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Biology

Microscopía de barrido con láser confocal de la dinámica del calcio en rodajas agudas de tejido pancreático de ratón

Published: April 13, 2021 doi: 10.3791/62293
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 1
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

Summary

Presentamos la preparación de lonchas de tejido pancreático agudo y su uso en microscopía de barrido láser confocal para estudiar la dinámica del calcio simultáneamente en un gran número de células vivas, durante largos períodos de tiempo, y con alta resolución espaciotemporal.

Abstract

La rebanada aguda de tejido pancreático de ratón es una preparación in situ única con comunicación intercelular preservada y arquitectura tisular que implica significativamente menos cambios inducidos por la preparación que los islotes aislados, acinos, conductos o células dispersas descritas en estudios in vitro típicos. Al combinar la rebanada de tejido pancreático agudo con imágenes de calcio de células vivas en microscopía de barrido láser confocal (CLSM), las señales de calcio se pueden estudiar en un gran número de células endocrinas y exocrinas simultáneamente, con una resolución unicelular o incluso subcelular. La sensibilidad permite la detección de cambios y permite el estudio de las ondas intercelulares y la conectividad funcional, así como el estudio de la dependencia de las respuestas fisiológicas de las células en su localización dentro de los islotes y la relación paracrina con otras células. Finalmente, desde la perspectiva del bienestar animal, el registro de señales de un gran número de células a la vez reduce el número de animales requeridos en los experimentos, lo que contribuye al principio de reemplazo, reducción y refinamiento de las 3R.

Introduction

El páncreas de los mamíferos es una gran glándula exocrina y endocrina. La parte exocrina constituye el 96-99% del volumen total del páncreas y consiste en acinos y conductos. La parte endocrina está formada por un gran número de islotes de Langerhans que representan el 1-4% restante del volumen total del páncreas1. La parte exocrina secreta enzimas digestivas importantes que descomponen los polímeros ricos en energía en los alimentos, así como un líquido rico en bicarbonato, que se combina con otras secreciones gastrointestinales para proporcionar un ambiente adecuado para la acción de las enzimas. La parte endocrina secreta hormonas que regulan la distribución postprandial, el almacenamiento y la liberación interprandial de nutrientes ricos en energía. Aunque el tejido exocrino está relativamente subdesarrollado y el endocrino relativamente bien desarrollado al nacer, el primero crece rápidamente en exceso el segundo al destetar 2,3,4. Los primeros estudios de la función pancreática marcaron el nacimiento de la fisiología moderna, y los principales avances metodológicos en el campo han sido seguidos por importantes rupturas científicas5. Trabajar con el páncreas es técnicamente un desafío debido a la intrincada estructura de la glándula, pero también es una gran motivación debido a enfermedades como el cáncer de páncreas, la pancreatitis y la diabetes que presentan grandes amenazas para la salud pública, y para las cuales se necesitan nuevos enfoques terapéuticos.

Los islotes aislados6,acini 7,8 y fragmentos ductales se habían desarrollado y utilizado durante décadas como métodos estándar de oro debido a sus ventajas en comparación con las líneas celulares y las células endocrinas, acinares y ductales dispersas primarias 9,10. A pesar de la función notablemente mejorada de los colectivos celulares aislados, estos métodos todavía implican un estrés mecánico y enzimático considerable, aíslan las células del tejido circundante y, por lo tanto, carecen de interacciones paracrinas y soporte mecánico, y lo más importante, se acompañan de cambios significativos en la fisiología normal 11,12,13 . La rebanada aguda de tejido pancreático de ratón se desarrolló en 2001 a partir de una necesidad percibida de desarrollar una plataforma experimental similar al cerebro, la hipófisis y las rebanadas suprarrenales con contactos intercelulares preservados, interacciones paracrinas, mesénquima y arquitectura tisular, así como sin algunas de las deficiencias más importantes del método estándar de oro en la investigación de islotes de ese momento: los islotes aislados12, 14. Entre estas deficiencias se encuentran el daño a las capas más externas, la falta de accesibilidad de las áreas de los islotes centrales y la necesidad de cultivo con efectos posiblemente importantes sobre la identidad celular y la fisiología12,15. Además, el método de corte de tejido permite estudios en modelos animales con una arquitectura de islotes extremadamente desquiciada donde es imposible aislar islotes, o cuando el rendimiento de los islotes es extremadamente bajo por el aislamiento tradicional 16,17,18,19,20,21.

Además, la rebanada es más adecuada para estudiar los cambios morfológicos durante el desarrollo de la diabetes y la pancreatitis, por ejemplo, ya que permite una mejor visión general de todo el tejido y también es compatible con el estudio de las diferencias regionales. Es importante destacar que, a pesar del enfoque temprano en la parte endocrina, el método de corte de tejido permite inherentemente el estudio de los componentes exocrinos 9,22,23. Durante la primera década después de su introducción, el método se empleó para estudios electrofisiológicos de células beta 14,24,25,26,27,28,29 y alfa 30,31, así como para examinar la maduración morfológica y funcional del páncreas 2,3 . Una década más tarde, en 2013, el método se adaptó con éxito para la obtención de imágenes de calcio de células vivas de células de islotes utilizando CLSM para caracterizar sus respuestas a la glucosa32, sus patrones de conectividad funcional33 y la relación entre el potencial de membrana y el calcio intracelular mediante la combinación de un colorante de calcio fluorescente con un colorante de potencial de membrana34. Más tarde en el mismo año, el método también se utilizó para evaluar la dinámica del calcio en las células acinares22,35. En los años siguientes, las rodajas de tejido pancreático se han utilizado en una serie de estudios diferentes y se han adaptado con éxito al tejido de cerdo y humano 9,36,37,38,39,40,41. Sin embargo, en conjunto, las imágenes de calcio, en cortes de tejido pancreático de ratón en general y en islotes en particular, todavía se realizan principalmente por este grupo. Una de las principales razones de esto puede estar en la combinación de una preparación de corte de tejido técnicamente desafiante, la necesidad de un microscopio confocal y un análisis de datos bastante complejo. El objetivo principal del presente documento es hacer que este poderoso método sea más accesible para otros usuarios potenciales.

Ya existen algunos excelentes artículos metodológicos que tratan en detalle la preparación de rodajas de tejido y el uso de rodajas para estudios estructurales y de secreción, pero no para imágenes de calcio confocal 9,42,43. Por lo tanto, este documento se centra en algunos consejos y trucos adicionales durante la preparación de rebanadas, en los pasos críticos para la carga exitosa del tinte, la adquisición de imágenes, así como en los pasos principales del análisis básico de datos de calcio. Por lo tanto, esta contribución debe considerarse complementaria y no como una alternativa al método antes mencionado. Del mismo modo, las imágenes de calcio en rodajas de tejido pancreático de ratón se considerarán un enfoque experimental que se utilizará para responder a preguntas específicas y, por lo tanto, es complementario en lugar de una alternativa absoluta para otros enfoques de imágenes de calcio en fisiología pancreática, como conductos aislados o acini, islotes aislados, organoides, islotes trasplantados en la cámara anterior del ojo, y grabaciones in vivo 11,44,45,46,47,48. La promesa de las imágenes de calcio en cortes de tejido pancreático de ratón probablemente se ilustra mejor con registros exitosos recientes de la dinámica del calcio en células mesenquimales de islotes como pericitos49 y macrófagos50, así como en células ductales23.

Protocol

NOTA: Todos los experimentos se realizaron en estricta conformidad con las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales en la investigación. El protocolo fue aprobado por la Administración de la República de Eslovenia para la Seguridad Alimentaria, el Sector Veterinario y la Protección Fitosanitaria (número de permiso: 34401-35-2018/2).

