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Biology

तीव्र माउस अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में कैल्शियम गतिशीलता के कन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी

Published: April 13, 2021 doi: 10.3791/62293
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 1
1Institute of Physiology, Faculty of Medicine, University of Maribor, 2Faculty of Natural Sciences and Mathematics, University of Maribor, 3Center for Physiology and Pharmacology, Medical University of Vienna

Summary

हम तीव्र अग्नाशयी ऊतक स्लाइस की तैयारी और कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी में उनके उपयोग को बड़ी संख्या में जीवित कोशिकाओं में एक साथ कैल्शियम गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रस्तुत करते हैं, लंबे समय तक, और उच्च स्थानिक संकल्प के साथ।

Abstract

तीव्र माउस अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा संरक्षित अंतरकोशिकीय संचार और ऊतक वास्तुकला के साथ सीटू तैयारी में एक अद्वितीय है जो इन विट्रो अध्ययनों में विशिष्ट में वर्णित पृथक आइलेट्स, एसिनी, नलिकाओं या छितरी हुई कोशिकाओं की तुलना में काफी कम तैयारी-प्रेरित परिवर्तनों पर जोर देता है। कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) में लाइव-सेल कैल्शियम इमेजिंग के साथ तीव्र अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा के संयोजन से, कैल्शियम संकेतों का अध्ययन बड़ी संख्या में अंतःस्रावी और एक्सोक्राइन कोशिकाओं में एक साथ, एकल-कोशिका या यहां तक कि उपकोशिकीय संकल्प के साथ किया जा सकता है। संवेदनशीलता परिवर्तनों का पता लगाने की अनुमति देती है और अंतरकोशिकीय तरंगों और कार्यात्मक कनेक्टिविटी के अध्ययन के साथ-साथ अन्य कोशिकाओं के साथ आइलेट और पैराक्राइन संबंधों के भीतर उनके स्थानीयकरण पर कोशिकाओं की शारीरिक प्रतिक्रियाओं की निर्भरता के अध्ययन को सक्षम बनाती है। अंत में, पशु कल्याण के परिप्रेक्ष्य से, एक समय में बड़ी संख्या में कोशिकाओं से सिग्नल रिकॉर्ड करना प्रयोगों में आवश्यक जानवरों की संख्या को कम करता है, 3 आर-प्रतिस्थापन, कमी और शोधन-सिद्धांत में योगदान देता है।

Introduction

स्तनधारी अग्न्याशय एक बड़ी एक्सोक्राइन और अंतःस्रावी ग्रंथि है। एक्सोक्राइन भाग कुल अग्न्याशय की मात्रा का 96-99% बनाता है और इसमें एसिनी और नलिकाएं होती हैं। अंतःस्रावी भाग लैंगरहैंस के बड़ी संख्या में आइलेट्स से बना है जो कुल अग्न्याशय मात्रा 1 के शेष1-4% के लिए लेखांकन करता है। एक्सोक्राइन भाग प्रमुख पाचन एंजाइमों को स्रावित करता है जो भोजन में ऊर्जा समृद्ध पॉलिमर को तोड़ते हैं, साथ ही एक बाइकार्बोनेट युक्त तरल पदार्थ, जो एंजाइमों की कार्रवाई के लिए उपयुक्त वातावरण प्रदान करने के लिए अन्य गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्राव के साथ जोड़ता है। अंतःस्रावी भाग हार्मोन को स्रावित करता है जो ऊर्जा युक्त पोषक तत्वों के पोस्टप्रैंडियल वितरण, भंडारण और इंटरप्रैंडियल रिलीज को विनियमित करता है। यद्यपि एक्सोक्राइन ऊतक अपेक्षाकृत अविकसित होता है और अंतःस्रावी जन्म के समय अपेक्षाकृत अच्छी तरह से विकसित होता है, पूर्वजल्दी से 2,3,4 को छुड़ाने पर उत्तरार्द्ध को ओवरग्रो करता है। अग्नाशयी कार्य के प्रारंभिक अध्ययनों ने आधुनिक शरीर विज्ञान के जन्म को चिह्नित किया, और क्षेत्र में प्रमुख पद्धतिगत प्रगति के बाद प्रमुख वैज्ञानिक ब्रेकट्रॉज5. ग्रंथि की जटिल संरचना के कारण अग्न्याशय के साथ काम करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, लेकिन अग्नाशय के कैंसर, अग्नाशयशोथ और मधुमेह जैसी बीमारियों के कारण भी एक बड़ी प्रेरणा है जो सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए प्रमुख खतरे पेश करते हैं, और जिसके लिए उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।

पृथक आइलेट्स6, एसिनी 7,8, और डक्टल टुकड़े दशकों से सेल लाइनों और प्राथमिक बिखरे हुए अंतःस्रावी, एसीनार और डक्टल कोशिकाओं 9,10 की तुलना में उनके फायदे के कारण सोने के मानक तरीकों के रूप में विकसित और उपयोग किए गए थे। पृथक सेल समूहों के स्पष्ट रूप से बेहतर कार्य के बावजूद, इन विधियों में अभी भी काफी यांत्रिक और एंजाइमेटिक तनाव शामिल है, आसपास के ऊतकों से कोशिकाओं को अलग करना और इस प्रकार पैराक्राइन इंटरैक्शन और यांत्रिक समर्थन की कमी है, और सबसे महत्वपूर्ण बात, सामान्य शरीर विज्ञान 11,12,13 में महत्वपूर्ण परिवर्तन के साथ हैं . तीव्र माउस अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा 2001 में संरक्षित अंतरकोशिकीय संपर्कों, पैराक्राइन इंटरैक्शन, मेसेनकाइम और ऊतक वास्तुकला के साथ मस्तिष्क, पिट्यूटरी और अधिवृक्क स्लाइस के समान एक प्रयोगात्मक मंच विकसित करने की कथित आवश्यकता से विकसित किया गया था, साथ ही साथ उस समय के आइलेट अनुसंधान में स्वर्ण मानक विधि की कुछ सबसे महत्वपूर्ण कमियों के बिना- पृथक आइलेट्स12, 14. इन कमियों में सबसे बाहरी परतों को नुकसान, कोर आइलेट क्षेत्रों की पहुंच की कमी, और सेल पहचान और शरीर विज्ञान12,15 पर संभवतः महत्वपूर्ण प्रभावों के साथ खेती की आवश्यकता है। इसके अलावा, ऊतक टुकड़ा विधि बेहद विक्षिप्त आइलेट आर्किटेक्चर के साथ पशु मॉडल पर अध्ययन करने में सक्षम बनाती है जहां आइलेट्स को अलग करना असंभव है, या जब पारंपरिक अलगाव16,17,18,19,20,21 द्वारा आइलेट उपज बेहद कम है।

इसके अतिरिक्त, स्लाइस मधुमेह और अग्नाशयशोथ के विकास के दौरान रूपात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए अधिक उपयुक्त है, उदाहरण के लिए, क्योंकि यह पूरे ऊतक का बेहतर अवलोकन करने में सक्षम बनाता है और क्षेत्रीय मतभेदों का अध्ययन करने के साथ भी संगत है। महत्वपूर्ण बात यह है कि अंतःस्रावी भाग पर शुरुआती ध्यान देने के बावजूद, ऊतक टुकड़ा विधि स्वाभाविक रूप से एक्सोक्राइन घटकों 9,22,23 के अध्ययन को सक्षम बनाती है। इसकी शुरूआत के बाद पहले दशक के दौरान, इस विधि को बीटा 14,24,25,26,27,28,29 और अल्फा30,31 कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के साथ-साथ अग्न्याशय 2,3 की रूपात्मक और कार्यात्मक परिपक्वता की जांच के लिए नियोजित किया गया था . एक दशक बाद 2013 में, विधि को ग्लूकोज32, उनके कार्यात्मक कनेक्टिविटी पैटर्न 33, और झिल्ली संभावित डाई34 के साथ फ्लोरोसेंट कैल्शियम डाई के संयोजन से झिल्ली क्षमता और इंट्रासेल्युलर कैल्शियम के बीचसंबंधों को चिह्नित करने के लिए सीएलएसएम का उपयोग करके आइलेट कोशिकाओं के लाइव-सेल कैल्शियम इमेजिंग के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया था। बाद में उसी वर्ष, इस विधि का उपयोग एसीनार कोशिकाओं22,35 में कैल्शियम गतिशीलता का आकलन करने के लिए भी किया गया था। बाद के वर्षों में, अग्नाशयी ऊतक स्लाइस का उपयोग कई अलग-अलग अध्ययनों में किया गया है और सुअर और मानव ऊतक 9,36,37,38,39,40,41 के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया है। हालांकि, एक साथ लिया गया, कैल्शियम इमेजिंग-सामान्य रूप से माउस अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में और विशेष रूप से आइलेट्स में-अभी भी ज्यादातर इस समूह द्वारा किया जाता है। इसके मुख्य कारणों में से एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण ऊतक टुकड़ा तैयारी, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता और बल्कि जटिल डेटा विश्लेषण के संयोजन में निहित हो सकता है। वर्तमान पेपर का मुख्य उद्देश्य इस शक्तिशाली विधि को अन्य संभावित उपयोगकर्ताओं के लिए अधिक सुलभ बनाना है।

ऊतक टुकड़ा तैयारी और संरचनात्मक और स्राव अध्ययन के लिए स्लाइस के उपयोग के साथ विस्तार से निपटने वाले कुछ उत्कृष्ट पद्धतिगत लेख पहले से ही हैं, लेकिन कॉन्फोकल कैल्शियम इमेजिंग 9,42,43 के लिए नहीं। इसलिए, यह पेपर स्लाइस की तैयारी के दौरान कुछ अतिरिक्त युक्तियों और चालों पर केंद्रित है, सफल डाई लोडिंग, छवि अधिग्रहण के साथ-साथ बुनियादी कैल्शियम डेटा विश्लेषण के मुख्य चरणों के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर। इसलिए, इस योगदान को उपर्युक्त विधि के विकल्प के बजाय पूरक के रूप में देखा जाना चाहिए। इसी तरह, माउस अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में कैल्शियम इमेजिंग को विशिष्ट प्रश्नों के उत्तर देने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के रूप में देखा जाएगा और इस प्रकार अग्नाशयी शरीर विज्ञान में अन्य कैल्शियम इमेजिंग दृष्टिकोणों के लिए एक पूर्ण विकल्प के बजाय पूरक है जैसे कि पृथक नलिकाएं या एसिनी, पृथक आइलेट्स, ऑर्गेनोइड, आइलेट्स आंख के पूर्वकाल कक्ष में प्रत्यारोपित, और वीवो 11,44,45,46,47,48 में रिकॉर्डिंग। माउस अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में कैल्शियम इमेजिंग का वादा शायद आइलेट मेसेनकाइमल कोशिकाओं जैसे पेरिसाइट्स49 और मैक्रोफेज50 में कैल्शियम गतिशीलता की हालिया सफल रिकॉर्डिंग के साथ-साथ डक्टल कोशिकाओं23 में सबसे अच्छा सचित्र है।

Protocol

नोट: सभी प्रयोगों अनुसंधान में जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार सख्त में प्रदर्शन किया गया। प्रोटोकॉल खाद्य सुरक्षा, पशु चिकित्सा क्षेत्र और पौध संरक्षण के लिए स्लोवेनिया गणराज्य के प्रशासन द्वारा अनुमोदित किया गया था (परमिट संख्या: 34401-35-2018/2)।

