Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Konfokal laserscanning Mikroskopi af calciumdynamik i akutte musespytkirtelvævsskiver

Published: April 13, 2021 doi: 10.3791/62293
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 1
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

Summary

Vi præsenterer fremstillingen af akutte bugspytkirtelvævsskiver og deres anvendelse i konfokal laserscanningsmikroskopi til at studere calciumdynamik samtidigt i et stort antal levende celler over lange tidsperioder og med høj spatiotemporal opløsning.

Abstract

Den akutte skive af bugspytkirtelvæv er et unikt in situ-præparat med bevaret intercellulær kommunikation og vævsarkitektur, der medfører signifikant færre forberedelsesinducerede ændringer end isolerede øer, acini, kanaler eller dispergerede celler beskrevet i typiske in vitro-undersøgelser. Ved at kombinere den akutte bugspytkirtelvævsskive med levende celle calciumbilleddannelse i konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) kan calciumsignaler studeres i et stort antal endokrine og eksokrine celler samtidigt med en enkeltcellet eller endda subcellulær opløsning. Følsomheden tillader påvisning af ændringer og muliggør undersøgelse af intercellulære bølger og funktionel forbindelse samt undersøgelse af afhængigheden af fysiologiske reaktioner af celler på deres lokalisering inden for øen og parakrinforholdet med andre celler. Endelig, set ud fra et dyrevelfærdsperspektiv, sænker registrering af signaler fra et stort antal celler ad gangen antallet af dyr, der kræves i forsøg, hvilket bidrager til 3R-erstatnings-, reduktions- og raffinementsprincippet.

Introduction

Pattedyrets bugspytkirtel er en stor eksokrine og endokrin kirtel. Den eksokrine del udgør 96-99% af det samlede bugspytkirtelvolumen og består af acini og kanaler. Den endokrine del består af et stort antal øer af Langerhans, der tegner sig for de resterende 1-4% af det samlede bugspytkirtelvolumen1. Den eksokrine del udskiller store fordøjelsesenzymer, der nedbryder energirige polymerer i fødevarer, samt en bicarbonatrig væske, der kombineres med andre gastrointestinale sekreter for at tilvejebringe et miljø, der er egnet til virkningen af enzymer. Den endokrine del udskiller hormoner, der regulerer postprandial distribution, opbevaring og interprandial frigivelse af energirige næringsstoffer. Selvom det eksokrine væv er relativt underudviklet og det endokrine relativt veludviklet ved fødslen, vokser førstnævnte hurtigt sidstnævnte ved fravænningaf 2,3,4. Tidlige studier af bugspytkirtelfunktionen markerede fødslen af moderne fysiologi, og store metodiske fremskridt på området er blevet efterfulgt af store videnskabelige gennembrud5. At arbejde med bugspytkirtlen er teknisk udfordrende på grund af kirtlens indviklede struktur, men er også en stor motivation på grund af sygdomme som kræft i bugspytkirtlen, pancreatitis og diabetes, der udgør store trusler mod folkesundheden, og for hvilke der er behov for nye terapeutiske tilgange.

Isolerede øer6, acini 7,8 og duktale fragmenter var blevet udviklet og brugt i årtier som guldstandardmetoder på grund af deres fordele sammenlignet med cellelinjer og primære dispergerede endokrine, acinar- og duktale celler 9,10. På trods af isolerede cellekollektivers markant forbedrede funktion involverer disse metoder stadig betydelig mekanisk og enzymatisk belastning, isolerer celler fra det omgivende væv og mangler således parakrine interaktioner og mekanisk støtte, og vigtigst af alt ledsages af betydelige ændringer i normal fysiologi 11,12,13 . Den akutte musespytkirtelvævsskive blev udviklet i 2001 ud fra et opfattet behov for at udvikle en eksperimentel platform svarende til hjerne-, hypofyse- og binyreskiver med bevarede intercellulære kontakter, parakrine interaktioner, mesenchym og vævsarkitektur samt uden nogle af de vigtigste mangler ved guldstandardmetoden i øforskning på den tid - de isolerede øer12, 14. Blandt disse mangler er skader på de yderste lag, manglende tilgængelighed af kerneøområder og behovet for dyrkning med muligvis vigtige virkninger på celleidentitet og fysiologi12,15. Desuden muliggør vævsskivemetoden undersøgelser af dyremodeller med groft forstyrret holmarkitektur, hvor det er umuligt at isolere holme, eller når holmudbyttet er ekstremt lavt ved traditionel isolering 16,17,18,19,20,21.

Derudover er skiven mere velegnet til at studere morfologiske ændringer under udviklingen af diabetes og pancreatitis, for eksempel, da den giver et bedre overblik over hele vævet og også er kompatibel med at studere regionale forskelle. På trods af det tidlige fokus på den endokrine del muliggør vævsskivemetoden i sagens natur undersøgelsen af de eksokrine komponenter 9,22,23. I løbet af det første årti efter introduktionen blev metoden anvendt til elektrofysiologiske undersøgelser af beta-14,24,25,26,27,28,29- og alfa-30,31-celler samt til undersøgelse af den morfologiske og funktionelle modning af bugspytkirtlen 2,3 . Et årti senere i 2013 blev metoden med succes tilpasset til levende celle calciumbilleddannelse af øceller ved hjælp af CLSM til at karakterisere deres reaktioner på glucose32, deres funktionelle forbindelsesmønstre33 og forholdet mellem membranpotentiale og intracellulært calcium ved at kombinere et fluorescerende calciumfarvestof med et membranpotentialefarvestof34. Senere samme år blev metoden også brugt til at vurdere calciumdynamikken i acinarcellerne22,35. I løbet af de følgende år er bugspytkirtelvævsskiver blevet anvendt i en række forskellige undersøgelser og med succes tilpasset svin og humant væv 9,36,37,38,39,40,41. Men samlet set udføres calciumbilleddannelse - i skiver af bugspytkirtelvæv i almindelighed og i holme i særdeleshed - stadig for det meste af denne gruppe. En af hovedårsagerne til dette kan ligge i kombinationen af et teknisk udfordrende vævsskivepræparat, behovet for et konfokalt mikroskop og ret kompleks dataanalyse. Hovedformålet med dette papir er at gøre denne kraftfulde metode mere tilgængelig for andre potentielle brugere.

Der er allerede nogle fremragende metodologiske artikler, der beskæftiger sig detaljeret med vævsskiveforberedelse og brugen af skiver til struktur- og sekretionsundersøgelser, men ikke til konfokal calciumbilleddannelse 9,42,43. Derfor fokuserer dette papir på nogle yderligere tips og tricks under forberedelsen af skiver, på trin, der er kritiske for vellykket farvestofindlæsning, billedoptagelse samt på hovedtrinnene i grundlæggende calciumdataanalyse. Dette bidrag bør derfor betragtes som et supplement til snarere end et alternativ til ovennævnte metode. På samme måde skal calciumdannelse i skiver af bugspytkirtelvæv betragtes som en eksperimentel tilgang, der skal anvendes til at besvare specifikke spørgsmål og er således komplementær til snarere end et absolut alternativ til andre calciumbilleddannelsesmetoder i bugspytkirtelfysiologi såsom isolerede kanaler eller acini, isolerede holme, organoider, holme transplanteret i øjets forreste kammer og optagelser in vivo 11,44,45,46,47,48. Løftet om calciumbilleddannelse i skiver af bugspytkirtelvæv illustreres sandsynligvis bedst af nylige vellykkede optagelser af calciumdynamik i ø-mesenkymale celler såsom pericytter49 og makrofager50 samt i duktale celler23.

Protocol

BEMÆRK: Alle forsøg blev udført i nøje overensstemmelse med institutionelle retningslinjer for pleje og anvendelse af dyr i forskning. Protokollen blev godkendt af Republikken Sloveniens administration for fødevaresikkerhed, veterinærsektor og plantebeskyttelse (tilladelsesnummer: 34401-35-2018/2).

1. Fremstilling af skiver af bugspytkirtelvæv

BEMÆRK: Forberedelsen af akutte bugspytkirtelvævsskiver til calciumbilleddannelse ved hjælp af CLSM kræver en række instrumenter, forskellige opløsninger og fortsætter i en række kritiske trin, der er skematisk præsenteret i figur 1 og beskrevet detaljeret nedenfor.

