Vi presenterer forberedelsen av akutte bukspyttkjertelvev skiver og deres bruk i konfokal laser skanning mikroskopi for å studere kalsiumdynamikk samtidig i et stort antall levende celler, over lange tidsperioder, og med høy romlig løsning.
Den akutte pankreasvevsskiven for mus bukspyttkjertelen er et unikt in situ-preparat med bevart intercellulær kommunikasjon og vevsarkitektur som medfører betydelig færre forberedelsesinduserte endringer enn isolerte holmer, akini, kanaler eller dispergerte celler beskrevet i typiske in vitro-studier. Ved å kombinere den akutte bukspyttkjertelvevsskiven med levende celle kalsiumavbildning i konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM), kan kalsiumsignaler studeres i et stort antall endokrine og eksokrine celler samtidig, med en enkeltcellet eller til og med subcellulær oppløsning. Følsomheten tillater påvisning av endringer og muliggjør studiet av intercellulære bølger og funksjonell tilkobling samt studiet av avhengigheten av fysiologiske responser av celler på deres lokalisering innenfor holme- og parakrineforholdet med andre celler. Til slutt, fra dyrevelferdsperspektivet, senker registreringen av signaler fra et stort antall celler om gangen antall dyr som kreves i eksperimenter, noe som bidrar til 3R-erstatnings-, reduksjons- og raffineringsprinsippet.
Pattedyr bukspyttkjertelen er en stor eksokrine og endokrine kjertel. Eksokrindelen utgjør 96-99% av det totale bukspyttkjertelvolumet og består av akini og kanaler. Den endokrine delen består av et stort antall holmer av Langerhans som står for de resterende 1-4% av det totale bukspyttkjertelen volum1. Eksokrindelen skiller ut store fordøyelsesenzymer som bryter ned energirike polymerer i mat, samt en bikarbonatrik væske, som kombineres med andre gastrointestinale sekreter for å gi et miljø som passer for virkningen av enzymer. Den endokrine delen skiller ut hormoner som regulerer postprandial distribusjon, lagring og interprandial frigjøring av energirike næringsstoffer. Selv om eksokrine vevet er relativt underutviklet og endokrine relativt godt utviklet ved fødselen, overgroder førstnevnte raskt sistnevnte ved avvenning 2,3,4. Tidlige studier av bukspyttkjertelfunksjon markerte fødselen av moderne fysiologi, og store metodologiske fremskritt på feltet har blitt etterfulgt av store vitenskapelige breaktroughs5. Å jobbe med bukspyttkjertelen er teknisk utfordrende på grunn av den intrikate strukturen i kjertelen, men er også en stor motivasjon på grunn av sykdommer som bukspyttkjertelkreft, pankreatitt og diabetes som presenterer store trusler mot folkehelsen, og for hvilke nye terapeutiske tilnærminger som trengs.
Isolerte holmer6, acini 7,8 og kanalfragmenter hadde blitt utviklet og brukt i flere tiår som gullstandardmetoder på grunn av deres fordeler sammenlignet med cellelinjer og primære dispergerte endokrine, acinar og kanalceller 9,10. Til tross for den markant forbedrede funksjonen til isolerte cellekollektiver, innebærer disse metodene fortsatt betydelig mekanisk og enzymatisk stress, isolerer celler fra det omkringliggende vevet og mangler dermed parakrineinteraksjoner og mekanisk støtte, og viktigst av alt, ledsages av betydelige endringer i normal fysiologi 11,12,13 . Den akutte pankreasvevsskiven for mus ble utviklet i 2001 av et opplevd behov for å utvikle en eksperimentell plattform som ligner på hjerne-, hypofyse- og binyreskiver med bevarte intercellulære kontakter, parakrineinteraksjoner, mesenchyme og vevsarkitektur, samt uten noen av de viktigste manglene i gullstandardmetoden i holmeforskning av den tiden- de isolerte holmene12, 14. Blant disse manglene er skade på de ytterste lagene, mangel på tilgjengelighet av kjerne holmeområder, og behovet for dyrking med muligens viktige effekter på celleidentitet og fysiologi12,15. Videre muliggjør vevsskivemetoden studier på dyremodeller med grovt forstyrret holmearkitektur der det er umulig å isolere holmer, eller når holmeutbyttet er ekstremt lavt ved tradisjonell isolasjon 16,17,18,19,20,21.