1. अग्नाशयी ऊतक स्लाइस की तैयारी

नोट: सीएलएसएम का उपयोग कर कैल्शियम इमेजिंग के लिए तीव्र माउस अग्न्याशय ऊतक स्लाइस की तैयारी के लिए कई उपकरणों, विभिन्न समाधानों और महत्वपूर्ण चरणों की एक श्रृंखला में आय की आवश्यकता होती है जो योजनाबद्ध रूप से चित्रा 1 में प्रस्तुत किए जाते हैं और नीचे विस्तार से वर्णित होते हैं।

Figure 1
चित्र 1: वर्कफ़्लो आरेख. अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा तैयारी की प्रक्रिया में सभी चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, आम पित्त नली में एगरोज़ के इंजेक्शन के साथ शुरू होता है, इसके बाद अग्न्याशय और टुकड़ा करने की क्रिया का निष्कर्षण होता है। तैयार स्लाइस का उपयोग लाइव / डेड किट के साथ ऊतक की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है या कैल्शियम सेंसर के साथ दाग दिया जा सकता है। एक बार दाग लगने के बाद, वे इमेजिंग के लिए तैयार हैं। इमेजिंग प्रक्रिया से प्राप्त रिकॉर्डिंग का उपयोग तब डेटा विश्लेषण के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. समाधान की तैयारी
    नोट: सभी समाधान अग्रिम में तैयार किया जाना चाहिए और एक महीने तक 4-8 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है। ऊतक स्लाइस की तैयारी और भंडारण के लिए, 6 एमएम ग्लूकोज के साथ लगभग 0.5 एल बाह्य समाधान (ईसीएस) और 4-(2-हाइड्रॉक्सीथाइल) -1-पिपराज़िनेथेनेसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस) बफर के 0.3 एल की आवश्यकता होती है। मिनट प्रवाह दर पर सेट पेरिफ्यूजन सिस्टम के साथ कैल्शियम इमेजिंग के 1 दिन के लिए, लगभग 0.5 एल ईसीएस की आवश्यकता होती है।
    1. 6 एमएम ग्लूकोज के साथ बाह्य समाधान
      1. 125 एमएम एनएसीएल, 26 एमएम एनएएचसीओ 3, 6 एमएम ग्लूकोज, 6 एमएम लैक्टिक एसिड,3 एमएम मायो-इनोसिटोल, 2.5 एमएम केसीएल, 2 एमएम एनए पाइरूवेट, 2 एमएम सीएसीएल 2,1.25 एमएम एनएएच2पीओ4, 1 एमएम एमजीसीएल2, और 0.5 एमएम एस्कॉर्बिक एसिड युक्त ईसीएस का 1 एल तैयार करें। अच्छी तरह से मिलाएं जब तक कि सभी सामग्री पूरी तरह से घुल न जाए। ईसीएस के 50 μL को 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में लें, इसे निर्माता के निर्देशों के अनुसार ऑस्मोमीटर पर रखें, और ऑस्मोलरिटी की जांच करें।
        नोट: परासरण 300-320 एमओएसएम होना चाहिए। बीटा कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए, उच्च ग्लूकोज सांद्रता वाले समाधानों का उपयोग करें। टुकड़ा करने की क्रिया और प्रयोगों के दौरान 7.4 के शारीरिक पीएच मान को सुनिश्चित करने के लिए, बैरोमीटर दबाव पर कार्बोजन (यानी, 95% ओ2 और 5% सीओ2 का गैस मिश्रण) के साथ ईसीएस को लगातार बुलबुला करें। कार्बोजन (यानी, एक दबाव गैस सिलेंडर) के स्रोत के लिए 5 मिमी सिलिकॉन ट्यूबिंग के एक छोर को संलग्न करके एक साधारण बुदबुदाहट प्रणाली स्थापित की जा सकती है और ट्यूबिंग के दूसरे छोर को सीधे ईसीएस युक्त बोतल में रखा जा सकता है।
      2. वैकल्पिक रूप से, 1250 एमएम एनएसीएल, 260 एमएम एनएएचसीओ3, 30 एमएम मायो-इनोसिटोल, 25 एमएम केसीएल, 20 एमएम एनए पाइरूवेट, 12.5 एमएम एनएएच2पीओ4 और 5 एमएम एस्कॉर्बिक एसिड युक्त 10 एक्स स्टॉक तैयार करें। जब 6 एमएम ग्लूकोज युक्त ईसीएस की आवश्यकता होती है, तो स्टॉक के 100 एमएल को 1 एम सीएसीएल 2 के 2 एमएल, 1 एमजीसीएल2 के 1 एमएल, 13.2 एम लैक्टिक एसिड के 0.455 एमएल और 1.08 ग्राम ग्लूकोज के साथ मिलाएं, और 1 एल तक डबल-डिस्टिल्ड पानी से भरें। यदि आवश्यक हो, तो अन्य ग्लूकोज सांद्रता प्राप्त करने के लिए ग्लूकोज की विभिन्न मात्रा का उपयोग करें।
    2. 6 एमएम ग्लूकोज के साथ एचईपीईएस बफर
      1. 150 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम एचईपीईएस, 6 एमएम ग्लूकोज, 5 एमएम केसीएल, 2 एमएम सीएसीएल 2, और 1 एमएम एमजीसीएल 2 युक्त एचईपीईएस-बफर समाधान (एचबीएस) के0.5 एल तैयारकरें; 1 एम एनएओएच के साथ पीएच = 7.4 के लिए टाइट्रेट।
        नोट: यदि कार्बोजन उपलब्ध नहीं है, तो इस बफर का उपयोग ईसीएस के बजाय सभी चरणों के लिए किया जा सकता है।
    3. अगरोज़ (1.9% डब्ल्यू /
      1. 40 डिग्री सेल्सियस तक पानी के स्नान को प्रीवॉर्म करें।
      2. 0.475 ग्राम कम पिघलने-बिंदु एगरोज़ और 6 एमएम ग्लूकोज युक्त 25 एमएल ईसीएस को एर्लेनमेयर फ्लास्क में जोड़ें, और फ्लास्क को माइक्रोवेव ओवन में कुछ सेकंड के लिए अधिकतम शक्ति पर रखें जब तक कि यह उबलना शुरू न हो जाए। फ्लास्क को ओवन से बाहर निकालें और इसे कुछ बार घुमाएं, जब तक कि एगरोज़ पूरी तरह से घुल न जाए। वांछित तापमान पर एगरोज़ को ठंडा करने और इंजेक्शन तक तरल रखने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गर्म पानी के स्नान के लिए तरल एगरोज़ के साथ फ्लास्क को स्थानांतरित करें। एक स्थिर नेतृत्व अंगूठी के साथ कुप्पी सुरक्षित करें।
        नोट: एगरोज़ को पहले से तैयार किया जा सकता है और रेफ्रिजरेटर में रखा जा सकता है। उपयोग करने से पहले, माइक्रोवेव ओवन में एगरोज़ को तब तक गर्म करें जब तक कि यह तरलीकृत न हो जाए, और एर्लेनमेयर फ्लास्क को 40 डिग्री सेल्सियस तक पानी के स्नान में स्थानांतरित करें। एगरोज़ को 5x तक फिर से उपयोग किया जा सकता है। यदि 5x से परे फिर से उपयोग किया जाता है, तो यह घने और इंजेक्ट करने के लिए कठिन हो जाएगा।
  2. अग्न्याशय का इंजेक्शन एगरोज़ के साथ
    नोट: धारा 1.2 और 1.3 ऊतक स्लाइस की तैयारी की व्याख्या करते हैं जिसका उपयोग कैल्शियम इमेजिंग, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, स्राव अध्ययन और संरचनात्मक /
    1. चरण 1.1.3.2 से पानी के स्नान में एर्लेनमेयर फ्लास्क से तरल एगरोज के साथ 5 एमएल सिरिंज भरें, किसी भी बुलबुले को हटा दें, और 30 जी सुई माउंट करें। एक टोपी के साथ सुई की रक्षा करें, और भरे हुए सिरिंज को पानी के स्नान में वापस रखें, सुई को नीचे की ओर और पानी की सतह के नीचे अगरोज की पूरी मात्रा के साथ रखें। सिरिंज को एक स्थिर लीड रिंग के साथ इस तरह से सुरक्षित करें कि अंगूठी पानी के स्नान की दीवार के खिलाफ सिरिंज को दबाए।
      नोट: सुई में किसी भी अगारोज को धक्का न दें क्योंकि यह जल्दी से कठोर हो जाएगा और सुई को अवरुद्ध कर देगा। यदि कमरे का तापमान कम है, और यदि इंजेक्शन कम अनुभवी व्यक्ति द्वारा किया जाता है, तो इंजेक्शन के लिए कुछ अतिरिक्त समय प्राप्त करने के लिए पानी के स्नान के तापमान को 42 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाएं।
    2. बर्फ के साथ एक बर्फ की बाल्टी भरें, और उसमें ईसीएस युक्त बोतल रखें। ऑक्सीजनेशन और 7.4 के पीएच को सुनिश्चित करने के लिए बैरोमेट्रिक दबाव और कमरे के तापमान पर कार्बोजन के साथ ईसीएस को लगातार 1.5 एमएल /
    3. ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ2 की एक उच्च एकाग्रता का प्रशासन करके एक माउस का बलिदान करें। पशु पीड़ा को कम करने के लिए सभी प्रयास करें।
    4. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत काम करना, लैपरोटॉमी (चित्रा 2 ए) के माध्यम से पेट तक पहुंचें। धीरे आम पित्त नली का पर्दाफाश करने के लिए माउस के बाईं ओर (माउस के शारीरिक परिप्रेक्ष्य से) आंत फ्लिप। ग्रहणी भाग को थोड़ा उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें, और वेटर के प्रमुख ग्रहणी पैपिला-पैपिला को ढूंढें। ग्रहणी में वाहिनी से अगारोज के रिसाव को रोकने के लिए हेमोस्टैट (चित्रा 2 बी, सी) का उपयोग करके ग्रहणी पैपिला पर आम पित्त नली को क्लैंप करें।
      नोट: ग्रहणी में अगारोज रिसाव को रोकने के लिए और जठरांत्र संबंधी मार्ग में आगे ऊपर और नीचे, हेमोस्टैट को इस तरह से रखें कि यह पैपिला से समीपस्थ और अलग-अलग ग्रहणी को भी क्लैंप करता है। इस उद्देश्य के लिए घुमावदार हेमोस्टैट का उपयोग करना सबसे अच्छा है।
    5. छोटे तेज संदंश के साथ, आम पित्त नली के नीचे तक पहुंचें, और झिल्ली को तोड़ें जो नलिका को अग्नाशयी ऊतक से जोड़ता है। बेहतर दृश्य नियंत्रण और आसान इंजेक्शन के लिए, जितना संभव हो उतना वसा और संयोजी ऊतक को वाहिनी से साफ़ करें।
    6. बड़े संदंश (चित्रा 2 डी) पर लंबवत वाहिनी प्लेस, और आम पित्त नली (चित्रा 2 डी) के समीपस्थ भाग में तैयार तरल एगरोज़ इंजेक्ट। सिरिंज को जोर से निचोड़ना सुनिश्चित करें क्योंकि एगरोज़ चिपचिपा है। अग्न्याशय को तब तक भरते रहें जब तक कि यह सफेद और थोड़ा विघटित न हो जाए या कम से कम 20-30 एस के लिए।
      नोट: यह टुकड़ा तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। यदि अग्न्याशय के डक्टल पेड़ में कोई किंक हैं, तो उन्हें समतल करने के लिए अग्न्याशय को सिरिंज से धीरे-धीरे उठाएं या खींचें। सिरिंज से इंजेक्शन की मात्रा के आधार पर इंजेक्शन को कब रोकना है, यह तय न करें क्योंकि इंजेक्शन के बिंदु पर बैकफ्लो और ग्रहणी में आगे का रिसाव आमतौर पर अग्न्याशय के डक्टल पेड़ में इंजेक्ट की गई मात्रा से बहुत अधिक होता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि सफल इंजेक्शन सिरिंज की मात्रा में व्यावहारिक रूप से ध्यान देने योग्य परिवर्तनों के साथ किया जा सकता है।
    7. सिरिंज निकालें, और धीरे-धीरे ऊतक को ठंडा करने और अगारोज को कठोर करने के लिए अग्न्याशय पर बोतल से 0-4 डिग्री सेल्सियस पर बुलबुले बर्फ-ठंडे ईसीएस के 20 मिलीलीटर डालें।
    8. धीरे संदंश और ठीक कठिन कटौती कैंची का उपयोग कर अग्न्याशय निकालें। निकाले गए अग्न्याशय को ~ 40 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा ईसीएस युक्त 100 मिमी पेट्री डिश में रखें, और इसे धोने के लिए धीरे-धीरे इसे चारों ओर ले जाएं। अग्न्याशय को एक ताजा 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें ~ 40 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा ईसीएस हो।
    9. अग्न्याशय के अच्छी तरह से इंजेक्शन वाले हिस्से से, जो सफेद (चित्रा 3 ए) दिखाई देता है, संदंश और कठिन कट कैंची का उपयोग करके, ऊतक के 6 ब्लॉक, आकार में 0.1-0.2 सेमी3 तक काट लें। उन्हें किसी भी संयोजी और वसायुक्त ऊतक से साफ़ करें।
    10. 40 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 5 मिलीलीटर तरल एगरोज़ के साथ 35 मिमी गैर-चिपचिपा नीचे-पेट्री डिश भरें, ऊतक ब्लॉकों को इसमें स्थानांतरित करें, और तुरंत पेट्री डिश को ठंडा करने और एगरोज़ को कठोर करने के लिए बर्फ पर रखें।
      नोट: जिस तरह से अग्न्याशय के ब्लॉक एगरोज़ में फंस जाते हैं, वह निर्धारित करता है कि स्लाइसिंग के दौरान उन्हें कैसे काटा जाता है। अनुभवी प्रयोगकर्ता बर्फ पर रखे जाने पर अगारोज कठोर होने से पहले कुछ क्षणों के दौरान ब्लॉक की स्थिति को ठीक करने की कोशिश कर सकते हैं।
    11. ऊतक ब्लॉक के साथ अगरोज़ सख्त होने के बाद, पेट्री डिश को एक सपाट चिकनी सतह पर उल्टा कर दें जैसे कि 100 मिमी पेट्री डिश का ढक्कन, और पेट्री डिश और एगरोज़ की पार्श्व दीवार के बीच मार्जिन में रेजर ब्लेड के आधे हिस्से के साथ धीरे-धीरे काटकर एगरोज़ को हटा दें। एक रेजर ब्लेड के साथ, व्यक्तिगत एगरोज़ क्यूब्स को काटें, प्रत्येक में एक ऊतक ब्लॉक होता है, यह ध्यान रखते हुए कि प्रत्येक ऊतक ब्लॉक एगरोज़ से घिरा हुआ है। साइनोएक्रिलेट गोंद (चित्रा 3 बी) के साथ वाइब्रेटोम की नमूना प्लेट पर एगरोज़ ब्लॉक गोंद।