Figure 1
Figur 1: Diagram over arbejdsgang. Skematisk repræsentation af alle trin i processen med fremstilling af bugspytkirtelvævsskiver, begyndende med injektion af agarose i den fælles galdekanal efterfulgt af ekstraktion af bugspytkirtlen og udskæring. De tilberedte skiver kan bruges til at vurdere vævets levedygtighed med et Levende / dødt sæt eller farves med en calciumsensor. Når de er farvet, er de klar til billeddannelse. Optagelser opnået fra billeddannelsesprocessen bruges derefter til dataanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Fremstilling af opløsninger
    BEMÆRK: Alle opløsninger skal tilberedes på forhånd og kan opbevares i køleskabet ved 4-8 °C i op til en måned. Til fremstilling og opbevaring af vævsskiver er der behov for ca. 0,5 liter ekstracellulær opløsning (ECS) med 6 mM glucose og 0,3 L 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsyre (HEPES) buffer. For 1 dags calciumbilleddannelse med perifusionssystemet indstillet til 1-2 ml / min strømningshastighed er der behov for ca. 0,5 liter ECS.
    1. Ekstracellulær opløsning med 6 mM glucose
      1. Der fremstilles 1 liter ECS indeholdende 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM glucose, 6 mM mælkesyre, 3 mM myo-inositol, 2,5 mM KCl, 2 mM Na pyruvat, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2 og 0,5 mM ascorbinsyre. Bland grundigt, indtil alle ingredienser er helt opløst. Tag 50 μL ECS i et 0,5 ml mikrocentrifugerør, læg det på osmometeret i henhold til producentens anvisninger, og kontroller osmolariteten.
        BEMÆRK: Osmolariteten skal være 300-320 mOsm. Til stimulering af betaceller skal du bruge opløsninger med højere glukosekoncentrationer. For at sikre en fysiologisk pH-værdi på 7,4 under udskæring og forsøg bobler ECS konstant med carbogen (dvs. en gasblanding på 95% O2 og 5% CO2) ved barometertryk. Et simpelt boblesystem kan opsættes ved at fastgøre den ene ende af en 5 mm siliciumslange til karbonens kilde (dvs. en gasflaske under tryk) og den anden ende af slangen placeres direkte i flasken indeholdende ECS.
      2. Alternativt kan du forberede en 10x bestand indeholdende 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3, 30 mM myo-inositol, 25 mM KCl, 20 mM Na pyruvat, 12,5 mM NaH2PO4 og 5 mM ascorbinsyre. Når der er behov for ECS indeholdende 6 mM glucose, blandes 100 ml af stammen med 2 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgCl2, 0,455 ml 13,2 ml mælkesyre og 1,08 g glucose og fyldes med dobbeltdestilleret vand op til 1 l. Brug om nødvendigt forskellige mængder glucose til at opnå andre glukosekoncentrationer.
    2. HEPES-buffer med 6 mM glukose
      1. Der fremstilles 0,5 liter HEPES-bufferopløsning (HBS) indeholdende 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM glucose, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2 og 1 mM MgCl2; titreres til pH = 7,4 med 1 M NaOH.
        BEMÆRK: Hvis carbogen ikke er tilgængelig, kan denne buffer bruges til alle trin i stedet for ECS.
    3. Agarose (1,9% w/w)
      1. Forvarm et vandbad til 40 °C.
      2. Der tilsættes 0,475 g lavsmeltepunktsagarose og 25 ml ECS indeholdende 6 mM glucose til en Erlenmeyer-kolbe, og kolben anbringes i en mikrobølgeovn med maksimal effekt i nogle få sekunder, indtil den begynder at koge. Tag kolben ud af ovnen og hvirvl den et par gange, indtil agarosen er helt opløst. Kolben med den flydende agarose overføres til det forvarmede vandbad ved 40 °C for at afkøle agarosen til den ønskede temperatur og holde den flydende indtil injektion. Kolben fastgøres med en stabiliserende blyring.
        BEMÆRK: Agarosen kan tilberedes på forhånd og opbevares i køleskabet. Før brug opvarmes agarosen i mikrobølgeovnen, indtil den er flydende, og Erlenmeyer-kolben overføres til et vandbad, der er forvarmet til 40 °C. Agarosen kan genbruges op til 5x. Hvis det genbruges ud over 5x, bliver det tæt og sværere at injicere.
  2. Injektion af bugspytkirtlen med agarose
    BEMÆRK: Afsnit 1.2 og 1.3 forklarer fremstillingen af vævsskiver, der kan anvendes til forskellige eksperimentelle formål såsom calciumbilleddannelse, elektrofysiologi, immunohistokemi, sekretionsundersøgelser og strukturelle / mikroanatomiske undersøgelser.
    1. Fyld en 5 ml sprøjte med den flydende agarose fra Erlenmeyer-kolben i vandbadet fra trin 1.1.3.2, fjern eventuelle bobler, og monter en 30 G nål. Beskyt kanylen med en hætte, og hold den fyldte sprøjte tilbage i vandbadet med nålen nedad og hele volumenet af agarose under vandoverfladen. Fastgør sprøjten med en stabiliserende blyring på en sådan måde, at ringen presser sprøjten mod vandbadets væg.
      BEMÆRK: Pas på ikke at skubbe agarose ind i nålen, da den hærder hurtigt og blokerer nålen. Hvis stuetemperaturen er lav, og hvis injektionen udføres af en mindre erfaren person, skal du øge vandbadets temperatur op til 42 °C for at få lidt ekstra tid til injektion.
    2. Fyld en isspand med is, og læg flasken med ECS i den. Boble ECS konstant ved 1,5 ml/min med carbogen ved barometertryk og stuetemperatur for at sikre iltning og en pH på 7,4.
    3. Ofre en mus ved at administrere en høj koncentration af CO2 efterfulgt af cervikal dislokation. Gør alt for at minimere dyrs lidelse.
    4. Arbejder under et stereomikroskop, få adgang til maven via laparotomi (figur 2A). Vend forsigtigt tarmen til venstre side af musen (fra musens anatomiske perspektiv) for at udsætte den fælles galdekanal. Brug pincet til at løfte duodenaldelen lidt, og find den store duodenale papilla-papilla af Vater. Klem den fælles galdekanal ved duodenalpapillen ved hjælp af en hæmostat (figur 2B, C) for at forhindre lækage af agarose fra kanalen ind i tolvfingertarmen.
      BEMÆRK: For at forhindre agaroselækage i tolvfingertarmen og længere op og ned i mave-tarmkanalen skal du placere hæmostaten på en sådan måde, at den også klemmer tolvfingertarmen både proximalt og distalt fra papillen. Det er bedst at bruge en buet hæmostat til dette formål.
    5. Med små skarpe tang, nå under den fælles galdekanal og bryde membranen, der fastgør kanalen til bugspytkirtelvævet. For bedre visuel kontrol og lettere injektion skal du fjerne så meget fedt og bindevæv fra kanalen som muligt.
    6. Anbring kanalen vinkelret på store tang (figur 2D), og injicer den tilberedte flydende agarose i den proksimale del af den fælles galdegang (figur 2D). Sørg for at klemme sprøjten hårdt, da agarosen er tyktflydende. Bliv ved med at fylde bugspytkirtlen, indtil den bliver hvidlig og let udspilet eller i mindst 20-30 s.
      BEMÆRK: Dette er det mest kritiske trin i skiveforberedelse. Hvis der er knæk i duktaltræet i bugspytkirtlen, skal du forsigtigt hæve eller trække bugspytkirtlen væk fra sprøjten for at udjævne dem. Beslut ikke, hvornår injektionen skal stoppes, baseret på det volumen, der injiceres fra sprøjten, da tilbagestrømningen på injektionspunktet og lækagen fremad i tolvfingertarmen typisk er meget højere end det volumen, der injiceres i bugspytkirtelens duktale træ. Det er vigtigt, at vellykkede injektioner kan udføres med praktisk talt umærkelige ændringer i sprøjtevolumen.
    7. Fjern sprøjten, og hæld langsomt 20 ml af den boblede iskolde ECS ved 0-4 ° C fra flasken på bugspytkirtlen for at afkøle vævet og hærde agarosen.
    8. Træk forsigtigt bugspytkirtlen ud ved hjælp af tang og fine hårdskårne sakse. Anbring den ekstraherede bugspytkirtel i en 100 mm petriskål indeholdende ~ 40 ml iskold ECS, og flyt den forsigtigt rundt for at vaske den. Overfør bugspytkirtlen til en frisk 100 mm petriskål indeholdende ~ 40 ml iskold ECS.
    9. Fra den godt injicerede del af bugspytkirtlen, der forekommer hvidlig (figur 3A), skæres op til 6 blokke væv, 0,1-0,2 cm3 i størrelse ved hjælp af tang og hårdskåret saks. Ryd dem for ethvert bindevæv og fedtvæv.
    10. Fyld en 35 mm ikke-klæbrig bund-petriskål med ca. 5 ml flydende agarose ved 40 °C, overfør vævsblokkene ind i den, og læg straks petriskålen på is for at køle den ned og hærde agarosen.
      BEMÆRK: Den måde, hvorpå blokkene i bugspytkirtlen er fanget i agarose, bestemmer den måde, de skæres under udskæring. Erfarne eksperimentelle kan forsøge at finjustere blokkenes position i løbet af de få øjeblikke, før agarosen hærder, når den placeres på is.
    11. Når agarosen med vævsblokkene er hærdet, vendes petriskålen på hovedet på en flad glat overflade, f.eks. låget på et 100 mm petriskål, og agarosen fjernes ved forsigtigt at skære med den ene halvdel af et barberblad i kanten mellem petriskålens sidevæg og agarosen. Skær individuelle agaroseterninger, der hver indeholder en vævsblok, med et barberblad, og pas på, at hver vævsblok er omgivet af agarose. Lim agaroseblokkene på prøvepladen af vibratomet med cyanoacrylatlim (figur 3B).