1. Preparación de rodajas de tejido pancreático

NOTA: La preparación de cortes agudos de tejido de páncreas de ratón para imágenes de calcio utilizando CLSM requiere una serie de instrumentos, diferentes soluciones y procede en una serie de pasos críticos que se presentan esquemáticamente en la Figura 1 y se describen en detalle a continuación.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo de trabajo. Representación esquemática de todos los pasos en el proceso de preparación de la rebanada de tejido pancreático, comenzando con la inyección de agarosa en el conducto biliar común, seguido de la extracción del páncreas y el corte. Las rodajas preparadas se pueden utilizar para evaluar la viabilidad del tejido con un kit Live/Dead o teñirse con un sensor de calcio. Una vez manchados, están listos para la obtención de imágenes. Las grabaciones obtenidas del proceso de obtención de imágenes se utilizan para el análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Preparación de soluciones
    NOTA: Todas las soluciones deben prepararse con anticipación y se pueden almacenar en el refrigerador a 4-8 ° C durante un máximo de un mes. Para la preparación y almacenamiento de rodajas de tejido, se necesitan aproximadamente 0,5 L de solución extracelular (SEC) con 6 mM de glucosa y 0,3 L de tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatanosulfónico (HEPES). Para 1 día de imágenes de calcio con el sistema de perifusión establecido en 1-2 ml / min de caudal, se necesita aproximadamente 0.5 L de ECS.
    1. Solución extracelular con 6 mM de glucosa
      1. Preparar 1 L de ECS que contenga 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM de glucosa, 6 mM de ácido láctico, 3 mM de mioinositol, 2,5 mM de KCl, 2 mM de na piruvato, 2 mM de CaCl2, 1,25 mM de NaH2PO4, 1 mM de MgCl2 y 0,5 mM de ácido ascórbico. Mezclar bien hasta que todos los ingredientes se disuelvan por completo. Tome 50 μL de ECS en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, colóquelo en el osmómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante y verifique la osmolaridad.
        NOTA: La osmolaridad debe ser de 300-320 mOsm. Para la estimulación de las células beta, use soluciones con concentraciones más altas de glucosa. Para garantizar un valor de pH fisiológico de 7,4 durante el corte y los experimentos, burbujee constantemente el SEC con carbógeno (es decir, una mezcla de gases de 95% O2 y 5% de CO2) a presión barométrica. Se puede configurar un sistema de burbujeo simple conectando un extremo de un tubo de silicio de 5 mm a la fuente de carbógeno (es decir, un cilindro de gas presurizado) y el otro extremo del tubo colocado directamente en la botella que contiene ECS.
      2. Alternativamente, prepare un caldo 10x que contenga 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3, 30 mM myo-inositol, 25 mM KCl, 20 mM Na piruvato, 12.5 mM NaH2PO4 y 5 mM de ácido ascórbico. Cuando se necesite el SEC que contenga 6 mM de glucosa, mezcle 100 ml del caldo con 2 ml de 1 M de CaCl2, 1 ml de 1 M MgCl2, 0,455 ml de ácido láctico de 13,2 M y 1,08 g de glucosa, y llénelo con agua de doble destilación hasta 1 L. Si es necesario, use diferentes cantidades de glucosa para obtener otras concentraciones de glucosa.
    2. Tampón HEPES con 6 mM de glucosa
      1. Preparar 0,5 L de solución tamponada (HBS) con HEPES que contenga 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM de glucosa, 5 mM KCl, 2 mM De CaCl2 y 1 mM de MgCl2; titulación a pH = 7,4 con 1 M de NaOH.
        NOTA: Si el carbógeno no está disponible, este tampón se puede utilizar para todos los pasos en lugar de ECS.
    3. Agarosa (1,9% p/p)
      1. Precalentar un baño de agua a 40 °C.
      2. Añadir 0,475 g de agarosa de bajo punto de fusión y 25 ml de ECS que contengan 6 mM de glucosa a un matraz Erlenmeyer, y colocar el matraz en un horno microondas a máxima potencia durante unos segundos hasta que comience a hervir. Saque el matraz del horno y agítelo varias veces, hasta que la agarosa se disuelva por completo. Transfiera el matraz con la agarosa líquida al baño de agua precalentado a 40 °C para enfriar la agarosa a la temperatura deseada y mantenerla líquida hasta la inyección. Asegure el matraz con un anillo estabilizador de plomo.
        NOTA: La agarosa se puede preparar con anticipación y guardar en el refrigerador. Antes de su uso, caliente la agarosa en el horno de microondas hasta que se licúe y transfiera el matraz Erlenmeyer a un baño de agua precalentado a 40 ° C. La agarosa se puede reutilizar hasta 5x. Si se reutiliza más allá de 5x, se volverá denso y más difícil de inyectar.
  2. Inyección de páncreas con agarosa
    NOTA: Las secciones 1.2 y 1.3 explican la preparación de rodajas de tejido que se pueden utilizar para diferentes fines experimentales, como imágenes de calcio, electrofisiología, inmunohistoquímica, estudios de secreción y estudios estructurales / microanatómicos.
    1. Llene una jeringa de 5 ml con la agarosa líquida del matraz Erlenmeyer en el baño de agua del paso 1.1.3.2, retire las burbujas y monte una aguja de 30 G. Proteja la aguja con una tapa y mantenga la jeringa llena de nuevo en el baño de agua con la aguja hacia abajo y todo el volumen de agarosa debajo de la superficie del agua. Asegure la jeringa con un anillo de plomo estabilizador de tal manera que el anillo presione la jeringa contra la pared del baño de agua.
      NOTA: Tenga cuidado de no empujar ninguna agarosa en la aguja, ya que se endurecerá rápidamente y bloqueará la aguja. Si la temperatura ambiente es baja, y si la inyección es realizada por una persona menos experimentada, aumente la temperatura del baño de agua hasta 42 ° C para ganar algo de tiempo adicional para la inyección.
    2. Llene un cubo de hielo con hielo y coloque la botella que contiene ECS en ella. Burbujear el SEC constantemente a 1,5 ml/min con carbógeno a presión barométrica y temperatura ambiente para garantizar la oxigenación y un pH de 7,4.
    3. Sacrificar un ratón administrando una alta concentración de CO2 seguida de dislocación cervical. Haga todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.
    4. Trabajando bajo un estereomicroscopio, acceda al abdomen a través de la laparotomía (Figura 2A). Voltee suavemente el intestino hacia el lado izquierdo del ratón (desde la perspectiva anatómica del ratón) para exponer el conducto biliar común. Use fórceps para levantar ligeramente la parte duodenal y encuentre la papila-papila duodenal mayor de Vater. Pinte el conducto biliar común en la papila duodenal con un hemostático (Figura 2B, C) para evitar la fuga de agarosa del conducto al duodeno.
      NOTA: Para evitar la fuga de agarosa en el duodeno y más arriba y abajo en el tracto gastrointestinal, coloque el hemostático de tal manera que también sujete el duodeno tanto proximal como distalmente de la papila. Es mejor usar un hemostático curvo para este propósito.
    5. Con pequeñas pinzas afiladas, alcance debajo del conducto biliar común y rompa la membrana que une el conducto al tejido pancreático. Para un mejor control visual y una inyección más fácil, limpie la mayor cantidad de grasa y tejido conectivo del conducto como sea posible.
    6. Coloque el conducto perpendicularmente sobre fórceps grandes (Figura 2D) e inyecte la agarosa líquida preparada en la parte proximal del conducto biliar común (Figura 2D). Asegúrese de apretar la jeringa con fuerza ya que la agarosa es viscosa. Siga llenando el páncreas hasta que se vuelva blanquecino y ligeramente distendido o durante al menos 20-30 s.
      NOTA: Este es el paso más crítico en la preparación de la rebanada. Si hay alguna torcedura en el árbol ductal del páncreas, eleve suavemente o retire el páncreas de la jeringa para nivelarla. No decida cuándo detener la inyección en función del volumen inyectado desde la jeringa, ya que el reflujo en el punto de inyección y la fuga hacia adelante en el duodeno suelen ser mucho más altos que el volumen inyectado en el árbol ductal del páncreas. Es importante destacar que las inyecciones exitosas se pueden realizar con cambios prácticamente imperceptibles en el volumen de la jeringa.
    7. Retire la jeringa y vierta lentamente 20 ml del SEC helado burbujeado a 0-4 °C del frasco sobre el páncreas para enfriar el tejido y endurecer la agarosa.
    8. Extraiga suavemente el páncreas con fórceps y tijeras finas de corte duro. Coloque el páncreas extraído en una placa de Petri de 100 mm que contenga ~ 40 ml de ECS helado y muévalo suavemente para lavarlo. Transfiera el páncreas a una placa de Petri fresca de 100 mm que contenga ~ 40 ml de ECS helado.
    9. Desde la parte bien inyectada del páncreas, que aparece blanquecina (Figura 3A), corte hasta 6 bloques de tejido, de 0.1-0.2 cmde tamaño 3 , usando fórceps y tijeras de corte duro. Límpielos de cualquier tejido conectivo y graso.
    10. Llene una placa de Petri de fondo no pegajosa de 35 mm con aproximadamente 5 ml de agarosa líquida a 40 ° C, transfiera los bloques de tejido en ella e inmediatamente coloque la placa de Petri en hielo para enfriarla y endurecer la agarosa.
      NOTA: La forma en que los bloques de páncreas quedan atrapados en la agarosa determina la forma en que se cortan durante el corte. Los experimentalistas experimentados pueden tratar de afinar la posición de los bloques durante los pocos momentos antes de que la agarosa se endurezca cuando se coloca en el hielo.
    11. Después de que la agarosa con los bloques de tejido se endurezca, gire la placa de Petri boca abajo sobre una superficie plana y lisa, como la tapa de una placa de Petri de 100 mm, y retire la agarosa cortando suavemente con la mitad de una cuchilla de afeitar en el margen entre la pared lateral de la placa de Petri y la agarosa. Con una cuchilla de afeitar, corte cubos de agarosa individuales, cada uno con un bloque de tejido, teniendo cuidado de que cada bloque de tejido esté rodeado de agarosa. Pegue los bloques de agarosa en la placa de muestra del vibratomo con pegamento de cianoacrilato (Figura 3B).