I tillegg er stykket mer egnet for å studere morfologiske endringer under utvikling av diabetes og pankreatitt, for eksempel, da det gir en bedre oversikt over hele vevet og er også kompatibel med å studere regionale forskjeller. Viktig, til tross for det tidlige fokuset på den endokrine delen, muliggjør vevsskivemetoden iboende studiet av de eksokrine komponentene 9,22,23. I løpet av det første tiåret etter introduksjonen ble metoden brukt til elektrofysiologiske studier av beta 14,24,25,26,27,28,29 og alfa 30,31 celler samt for å undersøke morfologiske og funksjonelle modning av bukspyttkjertelen 2,3 . Et tiår senere i 2013 ble metoden vellykket tilpasset for levende celle kalsiumavbildning av holmeceller ved hjelp av CLSM for å karakterisere deres respons på glukose32, deres funksjonelle tilkoblingsmønstre33, og forholdet mellom membranpotensial og intracellulært kalsium ved å kombinere en fluorescerende kalsiumfarge med et membranpotensialfargestoff 34. Senere samme år ble metoden også brukt til å vurdere kalsiumdynamikk i acinarceller22,35. I løpet av de følgende årene har bukspyttkjertelvevsskiver blitt brukt i en rekke forskjellige studier og vellykket tilpasset gris og menneskelig vev 9,36,37,38,39,40,41. Men samlet sett er kalsiumavbildning-i-mus bukspyttkjertelvev skiver generelt og i holmer spesielt -er fortsatt for det meste utført av denne gruppen. En av hovedårsakene til dette kan ligge i kombinasjonen av en teknisk utfordrende vevsskiveforberedelse, behovet for et konfokalt mikroskop og ganske kompleks dataanalyse. Hovedmålet med det nåværende papiret er å gjøre denne kraftige metoden mer tilgjengelig for andre potensielle brukere.
Det er allerede noen gode metodologiske artikler som omhandler i detalj med vevsskiveforberedelse og bruk av skiver til strukturelle og sekresjonsstudier, men ikke for konfikal kalsiumavbildning 9,42,43. Derfor fokuserer dette papiret på noen ekstra tips og triks under utarbeidelsen av skiver, på trinn som er kritiske for vellykket fargeinnlasting, bildeanskaffelse, samt på hovedtrinnene i grunnleggende kalsiumdataanalyse. Derfor bør dette bidraget ses på som komplementært til i stedet for som et alternativ for ovennevnte metode. På samme måte skal kalsiumavbildning i pankreasvevsskiver for mus ses på som en eksperimentell tilnærming som skal brukes til å svare på spesifikke spørsmål og er dermed komplementært til snarere enn et absolutt alternativ for andre kalsiumavbildningsmetoder i bukspyttkjertelfysiologi som isolerte kanaler eller akini, isolerte holmer, organoider, holmer transplantert inn i øyets fremre kammer, og innspillinger in vivo 11,44,45,46,47,48. Løftet om kalsiumavbildning i pankreasvevskiver hos mus er sannsynligvis best illustrert ved nylige vellykkede registreringer av kalsiumdynamikk i holmemesenchymale celler som pericytter49 og makrofager50, samt i kanalceller23.