Figure 2
Figur 2: Injektion af agarose i den fælles galdegang. (A) Åbn bughulen, og udsæt organerne i bughulen. (B) Den forstørrede del af området, der er omgivet af rektanglet i panel A. Den hvide plet på tolvfingertarmen (angivet med pilen) angiver Vaters ampulla. Øer i Langerhans er betegnet med pilespidser. (C) Klem Vaters ampulla med en buet hæmostat, og hæv den lidt for at udsætte og forsigtigt strække den fælles galdekanal (pil). (D) Kannulering af den fælles galdekanal og injektion af 1,9% agaroseopløsning ved hjælp af en 5 ml sprøjte og en 30 G nål. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Udskæring
    1. Fyld vibratomens skærekammer med ~0,15 L iskold ECS, og boble konstant med carbogen. Omgiv skærekammeret med is, og tilsæt 2 isterninger (~ 10 ml hver) lavet af ECS med 6 mM glukose i skærekammeret. Monter barberbladet til skæring på vibratomen, og skru prøvepladen med agaroseblokke på plads.
    2. Skærmaskinen til at skære agaroseblokke ved 0,05 til 1 mm/s og 70 Hz i 140 μm tykke skiver med et overfladeareal på 20-100 mm2. Følg producentens anvisninger for udsnitsindstillinger.
    3. Umiddelbart efter hvert skæretrin sættes snitteren på pause, opsamles forsigtigt skiverne med en fin pensel, og overføres dem til en 100 mm petriskål fyldt med 40 ml HEPES-buffer med 6 mM glukose ved stuetemperatur (figur 3C).
      BEMÆRK: Skiverne kan opbevares i HEPES-buffer ved stuetemperatur i mindst 12 timer, og bufferen skal udskiftes hver 2. time.

Figure 3
Figur 3: Forberedelse og udskæring af bugspytkirtelvæv. (A) Den ekstraherede musespytkirtel efter injektion af agarose. Hvidt væv til venstre indikerer en godt injiceret del (duodenal del), mens den mere rødlige del til højre viser den utilstrækkeligt injicerede del af bugspytkirtlen (miltdelen). (B) Vibratom udskæring af to blokke af bugspytkirtelvæv indlejret i agarose. (C) Akut bugspytkirtelvævsskive med øer af Langerhans angivet med pilespidser. Skalabjælke = 3000 μm. (D) Akut bugspytkirtelvævsskive under lysmikroskopet med øen Langerhans angivet med en pilespids, stjerne angiver en bugspytkirtelkanal. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Levende/død assay ved hjælp af LIVE/DEAD levedygtigheds-/cytotoksicitetssæt til pattedyrceller

BEMÆRK: For nogle eksperimenter er det nyttigt at kontrollere levedygtigheden af celler i skiverne (figur 4) ved hjælp af levende / død assay som følger.

  1. Følg producentens anvisninger for at optø hætteglas med reagenser fra LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, og forbered arbejdsløsninger af calcein AM lige før brug. Brug løsningerne inden for en dag.
  2. I et 15 ml centrifugerør blandes 5 μL 4 mM calcein AM (komponent A), 20 μL 2 mM ethidium homodimer-1 (EthD-1, komponent B) og 10 ml Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (D-PBS) for at fremstille en arbejdsløsning indeholdende ca. 2 μM calcein AM og 4 μM EthD-1. Vortex grundigt.
  3. Brug en fin pensel til forsigtigt at overføre vævsskiverne til en 3 ml petriskål med frisk HEPES-buffer for at fortynde serumesteraseaktiviteten. HEPES-bufferen fjernes, og skiverne dækkes med 100-200 μL (eller om nødvendigt mere) af arbejdsløsningen fra trin 2.2.
  4. Inkuber skiverne i 30-45 min ved stuetemperatur i en lukket petriskål. Afbild vævsskiverne ved hjælp af excitations- / emissionsfiltre som anbefalet af producenten.

3. Calciumfarvestofbelastning

BEMÆRK: Fluorescerende farvestoffer skal beskyttes mod lyseksponering under hele processen med fremstilling og indlæsning af farvestoffet samt under håndtering af de farvede vævsskiver. Stanniol kan bruges til at dække rør eller petriskåle, der indeholder calciumfarvestoffet.

  1. Farvestof forberedelse
    1. Indholdet af et hætteglas (50 μg) af det cellegennemtrængelige Ca2+- indikatorfarvestof opløses (excitering/emission 495/523 nm; se materialetabellen), 7,5 μL dimethylsulfoxid (DMSO) og 2,5 μL polaxamer (20% opløsning i DMSO; Tabel over materialer) i 6,667 ml HBS indeholdende 6 mM glucose i et 15 ml skruelågrør.
      BEMÆRK: Denne endelige opløsning indeholder 6 μM af Ca2+ indikatorfarvestoffet, 0,11% DMSO og 0,037% polaxamer.
    2. Aspirere og udvise opløsningen i skruelågrøret gentagne gange med en pipette i 20 s; nedsænk røret i et ultralydsbadkammer i 30 s og hvirvel i 30 s for at forbedre opløseligheden. Aliquot 3.333 ml af den endelige Ca2+ indikatorfarveopløsning fremstillet i trin 3.1.1 til 5 ml petriskåle.
  2. Farvebelastning
    1. Overfør de tilberedte vævsskiver fra 60 ml petriskålen med HBS til 5 ml petriskåle fyldt med farvestofopløsningen ved forsigtigt at løfte hver vævsskive ved hjælp af en tynd, blød pensel og læg den i farvestofopløsningen. Inkuber op til 10 vævsskiver pr. Petriskål.
    2. Anbring den skivebelastede petriskål på en orbitalryster ved stuetemperatur indstillet til orbital bevægelse ved 40 omdrejninger i minuttet i 50 min. Skiverne i farvestofopløsningen, der udsættes for omgivende luft ved stuetemperatur, men afskærmes mod lys ved at dække petriskålen med stanniol.
  3. Opbevaring af skiver
    1. Overfør de farvede vævsskiver fra 5 ml petriskålen til en 60 ml petriskål fyldt med farvestoffri HBS ved forsigtigt at løfte dem ved hjælp af en fin, blød pensel. Opbevar op til 20 skiver pr. Petriskål.
      BEMÆRK: Brug vævsskiverne til billeddannelse på dette tidspunkt. Vævsskiverne bevarer Ca2+ indikatorfarvestoffet i flere timer. Overlevelsen af skiver og tilbageholdelse af farvestoffet kan forbedres ved at placere petriskålen i en isoleret beholder omgivet af is. Dette er især vigtigt, hvis de farvestofbelastede skiver skal transporteres. Derudover skal du udskifte HBS hver 2. time.

4. Calcium billeddannelse

  1. Opsætning af konfokalmikroskopet
    1. Vælg en passende objektiv forstørrelse afhængigt af undersøgelsens interesse. Vælg 20x og 25x (numerisk blænde [NA] 0,77-1,00) for at visualisere en hel ø, flere acini samtidigt eller større kanaler. Vælg højere forstørrelser for at studere intracellulær dynamik.
    2. Vælg anskaffelsestilstand for timelapse-billeddannelse (f.eks. timelapse, xyt eller lignende tilstand). Indstil pinhole til 100-200 μm.
    3. Indstil lysstien for grønne fluorophorer: excitation ved 488 nm og opsamling af emission ved 500-700 nm. Vælg fortrinsvis detektorer med en høj kvanteeffektivitet (f.eks. Galliumarsenidphosphid) frem for fotomultiplierdetektorer.
  2. Opsætning af optagekammeret og perifusionssystemet
    1. Optagekammeret monteres på mikroskopets temperaturstyrede trin og perifusionssystemet (enten tyngdekraftsfodret eller peristaltisk pumpebaseret opsætning, volumen 1 ml). Indløbet og udløbet placeres på optagekammerets yderste kanter for at undgå, at perfusatet bugter sig i kammeret, og indstrømningen og udstrømningen indstilles til lige store værdier (1-2 ml/min). Undgå drifting af den flydende meniskhøjde og dråber i perifusatet.
    2. Temperaturreguleringen af perifusionssystemet indstilles til 37 °C.Initier perifusionen med den ikke-stimulerende opløsning, og forbered de stimulerende opløsninger. Skift løsningerne via motoriserede ventiler eller ved manuelt at skifte de løsninger, der fodrer perifusionssystemet.
  3. Optag calciumdynamik
    1. Overfør en enkelt vævsskive til optagekammeret. Immobiliser vævsskiven med en U-formet platinvægt med stramt nylonnet (f.eks. Fra nylonstrømper). Undgå at placere nylontråde over strukturen af interesse.
    2. Find en ø / acinus / kanal ved hjælp af brightfield-indstillingen. Kør live billeddannelse for at placere de studerede strukturer i synsfeltet, og indstil billedparametrene. Optimer signal-støj-forholdet ved at justere lasereffekten, detektorforstærkningen og linjegennemsnit / binning for at muliggøre visualisering af cellerne, samtidig med at lasereffekten holdes minimal.
    3. Optagelsens brændplan justeres til ~15 μm under skærefladen (figur 5) for at undgå optagelse fra potentielt beskadigede celler på skærefladen.
    4. Indskaf billeder. Indstil samplingfrekvensen til 1-2 Hz for at detektere individuelle svingninger i første omgang, og brug en resonansscanner, der er i stand til hurtig linjegennemsnit (8-20) ved en højere anskaffelseshastighed (>10 Hz) til at registrere intracellulær Ca2+ ([Ca2+]IC) aktivitet. Tillad et interval (f.eks. 30 % af den samlede prøvetagningstid) mellem på hinanden følgende punktbelysninger for at forhindre fototoksicitet. Optag et billede i høj opløsning (f.eks. 1024 x 1024 pixel, linjegennemsnit > 50) før tidsserieanskaffelsen (se afsnit 5).
      BEMÆRK: Samplingfrekvensen på 1-2 Hz er under Nyquist-kriteriet for anskaffelsesfrekvens for de fleste celler, og signalets form vil som standard blive undersamplet.
    5. Se et online diagram, hvis det er tilgængeligt i billedbehandlingssoftwaren, for at få øjeblikkelig feedback om forberedelsesresponsen, overbelysning, fotobleaching og mekanisk drift. I tilfælde af en høj blegningshastighed under erhvervelsen skal du stoppe optagelsen og reducere lasereffekten, mens du øger detektorforstærkningen for at opretholde signal-støj-forholdet. I tilfælde af mekanisk drift kontrolleres for spændinger mellem slanger/kabler og mikroskopstadiet samt væskelækage eller ændringer af lydstyrken i optagekammeret. Forsøg eventuelt at korrigere driften under erhvervelse manuelt; Bemærk dog, at dette i sagens natur vil give begrænsede resultater.
      BEMÆRK: Endokrine celler er meget heterogene ved nær tærskelkoncentrationer. En tilstrækkelig længde af stimulering er nødvendig for at detektere rækkevidden af aktiverings- / deaktiveringsforsinkelser i individuelle celler. Dette er især vigtigt for nøjagtig påvisning af off-response efter meget stimulerende protokoller.
    6. Brug calciumbilleddannelse til funktionelt at skelne mellem endo- og eksokrine celler (figur 6). For at registrere forbigående aktivitet under aktivering og deaktivering skal du anvende stimuli uden at stoppe optagelsen.
    7. Gem dataene efter afslutningen af eksperimentet (overvej at bruge en automatisk gem-funktion). Tillad en afkølingsperiode, før du slukker for laserstrømmen for ikke at beskadige laserne under nedlukningsproceduren.