Figure 2
Figura 2: Inyección de agarosa en el conducto biliar común. (A) Abrir la cavidad abdominal y exponer los órganos de la cavidad peritoneal. B) La parte ampliada del área encerrada por el rectángulo en el panel A. La mancha blanca en el duodeno (indicada por la flecha) indica la ampolla de Vater. Los islotes de Langerhans se denotan con puntas de flecha. (C) Sujete la ampolla de Vater por un hemostático curvo, y levántela ligeramente para exponer y estirar suavemente el conducto biliar común (flecha). (D) Canulación del conducto biliar común y la inyección de solución de agarosa al 1,9% utilizando una jeringa de 5 ml y una aguja de 30 G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Rebanar
    1. Llene la cámara de corte del vibratomo con ~ 0.15 L de ECS helado y burbujee constantemente con carbógeno. Rodee la cámara de corte con hielo y agregue 2 cubitos de hielo (~ 10 ml cada uno) hechos de ECS con 6 mM de glucosa en la cámara de corte. Monte la cuchilla de afeitar para cortar en el vibratomo y fije con tornillo la placa de muestra con bloques de agarosa en su lugar.
    2. Ajuste la cortadora para cortar bloques de agarosa a 0,05 a 1 mm/s y 70 Hz en rodajas de 140 μm de espesor con una superficie de 20-100 mm2. Para la configuración de la segmentación de datos, siga las instrucciones del fabricante.
    3. Inmediatamente después de cada paso de corte, haga una pausa en la rebanadora, recoja suavemente las rodajas con un pincel fino y transfiéralas a una placa de Petri de 100 mm llena de 40 ml de tampón HEPES con 6 mM de glucosa a temperatura ambiente (Figura 3C).
      NOTA: Las rodajas se pueden mantener en tampón HEPES a temperatura ambiente durante al menos 12 h, y el tampón debe intercambiarse cada 2 h.

Figure 3
Figura 3: Preparación y corte del tejido del páncreas. (A) El páncreas de ratón extraído después de la inyección de agarosa. El tejido blanco de la izquierda indica una parte bien inyectada (parte duodenal), mientras que la parte más rojiza de la derecha muestra la parte insuficientemente inyectada del páncreas (parte esplénica). (B) Corte de vibratomo de dos bloques de tejido pancreático incrustado en agarosa. (C) Corte agudo de tejido pancreático con islotes de Langerhans indicados por puntas de flecha. Barra de escala = 3000 μm. (D) Rebanada aguda de tejido pancreático bajo el microscopio de luz con el islote de Langerhans indicado por una punta de flecha, el asterisco indica un conducto pancreático. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Ensayo vivo/muerto utilizando el kit de viabilidad/citotoxicidad VIVO/MUERTO para células de mamíferos

NOTA: Para algunos experimentos, es útil verificar la viabilidad de las células en las rebanadas (Figura 4) mediante el ensayo vivo/muerto de la siguiente manera.

  1. Siga las instrucciones del fabricante para descongelar viales con reactivos del kit de viabilidad/citotoxicidad LIVE/DEAD y preparar soluciones de trabajo de calceína AM justo antes de su uso. Utilice las soluciones en un día.
  2. En un tubo centrífugo de 15 ml, mezcle 5 μL de calceína AM de 4 mM (Componente A), 20 μL de homodímero de etidio-1 de 2 mM (EthD-1, Componente B) y 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) de Dulbecco para preparar una solución de trabajo que contenga aproximadamente 2 μM de calceína AM y 4 μM de EtD-1. Vórtice a fondo.
  3. Con un pincel fino, transfiera suavemente las rodajas de tejido a una placa de Petri de 3 ml con tampón HEPES fresco para diluir la actividad de la esterasa sérica. Retire el tampón HEPES y cubra las rodajas con 100-200 μL (o más si es necesario) de la solución de trabajo del paso 2.2.
  4. Incubar las rodajas durante 30-45 min a temperatura ambiente en una placa de Petri cerrada. Imagine las rodajas de tejido utilizando filtros de excitación / emisión según lo recomendado por el fabricante.

3. Carga de colorante de calcio

NOTA: Los tintes fluorescentes deben protegerse de la exposición a la luz durante todo el proceso de preparación y carga del tinte, así como durante el manejo de las rodajas de tejido teñido. La lámina de estaño se puede utilizar para cubrir tubos o placas de Petri que contienen el colorante de calcio.