Bukspyttkjertelvevsskivemetoden er en rask eksperimentell metode for å studere morfologien og fysiologien til de endokrine og eksokrine delene av bukspyttkjertelen i en mer bevart, in situ forberedelse. Mange av fordelene er allerede påpekt i innledningen. Det er verdt å påpeke at generelt (dvs. ikke bare for kalsiumavbildning), sparer skivetilnærmingen for å studere bukspyttkjertelfysiologi tid fordi det ikke innebærer en gjenopprettingsperiode etter isolasjon. Sistnevnte er ikke absolutt nødvendig med alle typer eksperimenter og bruk av isolerte holmer fra forskjellige arter, men brukes vanligvis til å øke renhet, gjenopprette levedyktighet og funksjonalitet, og noen ganger å samle holmer fra flere givere 59,60,61,62,63,64 . Men i sammenheng med kalsiumavbildning har betacelleresponser vist seg å avhenge av kulturens varighet og forhold, og dette er en viktig kilde til variasjon som bør tas i betraktning ved bruk av isolerte holmer15,65. Det samme problemet bør vurderes for vevsskiver hvis deres langsiktige kultur blir et mye brukt alternativ i fremtiden22,36. Vevsskivemetoden har også et høyt utbytte og reduserer dermed potensielt dyrelidelser og øker statistisk kraft. Videre kan så mange skiver fremstilles fra et enkelt dyr, og fordi skivene overlever i lange perioder, inkludert samme dyr eller til og med samme holme i både eksperimentelle og kontrollgruppene blir gjennomførbare.
Etter hvert som den opprinnelige arkitekturen og celle-til-celle-kommunikasjonen bevares, og fordi den er kompatibel med en rekke strukturelle analyser, elektrofysiologiske, avbildningsmetoder og hormonsekresjonsanalyser, er denne metoden spesielt nyttig for å studere bukspyttkjertelfunksjoner som er avhengige av uforstyrrede interaksjoner mellom individuelle celler, for eksempel følsomhet overfor secretagogues, paracrine og immuninteraksjoner mellom forskjellige celletyper, mønstre av elektrisk aktivitet, egenskaper av kalsiumdynamikk og sekresjon av forskjellige hormoner. For kalsiumavbildning spesielt er de viktigste fordelene ved å bruke skiver eksponeringen av holmekjernen og muligheten til å skaffe signaler fra mange forskjellige celletyper med høy oppløsning. Avhengig av kravene til eksperimentet og dyrenes alder, kan tykkelsen varieres, skivene kan transfekeres, eller oppnås fra dyr med genetisk kodede reportere. Som forklart mer detaljert nedenfor, muliggjør de to sistnevnte tilnærmingene også spesifikk funksjonell identifikasjon og karakterisering av svar fra ikke-betaceller 31,66. Videre kan holmer fra veldefinerte deler av orgelet studeres for forskjeller i respons eller følsomhet for sykdom. Selv om de ikke krever en utvinning inkubasjonsperiode, kan de lett inkuberes med forskjellige farmakologiske midler, fettsyrer, høy glukose og cytokiner.
Viktigst, da høy oppløsning er oppnåelig i kombinasjon med encellet eller til og med subcellulær oppløsning, er konfokal kalsiumavbildning i skiver en av de mest egnede metodene for å analysere kalsiumbølger, funksjonell tilkobling og de forskjellige funksjonelle rollene til celler i forskjellige deler av en holme54,67. Til tross for en rekke fordeler har vevsskivetilnærmingen viktige begrensninger. For det første er det fortsatt delvis forstyrrende for holme- og eksokrine arkitektur, spesielt på kuttoverflaten, og forholdsregler, for eksempel lav temperatur, hyppig utveksling av løsninger og mild og rask manipulering, er nødvendig under forberedelsen for å forhindre ytterligere mekanisk og endogen enzymatisk skade. For det andre er mønstrene for nærings- og secretagogue-levering fortsatt dårligere enn in vivo-ruten, preparatet er løsrevet fra systemisk innervering, og interorgantilbakemelding, som mellom holmen og målvevet, er umulig, i motsetning til in vivo-tilnærminger. For det tredje er maksimal skivetykkelse begrenset av oksygenering, næringstilførsel og pH-regulering ved ~ 200 μm9. Videre trenger både forberedelse av skiver og avbildning mye trening, og grundige analyser av kalsiumdata fra lange tidsserier og fra mange celler krever spesialisert kunnskap som ofte ikke er inkludert i verktøysettet til en klassisk fysiolog og krever hjelp fra fysikere eller dataforskere. Fordelen med at homo- og heterotypiske interaksjoner bevares, kan også komplisere analysen av prøver på grunn av tilstedeværelsen av signaler fra andre celler i interesseområder. Avhengig av protokoller kan aktivering av andre celler føre til indirekte ytterligere stimulering eller hemming av en observert celle.