5. Analyse af data

  1. Undersøg optagelsen visuelt kvalitativt ved at afspille timelapse-videoen igen. Kontroller, om der driver celler fra synsfeltet eller det optiske plan. Hvis der er sket en drift inden for det optiske plan, skal du anvende drivkorrektionspluginet i ImageJ.
  2. Vælg regioner af interesse (RI'er) ved hjælp af mikroskopsoftware eller tredjepartssoftware. Brug billedet i høj opløsning, den maksimale projektion eller rammegennemsnittet som reference til at vælge RIE'er. Afspil timelapse-billeddannelsen igen for at visualisere reagerende celler, der ikke er synlige i referencebilleder. Placer ROI'erne således, at det valgte område af et investeringsafkast ikke overlapper med naboceller for at undgå signalkrydstale mellem ROI'er.
  3. Eksportér tidsseriedataene som gennemsnitsværdi for investeringsafkast pr. ramme. Eksport roi koordinater.
  4. Tidsseriedataene for blegning korrigeres (figur 7A) ved at anvende en kombination af en eksponentiel og lineær tilpasning som beskrevet ved
    Equation 1(1)
    hvor x(t) betegner fluorescenssignalet på et tidspunkt t xcorr(t) det korrigerede signal på de tilsvarende tidspunkter og a, b og c parametrene for tilpasningen beregnet som den mindste sum af kvadrater mellem corr(t) og x(t).
  5. Analyser aktiverings- og deaktiveringsfasen af responset (figur 7B). Beregn det første derivat af tidsseriedataene, og bestem zenith og nadir af derivatet svarende til henholdsvis aktivering og deaktivering. Alternativt kan du manuelt vælge starten af den fasiske stigning. Gem og eksporter aktiverings-/deaktiveringstiderne og de tilsvarende cellekoordinater.
  6. Analyser plateaufasen (figur 7C). Registrer individuelle svingninger ved at begrænse rådata eller ved at begrænse det første derivat af tidsseriedataene. Definer begyndelsen og slutningen af en individuel svingning som den tid, der svarer til svingningens halve amplitude.
    1. Beregn varigheden og hyppigheden af individuelle svingninger for hver celle. Beregn den inverse værdi af interspike-intervallet (egnet til regelmæssige aktivitetsmønstre). Alternativt kan du dividere antallet af svingninger med postens tidsinterval (egnet til uregelmæssige aktivitetsmønstre).
    2. Beregn den aktive tid. Udtryk den aktive tid som summen af varigheder, og divider denne værdi med tidsintervallet. Alternativt multipliceres frekvensen og varigheden, der svarer til en svingning.
      BEMÆRK: Opdeling af summen af varigheder med tidsintervallet giver robuste resultater, men har lav statistisk diskrimination, da der opnås et enkelt datapunkt pr. Celle. Multiplikation af frekvensen og varigheden af en svingning tilvejebringer en svingning-til-oscillation temporal opløsning.

Representative Results

Injektionen af agaroseopløsningen i bugspytkirtelkanalen er det mest kritiske trin i bugspytkirtelvævsskiveforberedelse. En vellykket injektion kan genkendes ved en blegning af bugspytkirtelvævet, som det ses på venstre side af figur 3A, mens en ufuldstændigt injiceret del af bugspytkirtlen er præsenteret på højre side af figur 3A. Øerne i Langerhans kan genkendes med det blotte øje eller under et stereomikroskop, og dette hjælper med at skære de relevante dele af bugspytkirtlen til efterfølgende indlejring i agaroseblokke (figur 3B). I en friskskåret skive af musespytkirtelvæv kan holme af Langerhans let skelnes fra det omgivende eksokrine væv og mesenchym som hvide pletter under stereomikroskopet (figur 3C) eller som brunlige strukturer under lysmikroskopet (figur 3D). Bugspytkirtelvævsskiverne kan bruges til forskellige typer eksperimenter i mindst 12 timer efter udskæring. Ud over den bruttomorfologiske vurdering under stereomikroskopet, lysmikroskopet og cellernes funktionelle reaktioner under calciumbilleddannelse kan levedygtigheden af bugspytkirtelvævsskiverne vurderes (figur 4).

Figure 4
Figur 4: Levedygtighed af celler i vævsskiven. Levedygtigheden af celler blev bestemt med Live / Dead-analysen. Levende celler farves af Calcein AM (vist i grønt), mens døde celler er farvet med ethidium homodimer-1 (vist med rødt). Gule linjer angiver placeringen af X-Y-tværsnittet af Z-stakken, der vises nederst og til højre. Den fulde dybde af Z-stakken er 88 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Til calciumbilleddannelsesforsøg skal den fluorescerende calciumindikator trænge gennem et par lag celler. Figur 5A viser vellykket indlæsning af det cellegennemtrængelige Ca2+ indikatorfarvestof i bugspytkirtelvævsskiven, hvor individuelle ø- og acinarceller kan genkendes. I modsætning hertil er skiver i figur 5B-D ikke optimale på grund af mislykket penetration af farvestoffet (figur 5B), mangel på øceller (figur 5C) og meget nekrotisk væv på overfladen (figur 5D). Sådanne skiver kan kasseres, kontrolleres for tilstedeværelsen af yderligere holme, der er skåret eller farvet bedre (se tabel 1 for fejlfinding) eller bruges til registrering af eksokrine cellers reaktioner.

Figure 5
Figur 5: Eksempler på brugbare og ubrugelige præparater. (A) Et eksempel på en vellykket forberedelse af bugspytkirtelvævsskiven med velfarvede celler i øerne Langerhans samt duktale celler og omgivende acinarvæv. (B) Et eksempel på en dårligt farvet vævsskive. (C) Eksempel på en ø Langerhans med strukturelle afbrydelser. (D) Et eksempel på en ø Langerhans, der indeholder mange døde celler og meget affald. Opslagstabellen "glow-over, glow-under" til højre viser 0 intensitet i grønt og mætning i blåt. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Repræsentative resultater fra calciumbilleddannelse ved hjælp af det cellegennemtrængelige Ca2+ indikatorfarvestof er vist i figur 6. I figur 6A præsenteres et billede i høj opløsning af en bugspytkirtelvævsskive, der indeholder en ø af Langerhans, acinarvæv og en bugspytkirtelkanal. For bedre sondring er den endokrine, eksokrine og duktale del af bugspytkirtelvævsskiven, der er vist i figur 6A , farvet i figur 6B. Brug af passende stimuli kan funktionelt skelne mellem forskellige øceller eller ø- og ikke-øceller51. Betaceller vil typisk reagere på en kvadratpulsstimulering af glukose med en forbigående stigning i [Ca2+] IC efterfulgt af hurtige calciumoscillationer på et vedvarende plateau (figur 6C, øverste panel).

