是对于钙成像，使用切片的主要优点是胰岛核心的暴露以及以高分辨率从许多不同细胞类型获取信号的可能性。根据实验的要求和动物的年龄，厚度可以变化，切片可以转染，或者从具有遗传编码报告基因的动物中获得。正如下面更详细地解释的那样，后两种方法还能够特异性地识别和表征来自非β细胞 31，66的反应。此外，可以研究来自器官明确定义的部分的胰岛，以了解对疾病的反应性或易感性的差异。虽然它们不需要恢复潜伏期，但它们可以很容易地与不同的药理学药物，脂肪酸，高糖和细胞因子一起孵育。
最重要的是，由于高分辨率可以与单细胞甚至亚细胞分辨率结合使用，因此切片中的共聚焦钙成像是分析钙波，功能连接以及胰岛不同部分细胞的不同功能角色的最合适方法之一54，67。尽管具有许多优点，但组织切片方法具有重要的局限性。首先，它仍然至少部分地破坏胰岛和外分泌结构，特别是在切割表面，并且在制备过程中需要采取预防措施，例如低温，频繁交换溶液以及温和快速的操作，以防止额外的机械和内源性酶损伤。其次，与体内方法相比，营养和促泌剂递送的模式仍然不如体内途径，制剂与全身神经支配分离，器官间反馈（例如胰岛与其靶组织之间）是不可能的。第三，最大切片厚度受氧化，营养物质输送和pH调节在〜200μm9处的限制。此外，切片的制备和成像都需要大量的培训，并且从长时间序列和许多细胞中对钙数据进行深入分析需要专业知识，这些知识通常不包括在经典生理学家的工具包中，需要物理学家或数据科学家的帮助。由于感兴趣区域中存在来自其他细胞的信号，保持同型和异型相互作用的优势也可能使样品分析复杂化。根据方案的不同，其他细胞的活化可以导致间接的额外刺激或抑制观察到的细胞。
这只能通过反卷积方法，通过更复杂的刺激方案（包括阻断某些间接效应的物质），通过使用特定的敲除动物，以及通过将结果与其他采用更简化方法的研究结果仔细比较来最终解决。此外，如果需要进行分泌物测量，应记住，某些切片可能缺少胰岛，并且单个切片中内分泌组织的总质量通常较低。用于成像的急性胰腺组织切片的制备涉及以下各节中讨论的几个关键步骤，并在 表1中总结，读者还可以在其中找到简短但重要的故障排除提示。首先，在制备琼脂糖溶液时，琼脂糖粉末必须完全溶解，否则未溶解的颗粒可能会阻碍注射。将均匀的琼脂糖溶液保持在37-45°C，一方面防止琼脂糖因温度过低而硬化，另一方面防止由于温度过高而造成的组织损伤。使用后，剩余的琼脂糖可以储存在4°C并重新加热，尽管反复再加热可导致由于水分蒸发而增加密度，最终使注射变得困难或不可能。
制剂的下一个关键步骤是正确夹紧主要的十二指肠。十二指肠上的白点表示胆总管和十二指肠的交界处。夹子放置得太近会导致共同导管的一些外侧胰腺分支阻塞，使这些部位的注射无效，而放置得太远的夹子会导致琼脂糖通过较低的阻力路径直接泄漏到十二指肠。在胆总管插管之前，可以小心地去除周围的脂肪组织，以便更好地可视化胆管并在注射过程中更好地控制。去除周围组织时精度不足可能导致导管穿孔。用于琼脂糖注射的针径的选择也很重要。在小鼠中，优选使用30G针头;较小的（32 或 33 G）针头由于琼脂糖溶液粘度高而需要更多力气，并且更容易阻塞。然而，如果与低密度琼脂糖溶液结合使用，它们对较小的小鼠品系和年轻动物非常有帮助。在最初的产后几天，琼脂糖也可以通过囊下注射而不是管内注射2。在小鼠中使用直径较大的针头很可能导致胆总管受损。使用正确的针径也可以发生这种情况，并且镊子可以帮助在注射过程中将针头保持在适当的位置。在大鼠导管较大的情况下，较大直径的针头可能是唯一的解决方案。如果针太窄，无法确保紧密密封以防止背部泄漏，则在成功进入导管后，可以在其周围放置结扎。
琼脂糖注射由于溶液的粘度而需要一些努力，一旦注射过程开始，就不应中断，因为低熔点琼脂糖溶液可能会在注射完成后在针状物或导管树的最大部分中固化。这将导致组织穿透力差，切割过程中的支撑力较差。胆管应始终在左肝管和囊性导管连接形成胆总管的点进行插管。如果胆总管穿孔，反复尝试在靠近十二指肠的地方插管。当胰腺用琼脂糖溶液充分稳定并从腹膜腔中提取时，切割小块注射良好的组织。在将它们嵌入琼脂糖之前，去除所有脂肪和结缔组织至关重要，因为它们的残留物使切片更具挑战性。这同样适用于血管和导管残留物，除非它们是实验的焦点。在这种情况下，请确保以这样的方式放置它们，以获得所需的横截面。当将组织嵌入琼脂糖中时，请确保温度合适（37°C），并且组织完全被琼脂糖包围，因为振动切片过程中的力可以从琼脂糖块中撕出胰腺组织。
在将纸巾块放入琼脂糖中之前，通过将它们短暂地放在纸巾上来快速干燥纸巾块可以帮助防止在此步骤中组织与琼脂糖之间的不良接触。在琼脂糖块凝固过程中，水平放置培养皿，并防止胰腺组织与培养皿底部之间的接触。如果胰腺没有完全注射，切割过程将具有挑战性。因此，尝试降低切割速度以获得组织切片。为了尽量减少振动切片过程中的细胞损伤，请定期更换切片室中的ECS（以及由ECS制成的冰块）。后者会降低切片过程中从腺泡组织释放的胰腺酶的活性。切片的厚度也至关重要。对于钙动力学和电生理学实验，通常切割140μm切片;然而，根据研究的目的，切片厚度的范围可以从90μm到200μm。请记住，在较厚的切片中，氧气和营养物质的扩散将受到限制，但它们将包括更多的组织。此外，未切割的胰岛的比例可能随着切片厚度的增加而增加。切片可以在室温下在定期交换的ECS中储存数小时，甚至可以在适当的细胞培养基中培养数天;然而，这可能最终影响正常的胰岛细胞生理学3，22。