Dette kan bare løses avgjørende ved dekonvolusjonstilnærminger, ved mer komplekse stimuleringsprotokoller, inkludert stoffer som blokkerer noen av de indirekte effektene, ved å bruke spesifikke knock-out dyr, og ved nøye sammenligning av resultater med resultater fra andre studier som bruker mer reduksjonistiske metoder. I tillegg, hvis sekresjonsmålinger er nødvendige, bør du huske på at noen skiver kan mangle holmer, og den totale massen av endokrine vev i en enkelt skive er vanligvis lav. Utarbeidelsen av akutte bukspyttkjertelvevsskiver for avbildning innebærer flere kritiske trinn som er omtalt i avsnittene nedenfor og oppsummert i tabell 1, der leseren også kan finne korte, men viktige tips for feilsøking. Først, når du forbereder agaroseoppløsningen, må agarosepulveret oppløses helt, ellers kan de uløste partiklene hindre injeksjonen. Hold den homogene agaroseoppløsningen ved 37-45 °C for å forhindre herding av agarose på grunn av for lav temperatur på den ene siden og for å forhindre vevsskader på grunn av for høye temperaturer på den annen side. Etter bruk kan den gjenværende agarose lagres ved 4 °C og varmes opp igjen, selv om gjentatt oppvarming kan føre til økt tetthet på grunn av vannfordampning, noe som til slutt gjør injeksjonen vanskelig eller umulig.
Det neste kritiske trinnet i preparatet er å klemme den store duodenale papillaen riktig. En hvit flekk på tolvfingertarmen indikerer krysset mellom den vanlige gallekanalen og tolvfingertarmen. En klemme plassert for proksimalt vil resultere i hindring av noen laterale bukspyttkjertelgrener av den vanlige kanalen, deaktivere injeksjonen av disse delene, mens en klemme plassert for distalt vil føre til at agarose lekker gjennom den nedre motstandsbanen direkte inn i tolvfingertarmen. Før kanalisering av den vanlige gallekanalen kan det omkringliggende fettvevet forsiktig fjernes for bedre visualisering av kanalen og større kontroll under injeksjon. Utilstrekkelig presisjon under fjerning av det omkringliggende vevet kan føre til perforering av kanalen. Valget av nålediameteren som brukes til agarose injeksjon er også viktig. Hos mus brukes en 30 G nål fortrinnsvis; mindre (32 eller 33 G) nåler krever mer innsats på grunn av høy viskositet av agaroseoppløsningen og er mer utsatt for obstruksjon. Men hvis de brukes i kombinasjon med en agaroseløsning med lavere tetthet, kan de være svært nyttige i mindre musestammer og yngre dyr. I løpet av de første barseldagene kan agarose alternativt injiseres subkapsulært i stedet for intraductally2. Bruk av nåler med større diameter hos mus vil mest sannsynlig føre til skade på den vanlige gallekanalen. Dette kan også skje med riktig nåleediameter, og en tang kan bidra til å holde nålen på plass under injeksjon. Nåler med større diameter kan være den eneste løsningen i tilfelle større kanaler, som finnes hos rotter. Hvis nålen er for smal til å sikre en tett forsegling som forhindrer tilbakelekkasje, kan en ligatur plasseres rundt den ved vellykket inntreden i kanalen.