Da alle betaceller er koblet til et enkelt, stort, funktionelt syncytium, synkroniseres disse svingninger også meget godt mellem forskellige celler ved at sprede [Ca2+]IC-bølger 32,34,52,53,54 (figur 7C). Langsommere [Ca2+]IC-svingninger med en periode på 5-15 minutter kan ligge til grund for de hurtige svingninger eller endda være den dominerende type reponse55,56. Den samme enkle protokol kan afsløre andre typer svar, især i periferien af holme (figur 6C, nederste panel). Da disse celler ikke synkroniseres med betaceller og reagerer med hurtigere og mere uregelmæssige svingninger, der allerede er til stede under lave glukoseforhold eller med et fald i aktivitet, er sådanne reaktioner stærkt suggestive for ikke-beta-celler 21,32,57,58. Imidlertid kræver deres endelige funktionelle karakterisering mere komplekse protokoller med yderligere stimuleringstrin eller alternative tilgange, som diskuteres nedenfor. Typiske reaktioner fra acinar- og duktale celler er vist i henholdsvis figur 6D og figur 6E. Se litteraturen for flere detaljer om acinar- og duktale celler 22,23,35.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative resultater af calciumdynamik i forskellige typer bugspytkirtelceller. (A) Et billede i høj opløsning af en ø langerhans med omgivende væv. Skalabjælke = 100 μm. (B) Afgrænsning af forskellige dele af bugspytkirtelvæv med acinarvæv vist med gult, en ø langerhans vist med rødt og et segment af duktaltræet i blåt. Skalabjælke = 100 μm. (C) Typiske spor af calciumdynamik i beta- og formodede ikke-beta-celler under stimulering med 12 mM glucose; 3 mM glucose blev anvendt til ikke-stimulerende forhold. Protokoller, der kan bruges til mere specifik diskrimination af ikke-beta-celler, er beskrevet i diskussionsafsnittet. (D) Et typisk spor af calciumdynamik af acinarceller stimuleret af 25 nM acetylcholin. (E) Et typisk spor af calciumdynamik i duktale celler stimuleret af 1 mM chenodeoxycholsyre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Efter vellykket calciumbilleddannelse eksporteres dataene først og korrigeres til blegning ved en kombination af en eksponentiel og lineær pasform, som beskrevet i protokolafsnittet. En tidsserie før og efter blegningskorrektion er vist i figur 7A. Derefter kan flere parametre i aktiverings- og deaktiveringsfasen af responset samt plateaufasen analyseres. En forsinkelse i begyndelsen af [Ca2+] IC-stigning efter stimulering kan måles som repræsenteret ved forsinkelseA i figur 7B og heterogeniteten i forsinkelser blandt individuelle celler (forsinkelseA1). De samme parametre (forsinkelseD og forsinkelseD1) kan bruges til at beskrive deaktiveringsfasen. Efter den indledende transiente [Ca2+]IC-stigning er plateaufasen i de fleste pancreas betaceller på en ø karakteriseret ved relativt regelmæssige højfrekvente [Ca2+]IC-svingninger. Plateaufasen kan beskrives ved at analysere de klassiske funktionelle parametre. Den skematiske præsentation af [Ca2+]IC oscillationer varighed, frekvens og procentdel af aktiv tid er vist i figur 7C. I calciumbilleddannelse med erhvervelseshastigheder højere end 10 Hz kan calciumbølger, der gentagne gange spredes over øen, også genkendes tydeligt (figur 7C).

Figure 7
Figur 7: Analyse af tidsseriedata. (A) Korrektion af tidsseriedata til fotobleaching. (B) Analyse af forsinkelser i aktivering efter stimulering og deaktivering efter ophør af stimulering med 12 mM glucose. Stimuleringens varighed er angivet med den lysegrå, skraverede bjælke i billedet. (C) Analyse af flere parametre i plateaufasen: I) Svingningens varighed bestemt i halv højde, II) oscillationsfrekvens bestemt ved inter-oscillationsintervaller. III) aktiv tid som et produkt af frekvens og varighed af svingninger. I-IV) Forsinkelser mellem svingninger i en given bølge af svingninger, der spredes over øen Langerhans bestemt af forsinkelserne (Δt) i det tidspunkt, hvor en enkelt celle når halv højde af svingningen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Bugspytkirtelvævsskivemetoden er en hurtig eksperimentel metode til at studere morfologien og fysiologien af de endokrine og eksokrine dele af bugspytkirtlen i et mere konserveret in situ-præparat. Mange af fordelene er allerede blevet påpeget i indledningen. Det er værd at påpege, at skivemetoden til undersøgelse af bugspytkirtelfysiologi generelt (dvs. ikke kun til calciumbilleddannelse) sparer tid, fordi den ikke involverer en genopretningsperiode efter isolering. Sidstnævnte er ikke absolut nødvendigt med alle typer forsøg og anvendelser af isolerede holme fra forskellige arter, men anvendes typisk til at øge renheden, genoprette levedygtighed og funktionalitet og undertiden til at indsamle holme fra flere donorer 59,60,61,62,63,64 . I forbindelse med calciumbilleddannelse har betacelleresponser imidlertid vist sig at afhænge af kulturens varighed og betingelser, og dette er en vigtig kilde til variation, der bør tages i betragtning ved anvendelse af isolerede holme15,65. Det samme problem bør overvejes for vævsskiver, hvis deres langsigtede kultur bliver en udbredt mulighed i fremtiden22,36. Vævsskivemetoden har også et højt udbytte og reducerer dermed potentielt dyrs lidelser og øger statistisk effekt. Desuden kan der fremstilles så mange skiver fra et enkelt dyr, og fordi skiverne overlever i lange perioder, bliver det muligt at inkludere det samme dyr eller endda den samme ø i både forsøgs- og kontrolgrupperne.

Da den oprindelige arkitektur og celle-til-celle-kommunikation er bevaret, og fordi den er kompatibel med en række strukturelle analyser, elektrofysiologiske, billeddannelsesmetoder og hormonsekretionsassays, er denne metode især nyttig til at studere bugspytkirtelfunktioner, der afhænger af uforstyrrede interaktioner mellem individuelle celler, fx følsomhed over for sekretagoger, parakrine og immuninteraktioner mellem forskellige celletyper, mønstre af elektrisk aktivitet, egenskaber af calciumdynamik og udskillelse af forskellige hormoner. Specielt til calciumbilleddannelse er de vigtigste fordele ved at bruge skiver eksponeringen af økernen og muligheden for at erhverve signaler fra mange forskellige celletyper med høj opløsning. Afhængigt af forsøgets krav og dyrenes alder kan tykkelsen varieres, skiverne kan transficeret eller opnås fra dyr med genetisk kodede journalister. Som forklaret mere detaljeret nedenfor muliggør de to sidstnævnte tilgange også specifik funktionel identifikation og karakterisering af reaktioner fra ikke-betaceller 31,66. Desuden kan øer fra veldefinerede dele af organet undersøges for forskelle i lydhørhed eller modtagelighed for sygdom. Selvom de ikke kræver en genopretning inkubationsperiode, kan de let inkuberes med forskellige farmakologiske midler, fedtsyrer, høj glucose og cytokiner.

Vigtigst af alt, da høj opløsning kan opnås i kombination med enkeltcellet eller endda subcellulær opløsning, er konfokal calciumbilleddannelse i skiver en af de mest egnede metoder til analyse af calciumbølger, funktionel forbindelse og de forskellige funktionelle roller af celler i forskellige dele af en ø54,67. På trods af en række fordele har vævsskivemetoden vigtige begrænsninger. For det første er det stadig i det mindste delvist forstyrrende for holmens og eksokrine arkitektur, især ved skærefladen, og forholdsregler, såsom lav temperatur, hyppig udveksling af opløsninger og skånsom og hurtig manipulation, er nødvendige under forberedelsen for at forhindre yderligere mekanisk og endogen enzymatisk skade. For det andet er mønstrene for næringsstof- og sekretagogilevering stadig ringere end in vivo-ruten, præparatet er løsrevet fra systemisk innervering, og interorganfeedback, såsom mellem øen og dens målvæv, er umulig i modsætning til in vivo-tilgange. For det tredje er maksimal skivetykkelse begrænset af iltning, næringsstoftilførsel og pH-regulering ved ~ 200 μm9. Desuden kræver både forberedelse af skiver og billeddannelse meget træning, og dybdegående analyser af calciumdata fra lange tidsserier og fra mange celler kræver specialiseret viden, der ofte ikke er inkluderet i en klassisk fysiologs værktøjskasse og kræver hjælp fra fysikere eller dataforskere. Fordelen ved, at homo- og heterotypiske interaktioner bevares, kan også komplicere analysen af prøver på grund af tilstedeværelsen af signaler fra andre celler i områder af interesse. Afhængigt af protokoller kan aktivering af andre celler føre til indirekte yderligere stimulering eller hæmning af en observeret celle.