制备染料溶液时，请确保仔细混合所有组分，并避免暴露在环境光下。胰腺切片由许多细胞层组成，并且钙染料的摄取仅限于前几个最浅的细胞层，如前所述，用于分离的胰岛58，68和垂体切片69。然而，与孤立的胰岛相反，周围的胶囊和外细胞层阻碍染料渗透到更深层中，组织切片允许进入胰岛的整个横截面表面，从而能够同时测量来自胰岛所有层的数百个细胞中的钙动力学。荧光 Ca2+ 指示剂是用于测量钙动力学的最广泛用途，与 CLSM 一起，它们可以实现高时间分辨率的记录，达到数百赫兹。在选择最合适的荧光Ca2+指示剂时，应考虑不同的因素，包括影响细胞上样方法的指示剂形式，测量模式（定性或定量）以及需要在感兴趣的Ca2 +浓度范围内并取决于pH，温度，Mg2 +和其他离子存在的解离常数（Kd）， 以及蛋白质结合。由于细胞Ca2+信号通常是瞬态的，因此还应考虑Ca2+结合速率常数。为了测量胰腺细胞中的[Ca2 +]IC动力学，该组主要使用本方案（材料表）中描述的细胞渗透性Ca2 +指示剂染料，因为它是一种长波长指示剂，其发射波长在光谱中通常细胞自发荧光问题较少，并且激发光的能量较低，这降低了细胞光损伤的可能性。由于这种染料在低Ca2 +浓度下是荧光的，这有助于测定基线[Ca2 +]IC，并在刺激前增加细胞可见性。结合Ca2+后，染料的荧光强度增加14倍，即使[Ca2+]IC的微小变化也能被检测到。
为了成功进行活细胞钙成像，需要考虑几个关键的硬件参数，如方案部分所述。对于信号振幅低且光毒性几率高的活细胞成像，优选使用具有较高NA的物镜从标本中收集更多光。如果必须以高时间分辨率记录钙动力学，请使用共振扫描器而不是线性振镜。除了选择合适的物镜外，使用高灵敏度探测器（例如需要较少激光功率的混合探测器）还可以避免光毒性和光漂白。这对于持久的钙成像特别重要。钙成像中的其他重要步骤是时间序列采集的图像质量的参数设置。最重要的是时间和空间分辨率。由于钙动力学本身决定了可接受的最低时间分辨率，因此采样率需要至少比预期信号频率高两倍才能检测到信号，甚至需要高出10倍才能可靠地检测信号的形状。在急性胰腺组织切片中，钙动力学可以同时在数百个细胞中测量，因此，空间分辨率也很重要。这可以通过增加像素数或在实时采集期间增加行平均来增强。但是，由于空间分辨率和时间分辨率之间存在反比关系，因此需要在两种设置之间进行权衡。
如果必须在胰腺内的特定细胞群中进行钙成像，则需要能够功能性地分化切片内细胞的刺激。高葡萄糖可靠且快速地激活β细胞以振荡模式，该模式叠加在升高的钙水平上，并且在胰岛32，58，70内的所有细胞之间高度同步。β细胞是胰岛内数量最多的细胞类型，主要位于小鼠的胰岛核心中。相同的刺激方案减少，有时不会明显改变α细胞30，32，58，70，71，72的爆发。为了在功能上区分α细胞，可以使用低（3mM）葡萄糖，谷氨酸或肾上腺素来增加其频率或基础[Ca2 +]IC21，72，73，74，75。它们占胰岛细胞的10-20%，并将在胰岛外围1检测到。在外围也发现Δ细胞。它们仅占胰岛内分泌细胞总数的约5%，并且通常在6mM葡萄糖中活跃，并且对葡萄糖刺激的反应与基线相比增加的不规则爆发活性或钙水平略微升高1，32，71，76。Ghrelin可用于钙成像实验中δ细胞21，77，78，79的特异性刺激。然而，PP和ε细胞特异性功能鉴定的方案仍有待定义。此外，25 nM乙酰胆碱可靠地激活腺泡细胞以产生35，80，81的爆裂活性。此外，许多其他促分泌物，如蔚蓝，胆囊收缩素和氨基甲酰胆碱，可用于唤起腺泡细胞中的钙反应22，40，82，83。
最后，1 mM鹅去氧胆酸可靠地唤起组织切片中导管细胞中的钙反应;血管紧张素II，ATP和其他一些促分泌剂也可以使用11，23，84，85。每当基于对特定促分泌剂和抑制剂的特征反应的功能鉴定还不够时，遗传标记的动物31，转染的细胞73或免疫细胞化学可用于鉴定不同的细胞类型9，22，71，86.在过去的几年中，组织切片方法已成功适应人体组织，在外分泌41和内分泌生理学9，36，37，39中开辟了许多新的重要研究途径。有趣的是，对人类胰岛钙动力学的详细评估是出了名的困难，并且仍有待更详细地研究87。结合先进的共聚焦显微镜，胰腺组织切片方法已经对小鼠的钙动力学有了许多新的见解，并有望为人体组织做同样的事情。
Disclosures
作者声明，该研究是在没有任何商业或经济利益的情况下进行的。
Acknowledgments
本研究中介绍的工作得到了斯洛文尼亚研究机构的财政支持（研究核心资金Nos.P3-0396和I0-0029，以及研究项目编号。J3-9289、N3-0048 和 N3-0133）和奥地利科学基金 /Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung（双边赠款 I3562--B27 和 I4319--B30）。我们感谢Maruša Rošer、Maša Čater和Rudi Mlakar提供的出色技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Analytical balance KERN ALJ 120-4 | KERN & SOHN GmbH | ALJ 160-4A | |
| Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup | Leica | 5100001578 | |
| Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup | Leica | ||
| Cork pad 15 cm x 15 cm | |||
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430790 | |
| Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Fischer Scientific, Leicestershire, UK | 432124 | |
| Double edge razor blade | Personna, USA | ||
| Dumont #5 - Fine Forceps | FST, Germany | 11254-20 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL | Eppendorf | 0030 121.023 | |
| Erlenmeyer flask 200 mL | IsoLab, Germany | 027.01.100 | |
| Fine Scissors - ToughCut | FST, Germany | 14058-11 | |
| Flat orbital shaker IKA KS 260 basic | IKA | Ident. No.: 0002980200 | |
| Glass lab bottle 1000 mL | IsoLab, Germany | 091.01.901 | |
| Hartman Hemostat, curved | FST, Germany | 13003-10 | |
| HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) | Leica | 15507701 | |
| Measuring cylinder 25 mL | IsoLab, Germany | 015.01.025 | |
| Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 | Luigs & Neumann | 200-100 900 7311, 200-100 900 9050 | |
| Microwave owen | Gorenje, Slovenia | MO20MW | |
| Osmometer Gonotec 010 | Gonotec, Berlin, Germany | OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20 | |
| Paint brush | Faber-Castell, No.2 | Any thin soft round paint brush No.2, preferably black | |
| Paper towels | |||
| Perifusion pumps | Ismatec | ISM 827 | Reglo Analog MS - 4/8 |
| Petri dish 100/20 mm | Sarstedt | 83.3902 | |
| Petri dish 35/10 mm | Greiner bio-one | 627102 | |
| Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | 153066 | NON-STICKY for agarose blocks |
| pH meter inoLab pH Level 1 | WTW, Weilheim, Germany | E163694 | |
| Pipette 1000 mL | Eppendorf | 3121 000.120 | |
| Pipette 50 mL | Eppendorf | 3121 000.066 | |
| Push pins 23 mm | Deli, Ningbo, China | E0021 | |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Semken Forceps | FST, Germany | 11008-13 | |
| Stabilizing ring for Erlenmeyer flask | IsoLab, Germany | 027.11.048 | |
| Stereomicroscope Nikon SMZ 745 | Nikon, Melville, NY USA | ||
| Syringe Injekt Solo 5 mL | Braun, Melsungen, Germany | 4606051V | |
| Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") | Braun, Melsungen, Germany | 4656300 | |
| Temperature controller | Luigs & Neumann | 200-100 500 0150, 200-150-500-145 | Slice mini chamber, Temperature controller TC 07 |