Agarose injeksjon tar litt innsats på grunn av løsningens viskositet, og når injeksjonsprosessen har startet, bør den ikke avbrytes da den lavsmeltende agaroseoppløsningen kan størkne i nålen eller de største delene av kanaltreet før injeksjonen er fullført. Dette vil resultere i dårlig vev penetrasjon og verre støtte under kutting. Kanalen skal alltid være kanylert på det punktet hvor venstre leverkanal og den cystiske kanalen kobles sammen for å danne den vanlige gallekanalen.. Hvis den vanlige gallekanalen blir perforert, prøv gjentatte ganger å cannulating nærmere tolvfingertarmen. Når bukspyttkjertelen er tilstrekkelig stabilisert med agaroseoppløsning og ekstrahert fra bukhulen, kuttes små biter av godt injisert vev. Før du legger dem inn i agarose, er det avgjørende å fjerne alle fett- og bindevevene når rester gjør kuttingen mer utfordrende. Det samme gjelder blodkar og kanalrester, unntatt når de er fokus for eksperimentet. I dette tilfellet må du sørge for å plassere dem på en slik måte at ønsket tverrsnitt vil bli oppnådd. Når du legger inn vevet i agarose, må du sørge for at temperaturen er passende (37 °C), og at vevet er helt omgitt av agarose, da krefter under vibratom kutting kan rive ut bukspyttkjertelvevet fra de agarose blokkene.
Rask tørking av vevsblokkene før du plasserer dem i agarose ved å plassere dem kort på et papirvev, kan bidra til å forhindre dårlig kontakt mellom vev og agarose i løpet av dette trinnet. Under størkning av agarose blokker, plasser Petri parabolen horisontalt, og forhindre kontakt mellom bukspyttkjertelen vev og bunnen av Petri parabolen. Hvis bukspyttkjertelen ikke injiseres helt, vil skjæreprosessen være utfordrende. Prøv derfor å redusere skjærehastigheten for å oppnå vevsskiver. For å minimere celleskader under vibratom kutting, bytt ut ECS (og isbitene laget av ECS) regelmessig i skjærekammeret. Sistnevnte vil redusere aktiviteten til bukspyttkjertelenzymer frigjort fra acinarvev under kutting. Tykkelsen på skivene er også av avgjørende betydning. For kalsiumdynamikk og elektrofysiologiske eksperimenter blir 140 μm skiver vanligvis kuttet; Men i henhold til målet med studien kan skivetykkelsen variere fra 90 μm til 200 μm. Husk at i tykkere skiver vil diffusjonen av oksygen og næringsstoffer være begrenset, men de vil inkludere mer vev. I tillegg kan andelen uklippede holmer forventes å øke med økende skivetykkelse. Skiver kan lagres i en regelmessig byttet ECS ved romtemperatur i flere timer eller til og med dyrkes i et passende cellemedium i flere dager; Dette kan imidlertid til slutt påvirke den normale holmecellefysiologien 3,22.