Dette kan kun løses endeligt ved hjælp af dekonvolutionsmetoder, ved mere komplekse stimuleringsprotokoller, herunder stoffer, der blokerer nogle af de indirekte virkninger, ved hjælp af specifikke knock-out-dyr og ved omhyggelig sammenligning af resultater med resultater fra andre undersøgelser, der anvender mere reduktionistiske metoder. Derudover, hvis sekretionsmålinger er nødvendige, skal det huskes, at nogle skiver kan mangle holme, og den samlede masse af endokrint væv i en enkelt skive er typisk lav. Forberedelsen af akutte bugspytkirtelvævsskiver til billeddannelse involverer flere kritiske trin, der diskuteres i de følgende afsnit og opsummeres i tabel 1, hvor læseren også kan finde korte, men vigtige tip til fejlfinding. For det første skal agarosepulveret opløses fuldstændigt, når agaroseopløsningen fremstilles, ellers kan de uopløste partikler blokere injektionen. Den homogene agaroseopløsning opbevares ved 37-45 °C for at forhindre hærdning af agarose på grund af for lav temperatur på den ene side og for at forhindre vævsskade på grund af for høje temperaturer på den anden side. Efter brug kan den resterende agarose opbevares ved 4 °C og genopvarmes, selv om gentagen genopvarmning kan resultere i øget tæthed på grund af vandfordampning, hvilket i sidste ende gør injektionen vanskelig eller umulig.

Det næste kritiske trin i forberedelsen er at fastspænde den store duodenale papilla korrekt. En hvid plet på tolvfingertarmen angiver krydset mellem den fælles galdekanal og tolvfingertarmen. En klemme placeret for proximalt vil resultere i obstruktion af nogle laterale bugspytkirtelgrene i den fælles kanal, hvilket deaktiverer injektionen af disse dele, mens en klemme placeret for distalt vil resultere i, at agarose lækker gennem den nedre modstandsvej direkte ind i tolvfingertarmen. Før kannulering af den fælles galdekanal kan det omgivende fedtvæv fjernes omhyggeligt for bedre visualisering af kanalen og større kontrol under injektion. Utilstrækkelig præcision under fjernelse af det omgivende væv kan resultere i perforering af kanalen. Valget af nålediameteren, der anvendes til agaroseinjektion, er også vigtigt. Hos mus anvendes fortrinsvis en 30 G nål; mindre (32 eller 33 G) nåle kræver mere indsats på grund af høj viskositet af agaroseopløsningen og er mere tilbøjelige til obstruktion. Men hvis de anvendes i kombination med en agaroseopløsning med lavere densitet, kan de være meget nyttige i mindre musestammer og yngre dyr. I løbet af de første postnatale dage kan agarose alternativt injiceres subkapsulært snarere end intradukt2. Brug af nåle med større diameter hos mus vil sandsynligvis resultere i beskadigelse af den fælles galdegang. Dette kan også ske med den korrekte nålediameter, og en tang kan hjælpe med at holde nålen på plads under injektionen. Nåle med større diameter kan være den eneste løsning i tilfælde af større kanaler, som findes hos rotter. Hvis nålen er for smal til at sikre en tæt tætning, der forhindrer tilbagelækage, kan der placeres en ligatur omkring den ved vellykket indtræden i kanalen.

Agaroseinjektion kræver en vis indsats på grund af opløsningens viskositet, og når injektionsprocessen er startet, bør den ikke afbrydes, da agaroseopløsningen med lavt smeltepunkt kan størkne i nålen eller de største dele af duktaltræet, før injektionen er afsluttet. Dette vil resultere i dårlig vævsindtrængning og dårligere støtte under skæring. Kanalen skal altid kannuleres på det punkt, hvor den venstre leverkanal og den cystiske kanal sammenføjes for at danne den fælles galdekanal. Hvis den fælles galdekanal bliver perforeret, skal du gentagne gange prøve at cannulating tættere på tolvfingertarmen. Når bugspytkirtlen er tilstrækkeligt stabiliseret med agaroseopløsning og ekstraheret fra peritonealhulen, skæres små stykker godt injiceret væv. Før du indlejrer dem i agarosen, er det afgørende at fjerne alt fedt- og bindevæv, da deres rester gør udskæring mere udfordrende. Det samme gælder for blodkar og kanalrester, undtagen når de er fokus for eksperimentet. I dette tilfælde skal du sørge for at placere dem på en sådan måde, at det ønskede tværsnit opnås. Når vævet indlejres i agarose, skal du sikre dig, at temperaturen er passende (37 °C), og at vævet er helt omgivet af agarose, da kræfter under vibratomskæring kan rive bugspytkirtelvævet ud af agaroseblokkene.

Hurtig tørring af vævsblokkene, før de placeres i agarose ved at placere dem kort på et papirservietter, kan hjælpe med at forhindre dårlig kontakt mellem væv og agarose under dette trin. Under størkning af agaroseblokke skal du placere petriskålen vandret og forhindre kontakt mellem bugspytkirtelvævet og bunden af petriskålen. Hvis bugspytkirtlen ikke injiceres fuldt ud, vil skæreprocessen være udfordrende. Prøv derfor at reducere skærehastigheden for at opnå vævsskiver. For at minimere celleskader under vibratomskæring skal du udskifte ECS (og isterningerne lavet af ECS) i skærekammeret regelmæssigt. Sidstnævnte vil reducere aktiviteten af bugspytkirtlenzymer frigivet fra acinarvæv under udskæring. Tykkelsen af skiverne er også af afgørende betydning. Til calciumdynamik og elektrofysiologiske eksperimenter skæres normalt 140 μm skiver; Ifølge undersøgelsens formål kan skivetykkelsen imidlertid variere fra 90 μm til 200 μm. Husk, at diffusionen af ilt og næringsstoffer i tykkere skiver vil være begrænset, men de vil omfatte mere væv. Derudover kan andelen af uskårne holme forventes at stige med stigende skivetykkelse. Skiver kan opbevares i en regelmæssigt udvekslet ECS ved stuetemperatur i flere timer eller endda dyrkes i et passende cellemedium i flere dage; dette kan dog i sidste ende påvirke den normale øcellefysiologi 3,22.

Når du forbereder farvestofopløsningen, skal du sikre omhyggelig blanding af alle komponenter og undgå udsættelse for omgivende lys. Bugspytkirtelskiven består af mange cellelag, og optagelsen af calciumfarvestof er begrænset til de første par mest overfladiske cellelag, som tidligere beskrevet for isolerede holme58,68 og hypofyseskiver69. I modsætning til isolerede øer, hvor den omgivende kapsel og ydre cellelag forhindrer farvestoffets indtrængning i dybere lag, giver vævsskiver adgang til hele øens tværsnitsoverflade, hvilket muliggør samtidig måling af calciumdynamik i hundredvis af celler fra alle lag af en ø. Fluorescerende Ca2+ indikatorer er de mest anvendte til måling af calciumdynamik, og sammen med CLSM muliggør de optagelser med høj tidsmæssig opløsning, der når flere hundrede Hertz. Når du vælger den mest passende fluorescerende Ca2+ indikator, skal du overveje forskellige faktorer, herunder indikatorformen, som påvirker cellebelastningsmetoden, måletilstanden (kvalitativ eller kvantitativ) og dissociationskonstant (Kd), der skal være i Ca2+ koncentrationsområdet af interesse og afhænger af pH, temperatur, tilstedeværelse af Mg2+ og andre ioner, samt proteinbinding. Da cellulære Ca2+ signaler normalt er forbigående, bør Ca2+ bindingshastighedskonstanten også overvejes. Til måling af [Ca2+]IC-dynamik i bugspytkirtelceller bruger denne gruppe hovedsageligt det cellegennemtrængelige Ca2+ indikatorfarvestof beskrevet i denne protokol (Materialetabel), da det er en lang bølgelængdeindikator med emissionsbølgelængderne i spektret, hvor cellulær autofluorescens normalt er mindre problematisk, og energien i excitationslys er lav, hvilket reducerer potentialet for cellulær fotoskade. Fordi dette farvestof er fluorescerende ved lave Ca2+ koncentrationer, letter dette bestemmelsen af baseline [Ca2+] IC og øger cellulær synlighed før stimulering. Efter binding ca2+ øges farvestoffets fluorescensintensitet 14 gange, hvilket muliggør detektion af selv små ændringer i [Ca2+] IC.

For vellykket live-celle calciumbilleddannelse skal flere vigtige hardwareparametre overvejes, som beskrevet i protokolafsnittet. Til levende cellebilleddannelse, hvor signalamplituder er lave, og chancerne for fototoksicitet er høje, bruges mål med en højere NA fortrinsvis til at indsamle mere lys fra prøven. Hvis calciumdynamik skal registreres med en høj tidsmæssig opløsning, skal du bruge resonansscanneren i stedet for lineære galvanometre. Udover at vælge det rigtige mål undgår brugen af meget følsomme detektorer - såsom hybriddetektorer, der kræver mindre laserkraft - fototoksicitet og fotobleaching. Dette er af særlig betydning for langvarig calciumbilleddannelse. Andre vigtige trin i calciumbilleddannelse er parameterindstillinger for billedkvalitet til tidsserieopkøb. Det vigtigste er den tidsmæssige og den rumlige opløsning. Da calciumdynamikken i sig selv bestemmer den laveste acceptable tidsmæssige opløsning, skal samplingshastigheden være mindst to gange højere end den forventede signalfrekvens for at detektere signalet eller endda 10 gange højere for at detektere signalets form pålideligt. I akutte skiver af bugspytkirtelvæv kan calciumdynamik måles i hundredvis af celler samtidigt, og derfor er den rumlige opløsning også vigtig. Dette kan forbedres ved at øge antallet af pixels eller ved at øge linjegennemsnittet under live erhvervelse. På grund af det omvendte forhold mellem den rumlige og den tidsmæssige opløsning er der imidlertid behov for en afvejning mellem begge indstillinger.