Figure 2
चित्रा 2: आम पित्त नली में एगरोज़ का इंजेक्शन (ए) पेट की गुहा खोलें, और पेरिटोनियल गुहा में अंगों को उजागर करें। (बी) पैनल ए में आयत द्वारा संलग्न क्षेत्र का आवर्धित हिस्सा। ग्रहणी पर सफेद धब्बा (तीर द्वारा इंगित) वेटर के एम्पुला को इंगित करता है। लैंगरहैंस के आइलेट्स को एरोहेड्स द्वारा निरूपित किया जाता है। (सी) एक घुमावदार हेमोस्टैट द्वारा वेटर के एम्पुला को दबाएं, और आम पित्त नली (तीर) को उजागर करने और धीरे-धीरे फैलाने के लिए इसे थोड़ा उठाएं। (डी) आम पित्त नली का कैन्युलेशन और 5 एमएल सिरिंज और 30 जी सुई का उपयोग करके 1.9% एगरोज समाधान का इंजेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. स्लाइसिंग
    1. बर्फ-ठंडे ईसीएस के ~ 0.15 एल के साथ वाइब्रेटोम के काटने के कक्ष को भरें, और कार्बोजन के साथ लगातार बुलबुला। बर्फ के साथ काटने के कक्ष को घेरें, और काटने के कक्ष में 6 एमएम ग्लूकोज के साथ ईसीएस से बने 2 बर्फ के टुकड़े (~ 10 एमएल प्रत्येक) जोड़ें। वाइब्रेटोम पर काटने के लिए रेजर ब्लेड माउंट करें, और अपनी जगह पर एगरोज़ ब्लॉक के साथ नमूना प्लेट को स्क्रू-फिक्स करें।
    2. 20-100 मिमी 2 की सतह क्षेत्र के साथ 140 μm-मोटी स्लाइस में 0.05 से1 मिमी / सेकंड और 70 हर्ट्ज पर एगरोज़ ब्लॉक काटने के लिए स्लाइसर सेट करें। स्लाइसर सेटिंग्स के लिए, निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    3. प्रत्येक काटने के कदम के तुरंत बाद, स्लाइसर को रोकें, धीरे-धीरे एक ठीक पेंट ब्रश के साथ स्लाइस इकट्ठा करें, और उन्हें कमरे के तापमान (चित्रा 3 सी) पर 6 एमएम ग्लूकोज के साथ एचईपीईएस बफर के 40 एमएल से भरे 100 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
      नोट: स्लाइस कम से कम 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर HEPES बफर में रखा जा सकता है, और बफर हर 2 घंटे का आदान-प्रदान किया जाना चाहिए।

Figure 3
चित्रा 3: अग्न्याशय ऊतक तैयारी और टुकड़ा करने की क्रिया. (ए) एगरोज इंजेक्शन के बाद निकाले गए माउस अग्न्याशय। बाईं ओर सफेद ऊतक एक अच्छी तरह से इंजेक्शन वाले हिस्से (ग्रहणी भाग) को इंगित करता है, जबकि दाईं ओर अधिक लाल भाग अग्न्याशय (प्लीहा भाग) के अपर्याप्त इंजेक्शन वाले हिस्से को दर्शाता है। (बी) अगारोज़ में एम्बेडेड अग्न्याशय ऊतक के दो ब्लॉकों की वाइब्रेटोम टुकड़ा करने की क्रिया। (सी) तीरहेड्स द्वारा इंगित लैंगरहैंस के आइलेट्स के साथ तीव्र अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा। स्केल बार = 3000 μm. (डी) एक तीरहेड द्वारा इंगित लैंगरहैंस के आइलेट के साथ प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत तीव्र अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा, तारांकन एक अग्नाशयी वाहिनी को इंगित करता है। स्केल बार = 100 μm कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

2. स्तनधारी कोशिकाओं के लिए लाइव / मृत व्यवहार्यता / साइटोटॉक्सिसिटी किट का उपयोग करके लाइव /

नोट: कुछ प्रयोगों के लिए, यह निम्नानुसार जीवित / मृत परख द्वारा स्लाइस (चित्रा 4) में कोशिकाओं की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए उपयोगी है।

  1. साइटोटॉक्सिसिटी किट के अभिकर्मकों के साथ शीशियों को पिघलाने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें, और उपयोग से ठीक पहले कैल्सीन एएम के कामकाजी समाधान तैयार करें। एक दिन के भीतर समाधान का उपयोग करें।
  2. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में, 4 एमएम कैल्सीन एएम (घटक ए) के 5 μL, 2 एमएम एथिडियम होमोडिमर -1 (ईएचडी -1, घटक बी) के 20 μL, और दुलबेको के फॉस्फेट-बफर खारा (डी-पीबीएस) के 10 एमएल को मिलाएं ताकि लगभग 2 μM कैल्सीन एएम और 4 μM ईएचडी -1 युक्त एक कामकाजी समाधान तैयार किया जा सके। भंवर अच्छी तरह से।
  3. एक ठीक पेंट ब्रश का उपयोग करके, सीरम एस्टरेज़ गतिविधि को पतला करने के लिए ताजा एचईपीईएस बफर के साथ 3 एमएल पेट्री डिश में धीरे-धीरे ऊतक स्लाइस को स्थानांतरित करें। HEPES बफर निकालें, और चरण 2.2 से काम समाधान के 100-200 μL (या अधिक यदि आवश्यक हो) के साथ स्लाइस को कवर करें।
  4. एक बंद पेट्री डिश में कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट के लिए स्लाइस सेते हैं। निर्माता द्वारा अनुशंसित उत्तेजना/उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग करके ऊतक स्लाइस की छवि बनाएं।

3. कैल्शियम डाई लोड हो रहा है

नोट: फ्लोरोसेंट रंगों को डाई की तैयारी और लोडिंग की पूरी प्रक्रिया के दौरान, साथ ही दाग ऊतक स्लाइस से निपटने के दौरान प्रकाश जोखिम से परिरक्षित किया जाना चाहिए। टिन पन्नी का उपयोग कैल्शियम डाई युक्त ट्यूब या पेट्री व्यंजनों को कवर करने के लिए किया जा सकता है।