Når du forbereder fargestoffløsningen, må du sørge for forsiktig blanding av alle komponenter, og unngå eksponering for omgivelseslys. Bukspyttkjertelskiven består av mange cellelag, og opptaket av kalsiumfarge er begrenset til de første mest overfladiske cellelagene, som beskrevet tidligere for isolerte holmer58,68 og hypofyseskiver69. Men i motsetning til isolerte holmer der den omkringliggende kapselen og ytre cellelag hindrer penetrasjon av fargestoffet i dypere lag, gir vevsskiver tilgang til hele tverrsnittsoverflaten av holmen, noe som muliggjør samtidig måling av kalsiumdynamikk i hundrevis av celler fra alle lag av en holme. Fluorescerende Ca2+ indikatorer er de mest brukte for måling av kalsiumdynamikk, og sammen med CLSM muliggjør de opptak med høy temporal oppløsning, og når flere hundre Hertz. Når du velger den mest passende fluorescerende Ca2+ indikatoren, bør du vurdere forskjellige faktorer, inkludert indikatorformen, som påvirker cellelastemetoden, målemodus (kvalitativ eller kvantitativ) og dissosiasjonskonstant (Kd) som må være i Ca2 + konsentrasjonsområdet av interesse og avhenger av pH, temperatur, tilstedeværelse av Mg2 + og andre ioner, samt proteinbinding. Siden cellulære Ca2+-signaler vanligvis er forbigående, bør ca2+ bindingshastighetskonstanten også vurderes. For måling av [Ca2+]IC-dynamikken i bukspyttkjertelceller bruker denne gruppen hovedsakelig den cellegjennomtrengelige Ca2+ indikatorfargen som er beskrevet i denne protokollen (Materialtabell), da det er en lang bølgelengdeindikator med utslippsbølgelengdene i spekteret der cellulær autofluorescence vanligvis er mindre problematisk, og energien til eksitasjonslys er lav, noe som reduserer potensialet for cellulær fotodamage. Fordi dette fargestoffet er fluorescerende ved lave Ca2+ konsentrasjoner, letter dette bestemmelsen av baseline [Ca2 +]IC og øker cellulær synlighet før stimulering. Etter å ha tilsagt Ca2+, øker fluorescensintensiteten til fargestoffet 14 ganger, noe som muliggjør påvisning av selv små endringer i [Ca2+]IC.
For vellykket kalsiumavbildning i levende celler må flere viktige maskinvareparametere vurderes, som beskrevet i protokolldelen. For levende celleavbildning der signalamplituder er lave og sjansene for fototoksisitet er høye, brukes mål med høyere NA fortrinnsvis til å samle mer lys fra prøven. Hvis kalsiumdynamikk må registreres med høy temporal oppløsning, bruk resonansskanneren i stedet for lineære galvanisometre. I tillegg til å velge riktig mål, unngår bruk av svært følsomme detektorer – for eksempel hybriddetektorer som krever mindre laserkraft, fototoksisitet og fotobleaching. Dette er av spesiell betydning for langvarig kalsiumavbildning. Andre viktige trinn i kalsiumavbildning er parameterinnstillinger for bildekvalitet for tidsserieanskaffelser. De viktigste er den tidsmessige og romlige oppløsningen. Ettersom kalsiumdynamikken i seg selv bestemmer den laveste akseptable temporale oppløsningen, må samplingsfrekvensen være minst to ganger høyere enn forventet signalfrekvens for å oppdage signalet eller til og med 10 ganger høyere for å oppdage formen på signalet pålitelig. I akutte bukspyttkjertelvevsskiver kan kalsiumdynamikk måles i hundrevis av celler samtidig, og derfor er den romlige oppløsningen også viktig. Dette kan forbedres ved å øke antall piksler eller ved å øke linjegjennomsnittet under direkte anskaffelse. På grunn av det inverse forholdet mellom den romlige og den tidsmessige oppløsningen er det imidlertid nødvendig med en avveining mellom begge innstillingene.