  1. Preparación del tinte
    1. Disolver el contenido de un vial (50 μg) del colorante indicador de Ca2+ permeable a la célula (excitación/emisión 495/523 nm; ver la Tabla de Materiales), 7,5 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) y 2,5 μL del polaxámero (solución al 20% en DMSO; Tabla de Materiales) en 6.667 mL de HBS que contienen 6 mM de glucosa en un tubo tapón de rosca de 15 mL.
      NOTA: Esta solución final contiene 6 μM del colorante indicador Ca2+ , 0,11% dmSO y 0,037% de polaxámero.
    2. Aspire y expulse la solución en el tubo de tapón de rosca repetidamente con una pipeta durante 20 s; sumergir el tubo en una cámara de baño ultrasónica durante 30 s, y vórtice durante 30 s para mejorar la solubilización. Alícuota 3.333 mL de la solución final de colorante indicador De Ca2+ preparada en el paso 3.1.1 en placas de Petri de 5 mL.
  2. Carga de tinte
    1. Transfiera las rodajas de tejido preparadas de la placa de Petri de 60 ml con HBS a placas de Petri de 5 ml llenas con la solución de tinte levantando suavemente cada rebanada de tejido con un pincel delgado y suave y colocándola en la solución de tinte. Incubar hasta 10 rodajas de tejido por placa de Petri.
    2. Coloque la placa de Petri cargada en rodajas en un agitador orbital a temperatura ambiente ajustado al movimiento orbital a 40 vueltas por minuto durante 50 minutos. Incubar las rodajas en la solución de tinte expuesta al aire ambiente a temperatura ambiente, pero protegida de la luz cubriendo la placa de Petri con papel de aluminio.
  3. Almacenamiento de rodajas
    1. Transfiera las rodajas de tejido teñido de la placa de Petri de 5 ml a una placa de Petri de 60 ml llena de HBS sin colorante levantándolas suavemente con un pincel fino y suave. Almacene hasta 20 rebanadas por placa de Petri.
      NOTA: Use las rodajas de tejido para obtener imágenes en este punto. Las rodajas de tejido retendrán el tinte indicador Ca2+ durante varias horas. La supervivencia de las rodajas y la retención del tinte se pueden mejorar colocando la placa de Petri en un recipiente aislado, rodeado de hielo. Esto es especialmente importante si se van a transportar las rodajas cargadas de tinte. Además, cambie el HBS cada 2 h.

4. Imágenes de calcio

  1. Configuración del microscopio confocal
    1. Elegir una ampliación objetiva adecuada en función del interés del estudio. Seleccione 20x y 25x (apertura numérica [NA] 0.77-1.00) para visualizar un islote completo, varios acini simultáneamente o conductos más grandes. Seleccione aumentos más altos para estudiar la dinámica intracelular.
    2. Elija el modo de adquisición para imágenes de lapso de tiempo (por ejemplo, lapso de tiempo, xyt o modo similar). Ajuste el agujero de alfiler a 100-200 μm.
    3. Establezca la trayectoria de la luz para los fluoróforos verdes: excitación a 488 nm y recolección de emisión a 500-700 nm. Preferiblemente seleccionar detectores con una alta eficiencia cuántica (por ejemplo, fosfuro de arseniuro de galio) sobre detectores fotomultiplicadores.
  2. Configuración de la cámara de grabación y del sistema de perifusión
    1. Monte la cámara de grabación en la etapa de temperatura controlada del microscopio y el sistema de perifusión (ya sea una configuración basada en bomba peristáltica o alimentada por gravedad, volumen 1 ml). Coloque la entrada y la salida en los bordes lejanos de la cámara de grabación para evitar el meandro del perfusato dentro de la cámara, y ajuste la entrada y la salida a valores iguales (1-2 ml / min). Evite la deriva de la altura del menisco líquido y las gotas en el perifusato.
    2. Ajuste el control de temperatura del sistema de perifusión a 37 °C.Inicie la perifusión con la solución no estimulante y prepare las soluciones estimulantes. Cambie las soluciones a través de válvulas motorizadas o cambiando manualmente las soluciones que alimentan el sistema de perifusión.
  3. Registrar la dinámica del calcio
    1. Transfiera una sola rebanada de tejido a la cámara de grabación. Inmovilice la rebanada de tejido con un peso de platino en forma de U con malla de nylon tensa (por ejemplo, de medias de nylon). Evite colocar hilos de nylon sobre la estructura de interés.
    2. Localice un islote/acino/conducto utilizando la opción de campo brillante. Ejecute imágenes en vivo para posicionar las estructuras estudiadas en el campo de visión y configure los parámetros de imagen. Optimice la relación señal-ruido ajustando la potencia del láser, la amplificación del detector y el promedio / agrupación de líneas para permitir la visualización de las células mientras mantiene la potencia del láser mínima.
    3. Ajuste el plano focal de la grabación a ~15 μm por debajo de la superficie de corte (Figura 5) para evitar la grabación de células potencialmente dañadas en la superficie de corte.
    4. Adquirir imágenes. Establezca la frecuencia de muestreo en 1-2 Hz para detectar oscilaciones individuales inicialmente, y use un escáner resonante capaz de promediar línea rápidamente (8-20) a una tasa de adquisición más alta (>10 Hz) para registrar la actividad intracelular de Ca2+ ([Ca2+]IC). Permita un intervalo (por ejemplo, el 30% del tiempo total de muestreo) entre iluminaciones puntuales consecutivas para evitar la fototoxicidad. Grabe una imagen de alta resolución (por ejemplo, 1024 x 1024 píxeles, línea con un promedio de > 50) antes de la adquisición de series temporales (consulte la sección 5).
      NOTA: La frecuencia de muestreo de 1-2 Hz está por debajo del criterio de Nyquist para la frecuencia de adquisición para la mayoría de las células, y la forma de la señal estará submuestreada por defecto.
    5. Consulte un gráfico en línea, si está disponible en el software de imágenes, para obtener retroalimentación instantánea sobre la respuesta de preparación, la sobreiluminación, el fotoblanqueo y la deriva mecánica. En caso de una alta tasa de blanqueo durante la adquisición, detenga la grabación y disminuya la potencia del láser mientras aumenta la ganancia del detector para mantener la relación señal-ruido. En el caso de deriva mecánica, compruebe si hay tensión entre los tubos/cables y la etapa del microscopio, así como fugas de líquido o cambios de volumen en la cámara de grabación. Opcionalmente, intente corregir la deriva durante la adquisición manualmente; sin embargo, tenga en cuenta que esto producirá resultados inherentemente limitados.
      NOTA: Las células endocrinas son altamente heterogéneas a concentraciones cercanas al umbral. Se necesita una duración suficiente de la estimulación para detectar el rango de retrasos de activación / desactivación en células individuales. Esto es especialmente importante para la detección precisa de respuestas no deseadas siguiendo protocolos altamente estimulantes.
    6. Utilice imágenes de calcio para discriminar funcionalmente entre células endo y exocrinas (Figura 6). Para registrar la actividad transitoria durante la activación y desactivación, aplique estímulos sin detener la grabación.
    7. Guarde los datos después del final de la experimentación (considere usar una función de guardado automático). Permita un período de enfriamiento antes de apagar la alimentación del láser para no dañar los láseres durante el procedimiento de apagado.

5. Análisis de datos

  1. Inspeccione visualmente la grabación cualitativamente reproduciendo el video de lapso de tiempo. Compruebe si hay derivas celulares desde el campo de visión o el plano óptico. Si se ha producido una deriva dentro del plano óptico, emplee el complemento de corrección de deriva en ImageJ.
  2. Seleccione regiones de interés (ROI) utilizando software de microscopio o software de terceros. Utilice la imagen de alta resolución, la proyección máxima o el promedio de fotogramas como referencia para seleccionar el ROI. Vuelva a reproducir las imágenes de lapso de tiempo para visualizar las celdas que responden y que no son visibles en las imágenes de referencia. Coloque los ROI de tal manera que el área seleccionada de un ROI no se superponga con las células vecinas para evitar la diafonía de señal entre los ROI.
  3. Exporte los datos de la serie temporal como valor medio del ROI por fotograma. Exportar coordenadas de ROI.
  4. Corrija los datos de la serie temporal para el blanqueo (Figura 7A) empleando una combinación de un ajuste exponencial y lineal, como se describe en
    Equation 1(1)
    donde x(t) denota la señal de fluorescencia en un punto temporal t; xcorr(t) la señal corregida en los puntos de tiempo correspondientes; y a, b y c los parámetros del ajuste calculados como la menor suma de cuadrados entre el corr(t) y x(t).
  5. Analizar la fase de activación y desactivación de la respuesta (Figura 7B). Calcular la primera derivada de los datos de la serie temporal, y determinar el cenit y el nadir de la derivada correspondiente a la activación y desactivación, respectivamente. Alternativamente, seleccione manualmente el inicio del aumento fásico. Guarde y exporte los tiempos de activación/desactivación y las coordenadas de celda correspondientes.
  6. Analizar la fase de meseta (Figura 7C). Detecte oscilaciones individuales mediante el umbral de los datos sin procesar o mediante el umbral de la primera derivada de los datos de la serie temporal. Defina el principio y el final de una oscilación individual como el tiempo correspondiente a la media amplitud de la oscilación.
    1. Calcule la duración y la frecuencia de las oscilaciones individuales para cada celda. Calcule el valor inverso del intervalo interspike (adecuado para patrones de actividad regulares). Alternativamente, divida el número de oscilaciones por el intervalo de tiempo del registro (adecuado para patrones de actividad irregulares).
    2. Calcula el tiempo activo. Exprese el tiempo activo como la suma de duraciones y divida este valor por el intervalo de tiempo. Alternativamente, multiplique la frecuencia y la duración que corresponden con una oscilación.
      NOTA: Dividir la suma de duraciones por el intervalo de tiempo proporciona resultados robustos, pero tiene una baja discriminación estadística ya que se obtiene un único punto de datos por celda. Multiplicar la frecuencia y la duración de una oscilación proporciona una resolución temporal de oscilación a oscilación.