  1. डाई की तैयारी
    1. सेल पारगम्य सीए 2 + सूचक डाई (उत्तेजना / उत्सर्जन 495/523 एनएम; सामग्री की तालिका देखें), डाइमिथाइलसल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 7.5 μL, और पोलैक्सामर के 2.5 μL (डीएमएसओ में 20% समाधान) की एक शीशी (50 μg) की सामग्री को भंग करें; सामग्री की तालिका) 15 एमएल स्क्रू कैप ट्यूब में 6 एमएम ग्लूकोज युक्त एचबीएस के 6.667 एमएल में।
      नोट: इस अंतिम समाधान में सीए2 + सूचक डाई, 0.11% डीएमएसओ और 0.037% पोलैक्समर के 6 μM शामिल हैं।
    2. एस्पिरेट और स्क्रू कैप ट्यूब में समाधान को 20 एस के लिए एक पिपेट के साथ बार-बार निष्कासित करें; घुलनशीलता में सुधार के लिए 30 एस के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान कक्ष में ट्यूब को डुबोएं, और 30 एस के लिए भंवर। अंतिम सीए2 + सूचक डाई समाधान के विभाज्य 3.333 एमएल चरण 3.1.1 में 5 एमएल पेट्री व्यंजनों में तैयार किया गया।
  2. डाई लोड हो रहा है
    1. एचबीएस के साथ 60 एमएल पेट्री डिश से तैयार ऊतक स्लाइस को एक पतले, नरम पेंट ब्रश का उपयोग करके प्रत्येक ऊतक स्लाइस को धीरे-धीरे उठाकर डाई समाधान से भरे 5 एमएल पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करें और इसे डाई समाधान में रखें। पेट्री डिश प्रति 10 ऊतक स्लाइस तक सेते हैं।
    2. 50 मिनट के लिए प्रति मिनट 40 मोड़ पर कक्षीय गति के लिए सेट कमरे के तापमान पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर टुकड़ा लोड पेट्री डिश रखें। कमरे के तापमान पर परिवेशी हवा के संपर्क में डाई समाधान में स्लाइस सेते हैं, लेकिन टिन पन्नी के साथ पेट्री डिश को कवर करके प्रकाश से परिरक्षित।
  3. स्लाइस का भंडारण
    1. 5 एमएल पेट्री डिश से दाग ऊतक स्लाइस को डाई-फ्री एचबीएस से भरे 60 एमएल पेट्री डिश में धीरे-धीरे एक ठीक, नरम पेंट ब्रश का उपयोग करके उठाकर स्थानांतरित करें। पेट्री डिश प्रति 20 स्लाइस तक स्टोर करें।
      नोट: इस बिंदु पर इमेजिंग के लिए ऊतक स्लाइस का उपयोग करें। ऊतक स्लाइस कई घंटों के लिए सीए2 + सूचक डाई को बनाए रखेंगे। स्लाइस के अस्तित्व और डाई के प्रतिधारण को बर्फ से घिरे एक अछूता कंटेनर में पेट्री डिश रखकर सुधार किया जा सकता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि डाई-लोडेड स्लाइस को ले जाया जाना है। इसके अतिरिक्त, हर 2 घंटे में एचबीएस का आदान-प्रदान करें।

4. कैल्शियम इमेजिंग

  1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का सेटअप
    1. अध्ययन के हित के आधार पर एक उपयुक्त उद्देश्य आवर्धन चुनें। एक पूरे आइलेट, कई एसिनी एक साथ, या बड़ी नलिकाओं की कल्पना करने के लिए 20x और 25x (संख्यात्मक एपर्चर [एनए] 0.77-1.00) का चयन करें। इंट्रासेल्युलर गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उच्च आवर्धन का चयन करें।
    2. टाइम-लैप्स इमेजिंग (जैसे, टाइम-लैप्स, xyt, या इसी तरह के मोड) के लिए अधिग्रहण मोड चुनें। पिनहोल को 100-200 μm पर सेट करें।
    3. हरे फ्लोरोफोरस के लिए प्रकाश पथ सेट करें: 488 एनएम पर उत्तेजना, और 500-700 एनएम पर उत्सर्जन का संग्रह। अधिमानतः फोटोमल्टीप्लायर डिटेक्टरों पर उच्च क्वांटम दक्षता (जैसे, गैलियम आर्सेनाइड फॉस्फाइड) वाले डिटेक्टरों का चयन करें।
  2. रिकॉर्डिंग कक्ष और पेरिफ्यूजन सिस्टम का सेटअप
    1. माइक्रोस्कोप और पेरिफ्यूजन सिस्टम (या तो गुरुत्वाकर्षण-खिलाया या पेरिस्टाल्टिक-पंप-आधारित सेटअप, वॉल्यूम 1 एमएल) के तापमान-नियंत्रित चरण पर रिकॉर्डिंग कक्ष माउंट करें। कक्ष के भीतर इत्र के घूमने से बचने के लिए रिकॉर्डिंग कक्ष के दूर किनारों पर इनलेट और आउटलेट की स्थिति रखें, और प्रवाह और बहिर्वाह को समान मूल्यों (1-2 एमएल / पेरिफ्यूजेट में तरल मेनिस्कस ऊंचाई और बूंदों के बहाव से बचें।
    2. पेरिफ्यूजन सिस्टम के तापमान नियंत्रण को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें गैर-उत्तेजक समाधान के साथ पेरिफ्यूजन शुरू करें, और उत्तेजक समाधान तैयार करें। मोटरचालित वाल्व के माध्यम से या मैन्युअल रूप से उन समाधानों को स्विच करके समाधान बदलें जो पेरिफ्यूजन सिस्टम को खिलाते हैं।
  3. रिकॉर्ड कैल्शियम गतिशीलता
    1. रिकॉर्डिंग कक्ष में एक एकल ऊतक टुकड़ा स्थानांतरण। तना हुआ नायलॉन जाल (जैसे, नायलॉन मोज़ा से) के साथ यू-आकार के प्लैटिनम वजन के साथ ऊतक टुकड़ा स्थिर करें। ब्याज की संरचना पर नायलॉन धागे की स्थिति से बचें।
    2. ब्राइटफील्ड विकल्प का उपयोग करके एक आइलेट / एसिनस / वाहिनी का पता लगाएं। अध्ययन संरचनाओं को देखने के क्षेत्र में स्थिति के लिए लाइव इमेजिंग चलाएं, और इमेजिंग पैरामीटर स्थापित करें। लेजर पावर को न्यूनतम रखते हुए कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए लेजर पावर, डिटेक्टर प्रवर्धन और लाइन औसत / बिनिंग को समायोजित करके सिग्नल-टू-शोर अनुपात का अनुकूलन करें।
    3. कटौती सतह पर संभावित क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग से बचने के लिए कटौती सतह (चित्रा 5) के नीचे ~ 15 μm करने के लिए रिकॉर्डिंग के फोकल विमान को समायोजित करें।
    4. छवियों को प्राप्त करें। शुरू में व्यक्तिगत दोलनों का पता लगाने के लिए नमूना आवृत्ति को 1-2 हर्ट्ज पर सेट करें, और इंट्रासेल्युलर सीए 2 + ([सीए 2 +] आईसी) गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए उच्च अधिग्रहण दर (>10 हर्ट्ज) पर तेजी से लाइन औसत (8-20) में सक्षम एक गुंजयमान स्कैनरका उपयोग करें। फोटोटॉक्सिसिटी को रोकने के लिए लगातार बिंदु रोशनी के बीच एक अंतराल (जैसे, कुल नमूना समय का 30%) की अनुमति दें। समय श्रृंखला अधिग्रहण से पहले एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि (जैसे, 1024 x 1024 पिक्सेल, लाइन औसत > 50) रिकॉर्ड करें (अनुभाग 5 देखें)।
      नोट: 1-2 हर्ट्ज की नमूना आवृत्ति अधिकांश कोशिकाओं के लिए अधिग्रहण आवृत्ति के लिए नाइक्विस्ट मानदंड से नीचे है, और सिग्नल का आकार डिफ़ॉल्ट रूप से कम हो जाएगा।
    5. तैयारी प्रतिक्रिया, अति-रोशनी, फोटोब्लीचिंग और यांत्रिक बहाव पर तत्काल प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में उपलब्ध होने पर एक ऑनलाइन चार्ट देखें। अधिग्रहण के दौरान विरंजन की उच्च दर के मामले में, रिकॉर्डिंग को रोकें और सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बनाए रखने के लिए डिटेक्टर लाभ को बढ़ाते हुए लेजर पावर को कम करें। यांत्रिक बहाव के मामले में, ट्यूबिंग/केबल और माइक्रोस्कोप चरण के साथ-साथ तरल रिसाव या रिकॉर्डिंग कक्ष में मात्रा के परिवर्तन के बीच तनाव की जांच करें। वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल रूप से अधिग्रहण के दौरान बहाव को सही करने का प्रयास करें; हालाँकि, ध्यान दें कि यह स्वाभाविक रूप से सीमित परिणाम देगा।
      नोट: अंतःस्रावी कोशिकाएं निकट-थ्रेशोल्ड सांद्रता पर अत्यधिक विषम होती हैं। व्यक्तिगत कोशिकाओं में सक्रियण/निष्क्रियकरण देरी की सीमा का पता लगाने के लिए उत्तेजना की पर्याप्त लंबाई की आवश्यकता होती है। यह अत्यधिक उत्तेजक प्रोटोकॉल के बाद ऑफ-प्रतिक्रियाओं का सटीक पता लगाने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
    6. एंडो- और एक्सोक्राइन कोशिकाओं (चित्रा 6) के बीच कार्यात्मक रूप से भेदभाव करने के लिए कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करें। सक्रियण और निष्क्रियता के दौरान क्षणिक गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, रिकॉर्डिंग को रोकने के बिना उत्तेजनाओं को लागू करें।
    7. प्रयोग के अंत के बाद डेटा सहेजें (ऑटो-सेव फ़ंक्शन का उपयोग करने पर विचार करें)। लेजर पावर को बंद करने से पहले शीतलन अवधि की अनुमति दें ताकि शटडाउन प्रक्रिया के दौरान लेजर को नुकसान न पहुंचे।

5. डेटा का विश्लेषण

  1. नेत्रहीन समय चूक वीडियो को फिर से चलाकर रिकॉर्डिंग का गुणात्मक निरीक्षण करें। दृश्य के क्षेत्र या ऑप्टिकल विमान से सेल बहाव के लिए जाँच करें। यदि ऑप्टिकल विमान के भीतर एक बहाव हुआ है, तो इमेजजे में बहाव सुधार प्लगइन को नियोजित करें।
  2. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर या तृतीय-पक्ष सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करें। आरओआई का चयन करने के लिए संदर्भ के रूप में उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि, अधिकतम प्रक्षेपण, या फ्रेम औसत का उपयोग करें। संदर्भ छवियों में दृश्यमान नहीं हैं जो प्रत्युत्तर कक्षों की कल्पना करने के लिए समय-चूक इमेजिंग को फिर से चलाएं। आरओआई को इस तरह रखें कि आरओआई का चयनित क्षेत्र आरओआई के बीच सिग्नल क्रॉसस्टॉक से बचने के लिए पड़ोसी कोशिकाओं के साथ ओवरलैप नहीं होता है।
  3. प्रति फ्रेम आरओआई औसत मान के रूप में समय श्रृंखला डेटा निर्यात करें। निर्यात आरओआई निर्देशांक।
  4. एक घातीय और रैखिक फिट के संयोजन को नियोजित करके विरंजन (चित्रा 7 ए) के लिए समय श्रृंखला डेटा को सही करें, जैसा कि वर्णित है
    Equation 1(1)
    जहां एक्स (टी) एक समय बिंदु टी पर प्रतिदीप्ति संकेत को दर्शाता है; एक्सकोर (टी) संबंधित समय बिंदुओं पर सही सिग्नल; और ए, बी, और सी फिट के मापदंडों की गणना कोर (टी) और एक्स (टी) के बीच वर्गों के कम से कम योग के रूप में की जाती है।
  5. प्रतिक्रिया (चित्रा 7 बी) के सक्रियण और निष्क्रियकरण चरण का विश्लेषण करें। समय श्रृंखला डेटा के पहले व्युत्पन्न की गणना करें, और क्रमशः सक्रियण और निष्क्रियता के अनुरूप व्युत्पन्न के चरम और नादिर का निर्धारण करें। वैकल्पिक रूप से, मैन्युअल रूप से फासिक वृद्धि की शुरुआत का चयन करें। सक्रियण/निष्क्रियता समय और संबंधित सेल निर्देशांक सहेजें और निर्यात करें।
  6. पठार चरण (चित्रा 7 सी) का विश्लेषण करें। कच्चे डेटा को थ्रेसहोल्ड करके या समय-श्रृंखला डेटा के पहले व्युत्पन्न को थ्रेसहोल्ड करके व्यक्तिगत दोलनों का पता लगाएं। एक व्यक्तिगत दोलन की शुरुआत और अंत को दोलन के आधे आयाम के अनुरूप समय के रूप में परिभाषित करें।
    1. प्रत्येक सेल के लिए व्यक्तिगत दोलनों की अवधि और आवृत्ति की गणना करें। इंटरस्पाइक अंतराल (नियमित गतिविधि पैटर्न के लिए उपयुक्त) के व्युत्क्रम मूल्य की गणना करें। वैकल्पिक रूप से, रिकॉर्ड के समय अंतराल (अनियमित गतिविधि पैटर्न के लिए उपयुक्त) द्वारा दोलनों की संख्या को विभाजित करें।
    2. सक्रिय समय की गणना करें। सक्रिय समय को अवधियों के योग के रूप में व्यक्त करें, और इस मान को समय अंतराल से विभाजित करें। वैकल्पिक रूप से, आवृत्ति और अवधि को गुणा करें जो एक दोलन के अनुरूप है।
      नोट: समय अंतराल से अवधि के योग को विभाजित करना मजबूत परिणाम प्रदान करता है, लेकिन प्रति सेल एक एकल डेटा बिंदु प्राप्त होने के रूप में कम सांख्यिकीय भेदभाव होता है। दोलन की आवृत्ति और अवधि को गुणा करना एक दोलन-से-दोलन अस्थायी संकल्प प्रदान करता है।