| Tubings for perifusion system | Ismatec | SC0310 | Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD) |
| Ultrasonic bath Studio GT-7810A | Globaltronics | ||
| Vibrotome Leica VT 1000 S | Leica, Nussloch, Germany | 14047235613 | |
| Volumetric flask 1000 mL | IsoLab, Germany | 013.01.910 | |
| Vortex mixer Neolab 7-2020 | Neolab | 7-2020 | |
| Water bath Thermo Haake open-bath circulator | Thermo Fisher Scientific | Z527912 | |
| Material/Reagent | |||
| Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O | Sigma Aldrich, Germany | C5080-500G | |
| D-(+)-glucose | Sigma Aldrich, Germany | G8270-1KG | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540-100ML | |
| DL-lactic acid | Sigma Aldrich, Germany | L1250-500ML | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D8662-500ML | |
| Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure | |||
| Glue Wekem sekundenkleber WK-110 | Wekem GmbH, Bergkamen, Germany | WK 110-020 | |
| HEPES | Sigma Aldrich, Germany | H3375-250G | |
| L-(+)-ascorbic acid | Sigma Aldrich, Germany | A9,290-2 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | L3224 | |
| Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O | Sigma Aldrich, Germany | M2670-500G | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich, Germany | I5125-100G | |
| Oregon Green 488 BAPTA-1, AM | Invitrogen (Thermo FisherScientific) | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm) |
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | P3000MP | polaxamer: nonionic triblock copolymer |
| Potassium chloride - KCl | Sigma Aldrich, Germany | 31248 | |
| SeaPlaque GTG agarose | Lonza, Rockland, USA | 50111 | |
| Sodium bicarbonate - NaHCO3 | Honeywell, Germany | 31437-500G | |
| Sodium chloride - NaCl | Honeywell, Germany | 31434-1KG | |
| Sodium hydroxide - NaOH | Sigma Aldrich, Germany | 30620 | |
| Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 | Sigma Aldrich, Germany | S0751-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich, Germany | 15990-100G | |
| Software | |||
| FIJI | FIJI is an open source project | ||
| LASAF | Leica microsystems, Inc. | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Python | Python Software Foundation | Python is an open source project |
References
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