Representative Results

La inyección de la solución de agarosa en el conducto pancreático es el paso más crítico en la preparación de la rebanada de tejido del páncreas. Una inyección exitosa puede ser reconocida por un blanqueamiento del tejido del páncreas, como se ve en el lado izquierdo de la Figura 3A, mientras que una parte incompletamente inyectada del páncreas se presenta en el lado derecho de la Figura 3A. Los islotes de Langerhans se pueden reconocer a simple vista o bajo un estereomicroscopio, y esto ayuda a cortar las partes apropiadas del páncreas para su posterior incrustación en bloques de agarosa (Figura 3B). En una rebanada de tejido pancreático de ratón recién cortada, los islotes de Langerhans se pueden distinguir fácilmente del tejido exocrino circundante y el mesénquima como manchas blancas debajo del estereomicroscopio (Figura 3C) o como estructuras parduscas bajo el microscopio de luz (Figura 3D). Las rodajas de tejido pancreático se pueden usar para distintos tipos de experimentos durante al menos 12 h después del corte. Además de la evaluación morfológica macroscópica bajo el estereomicroscopio, el microscopio de luz y las respuestas funcionales de las células durante las imágenes de calcio, se puede evaluar la viabilidad de las rodajas de tejido pancreático (Figura 4).

Figure 4
Figura 4: Viabilidad de las células dentro de la rebanada de tejido. La viabilidad de las células se determinó con el ensayo Live/Dead. Las células vivas son teñidas por Calcein AM (que se muestra en verde), mientras que las células muertas se tiñen con homodímero de etidio-1 (se muestra en rojo). Las líneas amarillas denotan la posición de la sección transversal X-Y de la pila Z que se muestra en la parte inferior y derecha. La profundidad total de la pila Z es de 88 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para los experimentos de imágenes de calcio, el indicador de calcio fluorescente necesita penetrar a través de unas pocas capas de células. La Figura 5A presenta la carga exitosa del colorante indicador de Ca2+ permeable a las células en la rebanada de tejido pancreático en la que se pueden reconocer las células individuales de los islotes y acinares. En contraste, las rodajas en la Figura 5B-D no son óptimas debido a la penetración fallida del tinte (Figura 5B), la falta de células de los islotes (Figura 5C) y una gran cantidad de tejido necrótico en la superficie (Figura 5D). Tales rebanadas pueden desecharse, verificarse para detectar la presencia de islotes adicionales que se cortan o tiñen mejor (consulte la Tabla 1 para la solución de problemas) o usarse para registrar las respuestas de las células exocrinas.

Figure 5
Figura 5: Ejemplos de preparaciones utilizables e inutilizables. (A) Un ejemplo de una preparación exitosa de la rebanada de tejido del páncreas con células bien teñidas en los islotes de Langerhans, así como células ductales y tejido acinar circundante. (B) Un ejemplo de una rebanada de tejido mal teñida. (C) Ejemplo de un islote de Langerhans con discontinuaciones estructurales. (D) Un ejemplo de un islote de Langerhans que contiene muchas células muertas y muchos escombros. La tabla de búsqueda "glow-over, glow-under" a la derecha muestra la intensidad 0 en verde y la saturación en azul. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los resultados representativos de las imágenes de calcio utilizando el tinte indicador Ca2+ permeable a las células se muestran en la Figura 6. En la Figura 6A, se presenta una imagen de alta resolución de una rebanada de tejido pancreático, que contiene un islote de Langerhans, tejido acinar y un conducto pancreático. Para una mejor distinción, la parte endocrina, exocrina y ductal de la rebanada de tejido pancreático presentada en la Figura 6A se colorea en la Figura 6B. El uso de estímulos apropiados puede discriminar funcionalmente entre diferentes células de los islotes, o células de los islotes y no islotes51. Las células beta generalmente responderán a una estimulación de pulso cuadrado por glucosa con un aumento transitorio en [Ca2+]IC seguido de oscilaciones rápidas de calcio en una meseta sostenida (Figura 6C, panel superior).

Como todas las células beta están acopladas en un solo sincitio funcional, grande y funcional, estas oscilaciones también están muy bien sincronizadas entre diferentes células mediante la propagación de ondas IC [Ca2+]32,34,52,53,54 (Figura 7C). Las oscilaciones IC más lentas [Ca2+]con un período de 5-15 minutos pueden ser la base de las oscilaciones rápidas o incluso ser el tipo predominante de respuesta55,56. El mismo protocolo simple puede revelar otros tipos de respuestas, especialmente en la periferia de los islotes (Figura 6C, panel inferior). Como estas células no están sincronizadas con las células beta y responden con oscilaciones más rápidas e irregulares que ya están presentes en condiciones de baja glucosa o con una disminución de la actividad, tales respuestas son altamente sugestivas de células no beta 21,32,57,58. Sin embargo, su caracterización funcional definitiva requiere protocolos más complejos con pasos de estimulación adicionales o enfoques alternativos, que se discuten a continuación. Las respuestas típicas de las células acinares y ductales se presentan en la Figura 6D y la Figura 6E, respectivamente. Consulte la literatura para obtener más detalles sobre las células acinares y ductales 22,23,35.

Figure 6
Figura 6: Resultados representativos de la dinámica del calcio en distintos tipos de células pancreáticas. (A) Imagen de alta resolución de un islote de Langerhans con tejido circundante. Barra de escala = 100 μm. (B) Delineación de distintas partes del tejido pancreático con tejido acinar mostrado en amarillo, un islote de Langerhans mostrado en rojo y un segmento del árbol ductal en azul. Barra de escala = 100 μm. (C) Trazas típicas de la dinámica del calcio en células beta y supuestamente no beta durante la estimulación con glucosa de 12 mM; Se utilizó glucosa de 3 mM para condiciones no estimulantes. Los protocolos que se pueden utilizar para una discriminación más específica de las células no beta se describen en la sección de discusión. (D) Un rastro típico de la dinámica del calcio de las células acinares estimuladas por 25 nM de acetilcolina. (E) Un rastro típico de la dinámica del calcio de las células ductales estimuladas por 1 mM de ácido quenodesoxicólico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Después de obtener imágenes de calcio exitosas, los datos se exportan primero y se corrigen para el blanqueo mediante una combinación de un ajuste exponencial y lineal, como se describe en la sección de protocolo. En la Figura 7A se presenta una serie temporal antes y después de la corrección del blanqueo. A partir de entonces, se pueden analizar varios parámetros en la fase de activación y desactivación de la respuesta, así como en la fase de meseta. Un retraso en el inicio del aumento de [Ca2+]IC después de la estimulación se puede medir como lo representa el retrasoA en la Figura 7B y la heterogeneidad en los retrasos entre las células individuales (retrasoA1). Los mismos parámetros (retardo D yretardo D1) se pueden utilizar para describir la fase de desactivación. Después del aumento transitorio inicial de [Ca2+]IC , la fase de meseta en la mayoría de las células beta pancreáticas en un islote se caracteriza por oscilaciones de alta frecuencia [Ca2+]IC relativamente regulares. La fase de meseta se puede describir analizando los parámetros funcionales clásicos. La presentación esquemática de la duración, frecuencia y porcentaje de tiempo activo de las oscilaciones [Ca2+]IC se presenta en la Figura 7C. En las imágenes de calcio con tasas de adquisición superiores a 10 Hz, las ondas de calcio que se propagan repetidamente a través del islote también se pueden reconocer claramente (Figura 7C).