Hvis kalsiumavbildning må utføres i en bestemt cellepopulasjon i bukspyttkjertelen, er det nødvendig med en stimulans som kan skille cellene i stykket funksjonelt. Høy glukose reliably og raskt aktiverer betaceller til et oscillatorisk mønster som er lagt på et forhøyet kalsiumnivå og er svært synkronisert blant alle celler i en holme 32,58,70. Betacellene er den mest tallrike celletypen i en holme og ligger for det meste i holmekjernen hos mus. Den samme stimuleringsprotokollen reduseres og endrer noen ganger ikke sprengningen i alfaceller 30,32,58,70,71,72. For å diskriminere alfaceller funksjonelt, kan lav (3 mM) glukose, glutamat eller adrenalin brukes til å øke frekvensen eller basal [Ca2+]IC 21,72,73,74,75. De representerer 10-20% av holmecellene og vil bli oppdaget på holmen periferi1. Deltaceller finnes også i periferien. De utgjør bare ~ 5% av det totale antallet endokrine celler i en holme og er vanligvis aktive i 6 mM glukose og reagerer på glukosestimulering med økt uregelmessig sprengningsaktivitet fra grunnlinjen eller et litt forhøyet kalsiumnivå 1,32,71,76. Ghrelin kan brukes til spesifikk stimulering av deltaceller 21,77,78,79 i kalsiumavbildningsforsøk. Protokoller for spesifikk funksjonell identifikasjon av PP- og epsilonceller gjenstår imidlertid å definere. Videre aktiverer 25 nM acetylkolin pålitelig acinarceller til sprengningsaktivitet 35,80,81. I tillegg kan en rekke andre secretagogues, som cerulein, cholecystokinin og karbamylcholine, brukes til å fremkalle kalsiumresponser i acinarceller 22,40,82,83.
Til slutt fremkaller 1 mM kenodeoksykolsyre pålitelig kalsiumresponser i kanalceller i vevsskiver; angiotensin II, ATP og noen andre secretagogues kan også brukes 11,23,84,85. Når en funksjonell identifikasjon basert på karakteristiske responser på spesifikke sekretesse og hemmere ikke er tilstrekkelig, kan genetisk merkede dyr31, transfekterte celler73 eller immunocytokjemi brukes til identifisering av forskjellige celletyper 9,22,71,86 . I løpet av de siste par årene har vevsskivemetoden blitt vellykket tilpasset menneskelig vev, og åpnet mange nye viktige forskningsveier i både eksokrine41 og endokrine fysiologi 9,36,37,39. Interessant nok har en detaljert vurdering av kalsiumdynamikk i menneskelige holmer vært notorisk vanskelig og gjenstår å undersøke nærmere87. Kombinert med avansert konfektmikroskopi har pankreasvevsskivemetoden gjort det mulig for mange nye innsikter i kalsiumdynamikken hos mus og vil forhåpentligvis gjøre det samme for menneskelig vev.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet som ble presentert i denne studien ble økonomisk støttet av Det slovenske forskningsbyrået (forskningskjernefinansieringsnr. P3-0396 og I0-0029, samt forskningsprosjekt nr. J3-9289, N3-0048 og N3-0133) og av Det østerrikske vitenskapsfondet / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bilaterale tilskudd I3562–B27 og I4319–B30). Vi takker Maruša Rošer, Maša Čater og Rudi Mlakar for utmerket teknisk assistanse.