Representative Results

अग्नाशयी वाहिनी में एगरोज़ समाधान का इंजेक्शन अग्न्याशय ऊतक टुकड़ा तैयारी में सबसे महत्वपूर्ण कदम है। एक सफल इंजेक्शन अग्न्याशय ऊतक की एक सफेदी द्वारा पहचाना जा सकता है, जैसा कि चित्रा 3 ए के बाईं ओर देखा गया है, जबकि अग्न्याशय का एक अपूर्ण इंजेक्शन हिस्सा चित्रा 3 ए के दाईं ओर प्रस्तुत किया गया है। लैंगरहैंस के आइलेट्स को नग्न आंखों से या स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत पहचाना जा सकता है, और यह एगरोज़ ब्लॉक (चित्रा 3 बी) में बाद में एम्बेडिंग के लिए अग्न्याशय के उपयुक्त हिस्सों को काटने में सहायता करता है। एक ताजा कटौती माउस अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा में, लैंगरहैंस के आइलेट्स आसानी से स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (चित्रा 3 सी) के तहत सफेद धब्बे के रूप में आसपास के एक्सोक्राइन ऊतक और मेसेनकाइम से या प्रकाश माइक्रोस्कोप (चित्रा 3 डी) के तहत भूरे रंग की संरचनाओं के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकता है। अग्नाशयी ऊतक स्लाइस टुकड़ा करने की क्रिया के बाद कम से कम 12 घंटे के लिए प्रयोगों के विभिन्न प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, प्रकाश माइक्रोस्कोप, और कैल्शियम इमेजिंग के दौरान कोशिकाओं की कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं के तहत सकल रूपात्मक मूल्यांकन के अलावा, अग्नाशयी ऊतक स्लाइस की व्यवहार्यता का आकलन किया जा सकता है (चित्रा 4)।

Figure 4
चित्रा 4: ऊतक टुकड़ा के भीतर कोशिकाओं की व्यवहार्यता। कोशिकाओं की व्यवहार्यता लाइव / मृत परख के साथ निर्धारित की गई थी। लाइव कोशिकाओं को कैल्सीन एएम (हरे रंग में दिखाया गया है) द्वारा दाग दिया जाता है, जबकि मृत कोशिकाओं को एथिडियम होमोडिमर -1 (लाल रंग में दिखाया गया है) के साथ दाग दिया जाता है। पीली रेखाएं नीचे और दाईं ओर प्रदर्शित जेड-स्टैक के एक्स-वाई क्रॉस सेक्शन की स्थिति को दर्शाती हैं। Z-स्टैक की पूरी गहराई 88 μm है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों के लिए, फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक को कोशिकाओं की कुछ परतों के माध्यम से प्रवेश करने की आवश्यकता होती है। चित्रा 5 ए अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा में सेल-पारगम्य सीए2 + सूचक डाई के सफल लोडिंग को प्रस्तुत करता है जिसमें व्यक्तिगत आइलेट और एसिनार कोशिकाओं को पहचाना जा सकता है। इसके विपरीत, चित्रा 5 बी-डी में स्लाइस डाई (चित्रा 5 बी), आइलेट कोशिकाओं (चित्रा 5 सी) की कमी, और सतह पर बहुत सारे नेक्रोटिक ऊतक (चित्रा 5 डी) के असफल प्रवेश के कारण इष्टतम नहीं हैं। इस तरह के स्लाइस को त्याग दिया जा सकता है, अतिरिक्त आइलेट्स की उपस्थिति के लिए जाँच की जा सकती है जो काटे जाते हैं या बेहतर दाग होते हैं (समस्या निवारण के लिए तालिका 1 देखें), या एक्सोक्राइन कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड करने के लिए उपयोग किया जाता है।

Figure 5
चित्रा 5: प्रयोग करने योग्य और अनुपयोगी तैयारी के उदाहरण( ए) लैंगरहैंस के द्वीपों में अच्छी तरह से दाग वाली कोशिकाओं के साथ-साथ डक्टल कोशिकाओं और आसपास के एसिनार ऊतक के साथ अग्न्याशय ऊतक स्लाइस की सफल तैयारी का एक उदाहरण। (बी) एक खराब दाग ऊतक टुकड़ा का एक उदाहरण। (सी) संरचनात्मक विच्छेदन के साथ लैंगरहैंस के एक आइलेट का उदाहरण। (डी) लैंगरहैंस के एक टापू का एक उदाहरण जिसमें कई मृत कोशिकाएं और बहुत सारे मलबे होते हैं। दाईं ओर "ग्लो-ओवर, ग्लो-अंडर" लुकअप टेबल हरे रंग में 0 तीव्रता और नीले रंग में संतृप्ति प्रदर्शित करता है। स्केल बार = 100 μm कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

सेल पारगम्य सीए2 + सूचक डाई का उपयोग कर कैल्शियम इमेजिंग से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 6 में दिखाया गया है। चित्रा 6 ए में, एक अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा की एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि प्रस्तुत की जाती है, जिसमें लैंगरहैंस, एसिनार ऊतक और एक अग्नाशयी वाहिनी का एक आइलेट होता है। बेहतर भेद के लिए, चित्रा 6 ए में प्रस्तुत अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा के अंतःस्रावी, एक्सोक्राइन और डक्टल भाग को चित्रा 6 बी में रंगा गया है। उपयुक्त उत्तेजनाओं का उपयोग कार्यात्मक रूप से विभिन्न आइलेट कोशिकाओं, या आइलेट और गैर-आइलेट कोशिकाओं के बीच भेदभाव कर सकता है51. बीटा कोशिकाएं आम तौर पर ग्लूकोज द्वारा एक वर्ग-नाड़ी उत्तेजना का जवाब देंगी जिसमें [सीए2 +] आईसी में क्षणिक वृद्धि होती है, इसके बाद एक निरंतर पठार (चित्रा 6 सी, ऊपरी पैनल) पर तेजी से कैल्शियम दोलन होता है।

चूंकि सभी बीटा कोशिकाओं को एक एकल, बड़े, कार्यात्मक सिंकिटियम में युग्मित किया जाता है, इसलिए इन दोलनों को [सीए 2 +] आईसी तरंगों 32,34,52,53,54 (चित्रा 7 सी) को फैलाने के माध्यम से विभिन्न कोशिकाओं के बीच बहुत अच्छी तरह से सिंक्रनाइज़ किया जाता है। 5-15 मिनट की अवधि के साथ धीमी [सीए2 +] आईसी दोलन तेजी से दोलनों को रेखांकित कर सकते हैं या यहां तक कि प्रतिक्रिया55,56 का प्रमुख प्रकार भी हो सकता है। एक ही सरल प्रोटोकॉल प्रतिक्रियाओं के अन्य प्रकार प्रकट कर सकते हैं, विशेष रूप से आइलेट्स की परिधि पर (चित्रा 6 सी, निचले पैनल)। चूंकि ये कोशिकाएं बीटा कोशिकाओं के साथ सिंक्रनाइज़ नहीं होती हैं और तेजी से और अधिक अनियमित दोलनों के साथ प्रतिक्रिया करती हैं जो पहले से ही कम ग्लूकोज स्थितियों में मौजूद हैं या गतिविधि में कमी के साथ, ऐसी प्रतिक्रियाएं गैर-बीटा कोशिकाओं21,32,57,58 के अत्यधिक विचारोत्तेजक हैं। हालांकि, उनके निश्चित कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए अतिरिक्त उत्तेजना चरणों या वैकल्पिक दृष्टिकोणों के साथ अधिक जटिल प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है, जिनकी चर्चा नीचे की गई है। एसिनार और डक्टल कोशिकाओं की विशिष्ट प्रतिक्रियाएं क्रमशः चित्रा 6 डी और चित्रा 6 ई में प्रस्तुत की जाती हैं। एसीनार और डक्टल कोशिकाओं 22,23,35 पर अधिक जानकारी के लिए साहित्य देखें।

Figure 6
चित्रा 6: अग्नाशयी कोशिकाओं के विभिन्न प्रकारों में कैल्शियम गतिशीलता के प्रतिनिधि परिणाम( ए) आसपास के ऊतक के साथ लैंगरहैंस के एक आइलेट की एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवि। स्केल बार = 100 μm. (B) पीले रंग में दिखाए गए एसिनार ऊतक के साथ अग्नाशयी ऊतक के अलग-अलग हिस्सों का चित्रण, लाल रंग में दिखाए गए लैंगरहैंस का एक आइलेट, और नीले रंग में डक्टल पेड़ का एक खंड। स्केल बार = 100 μm. (सी) 12 एमएम ग्लूकोज के साथ उत्तेजना के दौरान बीटा और पुटेटिव गैर-बीटा कोशिकाओं में कैल्शियम गतिशीलता के विशिष्ट निशान; गैर-उत्तेजक स्थितियों के लिए 3 एमएम ग्लूकोज का उपयोग किया गया था। गैर-बीटा कोशिकाओं के अधिक विशिष्ट भेदभाव के लिए उपयोग किए जा सकने वाले प्रोटोकॉल चर्चा अनुभाग में वर्णित हैं। (डी) 25 एनएम एसिटाइलकोलाइन द्वारा उत्तेजित एसिनार कोशिकाओं की कैल्शियम गतिशीलता का एक विशिष्ट निशान। (ई) 1 एमएम चेनोडोक्सिकोलिक एसिड द्वारा उत्तेजित डक्टल कोशिकाओं की कैल्शियम गतिशीलता का एक विशिष्ट निशान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सफल कैल्शियम इमेजिंग के बाद, डेटा को पहले निर्यात किया जाता है और प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित घातीय और रैखिक फिट के संयोजन से विरंजन के लिए सही किया जाता है। विरंजन सुधार से पहले और बाद में एक समय श्रृंखला चित्रा 7 ए में प्रस्तुत की गई है। इसके बाद, प्रतिक्रिया के सक्रियण और निष्क्रियता चरण के साथ-साथ पठार चरण में कई मापदंडों का विश्लेषण किया जा सकता है। उत्तेजना के बाद [सीए2 +] आईसी वृद्धि की शुरुआत में देरी को चित्रा 7 बी में देरीए और व्यक्तिगत कोशिकाओं (देरीए 1) के बीच देरी में विषमता द्वारा दर्शाया जा सकता है। निष्क्रियकरण चरण का वर्णन करनेके लिए एक ही पैरामीटर (देरी डी और देरीडी 1) का उपयोग किया जा सकता है। प्रारंभिक क्षणिक [सीए2 +] आईसी वृद्धि के बाद, एक आइलेट में अधिकांश अग्नाशयी बीटा कोशिकाओं में पठार चरण अपेक्षाकृत नियमित उच्च आवृत्ति [सीए2 +] आईसी दोलनों की विशेषता है। पठार चरण को शास्त्रीय कार्यात्मक मापदंडों का विश्लेषण करके वर्णित किया जा सकता है। [सीए2 +] आईसी दोलनों की योजनाबद्ध प्रस्तुति अवधि, आवृत्ति और सक्रिय समय का प्रतिशत चित्रा 7 सी में प्रस्तुत किया गया है। 10 हर्ट्ज से अधिक अधिग्रहण दर के साथ कैल्शियम इमेजिंग में, बार-बार आइलेट में फैलने वाली कैल्शियम तरंगों को भी स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है (चित्रा 7 सी)।

Figure 7
चित्रा 7: समय-श्रृंखला डेटा का विश्लेषण( ए) फोटोब्लीचिंग के लिए समय-श्रृंखला डेटा का सुधार। (बी) उत्तेजना के बाद सक्रियण और 12 एमएम ग्लूकोज के साथ उत्तेजना की समाप्ति के बाद निष्क्रिय करने में देरी का विश्लेषण। उत्तेजना की अवधि छवि में हल्के भूरे, छायांकित बार द्वारा निरूपित की जाती है। (सी) पठार चरण के कई मापदंडों का विश्लेषण: I) आधी ऊंचाई पर निर्धारित दोलन की अवधि, II) अंतर-दोलन अंतराल द्वारा निर्धारित दोलनों की आवृत्ति। III) आवृत्ति और दोलनों की अवधि के उत्पाद के रूप में सक्रिय समय। I-IV) दोलनों की किसी भी दी गई तरंग में दोलनों के बीच देरी जो लैंगरहैंस के आइलेट में फैलती है, जो उस समय में देरी (Δt) द्वारा निर्धारित होती है जिस पर एक एकल कोशिका दोलन की आधी ऊंचाई तक पहुंच जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 1. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा विधि एक अधिक संरक्षित, सीटू तैयारी में अग्न्याशय के अंतःस्रावी और एक्सोक्राइन भागों की आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक तेज़ प्रयोगात्मक विधि है। परिचय में कई फायदे पहले ही बताए जा चुके हैं। यह इंगित करने योग्य है कि सामान्य रूप से (यानी, न केवल कैल्शियम इमेजिंग के लिए), अग्नाशयी शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए टुकड़ा दृष्टिकोण समय बचाता है क्योंकि इसमें अलगाव के बाद वसूली अवधि शामिल नहीं होती है। उत्तरार्द्ध सभी प्रकार के प्रयोगों और विभिन्न प्रजातियों से पृथक द्वीपों के उपयोग के साथ बिल्कुल आवश्यक नहीं है, लेकिन आमतौर पर शुद्धता बढ़ाने, व्यवहार्यता और कार्यक्षमता को बहाल करने और कभी-कभी कई दाताओं से आइलेट्स इकट्ठा करने के लिए नियोजित किया जाता है 59,60,61,62,63,64 . हालांकि, कैल्शियम इमेजिंग के संदर्भ में, बीटा सेल प्रतिक्रियाओं को संस्कृति की अवधि और स्थितियों पर निर्भर पाया गया है, और यह भिन्नता का एक महत्वपूर्ण स्रोत है जिसे पृथक आइलेट्स15,65 का उपयोग करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। ऊतक स्लाइस के लिए एक ही मुद्दे पर विचार किया जाना चाहिए यदि उनकी दीर्घकालिक संस्कृति भविष्य22,36 में व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला विकल्प बन जाती है। ऊतक टुकड़ा विधि में भी उच्च उपज होती है और इस प्रकार संभावित रूप से पशु पीड़ा को कम करता है और सांख्यिकीय शक्ति को बढ़ाता है। इसके अलावा, एक ही जानवर से कई स्लाइस तैयार किए जा सकते हैं और क्योंकि स्लाइस लंबे समय तक जीवित रहते हैं, जिसमें एक ही जानवर या यहां तक कि प्रयोगात्मक और नियंत्रण समूहों दोनों में एक ही आइलेट भी शामिल है।

चूंकि मूल वास्तुकला और सेल-टू-सेल संचार संरक्षित हैं, और क्योंकि यह कई संरचनात्मक विश्लेषणों, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल, इमेजिंग विधियों और हार्मोन स्राव परखों के साथ संगत है, यह विधि अग्नाशयी कार्यों का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जो व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच निर्बाध बातचीत पर निर्भर करती हैं, उदाहरण के लिए, विभिन्न सेल प्रकारों के बीच स्राव, पैराक्राइन और प्रतिरक्षा बातचीत के प्रति संवेदनशीलता, विद्युत गतिविधि के पैटर्न, कैल्शियम गतिशीलता के गुण, और विभिन्न हार्मोन का स्राव। विशेष रूप से कैल्शियम इमेजिंग के लिए, स्लाइस का उपयोग करने के मुख्य फायदे आइलेट कोर के संपर्क में हैं और उच्च रिज़ॉल्यूशन वाले कई अलग-अलग सेल प्रकारों से संकेत प्राप्त करने की संभावना है। प्रयोग की आवश्यकताओं और जानवरों की उम्र के आधार पर, मोटाई विविध हो सकती है, स्लाइस को ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है, या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड पत्रकारों वाले जानवरों से प्राप्त किया जा सकता है। जैसा कि नीचे अधिक विस्तार से बताया गया है, बाद के दो दृष्टिकोण गैर-बीटा कोशिकाओं 31,66 से प्रतिक्रियाओं की विशिष्ट कार्यात्मक पहचान और लक्षण वर्णन को भी सक्षम करते हैं। इसके अलावा, अंग के अच्छी तरह से परिभाषित भागों से आइलेट्स का अध्ययन रोग के प्रति जवाबदेही या संवेदनशीलता में अंतर के लिए किया जा सकता है। यद्यपि उन्हें इनक्यूबेशन वसूली की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन उन्हें आसानी से विभिन्न औषधीय एजेंटों, फैटी एसिड, उच्च ग्लूकोज और साइटोकिन्स के साथ ऊष्मायन किया जा सकता है।

सबसे महत्वपूर्ण बात, जैसा कि उच्च रिज़ॉल्यूशन एकल-कोशिका या यहां तक कि उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन के साथ संयोजन में प्राप्त करने योग्य है, स्लाइस में कॉन्फोकल कैल्शियम इमेजिंग कैल्शियम तरंगों, कार्यात्मक कनेक्टिविटी और आइलेट54,67 के अलग-अलग हिस्सों में कोशिकाओं की विभिन्न कार्यात्मक भूमिकाओं का विश्लेषण करने के लिए सबसे उपयुक्त तरीकों में से एक है। कई फायदों के बावजूद, ऊतक टुकड़ा दृष्टिकोण की महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। सबसे पहले, यह अभी भी आइलेट और एक्सोक्राइन आर्किटेक्चर के लिए कम से कम आंशिक रूप से विघटनकारी है, विशेष रूप से कट सतह पर, और अतिरिक्त यांत्रिक और अंतर्जात एंजाइमी क्षति को रोकने के लिए तैयारी के दौरान कम तापमान, समाधानों का लगातार आदान-प्रदान और कोमल और त्वरित हेरफेर जैसी सावधानियों की आवश्यकता होती है। दूसरा, पोषक तत्व और स्रावी वितरण के पैटर्न अभी भी विवो मार्ग से नीच हैं, तैयारी प्रणालीगत अंतर्वेशन से अलग है, और अंतर-अंग प्रतिक्रिया, जैसे कि आइलेट और इसके लक्ष्य ऊतकों के बीच, विवो दृष्टिकोणों के विपरीत असंभव है। तीसरा, अधिकतम टुकड़ा मोटाई ~ 200 μm9 पर ऑक्सीजन, पोषक तत्व वितरण और पीएच विनियमन द्वारा सीमित है। इसके अलावा, स्लाइस और इमेजिंग दोनों की तैयारी के लिए बहुत सारे प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है, और लंबे समय तक श्रृंखला और कई कोशिकाओं से कैल्शियम डेटा के गहन विश्लेषण के लिए विशेष ज्ञान की आवश्यकता होती है जो अक्सर शास्त्रीय फिजियोलॉजिस्ट के टूलकिट में शामिल नहीं होता है और भौतिकविदों या डेटा वैज्ञानिकों से मदद की आवश्यकता होती है। लाभ यह है कि होमो- और हेटेरोटाइपिक इंटरैक्शन संरक्षित हैं, ब्याज के क्षेत्रों में अन्य कोशिकाओं से संकेतों की उपस्थिति के कारण नमूनों के विश्लेषण को भी जटिल कर सकते हैं। प्रोटोकॉल के आधार पर, अन्य कोशिकाओं की सक्रियता अप्रत्यक्ष अतिरिक्त उत्तेजना या एक मनाया सेल के निषेध के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

यह केवल डिकॉन्वोल्यूशन दृष्टिकोण द्वारा निर्णायक रूप से हल किया जा सकता है, अधिक जटिल उत्तेजना प्रोटोकॉल द्वारा जिसमें कुछ अप्रत्यक्ष प्रभावों को अवरुद्ध करने वाले पदार्थ शामिल हैं, विशिष्ट नॉक-आउट जानवरों का उपयोग करके, और अधिक न्यूनीकरणवादी पद्धतियों को नियोजित करने वाले अन्य अध्ययनों के परिणामों के साथ परिणामों की सावधानीपूर्वक तुलना करके। इसके अतिरिक्त, यदि स्राव माप आवश्यक हैं, तो यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कुछ स्लाइस में आइलेट्स की कमी हो सकती है, और एक टुकड़े में अंतःस्रावी ऊतक का कुल द्रव्यमान आमतौर पर कम होता है। इमेजिंग के लिए तीव्र अग्नाशयी ऊतक स्लाइस की तैयारी में निम्नलिखित अनुभागों में चर्चा किए गए कई महत्वपूर्ण चरण शामिल हैं और तालिका 1 में संक्षेप ति किया गया है, जहां पाठक समस्या निवारण के लिए संक्षिप्त, लेकिन महत्वपूर्ण सुझाव भी पा सकता है। सबसे पहले, एगरोज़ समाधान तैयार करते समय, एगरोज़ पाउडर को पूरी तरह से भंग करना चाहिए, अन्यथा अविघटित कण इंजेक्शन को बाधित कर सकते हैं। सजातीय एगरोज़ समाधान को 37-45 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि एक तरफ बहुत कम तापमान के कारण एगरोज़ के सख्त होने से रोका जा सके और दूसरी ओर बहुत अधिक तापमान के कारण ऊतक क्षति को रोका जा सके। उपयोग के बाद, शेष एगरोज़ को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और फिर से गरम किया जा सकता है, हालांकि बार-बार फिर से गर्म करने से पानी के वाष्पीकरण के कारण घनत्व में वृद्धि हो सकती है, अंततः इंजेक्शन मुश्किल या असंभव हो जाता है।

तैयारी में अगला महत्वपूर्ण कदम प्रमुख ग्रहणी पैपिला को सही ढंग से क्लैंप करना है। ग्रहणी पर एक सफेद धब्बा सामान्य पित्त नली और ग्रहणी के जंक्शन को इंगित करता है। बहुत समीपस्थ रूप से रखे गए क्लैंप के परिणामस्वरूप सामान्य वाहिनी की कुछ पार्श्व अग्नाशयी शाखाओं में रुकावट आएगी, इन भागों के इंजेक्शन को अक्षम कर दिया जाएगा, जबकि बहुत अलग रखा गया क्लैंप के परिणामस्वरूप निचले प्रतिरोध पथ के माध्यम से सीधे ग्रहणी में रिसाव होगा। आम पित्त नली के कैनुलेशन से पहले, इंजेक्शन के दौरान वाहिनी के बेहतर दृश्य और अधिक नियंत्रण के लिए आसपास के वसा ऊतक को सावधानीपूर्वक हटाया जा सकता है। आसपास के ऊतक को हटाने के दौरान अपर्याप्त परिशुद्धता के परिणामस्वरूप वाहिनी का छिद्र हो सकता है। अगारोज इंजेक्शन के लिए उपयोग की जाने वाली सुई व्यास का चयन भी महत्वपूर्ण है। चूहों में, एक 30 जी सुई अधिमानतः उपयोग किया जाता है; छोटे (32 या 33 जी) सुइयों को एग्रोस समाधान की उच्च चिपचिपाहट के कारण अधिक प्रयास की आवश्यकता होती है और रुकावट के लिए अधिक प्रवण होते हैं। हालांकि, यदि कम घनत्व वाले एगरोज़ समाधान के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो वे छोटे माउस उपभेदों और छोटे जानवरों में बहुत सहायक हो सकते हैं। प्रारंभिक प्रसवोत्तर दिनों के दौरान, एगरोज़ को वैकल्पिक रूप से इंट्राडक्टली2 के बजाय सबकैप्सुलर रूप से इंजेक्ट किया जा सकता है। चूहों में अधिक व्यास के साथ सुइयों का उपयोग करने से संभवतः आम पित्त नली को नुकसान पहुंचेगा। यह सही सुई व्यास के साथ भी हो सकता है, और एक संदंश इंजेक्शन के दौरान सुई को जगह में रखने में मदद कर सकता है। बड़ी नलिकाओं के मामले में बड़े व्यास की सुइयां एकमात्र समाधान हो सकती हैं, जैसा कि चूहों में पाया जाता है। यदि सुई बैक-रिसाव को रोकने वाली एक तंग मुहर सुनिश्चित करने के लिए बहुत संकीर्ण है, तो वाहिनी में सफल प्रवेश पर इसके चारों ओर एक संयुक्ताक्षर रखा जा सकता है।

एगरोज़ इंजेक्शन समाधान की चिपचिपाहट के कारण कुछ प्रयास करता है, और एक बार इंजेक्शन प्रक्रिया शुरू हो जाने के बाद, इसे बाधित नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि इंजेक्शन पूरा होने से पहले सुई या डक्टल पेड़ के सबसे बड़े हिस्सों में कम पिघलने-बिंदु एगरोज़ समाधान जम सकता है। इसके परिणामस्वरूप खराब ऊतक प्रवेश और काटने के दौरान बदतर समर्थन होगा। वाहिनी को हमेशा उस बिंदु पर कैनुलेट किया जाना चाहिए जहां बाएं यकृत वाहिनी और सिस्टिक वाहिनी आम पित्त नली बनाने के लिए जुड़ती हैं .. यदि सामान्य पित्त नली छिद्रित हो जाती है, तो बार-बार ग्रहणी के करीब कैनुलेटिंग का प्रयास करें। जब अग्न्याशय को एगरोज़ समाधान के साथ पर्याप्त रूप से स्थिर किया जाता है और पेरिटोनियल गुहा से निकाला जाता है, तो अच्छी तरह से इंजेक्शन वाले ऊतक के छोटे टुकड़े काट दिए जाते हैं। उन्हें एगरोज़ में एम्बेड करने से पहले, सभी वसा और संयोजी ऊतकों को हटाना महत्वपूर्ण है क्योंकि उनके अवशेष टुकड़ा करने की क्रिया को और अधिक चुनौतीपूर्ण बनाते हैं। वही रक्त वाहिकाओं और वाहिनी अवशेषों पर लागू होता है, सिवाय इसके कि जब वे प्रयोग का ध्यान केंद्रित करते हैं। इस मामले में, उन्हें इस तरह से स्थिति देना सुनिश्चित करें कि वांछित क्रॉस-सेक्शन प्राप्त किया जाएगा। एगरोज़ में ऊतक को एम्बेड करते समय, सुनिश्चित करें कि तापमान उपयुक्त है (37 डिग्री सेल्सियस), और यह कि ऊतक पूरी तरह से एगरोज़ से घिरा हुआ है, क्योंकि वाइब्रेटोम स्लाइसिंग के दौरान बल अग्न्याशय के ऊतकों को अगारोज़ ब्लॉक से चीर सकते हैं।

उन्हें कागज के ऊतक पर संक्षेप में रखकर उन्हें एगरोज में रखने से पहले ऊतक ब्लॉकों को जल्दी से सुखाने से इस चरण के दौरान ऊतक और एगरोज के बीच खराब संपर्क को रोकने में मदद मिल सकती है। एगरोज़ ब्लॉक के जमने के दौरान, पेट्री डिश को क्षैतिज रूप से रखें, और अग्न्याशय ऊतक और पेट्री डिश के नीचे के बीच संपर्क को रोकें। यदि अग्न्याशय को पूरी तरह से इंजेक्ट नहीं किया जाता है, तो काटने की प्रक्रिया चुनौतीपूर्ण होगी। इसलिए, ऊतक स्लाइस प्राप्त करने के लिए काटने की गति को कम करने का प्रयास करें। वाइब्रेटोम स्लाइसिंग के दौरान सेल क्षति को कम करने के लिए, नियमित रूप से टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष में ईसीएस (और ईसीएस से बने बर्फ के टुकड़े) को बदलें। उत्तरार्द्ध टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान एसिनार ऊतक से जारी अग्नाशयी एंजाइमों की गतिविधि को कम कर देगा। स्लाइस की मोटाई भी महत्वपूर्ण महत्व की है। कैल्शियम गतिशीलता और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए, 140 μm स्लाइस आमतौर पर काटे जाते हैं; हालांकि, अध्ययन के उद्देश्य के अनुसार, टुकड़ा मोटाई 90 μm से 200 μm तक हो सकती है। ध्यान रखें कि मोटे स्लाइस में, ऑक्सीजन और पोषक तत्वों का प्रसार सीमित होगा, लेकिन उनमें अधिक ऊतक शामिल होंगे। इसके अतिरिक्त, स्लाइस मोटाई बढ़ने के साथ बिना खतना के आइलेट्स का अनुपात बढ़ने की उम्मीद की जा सकती है। स्लाइस को कई घंटों तक कमरे के तापमान पर नियमित रूप से आदान-प्रदान किए गए ईसीएस में संग्रहीत किया जा सकता है या यहां तक कि कई दिनों तक एक उपयुक्त सेल माध्यम में खेती की जा सकती है; हालाँकि, यह अंततः सामान्य आइलेट सेल फिजियोलॉजी 3,22 को प्रभावित कर सकता है।

डाई समाधान तैयार करते समय, सभी घटकों के सावधानीपूर्वक मिश्रण को सुनिश्चित करें, और परिवेश प्रकाश के संपर्क से बचें। अग्नाशयी टुकड़ा कई सेल परतों से बना है, और कैल्शियम डाई का उत्थान पहले कुछ सबसे सतही सेल परतों तक सीमित है, जैसा कि पहले पृथक आइलेट्स58,68 और पिट्यूटरी स्लाइस 69 के लिए वर्णित है। हालांकि, पृथक द्वीपों के विपरीत जहां आसपास के कैप्सूल और बाहरी सेल परतें गहरी परतों में डाई के प्रवेश में बाधा डालती हैं, ऊतक स्लाइस आइलेट की पूरी क्रॉस-सेक्शनल सतह तक पहुंच की अनुमति देते हैं, जिससे आइलेट की सभी परतों से सैकड़ों कोशिकाओं में कैल्शियम गतिशीलता के एक साथ माप को सक्षम किया जाता है। फ्लोरोसेंट सीए2+ संकेतक कैल्शियम गतिशीलता को मापने के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, और सीएलएसएम के साथ, वे उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ रिकॉर्डिंग को सक्षम करते हैं, कई सौ हर्ट्ज तक पहुंचते हैं। सबसे उपयुक्त फ्लोरोसेंट सीए2 + सूचक का चयन करते समय, सूचक रूप सहित विभिन्न कारकों पर विचार करें, जो सेल लोडिंग विधि, माप मोड (गुणात्मक या मात्रात्मक), और पृथक्करण स्थिरांक (केडी) को प्रभावित करता है जिसे सीए2 + ब्याज की एकाग्रता सीमा में होना चाहिए और पीएच, तापमान, एमजी2 + और अन्य आयनों की उपस्थिति पर निर्भर करता है, साथ ही प्रोटीन बाइंडिंग भी। चूंकि सेलुलर सीए2+ सिग्नल आमतौर पर क्षणिक होते हैं, इसलिए सीए2 + बाध्यकारी दर स्थिर पर भी विचार किया जाना चाहिए। अग्नाशयी कोशिकाओं में [सीए2 +] आईसी गतिशीलता को मापने के लिए, यह समूह मुख्य रूप से इस प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) में वर्णित सेल-पारगम्य सीए 2 + संकेतक डाई का उपयोग करता है क्योंकि यह स्पेक्ट्रम में उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ एक लंबा तरंग दैर्ध्य संकेतक है जहां सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस आमतौर पर कम समस्याग्रस्त होता है, और उत्तेजना प्रकाश की ऊर्जा कम होती है, जो सेलुलर फोटोडैमेज की क्षमता को कम करती है। क्योंकि यह डाई कम सीए2 + सांद्रता पर फ्लोरोसेंट है, यह बेसलाइन [सीए2 +] आईसी के निर्धारण की सुविधा प्रदान करता है और उत्तेजना से पहले सेलुलर दृश्यता बढ़ाता है। बाध्यकारी सीए2+ के बाद, डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता 14 गुना बढ़ जाती है, जिससे [सीए2 +] आईसी में मामूली बदलाव का पता लगाने में सक्षम होता है।