Figure 7
Figura 7: Análisis de datos de series temporales. (A) Corrección de datos de series temporales para fotoblanqueo. (B) Análisis de los retrasos en la activación después de la estimulación y en la desactivación después del cese de la estimulación con glucosa de 12 mM. La duración de la estimulación se denota por la barra sombreada de color gris claro en la imagen. (C) Análisis de varios parámetros de la fase de meseta: I) Duración de la oscilación determinada a media altura, II) frecuencia de oscilaciones determinada por intervalos de oscilación. III) el tiempo activo como producto de la frecuencia y duración de las oscilaciones. I-IV) Retrasos entre oscilaciones en cualquier onda dada de oscilaciones que se extienden a través del islote de Langerhans determinados por los retrasos (Δt) en el tiempo en que una sola célula alcanza la mitad de la altura de la oscilación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

El método de rebanada de tejido pancreático es un método experimental rápido para estudiar la morfología y fisiología de las partes endocrinas y exocrinas del páncreas en una preparación más conservada e in situ. Muchas de las ventajas ya se han señalado en la Introducción. Vale la pena señalar que en general (es decir, no solo para las imágenes de calcio), el enfoque de corte para estudiar la fisiología pancreática ahorra tiempo porque no implica un período de recuperación después del aislamiento. Este último no es absolutamente necesario con todo tipo de experimentos y usos de islotes aislados de diferentes especies, pero generalmente se emplea para aumentar la pureza, restaurar la viabilidad y la funcionalidad, y a veces para recolectar islotes de varios donantes 59,60,61,62,63,64 . Sin embargo, en el contexto de las imágenes de calcio, se ha encontrado que las respuestas de las células beta dependen de la duración y las condiciones del cultivo, y esta es una fuente importante de variación que debe tenerse en cuenta cuando se utilizan islotes aislados15,65. El mismo problema debe considerarse para las rebanadas de tejido si su cultivo a largo plazo se convierte en una opción ampliamente utilizada en el futuro22,36. El método de corte de tejido también tiene un alto rendimiento y, por lo tanto, reduce potencialmente el sufrimiento de los animales y aumenta el poder estadístico. Además, se pueden preparar tantas rebanadas a partir de un solo animal y debido a que las rebanadas sobreviven durante largos períodos, es factible incluir el mismo animal o incluso el mismo islote tanto en el grupo experimental como en el de control.

A medida que se conservan la arquitectura original y las comunicaciones de célula a célula, y debido a que es compatible con una serie de análisis estructurales, electrofisiológicos, métodos de imagen y ensayos de secreción hormonal, este método es especialmente útil para estudiar las funciones pancreáticas que dependen de interacciones no perturbadas entre células individuales, por ejemplo, sensibilidad a secretagogos, interacciones paracrinas e inmunes entre diferentes tipos de células, patrones de actividad eléctrica, propiedades de la dinámica del calcio y la secreción de diferentes hormonas. Para las imágenes de calcio específicamente, las principales ventajas de usar rodajas son la exposición del núcleo de los islotes y la posibilidad de adquirir señales de muchos tipos de células diferentes con alta resolución. Dependiendo de los requisitos del experimento y la edad de los animales, el grosor puede variar, las rebanadas pueden ser transfectadas u obtenidas de animales con reporteros codificados genéticamente. Como se explica con más detalle a continuación, estos dos últimos enfoques también permiten la identificación funcional específica y la caracterización de las respuestas de las células no beta 31,66. Además, los islotes de partes bien definidas del órgano se pueden estudiar para detectar diferencias en la capacidad de respuesta o la susceptibilidad a la enfermedad. Aunque no requieren un período de incubación de recuperación, se pueden incubar fácilmente con diferentes agentes farmacológicos, ácidos grasos, glucosa alta y citoquinas.

Lo más importante es que, dado que la alta resolución se puede lograr en combinación con la resolución unicelular o incluso subcelular, la imagen de calcio confocal en rodajas es uno de los métodos más adecuados para analizar las ondas de calcio, la conectividad funcional y las diferentes funciones funcionales de las células en distintas partes de un islote54,67. A pesar de una serie de ventajas, el enfoque de corte de tejido tiene limitaciones importantes. En primer lugar, sigue siendo, al menos en parte, perjudicial para la arquitectura de los islotes y exocrinas, especialmente en la superficie de corte, y se necesitan precauciones, como baja temperatura, intercambio frecuente de soluciones y manipulación suave y rápida, durante la preparación para evitar daños enzimáticos mecánicos y endógenos adicionales. En segundo lugar, los patrones de entrega de nutrientes y secretagogos siguen siendo inferiores a la ruta in vivo, la preparación está separada de la inervación sistémica y la retroalimentación interorgánica, como entre el islote y sus tejidos diana, es imposible, en contraste con los enfoques in vivo. En tercer lugar, el grosor máximo de la rebanada está limitado por la oxigenación, el suministro de nutrientes y la regulación del pH a ~ 200 μm9. Además, tanto la preparación de rebanadas como las imágenes necesitan mucha capacitación, y los análisis en profundidad de datos de calcio de series de tiempo largas y de muchas células requieren conocimientos especializados que a menudo no se incluyen en el conjunto de herramientas de un fisiólogo clásico y requieren la ayuda de físicos o científicos de datos. La ventaja de que se conservan las interacciones homo y heterotípicas también puede complicar el análisis de muestras debido a la presencia de señales de otras células en regiones de interés. Dependiendo de los protocolos, la activación de otras células puede conducir a la estimulación adicional indirecta o la inhibición de una célula observada.

Esto solo puede resolverse de manera concluyente mediante enfoques de deconvolución, mediante protocolos de estimulación más complejos que incluyan sustancias que bloqueen algunos de los efectos indirectos, mediante el uso de animales knock-out específicos y mediante una comparación cuidadosa de los resultados con los resultados de otros estudios que emplean metodologías más reduccionistas. Además, si las mediciones de secreción son necesarias, debe tenerse en cuenta que algunas rebanadas pueden carecer de islotes, y la masa total de tejido endocrino en una sola rebanada suele ser baja. La preparación de cortes agudos de tejido pancreático para imágenes implica varios pasos críticos discutidos en las siguientes secciones y resumidos en la Tabla 1, donde el lector también puede encontrar consejos cortos pero importantes para la solución de problemas. Primero, al preparar la solución de agarosa, el polvo de agarosa debe disolverse por completo, de lo contrario las partículas no disueltas pueden obstruir la inyección. Mantenga la solución homogénea de agarosa a 37-45 ° C para evitar el endurecimiento de la agarosa debido a una temperatura demasiado baja, por un lado, y para evitar daños en los tejidos debido a temperaturas demasiado altas, por otro lado. Después de su uso, la agarosa restante puede almacenarse a 4 ° C y recalentarse, aunque el recalentamiento repetido puede resultar en un aumento de la densidad debido a la evaporación del agua, lo que eventualmente dificulta o imposibilita la inyección.

El siguiente paso crítico en la preparación es sujetar correctamente la papila duodenal principal. Una mancha blanca en el duodeno indica la unión del conducto biliar común y el duodeno. Una abrazadera colocada demasiado proximalmente dará como resultado la obstrucción de algunas ramas pancreáticas laterales del conducto común, inhabilitando la inyección de estas partes, mientras que una abrazadera colocada demasiado distalmente dará como resultado que la agarosa se filtre a través de la ruta de resistencia inferior directamente hacia el duodeno. Antes de la canulación del conducto biliar común, el tejido adiposo circundante se puede extirpar cuidadosamente para una mejor visualización del conducto y un mayor control durante la inyección. La precisión insuficiente durante la extracción del tejido circundante puede resultar en la perforación del conducto. La selección del diámetro de la aguja utilizada para la inyección de agarosa también es importante. En ratones, se usa preferiblemente una aguja de 30 G; Las agujas más pequeñas (32 o 33 G) requieren más esfuerzo debido a la alta viscosidad de la solución de agarosa y son más propensas a la obstrucción. Sin embargo, si se usan en combinación con una solución de agarosa de menor densidad, pueden ser muy útiles en cepas de ratones más pequeñas y animales más jóvenes. Durante los primeros días postnatales, la agarosa puede inyectarse alternativamente por vía subcapsular en lugar de intraductal2. El uso de agujas con mayor diámetro en ratones probablemente resultará en dañar el conducto biliar común. Esto también puede suceder con el diámetro correcto de la aguja, y un fórceps puede ayudar a mantener la aguja en su lugar durante la inyección. Las agujas de mayor diámetro pueden ser la única solución en caso de conductos más grandes, como se encuentra en las ratas. Si la aguja es demasiado estrecha para garantizar un sello hermético que evite la fuga hacia atrás, se puede colocar una ligadura a su alrededor al ingresar con éxito al conducto.

La inyección de agarosa requiere cierto esfuerzo debido a la viscosidad de la solución, y una vez que el proceso de inyección ha comenzado, no debe interrumpirse ya que la solución de agarosa de bajo punto de fusión puede solidificarse en la aguja o en las partes más grandes del árbol ductal antes de que se complete la inyección. Esto resultará en una mala penetración del tejido y un peor soporte durante el corte. El conducto siempre debe canularse en el punto donde el conducto hepático izquierdo y el conducto cístico se unen para formar el conducto biliar común. Si el conducto biliar común se perfora, intente repetidamente canular más cerca del duodeno. Cuando el páncreas está suficientemente estabilizado con solución de agarosa y extraído de la cavidad peritoneal, se cortan pequeños trozos de tejido bien inyectado. Antes de incrustarlos en la agarosa, es crucial eliminar todos los tejidos adiposos y conectivos, ya que sus residuos hacen que el corte sea más desafiante. Lo mismo se aplica a los vasos sanguíneos y los residuos de conductos, excepto cuando son el foco del experimento. En este caso, asegúrese de colocarlos de tal manera que se obtenga la sección transversal deseada. Al incrustar el tejido en agarosa, asegúrese de que la temperatura sea adecuada (37 ° C) y que el tejido esté completamente rodeado de agarosa, ya que las fuerzas durante el corte del vibratomo pueden arrancar el tejido del páncreas de los bloques de agarosa.

Secar rápidamente los bloques de tejido antes de colocarlos en agarosa colocándolos brevemente sobre un pañuelo de papel puede ayudar a prevenir el contacto deficiente entre el tejido y la agarosa durante este paso. Durante la solidificación de los bloques de agarosa, coloque la placa de Petri horizontalmente y evite el contacto entre el tejido del páncreas y la parte inferior de la placa de Petri. Si el páncreas no se inyecta completamente, el proceso de corte será un desafío. Por lo tanto, trate de reducir la velocidad de corte para obtener rodajas de tejido. Para minimizar el daño celular durante el corte del vibratomo, reemplace el SEC (y los cubitos de hielo hechos de ECS) en la cámara de corte regularmente. Este último reducirá la actividad de las enzimas pancreáticas liberadas del tejido acinar durante el corte. El grosor de las rodajas también es de crucial importancia. Para la dinámica del calcio y los experimentos electrofisiológicos, generalmente se cortan rodajas de 140 μm; sin embargo, de acuerdo con el objetivo del estudio, el grosor de la rebanada puede variar de 90 μm a 200 μm. Tenga en cuenta que en rodajas más gruesas, la difusión de oxígeno y nutrientes será limitada, pero incluirán más tejido. Además, se puede esperar que la proporción de islotes sin cortar aumente con el aumento del grosor de la rebanada. Las rebanadas pueden almacenarse en un SEC intercambiado regularmente a temperatura ambiente durante varias horas o incluso cultivarse en un medio celular apropiado durante varios días; sin embargo, esto puede eventualmente afectar la fisiología normal de las células de losislotes 3,22.

Al preparar la solución de tinte, asegúrese de una mezcla cuidadosa de todos los componentes y evite la exposición a la luz ambiental. La rebanada pancreática se compone de muchas capas celulares, y la absorción de colorante de calcio se limita a las primeras capas celulares más superficiales, como se describió anteriormente para los islotes aislados58,68 y las rodajas hipofisarias69. Sin embargo, a diferencia de los islotes aislados donde la cápsula circundante y las capas celulares externas dificultan la penetración del tinte en capas más profundas, las rodajas de tejido permiten el acceso a toda la superficie de la sección transversal del islote, lo que permite la medición simultánea de la dinámica del calcio en cientos de células de todas las capas de un islote. Los indicadores fluorescentes Ca2+ son los más utilizados para medir la dinámica del calcio, y junto con CLSM, permiten grabaciones con alta resolución temporal, alcanzando varios cientos de Hertz. Al seleccionar el indicador fluorescente Ca2+ más apropiado, considere diferentes factores, incluida la forma del indicador, que influye en el método de carga celular, el modo de medición (cualitativo o cuantitativo) y la constante de disociación (Kd) que debe estar en el rango de concentración de Ca2+ de interés y depende del pH, la temperatura, la presencia de Mg2+ y otros iones, así como la unión a proteínas. Como las señales celulares de Ca2+ suelen ser transitorias, también se debe considerar la constante de velocidad de unión de Ca2+. Para medir la dinámica [Ca2+]IC en células pancreáticas, este grupo utiliza principalmente el colorante indicador Ca2+ permeable a la célula descrito en este protocolo (Tabla de Materiales) ya que es un indicador de longitud de onda larga con las longitudes de onda de emisión en el espectro donde la autofluorescencia celular suele ser menos problemática, y la energía de la luz de excitación es baja, lo que reduce el potencial de fotodaño celular. Debido a que este colorante es fluorescente a bajas concentraciones de Ca2+, esto facilita la determinación de la ci basal [Ca2+] y aumenta la visibilidad celular antes de la estimulación. Después de unir Ca2+, la intensidad de fluorescencia del tinte aumenta 14 veces, lo que permite detectar incluso ligeros cambios en [Ca2+]IC.

Para el éxito de las imágenes de calcio de células vivas, se deben considerar varios parámetros de hardware cruciales, como se describe en la sección de protocolo. Para las imágenes de células vivas en las que las amplitudes de la señal son bajas y las posibilidades de fototoxicidad son altas, los objetivos con un NA más alto se utilizan preferiblemente para recolectar más luz de la muestra. Si la dinámica del calcio debe registrarse con una alta resolución temporal, utilice el escáner resonante en lugar de galvanómetros lineales. Además de elegir el objetivo correcto, el uso de detectores altamente sensibles, como los detectores híbridos que requieren menos potencia láser, evita la fototoxicidad y el fotoblanqueo. Esto es de especial importancia para las imágenes de calcio de larga duración. Otros pasos importantes en las imágenes de calcio son la configuración de parámetros de calidad de imagen para adquisiciones de series temporales. Los más importantes son la resolución temporal y la espacial. Como la dinámica del calcio per se determina la resolución temporal aceptable más baja, la frecuencia de muestreo debe ser al menos dos veces mayor que la frecuencia de señal esperada para detectar la señal o incluso 10 veces mayor para detectar la forma de la señal de manera confiable. En las rebanadas agudas de tejido pancreático, la dinámica del calcio se puede medir en cientos de células simultáneamente y, por lo tanto, la resolución espacial también es importante. Esto se puede mejorar aumentando el número de píxeles o aumentando el promedio de línea durante la adquisición en vivo. Sin embargo, debido a la relación inversa entre la resolución espacial y la temporal, se necesita una compensación entre ambas configuraciones.