Equipment | |||
Analytical balance KERN ALJ 120-4 | KERN & SOHN GmbH | ALJ 160-4A | |
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup | Leica | 5100001578 | |
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup | Leica | ||
Cork pad 15 cm x 15 cm | |||
Corning 15 mL centrifuge tubes | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | CLS430790 | |
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L | Fischer Scientific, Leicestershire, UK | 432124 | |
Double edge razor blade | Personna, USA | ||
Dumont #5 – Fine Forceps | FST, Germany | 11254-20 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL | Eppendorf | 0030 121.023 | |
Erlenmeyer flask 200 mL | IsoLab, Germany | 027.01.100 | |
Fine Scissors – ToughCut | FST, Germany | 14058-11 | |
Flat orbital shaker IKA KS 260 basic | IKA | Ident. No.: 0002980200 | |
Glass lab bottle 1000 mL | IsoLab, Germany | 091.01.901 | |
Hartman Hemostat, curved | FST, Germany | 13003-10 | |
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) | Leica | 15507701 | |
Measuring cylinder 25 mL | IsoLab, Germany | 015.01.025 | |
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 | Luigs & Neumann | 200-100 900 7311, 200-100 900 9050 | |
Microwave owen | Gorenje, Slovenia | MO20MW | |
Osmometer Gonotec 010 | Gonotec, Berlin, Germany | OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20 | |
Paint brush | Faber-Castell, No.2 | Any thin soft round paint brush No.2, preferably black | |
Paper towels | |||
Perifusion pumps | Ismatec | ISM 827 | Reglo Analog MS – 4/8 |
Petri dish 100/20 mm | Sarstedt | 83.3902 | |
Petri dish 35/10 mm | Greiner bio-one | 627102 | |
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | 153066 | NON-STICKY for agarose blocks |
pH meter inoLab pH Level 1 | WTW, Weilheim, Germany | E163694 | |
Pipette 1000 mL | Eppendorf | 3121 000.120 | |
Pipette 50 mL | Eppendorf | 3121 000.066 | |
Push pins 23 mm | Deli, Ningbo, China | E0021 | |
Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Semken Forceps | FST, Germany | 11008-13 | |
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask | IsoLab, Germany | 027.11.048 | |
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 | Nikon, Melville, NY USA | ||
Syringe Injekt Solo 5 mL | Braun, Melsungen, Germany | 4606051V | |
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") | Braun, Melsungen, Germany | 4656300 | |
Temperature controller | Luigs & Neumann | 200-100 500 0150, 200-150-500-145 | Slice mini chamber, Temperature controller TC 07 |
Tubings for perifusion system | Ismatec | SC0310 | Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD) |
Ultrasonic bath Studio GT-7810A | Globaltronics | ||
Vibrotome Leica VT 1000 S | Leica, Nussloch, Germany | 14047235613 | |
Volumetric flask 1000 mL | IsoLab, Germany | 013.01.910 | |
Vortex mixer Neolab 7-2020 | Neolab | 7-2020 | |
Water bath Thermo Haake open-bath circulator | Thermo Fisher Scientific | Z527912 | |
Material/Reagent | |||
Calcium chloride dihydrate – CaCl2.2H2O | Sigma Aldrich, Germany | C5080-500G | |
D-(+)-glucose | Sigma Aldrich, Germany | G8270-1KG | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D4540-100ML | |
DL-lactic acid | Sigma Aldrich, Germany | L1250-500ML | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Merck KGaA, Darmstadt, Germany | D8662-500ML | |
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure | |||
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 | Wekem GmbH, Bergkamen, Germany | WK 110-020 | |
HEPES | Sigma Aldrich, Germany | H3375-250G | |
L-(+)-ascorbic acid | Sigma Aldrich, Germany | A9,290-2 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA | L3224 | |
Magnesium chloride hexahydrate – MgCl2.2H2O | Sigma Aldrich, Germany | M2670-500G | |
Myo-inositol | Sigma Aldrich, Germany | I5125-100G | |
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM | Invitrogen (Thermo FisherScientific) | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm) |
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | P3000MP | polaxamer: nonionic triblock copolymer |
Potassium chloride – KCl | Sigma Aldrich, Germany | 31248 | |
SeaPlaque GTG agarose | Lonza, Rockland, USA | 50111 | |
Sodium bicarbonate – NaHCO3 | Honeywell, Germany | 31437-500G | |
Sodium chloride – NaCl | Honeywell, Germany | 31434-1KG | |
Sodium hydroxide – NaOH | Sigma Aldrich, Germany | 30620 | |
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 | Sigma Aldrich, Germany | S0751-500G | |
Sodium pyruvate | Sigma Aldrich, Germany | 15990-100G | |
Software | |||
FIJI | FIJI is an open source project | ||
LASAF | Leica microsystems, Inc. | ||
Matlab | Mathworks | ||
Python | Python Software Foundation | Python is an open source project |