Hvis calciumbilleddannelse skal udføres i en bestemt cellepopulation i bugspytkirtlen, er det nødvendigt med en stimulus, der er i stand til funktionelt at differentiere cellerne i skiven. Høj glukose aktiverer pålideligt og hurtigt betaceller til et oscillerende mønster, der er overlejret på et forhøjet calciumniveau og er stærkt synkroniseret blandt alle celler inden for en ø 32,58,70. Betacellerne er den mest talrige celletype på en ø og er for det meste placeret i økernen hos mus. Den samme stimuleringsprotokol falder og ændrer undertiden ikke mærkbart sprængningen i alfaceller 30,32,58,70,71,72. For at diskriminere alfaceller funktionelt kan lav (3 mM) glucose, glutamat eller adrenalin bruges til at øge deres frekvens eller basal [Ca2+] IC 21,72,73,74,75. De repræsenterer 10-20% af holmcellerne og vil blive detekteret på øens periferi1. Deltaceller findes også i periferien. De udgør kun ~ 5% af det samlede antal endokrine celler i en ø og er typisk aktive i 6 mM glukose og reagerer på glukosestimulering med en øget uregelmæssig sprængaktivitet fra basislinjen eller et let forhøjet calciumniveau 1,32,71,76. Ghrelin kan anvendes til specifik stimulering af deltaceller 21,77,78,79 i calciumbilleddannelsesforsøg. Der mangler dog stadig at blive fastlagt protokoller for specifik funktionel identifikation af PP- og epsilonceller. Endvidere aktiverer 25 nM acetylcholin pålideligt acinarceller til sprængningsaktivitet 35,80,81. Derudover kan en række andre sekretagoger, såsom cerulein, cholecystokinin og carbamylcholin, bruges til at fremkalde calciumresponser i acinarceller 22,40,82,83.

Endelig fremkalder 1 mM chenodeoxycholsyre pålideligt calciumresponser i duktale celler i vævsskiver; Angiotensin II, ATP og nogle andre sekretagoger kan også bruges 11,23,84,85. Når en funktionel identifikation baseret på karakteristiske reaktioner på specifikke sekretagoger og hæmmere ikke er tilstrækkelig, kan genetisk mærkede dyr31, transinficerede celler73 eller immuncytokemi anvendes til identifikation af forskellige celletyper 9,22,71,86 . I løbet af de sidste par år er vævsskivemetoden med succes blevet tilpasset humant væv, hvilket åbner mange nye vigtige forskningsveje inden for både eksokrin41 og endokrin fysiologi 9,36,37,39. Interessant nok har en detaljeret vurdering af calciumdynamikken i menneskelige holme været notorisk vanskelig og skal stadig undersøges nærmere87. Kombineret med avanceret konfokal mikroskopi har bugspytkirtelvævsskivemetoden muliggjort mange nye indsigter i calciumdynamikken hos mus og vil forhåbentlig gøre det samme for humant væv.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommerciel eller økonomisk interesse.

Acknowledgments

Det arbejde, der præsenteres i denne undersøgelse, blev støttet økonomisk af det slovenske forskningsagentur (forskningskernefinansieringsnr. P3-0396 og I0-0029 samt forskningsprojekter nr. J3-9289, N3-0048 og N3-0133) og af den østrigske videnskabsfond / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bilaterale tilskud I3562--B27 og I4319--B30). Vi takker Maruša Rošer, Maša Čater og Rudi Mlakar for fremragende teknisk assistance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Analytical balance KERN ALJ 120-4 KERN & SOHN GmbH ALJ 160-4A
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup Leica 5100001578
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup Leica
Cork pad 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL centrifuge tubes Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430790
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L Fischer Scientific, Leicestershire, UK 432124
Double edge razor blade Personna, USA
Dumont #5 - Fine Forceps FST, Germany 11254-20
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 0030 121.023
Erlenmeyer flask 200 mL IsoLab, Germany 027.01.100
Fine Scissors - ToughCut FST, Germany 14058-11
Flat orbital shaker  IKA KS 260 basic IKA Ident. No.: 0002980200
Glass lab bottle 1000 mL IsoLab, Germany 091.01.901
Hartman Hemostat, curved FST, Germany 13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) Leica 15507701
Measuring cylinder 25 mL IsoLab, Germany 015.01.025
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Microwave owen Gorenje, Slovenia MO20MW
Osmometer Gonotec 010 Gonotec, Berlin, Germany OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
Paint brush Faber-Castell, No.2 Any thin soft round paint brush No.2, preferably black
Paper towels
Perifusion pumps Ismatec ISM 827 Reglo Analog MS - 4/8
Petri dish 100/20 mm Sarstedt 83.3902
Petri dish 35/10 mm Greiner bio-one 627102
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA 153066 NON-STICKY for agarose blocks
pH meter inoLab pH Level 1 WTW, Weilheim, Germany E163694
Pipette 1000 mL Eppendorf 3121 000.120
Pipette 50 mL Eppendorf 3121 000.066
Push pins 23 mm Deli, Ningbo, China E0021
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Semken Forceps FST, Germany 11008-13
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask IsoLab, Germany 027.11.048
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 Nikon, Melville, NY USA
Syringe Injekt Solo 5 mL Braun, Melsungen, Germany 4606051V
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") Braun, Melsungen, Germany 4656300
Temperature controller Luigs & Neumann 200-100 500 0150, 200-150-500-145 Slice mini chamber, Temperature controller TC 07
Tubings for perifusion system Ismatec SC0310 Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
Ultrasonic bath Studio GT-7810A Globaltronics
Vibrotome Leica VT 1000 S Leica, Nussloch, Germany 14047235613
Volumetric flask 1000 mL IsoLab, Germany 013.01.910
Vortex mixer Neolab 7-2020 Neolab  7-2020
Water bath Thermo Haake open-bath circulator Thermo Fisher Scientific Z527912
Material/Reagent
Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany C5080-500G
D-(+)-glucose Sigma Aldrich, Germany G8270-1KG
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D4540-100ML
DL-lactic acid Sigma Aldrich, Germany L1250-500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Merck KGaA, Darmstadt, Germany D8662-500ML
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020
HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G
L-(+)-ascorbic acid Sigma Aldrich, Germany A9,290-2
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA L3224
Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany M2670-500G
Myo-inositol Sigma Aldrich, Germany I5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM Invitrogen (Thermo FisherScientific) O6807 cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) P3000MP polaxamer: nonionic triblock copolymer
Potassium chloride - KCl Sigma Aldrich, Germany 31248
SeaPlaque GTG agarose Lonza, Rockland, USA 50111
Sodium bicarbonate - NaHCO3 Honeywell, Germany 31437-500G
Sodium chloride - NaCl Honeywell, Germany 31434-1KG
Sodium hydroxide - NaOH Sigma Aldrich, Germany 30620
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 Sigma Aldrich, Germany S0751-500G
Sodium pyruvate Sigma Aldrich, Germany 15990-100G
Software
FIJI FIJI is an open source project
LASAF Leica microsystems, Inc.
Matlab Mathworks
Python Python Software Foundation Python is an open source project