Si se deben realizar imágenes de calcio en una población celular específica dentro del páncreas, es necesario un estímulo capaz de diferenciar funcionalmente las células dentro de la rebanada. La glucosa alta activa de manera confiable y rápida las células beta a un patrón oscilatorio que se superpone a un nivel elevado de calcio y está altamente sincronizado entre todas las células dentro de un islote 32,58,70. Las células beta son el tipo de célula más numerosa dentro de un islote y se encuentran principalmente en el núcleo del islote en ratones. El mismo protocolo de estimulación disminuye y a veces no cambia apreciablemente el estallido en las células alfa 30,32,58,70,71,72. Para discriminar funcionalmente a las células alfa, se puede utilizar glucosa baja (3 mM), glutamato o adrenalina para aumentar su frecuencia o basal [Ca2+]IC 21,72,73,74,75. Representan el 10-20% de las células de los islotes y se detectarán en la periferia de los islotes1. Las células delta también se encuentran en la periferia. Constituyen solo ~ 5% del número total de células endocrinas en un islote y son típicamente activas en glucosa de 6 mM y responden a la estimulación de la glucosa con una mayor actividad de estallido irregular desde el inicio o un nivel de calcio ligeramente elevado 1,32,71,76. La grelina se puede utilizar para la estimulación específica de las células delta 21,77,78,79 en experimentos de imágenes de calcio. Sin embargo, aún no se han definido protocolos para la identificación funcional específica de células PP y épsilon. Además, la acetilcolina de 25 nM activa de manera confiable las células acinares en actividad de estallido 35,80,81. Además, una serie de otros secretagogos, como la ceruleína, la colecistoquinina y la carbamilocolina, se pueden utilizar para evocar respuestas de calcio en las células acinares 22,40,82,83.

Finalmente, el ácido quenodesoxicólico de 1 mM evoca de manera confiable las respuestas de calcio en las células ductales en rodajas de tejido; la angiotensina II, ATP y algunos otros secretagogos también se pueden usar 11,23,84,85. Cuando una identificación funcional basada en respuestas características a secretagogos e inhibidores específicos no sea suficiente, se puede emplear animales marcados genéticamente31, células transfectadas73 o inmunocitoquímica para la identificación de diferentes tipos de células 9,22,71,86 . Durante los últimos años, el método de corte de tejido se ha adaptado con éxito al tejido humano, abriendo muchas nuevas vías de investigación importantes tanto en la fisiología exocrina41 como en la endocrina 9,36,37,39. Curiosamente, una evaluación detallada de la dinámica del calcio en los islotes humanos ha sido notoriamente difícil y aún no se ha investigado con mayor detalle87. Combinado con la microscopía confocal avanzada, el método de corte de tejido pancreático ha permitido muchos nuevos conocimientos sobre la dinámica del calcio en ratones y, con suerte, hará lo mismo con el tejido humano.

Disclosures

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier interés comercial o financiero.

Acknowledgments

El trabajo presentado en este estudio fue financiado por la Agencia Eslovena de Investigación (fondos básicos de investigación nos. P3-0396 e I0-0029, así como proyectos de investigación nos. J3-9289, N3-0048 y N3-0133) y por el Fondo Austriaco para la Ciencia / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (subvenciones bilaterales I3562--B27 e I4319--B30). Agradecemos a Maruša Rošer, Maša Čater y Rudi Mlakar por su excelente asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Analytical balance KERN ALJ 120-4 KERN & SOHN GmbH ALJ 160-4A
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup Leica 5100001578
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup Leica
Cork pad 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL centrifuge tubes Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430790
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L Fischer Scientific, Leicestershire, UK 432124
Double edge razor blade Personna, USA
Dumont #5 - Fine Forceps FST, Germany 11254-20
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 0030 121.023
Erlenmeyer flask 200 mL IsoLab, Germany 027.01.100
Fine Scissors - ToughCut FST, Germany 14058-11
Flat orbital shaker  IKA KS 260 basic IKA Ident. No.: 0002980200
Glass lab bottle 1000 mL IsoLab, Germany 091.01.901
Hartman Hemostat, curved FST, Germany 13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) Leica 15507701
Measuring cylinder 25 mL IsoLab, Germany 015.01.025
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Microwave owen Gorenje, Slovenia MO20MW
Osmometer Gonotec 010 Gonotec, Berlin, Germany OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
Paint brush Faber-Castell, No.2 Any thin soft round paint brush No.2, preferably black
Paper towels
Perifusion pumps Ismatec ISM 827 Reglo Analog MS - 4/8
Petri dish 100/20 mm Sarstedt 83.3902
Petri dish 35/10 mm Greiner bio-one 627102
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA 153066 NON-STICKY for agarose blocks
pH meter inoLab pH Level 1 WTW, Weilheim, Germany E163694
Pipette 1000 mL Eppendorf 3121 000.120
Pipette 50 mL Eppendorf 3121 000.066
Push pins 23 mm Deli, Ningbo, China E0021
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Semken Forceps FST, Germany 11008-13
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask IsoLab, Germany 027.11.048
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 Nikon, Melville, NY USA
Syringe Injekt Solo 5 mL Braun, Melsungen, Germany 4606051V
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") Braun, Melsungen, Germany 4656300
Temperature controller Luigs & Neumann 200-100 500 0150, 200-150-500-145 Slice mini chamber, Temperature controller TC 07
Tubings for perifusion system Ismatec SC0310 Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
Ultrasonic bath Studio GT-7810A Globaltronics
Vibrotome Leica VT 1000 S Leica, Nussloch, Germany 14047235613
Volumetric flask 1000 mL IsoLab, Germany 013.01.910
Vortex mixer Neolab 7-2020 Neolab  7-2020
Water bath Thermo Haake open-bath circulator Thermo Fisher Scientific Z527912
Material/Reagent
Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany C5080-500G
D-(+)-glucose Sigma Aldrich, Germany G8270-1KG
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D4540-100ML
DL-lactic acid Sigma Aldrich, Germany L1250-500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Merck KGaA, Darmstadt, Germany D8662-500ML
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020
HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G
L-(+)-ascorbic acid Sigma Aldrich, Germany A9,290-2
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA L3224
Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany M2670-500G
Myo-inositol Sigma Aldrich, Germany I5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM Invitrogen (Thermo FisherScientific) O6807 cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) P3000MP polaxamer: nonionic triblock copolymer
Potassium chloride - KCl Sigma Aldrich, Germany 31248
SeaPlaque GTG agarose Lonza, Rockland, USA 50111
Sodium bicarbonate - NaHCO3 Honeywell, Germany 31437-500G
Sodium chloride - NaCl Honeywell, Germany 31434-1KG
Sodium hydroxide - NaOH Sigma Aldrich, Germany 30620
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 Sigma Aldrich, Germany S0751-500G
Sodium pyruvate Sigma Aldrich, Germany 15990-100G
Software
FIJI FIJI is an open source project
LASAF Leica microsystems, Inc.
Matlab Mathworks
Python Python Software Foundation Python is an open source project

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Microscopía de barrido con láser confocal de la dinámica del calcio en rodajas agudas de tejido pancreático de ratón
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