सफल लाइव सेल कैल्शियम इमेजिंग के लिए, प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में कई महत्वपूर्ण हार्डवेयर मापदंडों पर विचार किया जाना चाहिए। लाइव-सेल इमेजिंग के लिए जिसमें सिग्नल आयाम कम होते हैं और फोटोटॉक्सिसिटी की संभावना अधिक होती है, उच्च एनए वाले उद्देश्यों का उपयोग अधिमानतः नमूने से अधिक प्रकाश एकत्र करने के लिए किया जाता है। यदि कैल्शियम गतिशीलता को उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ दर्ज किया जाना चाहिए, तो रैखिक गैल्वेनोमीटर के बजाय गुंजयमान स्कैनर का उपयोग करें। सही उद्देश्य चुनने के अलावा, अत्यधिक संवेदनशील डिटेक्टरों का उपयोग- जैसे हाइब्रिड डिटेक्टर जिन्हें कम लेजर पावर की आवश्यकता होती है- फोटोटॉक्सिसिटी और फोटोब्लीचिंग से बचते हैं। लंबे समय तक चलने वाले कैल्शियम इमेजिंग के लिए इसका विशेष महत्व है। कैल्शियम इमेजिंग में अन्य महत्वपूर्ण कदम समय श्रृंखला अधिग्रहण के लिए छवि गुणवत्ता की पैरामीटर सेटिंग्स हैं। सबसे महत्वपूर्ण लौकिक और स्थानिक संकल्प हैं। चूंकि कैल्शियम गतिशीलता प्रति से सबसे कम स्वीकार्य अस्थायी रिज़ॉल्यूशन निर्धारित करती है, इसलिए सिग्नल का पता लगाने के लिए नमूना दर अपेक्षित सिग्नल आवृत्ति से कम से कम दो गुना अधिक होनी चाहिए या सिग्नल के आकार का मज़बूती से पता लगाने के लिए 10 गुना अधिक होनी चाहिए। तीव्र अग्नाशयी ऊतक स्लाइस में, कैल्शियम गतिशीलता को एक साथ सैकड़ों कोशिकाओं में मापा जा सकता है और इसलिए, स्थानिक संकल्प भी महत्वपूर्ण है। इसे पिक्सेल की संख्या बढ़ाकर या लाइव अधिग्रहण के दौरान औसत लाइन बढ़ाकर बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, स्थानिक और लौकिक संकल्प के बीच व्युत्क्रम संबंध के कारण, दोनों सेटिंग्स के बीच एक व्यापार-बंद की आवश्यकता होती है।

यदि कैल्शियम इमेजिंग को अग्न्याशय के भीतर एक विशिष्ट कोशिका आबादी में किया जाना है, तो टुकड़े के भीतर कोशिकाओं को कार्यात्मक रूप से अलग करने में सक्षम एक उत्तेजना आवश्यक है। उच्च ग्लूकोज मज़बूती से और जल्दी से बीटा कोशिकाओं को एक दोलन पैटर्न में सक्रिय करता है जो एक ऊंचे कैल्शियम स्तर पर आरोपित होता है और एक आइलेट 32,58,70 के भीतर सभी कोशिकाओं के बीच अत्यधिक सिंक्रनाइज़ होता है। बीटा कोशिकाएं एक आइलेट के भीतर सबसे अधिक सेल प्रकार हैं और ज्यादातर चूहों में आइलेट कोर में स्थित हैं। एक ही उत्तेजना प्रोटोकॉल कम हो जाता है और कभी-कभी अल्फा कोशिकाओं30,32,58,70,71,72 में फटने को सराहनीय रूप से नहीं बदलता है। अल्फा कोशिकाओं को कार्यात्मक रूप से भेदभाव करने के लिए, कम (3 एमएम) ग्लूकोज, ग्लूटामेट या एड्रेनालाईन का उपयोग उनकी आवृत्ति या बेसल [सीए2 +] आईसी 21,72,73,74,75 को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है। वे आइलेट कोशिकाओं के 10-20% का प्रतिनिधित्व करते हैं और आइलेट परिधि1 पर पता लगाया जाएगा। परिधि पर डेल्टा कोशिकाएं भी पाई जाती हैं। वे एक आइलेट में अंतःस्रावी कोशिकाओं की कुल संख्या का केवल ~ 5% बनाते हैं और आमतौर पर 6 एमएम ग्लूकोज में सक्रिय होते हैं और बेसलाइन से अनियमित फटने की गतिविधि में वृद्धि के साथ ग्लूकोज उत्तेजना का जवाब देते हैं या थोड़ा ऊंचा कैल्शियम स्तर 1,32,71,76। घ्रेलिन का उपयोग कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों में डेल्टा कोशिकाओं 21,77,78,79 की विशिष्ट उत्तेजना के लिए किया जा सकता है। हालांकि, पीपी और एप्सिलॉन कोशिकाओं की विशिष्ट कार्यात्मक पहचान के लिए प्रोटोकॉल को परिभाषित किया जाना बाकी है। इसके अलावा, 25 एनएम एसिटाइलकोलाइन मज़बूती से 35,80,81 गतिविधि में एसीनार कोशिकाओं को सक्रिय करता है। इसके अतिरिक्त, कई अन्य स्रावी, जैसे सेरुलिन, कोलेसिस्टोकिनिन और कार्बामिलकोलाइन का उपयोग एसीनार कोशिकाओं 22,40,82,83 में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को पैदा करने के लिए किया जा सकता है।

अंत में, 1 एमएम चेनोडोक्सिकोलिक एसिड मज़बूती से ऊतक स्लाइस में डक्टल कोशिकाओं में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को उजागर करता है; एंजियोटेंसिन द्वितीय, एटीपी, और कुछ अन्य स्रावों का उपयोग 11,23,84,85 भी किया जा सकता है। जब भी विशिष्ट स्रावी और अवरोधकों के लिए विशिष्ट प्रतिक्रियाओं के आधार पर एक कार्यात्मक पहचान पर्याप्त नहीं होती है, तो आनुवंशिक रूप से लेबल किए गएजानवरों 31, ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं73, या इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री को विभिन्न सेलप्रकारों की पहचान के लिए नियोजित किया जा सकता है 9,22,71,86 . पिछले कुछ वर्षों के दौरान, ऊतक टुकड़ा विधि को सफलतापूर्वक मानव ऊतक के लिए अनुकूलित किया गया है, जिससे एक्सोक्राइन 41 और अंतःस्रावी शरीर विज्ञान 9,36,37,39 दोनों में कई नए महत्वपूर्ण शोध रास्ते खुल गए हैं। दिलचस्प बात यह है कि मानव द्वीपों में कैल्शियम गतिशीलता का एक विस्तृत मूल्यांकन कुख्यात रूप से कठिन रहा है औरअधिक विस्तार से जांच की जानी बाकी है। उन्नत कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त, अग्नाशयी ऊतक टुकड़ा विधि ने चूहों में कैल्शियम गतिशीलता में कई नई अंतर्दृष्टि सक्षम की है और उम्मीद है कि मानव ऊतक के लिए भी ऐसा ही होगा।

Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय हित की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था।

Acknowledgments

इस अध्ययन में प्रस्तुत कार्य को स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी (अनुसंधान कोर फंडिंग नं. पी 3-0396 और आई0-0029, साथ ही अनुसंधान परियोजनाएं नं। जे 3-9289, एन 3-0048, और एन 3-0133) और ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष / हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मारुसा रोसर, मासा काटर और रूडी म्लाकर को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Analytical balance KERN ALJ 120-4 KERN & SOHN GmbH ALJ 160-4A
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup Leica 5100001578
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup Leica
Cork pad 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL centrifuge tubes Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430790
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L Fischer Scientific, Leicestershire, UK 432124
Double edge razor blade Personna, USA
Dumont #5 - Fine Forceps FST, Germany 11254-20
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 0030 121.023
Erlenmeyer flask 200 mL IsoLab, Germany 027.01.100
Fine Scissors - ToughCut FST, Germany 14058-11
Flat orbital shaker  IKA KS 260 basic IKA Ident. No.: 0002980200
Glass lab bottle 1000 mL IsoLab, Germany 091.01.901
Hartman Hemostat, curved FST, Germany 13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) Leica 15507701
Measuring cylinder 25 mL IsoLab, Germany 015.01.025
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Microwave owen Gorenje, Slovenia MO20MW
Osmometer Gonotec 010 Gonotec, Berlin, Germany OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
Paint brush Faber-Castell, No.2 Any thin soft round paint brush No.2, preferably black
Paper towels
Perifusion pumps Ismatec ISM 827 Reglo Analog MS - 4/8
Petri dish 100/20 mm Sarstedt 83.3902
Petri dish 35/10 mm Greiner bio-one 627102
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA 153066 NON-STICKY for agarose blocks
pH meter inoLab pH Level 1 WTW, Weilheim, Germany E163694
Pipette 1000 mL Eppendorf 3121 000.120
Pipette 50 mL Eppendorf 3121 000.066
Push pins 23 mm Deli, Ningbo, China E0021
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Semken Forceps FST, Germany 11008-13
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask IsoLab, Germany 027.11.048
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 Nikon, Melville, NY USA
Syringe Injekt Solo 5 mL Braun, Melsungen, Germany 4606051V
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") Braun, Melsungen, Germany 4656300
Temperature controller Luigs & Neumann 200-100 500 0150, 200-150-500-145 Slice mini chamber, Temperature controller TC 07
Tubings for perifusion system Ismatec SC0310 Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
Ultrasonic bath Studio GT-7810A Globaltronics
Vibrotome Leica VT 1000 S Leica, Nussloch, Germany 14047235613
Volumetric flask 1000 mL IsoLab, Germany 013.01.910
Vortex mixer Neolab 7-2020 Neolab  7-2020
Water bath Thermo Haake open-bath circulator Thermo Fisher Scientific Z527912
Material/Reagent
Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany C5080-500G
D-(+)-glucose Sigma Aldrich, Germany G8270-1KG
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D4540-100ML
DL-lactic acid Sigma Aldrich, Germany L1250-500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Merck KGaA, Darmstadt, Germany D8662-500ML
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020
HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G
L-(+)-ascorbic acid Sigma Aldrich, Germany A9,290-2
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA L3224
Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany M2670-500G
Myo-inositol Sigma Aldrich, Germany I5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM Invitrogen (Thermo FisherScientific) O6807 cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) P3000MP polaxamer: nonionic triblock copolymer
Potassium chloride - KCl Sigma Aldrich, Germany 31248
SeaPlaque GTG agarose Lonza, Rockland, USA 50111
Sodium bicarbonate - NaHCO3 Honeywell, Germany 31437-500G
Sodium chloride - NaCl Honeywell, Germany 31434-1KG
Sodium hydroxide - NaOH Sigma Aldrich, Germany 30620
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 Sigma Aldrich, Germany S0751-500G
Sodium pyruvate Sigma Aldrich, Germany 15990-100G
Software
FIJI FIJI is an open source project
LASAF Leica microsystems, Inc.
Matlab Mathworks
Python Python Software Foundation Python is an open source project

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Stožer, A., Dolenšek, J., Križančić Bombek, L., Pohorec, V., Slak Rupnik, M., Klemen, M. S. Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62293, doi:10.3791/62293 (2021).

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