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e1024405 (2015).
  2. Meneghel-Rozzo, T., Rozzo, A., Poppi, L., Rupnik, M. In vivo and in vitro development of mouse pancreatic ß-cells in organotypic slices. Cell and Tissue Research. 316 (3), 295-303 (2004).
  3. Rozzo, A., Meneghel-Rozzo, T., Delakorda, S. L., Yang, S. B., Rupnik, M. Exocytosis of insulin: in vivo maturation of mouse endocrine pancreas. Annals of the New York Academy of the Sciences. 1152, 53-62 (2009).
  4. Dolenšek, J., Pohorec, V., Rupnik, M. S., Stožer, A. Pancreas physiology, challenges in pancreatic pathology. IntechOpen. Seicean, A. , (2017).
  5. Williams, J. A. The nobel pancreas: a historical perspective. Gastroenterology. 144 (6), 1166-1169 (2013).
  6. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  7. Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. American Journal of Physiology. 235 (5), 517-524 (1978).
  8. Peikin, S. R., Rottman, A. J., Batzri, S., Gardner, J. D. Kinetics of amylase release by dispersed acini prepared from guinea pig pancreas. American Journal of Physiology. 235 (6), E743-E749 (1978).
  9. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  10. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 105-113 (2010).
  11. Molnar, R., et al. Mouse pancreatic ductal organoid culture as a relevant model to study exocrine pancreatic ion secretion. Laboratory Investigation. 100 (1), 84-97 (2020).
  12. Rupnik, M. The physiology of rodent beta-cells in pancreas slices. Acta Physiologica (Oxford, England). 195 (1), 123-138 (2009).
  13. Blinman, T. A., et al. Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue: cytokine upregulation via p38 MAP kinase. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 279 (6), C1993-C2003 (2000).
  14. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic ß-cells. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 446 (5), 553-558 (2003).
  15. Gilon, P., Jonas, J., Henquin, J. Culture duration and conditions affect the oscillations of cytoplasmic calcium concentration induced by glucose in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 37 (10), 1007-1014 (1994).
  16. Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55160 (2017).
  17. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (7), e255 (2007).
  18. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1125 (2009).
  19. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1343 (2009).
  20. Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4137 (2012).
  21. Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (153), (2019).
  22. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS ONE. 8 (11), e78706 (2013).
  23. Gal, E., et al. A Novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
  24. Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. KATP-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar ATP. Molecular and Cellular Endocrinology. 230 (1-2), 51-58 (2005).
  25. Speier, S., Gjinovci, A., Charollais, A., Meda, P., Rupnik, M. Cx36-mediated coupling reduces β-cell heterogeneity, confines the stimulating glucose concentration range, and affects insulin release kinetics. Diabetes. 56 (4), 1078-1086 (2007).
  26. Rose, T., Efendic, S., Rupnik, M. Ca2+-secretion coupling is impaired in diabetic Goto Kakizaki rats. The Journal of General Physiology. 129 (6), 493-508 (2007).
  27. Paulmann, N., et al. Intracellular serotonin modulates insulin secretion from pancreatic β-cells by protein serotonylation. PLoS Biology. 7 (10), e1000229 (2009).
  28. Mandic, S. A., et al. Munc18-1 and Munc18-2 proteins modulate β-cell Ca2+ sensitivity and kinetics of insulin exocytosis differently. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 28026-28040 (2011).
  29. Dolensek, J., Skelin, M., Rupnik, M. S. Calcium dependencies of regulated exocytosis in different endocrine cells. Physiological Research. 60, S29-S38 (2011).
  30. Huang, Y. C., Rupnik, M., Gaisano, H. Y. Unperturbed islet α-cell function examined in mouse pancreas tissue slices. Journal of Physiology. 589 (2), 395-408 (2011).
  31. Huang, Y. C., et al. In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion. Diabetes. 62 (2), 519-530 (2013).
  32. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (1), e54638 (2013).
  33. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), e1002923 (2013).
  34. Dolenšek, J., Stožer, A., Skelin Klemen, M., Miller, E. W., Slak Rupnik, M. The relationship between membrane potential and calcium dynamics in glucose-stimulated beta cell syncytium in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (12), e82374 (2013).
  35. Perc, M., Rupnik, M., Gosak, M., Marhl, M. Prevalence of stochasticity in experimentally observed responses of pancreatic acinar cells to acetylcholine. Chaos. 19 (3), 037113 (2009).
  36. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265-3265 (2020).
  37. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
  38. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  39. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
  40. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  41. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  42. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  43. Klemen, M., Dolenšek, J., Stožer, A., Rupnik, M. Exocytosis Methods. Thorn, P. 7, Humana Press. 127-146 (2014).
  44. Speier, S. Experimental approaches for high-resolution in vivo imaging of islet of Langerhans biology. Current Diabetes Reports. 11 (5), 420-425 (2011).
  45. Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Molecular Metabolism. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  46. Reissaus, C. A., et al. A Versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 8449 (2019).
  47. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. FASEB Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  48. Fernandez, J., Valdeolmillos, M. Synchronous glucose-dependent [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans recorded in vivo. FEBS Letters. 477 (1-2), 33-36 (2000).
  49. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metabolism. 27 (3), 630-644 (2018).
  50. Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released ATP to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
  51. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in α- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  52. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  53. Santos, R. M., et al. Widespread synchronous Ca oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 418 (4), 417-422 (1991).
  54. terk, M., et al. Assessing the origin and velocity of Ca2+ waves in three-dimensional tissue: Insights from a mathematical model and confocal imaging in mouse pancreas tissue slices. Communications in Nonlinear Science and Numerical Simulation. 93, 105495 (2021).
  55. Gosak, M., et al. Critical and supercritical spatiotemporal calcium dynamics in beta cells. Frontiers in Physiology. 8, 1106 (2017).
  56. Satin, L. S., Butler, P. C., Ha, J., Sherman, A. S. Pulsatile insulin secretion, impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Molecular Aspects in Medicine. 42, 61-77 (2015).
  57. Tengholm, A., Gylfe, E. Oscillatory control of insulin secretion. Molecular and Cellular Endocrinology. 297 (1-2), 58-72 (2009).
  58. Quesada, I., et al. Glucose induces opposite intracellular Ca2+ concentration oscillatory patterns in identified α- and β-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 55 (9), 2463-2469 (2006).
  59. Ferguson, J., Allsopp, R. H., Taylor, R. M., Johnston, I. D. Isolation and long term preservation of pancreatic islets from mouse, rat and guinea pig. Diabetologia. 12 (2), 115-121 (1976).
  60. Andersson, A. Isolated mouse pancreatic islets in culture: effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets. Diabetologia. 14 (6), 397-404 (1978).
  61. Ramirez-Dominguez, M. Isolation of mouse pancreatic islets of Langerhans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 938, 25-34 (2016).
  62. Carter, J., Dula, S., Corbin, K., Wu, R., Nunemaker, C. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11 (1), 3-31 (2009).
  63. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplantation. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  64. Zawalich, W. S., Yamazaki, H., Zawalich, K. C. Biphasic insulin secretion from freshly isolated or cultured, perifused rodent islets: comparative studies with rats and mice. Metabolism. 57 (1), 30-39 (2008).
  65. Roe, M. W., et al. Absence of effect of culture duration on glucose-activated alterations in intracellular calcium concentration in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 38, 876-877 (1995).
  66. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflügers Archive. European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  67. Dolenšek, J., et al. Glucose-dependent activation, activity, and deactivation of beta cell networks in acute mouse pancreas tissue slices. bioRxiv. , (2020).
  68. QZhang, Q., et al. Cell coupling in mouse pancreatic beta-cells measured in intact islets of Langerhans. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 366 (1880), 3503-3523 (2008).
  69. Sánchez-Cárdenas, C., Hernández-Cruz, A. GnRH-induced Ca2+-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  70. Asada, N., Shibuya, I., Iwanaga, T., Niwa, K., Kanno, T. Identification of alpha- and beta-cells in intact isolated islets of Langerhans by their characteristic cytoplasmic Ca2+ concentration dynamics and immunocytochemical staining. Diabetes. 47 (5), 751-757 (1998).
  71. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified α-, β- and δ-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (1), 85-93 (1999).
  72. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  73. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  74. Li, J., et al. Submembrane ATP and Ca2+ kinetics in α-cells: unexpected signaling for glucagon secretion. FASEB Journal. 29 (8), 3379-3388 (2015).
  75. Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by Tpc2-dependent Ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic α-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  76. Arrojo, E. D. R., et al. Structural basis for delta cell paracrine regulation in pancreatic islets. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  77. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  78. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  79. Rorsman, P., Huising, M. O. The somatostatin-secreting pancreatic δ-cell in health and disease. Nature reviews. Endocrinology. 14 (7), 404-414 (2018).
  80. Petersen, C. C., Toescu, E. C., Petersen, O. H. Different patterns of receptor-activated cytoplasmic Ca2+ oscillations in single pancreatic acinar cells: dependence on receptor type, agonist concentration and intracellular Ca2+ buffering. The EMBO journal. 10 (3), 527-533 (1991).
  81. Thorn, P., Lawrie, A. M., Smith, P. M., Gallacher, D. V., Petersen, O. H. Local and global cytosolic Ca2+ oscillations in exocrine cells evoked by agonists and inositol trisphosphate. Cell. 74 (4), 661-668 (1993).
  82. Behrendorff, N., Floetenmeyer, M., Schwiening, C., Thorn, P. Protons released during pancreatic acinar cell secretion acidify the lumen and contribute to pancreatitis in mice. Gastroenterology. 139 (5), e1711-e1715 (2010).
  83. Criddle, D. N., et al. Cholecystokinin-58 and cholecystokinin-8 exhibit similar actions on calcium signaling, zymogen secretion, and cell fate in murine pancreatic acinar cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (6), G1085-G1092 (2009).
  84. Venglovecz, V., et al. Effects of bile acids on pancreatic ductal bicarbonate secretion in guinea pig. Gut. 57 (8), 1468-3288 (2008).
  85. Maleth, J., Hegyi, P. Calcium signaling in pancreatic ductal epithelial cells: an old friend and a nasty enemy. Cell Calcium. 55 (6), 337-345 (2014).
  86. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (Pt 1), 85-93 (1999).
  87. Skelin Klemen, M., Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).

Tags

Biologi Udgave 170 Bugspytkirtel agarose vævsskive in situ-forberedelse konfokal laserscanningsmikroskopi calciumbilleddannelse enkeltcelleopløsning 3R
Konfokal laserscanning Mikroskopi af calciumdynamik i akutte musespytkirtelvævsskiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stožer, A., Dolenšek, J.,… More

Stožer, A., Dolenšek, J., Križančić Bombek, L., Pohorec, V., Slak Rupnik, M., Klemen, M. S. Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62293, doi:10.3791/62293 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter