Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Konfokal laserscanningsmikroskopi av kalciumdynamik i akuta mus pankreasvävnadsskivor

Published: April 13, 2021 doi: 10.3791/62293

Summary

Vi presenterar beredningen av akuta bukspottkörtelvävnadsskivor och deras användning i konfokal laserscanningsmikroskopi för att studera kalciumdynamik samtidigt i ett stort antal levande celler, under långa tidsperioder och med hög spatiotemporal upplösning.

Abstract

Den akuta muspankreasvävnadsskivan är ett unikt in situ-preparat med bevarad intercellulär kommunikation och vävnadsarkitektur som medför betydligt färre beredningsinducerade förändringar än isolerade öar, acini, kanaler eller dispergerade celler som beskrivs i typiska in vitro-studier. Genom att kombinera den akuta bukspottkörtelvävnadsskivan med levande cellkalciumavbildning i konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) kan kalciumsignaler studeras i ett stort antal endokrina och exokrina celler samtidigt, med en encellig eller till och med subcellulär upplösning. Känsligheten möjliggör detektering av förändringar och möjliggör studier av intercellulära vågor och funktionell anslutning samt studier av beroendet av fysiologiska svar hos celler på deras lokalisering inom ö- och parakrinförhållandet med andra celler. Slutligen, ur ett djurskyddsperspektiv, minskar registrering av signaler från ett stort antal celler åt gången antalet djur som krävs i experiment, vilket bidrar till 3R-ersättning, minskning och förfining-principen.

Introduction

Däggdjurets bukspottkörtel är en stor exokrin och endokrin körtel. Den exokrina delen utgör 96-99% av den totala bukspottkörtelvolymen och består av acini och kanaler. Den endokrina delen består av ett stort antal langerhanska öar som står för de återstående 1-4% av den totala bukspottkörtelvolymen1. Den exokrina delen utsöndrar stora matsmältningsenzymer som bryter ner energirika polymerer i mat, liksom en bikarbonatrik vätska, som kombineras med andra gastrointestinala sekret för att ge en miljö som är lämplig för enzymernas verkan. Den endokrina delen utsöndrar hormoner som reglerar postprandial distribution, lagring och interprandial frisättning av energirika näringsämnen. Även om den exokrina vävnaden är relativt underutvecklad och den endokrina relativt välutvecklad vid födseln, växer den förra snabbt över den senare vid avvänjning 2,3,4. Tidiga studier av bukspottkörtelfunktionen markerade födelsen av modern fysiologi, och stora metodologiska framsteg inom området har följts av stora vetenskapliga genombrott5. Att arbeta med bukspottkörteln är tekniskt utmanande på grund av körtelns invecklade struktur, men är också en stor motivation på grund av sjukdomar som bukspottkörtelcancer, pankreatit och diabetes som utgör stora hot mot folkhälsan och för vilka nya terapeutiska metoder behövs.

Isolerade öar6, acini 7,8 och duktalt fragment hade utvecklats och använts i årtionden som guldstandardmetoder på grund av deras fördelar jämfört med cellinjer och primära dispergerade endokrina, acinära och duktala celler 9,10. Trots den markant förbättrade funktionen hos isolerade cellkollektiv involverar dessa metoder fortfarande betydande mekanisk och enzymatisk stress, isolerar celler från den omgivande vävnaden och saknar därmed parakrina interaktioner och mekaniskt stöd, och viktigast av allt, åtföljs av signifikanta förändringar i normal fysiologi 11,12,13 . Den akuta muspankreasvävnadsskivan utvecklades 2001 av ett upplevt behov av att utveckla en experimentell plattform som liknar hjärn-, hypofys- och binjureskivor med bevarade intercellulära kontakter, parakrina interaktioner, mesenkym och vävnadsarkitektur, liksom utan några av de viktigaste bristerna i guldstandardmetoden i öforskning av den tiden - de isolerade öarna12, 14. Bland dessa brister finns skador på de yttersta skikten, bristande tillgänglighet till kärnöar och behovet av odling med möjligen viktiga effekter på cellidentitet och fysiologi12,15. Dessutom möjliggör vävnadsskiva-metoden studier på djurmodeller med grovt rubbad öarkitektur där det är omöjligt att isolera öar, eller när öutbytet är extremt lågt genom traditionell isolering 16,17,18,19,20,21.

Dessutom är skivan mer lämplig för att studera morfologiska förändringar under utvecklingen av diabetes och pankreatit, till exempel, eftersom den möjliggör en bättre översikt över hela vävnaden och också är kompatibel med att studera regionala skillnader. Viktigt, trots det tidiga fokuset på den endokrina delen, möjliggör vävnadsskiva-metoden i sig studier av de exokrina komponenterna 9,22,23. Under det första decenniet efter introduktionen användes metoden för elektrofysiologiska studier av beta 14,24,25,26,27,28,29 och alfa 30,31 celler samt för att undersöka den morfologiska och funktionella mognaden av bukspottkörteln 2,3 . Ett decennium senare 2013 anpassades metoden framgångsrikt för levande cellkalciumavbildning av öceller med hjälp av CLSM för att karakterisera deras svar på glukos32, deras funktionella anslutningsmönster33 och förhållandet mellan membranpotential och intracellulärt kalcium genom att kombinera ett fluorescerande kalciumfärgämne med ett membranpotentialfärgämne34. Senare samma år användes metoden också för att bedöma kalciumdynamiken i acinarceller22,35. Under de följande åren har bukspottkörtelvävnadsskivor använts i ett antal olika studier och framgångsrikt anpassats till gris och mänsklig vävnad 9,36,37,38,39,40,41. Sammantaget utförs dock kalciumavbildning - i mus bukspottkörtelvävnadsskivor i allmänhet och på öar i synnerhet - fortfarande mestadels av denna grupp. En av de främsta orsakerna till detta kan ligga i kombinationen av ett tekniskt utmanande vävnadsskivapreparat, behovet av ett konfokalmikroskop och ganska komplex dataanalys. Huvudsyftet med detta dokument är att göra denna kraftfulla metod mer tillgänglig för andra potentiella användare.

Det finns redan några utmärkta metodologiska artiklar som i detalj behandlar vävnadsskivaberedning och användning av skivor för struktur- och utsöndringsstudier, men inte för konfokal kalciumavbildning 9,42,43. Därför fokuserar detta papper på några ytterligare tips och tricks under beredningen av skivor, på steg som är kritiska för framgångsrik färgladdning, bildförvärv samt på de viktigaste stegen i grundläggande kalciumdataanalys. Detta bidrag bör därför ses som ett komplement till snarare än som ett alternativ till ovannämnda metod. På samma sätt ska kalciumavbildning i musvävnadsskivor för bukspottkörtelvävnad ses som ett experimentellt tillvägagångssätt som ska användas för att besvara specifika frågor och är därmed ett komplement till snarare än ett absolut alternativ för andra kalciumavbildningsmetoder inom bukspottkörtelfysiologi, såsom isolerade kanaler eller acini, isolerade öar, organoider, öar som transplanterats in i ögats främre kammare. och inspelningar in vivo 11,44,45,46,47,48. Löftet om kalciumavbildning i mus bukspottkörtelvävnadsskivor illustreras förmodligen bäst av nyligen framgångsrika inspelningar av kalciumdynamik i ö-mesenkymala celler som pericyter49 och makrofager50, liksom i duktala celler23.

Protocol

OBS: Alla experiment utfördes i strikt överensstämmelse med institutionella riktlinjer för vård och användning av djur i forskning. Protokollet godkändes av Sloveniens regering för livsmedelssäkerhet, veterinärsektor och växtskydd (tillståndsnummer: 34401-35-2018/2).

1. Beredning av bukspottkörtelvävnadsskivor

OBS: Beredningen av akuta muspankreasvävnadsskivor för kalciumavbildning med CLSM kräver ett antal instrument, olika lösningar och fortsätter i en serie kritiska steg som schematiskt presenteras i figur 1 och beskrivs i detalj nedan.

Figure 1
Bild 1: Arbetsflödesdiagram. Schematisk representation av alla steg i processen med beredning av bukspottkörtelvävnadsskiva, som börjar med injektion av agaros i den gemensamma gallgången, följt av extraktion av bukspottkörteln och skivning. De beredda skivorna kan användas för att bedöma vävnadens livskraft med ett Levande / Död-kit eller färgat med en kalciumsensor. När de är färgade är de redo för avbildning. Inspelningar som erhållits från avbildningsprocessen används sedan för dataanalys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Beredning av lösningar
    OBS: Alla lösningar bör förberedas i förväg och kan förvaras i kylskåp vid 4-8 °C i upp till en månad. För beredning och lagring av vävnadsskivor behövs cirka 0,5 L extracellulär lösning (ECS) med 6 mM glukos och 0,3 L 4-(2-hydroxietyl)-1-piperazineetansulfonsyra (HEPES) buffert. För 1 dag med kalciumavbildning med perifusionssystemet inställt på 1-2 ml / min flödeshastighet behövs cirka 0,5 liter ECS.
    1. Extracellulär lösning med 6 mM glukos
      1. Förbered 1 liter ECS innehållande 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 6 mM glukos, 6 mM mjölksyra, 3 mM myo-inositol, 2,5 mM KCl, 2 mM Na pyruvat, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2 och 0,5 mM askorbinsyra. Blanda noggrant tills alla ingredienser är helt upplösta. Ta 50 μL ECS i ett 0,5 ml mikrocentrifugrör, placera det på osmometern enligt tillverkarens instruktioner och kontrollera osmolariteten.
        OBS: Osmolariteten ska vara 300-320 mOsm. För stimulering av betaceller, använd lösningar med högre glukoskoncentrationer. För att säkerställa fysiologiskt pH-värde på 7,4 under skivning och experiment, bubbla ständigt ECS med karbogen (dvs en gasblandning av 95% O2 och 5%CO2) vid barometertryck. Ett enkelt bubblande system kan ställas in genom att fästa ena änden av en 5 mm kiselslang på källan till karbogen (dvs. en trycksatt gascylinder) och den andra änden av slangen placeras direkt i flaskan som innehåller ECS.
      2. Alternativt kan du förbereda ett 10x lager innehållande 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO3, 30 mM myo-inositol, 25 mM KCl, 20 mM Na pyruvat, 12,5 mM NaH2PO4 och 5 mM askorbinsyra. När ECS som innehåller 6 mM glukos behövs, blanda 100 ml av beståndet med 2 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgCl2, 0,455 ml 13,2 M mjölksyra och 1,08 g glukos och fyll med dubbeldestillerat vatten upp till 1 L. Om det behövs, använd olika mängder glukos för att få andra glukoskoncentrationer.
    2. HEPES-buffert med 6 mM glukos
      1. Bered 0,5 L HEPES-buffrad lösning (HBS) innehållande 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM glukos, 5 mM KCl, 2 mMCaCl2 och 1 mMMgCl2; titrera till pH = 7,4 med 1 M NaOH.
        OBS: Om karbogen inte är tillgängligt kan denna buffert användas för alla steg istället för ECS.
    3. Agaros (1,9 % vikt/vikt)
      1. Förvarda ett vattenbad till 40 °C.
      2. Tillsätt 0,475 g agaros med låg smältpunkt och 25 ml ECS innehållande 6 mM glukos till en Erlenmeyerkolv och placera kolven i en mikrovågsugn med maximal effekt i några sekunder tills den börjar koka. Ta ut kolven ur ugnen och virvla den några gånger tills agarosen löser sig helt. Överför kolven med den flytande agarosen till det förvärmda vattenbadet vid 40 °C för att kyla agarosen till önskad temperatur och hålla den flytande till injektion. Säkra kolven med en stabiliserande blyring.
        OBS: Agarosen kan förberedas i förväg och förvaras i kylskåp. Värm agarosen i mikrovågsugnen före användning tills den flyter och överför Erlenmeyerkolven till ett vattenbad som är förvärmt till 40 °C. Agarosen kan återanvändas upp till 5x. Om den återanvänds utöver 5x blir den tät och svårare att injicera.
  2. Injektion av bukspottkörteln med agaros
    OBS: Avsnitt 1.2 och 1.3 förklarar beredningen av vävnadsskivor som kan användas för olika experimentella ändamål såsom kalciumavbildning, elektrofysiologi, immunohistokemi, utsöndringsstudier och strukturella / mikroanatomiska studier.
    1. Fyll en 5 ml spruta med flytande agaros från Erlenmeyerkolven i vattenbadet från steg 1.1.3.2, ta bort eventuella bubblor och montera en 30 G nål. Skydda nålen med ett lock och håll tillbaka den fyllda sprutan i vattenbadet med nålen nedåt och hela volymen agaros under vattenytan. Säkra sprutan med en stabiliserande blyring på ett sådant sätt att ringen pressar sprutan mot vattenbadets vägg.
      OBS: Var försiktig så att du inte trycker in någon agaros i nålen eftersom den härdar snabbt och blockerar nålen. Om rumstemperaturen är låg och om injektionen utförs av en mindre erfaren person, öka temperaturen på vattenbadet upp till 42 °C för att få lite extra tid för injektion.
    2. Fyll en ishink med is och placera flaskan som innehåller ECS i den. Bubbla ECS konstant vid 1,5 ml / min med karbogen vid barometertryck och rumstemperatur för att säkerställa syresättning och ett pH på 7,4.
    3. Offra en mus genom att administrera en hög koncentration av CO2 följt av cervikal dislokation. Gör allt för att minimera djurens lidande.
    4. Arbeta under ett stereomikroskop, komma åt buken via laparotomi (figur 2A). Vänd försiktigt tarmen till vänster om musen (ur musens anatomiska perspektiv) för att exponera den gemensamma gallgången. Använd pincett för att lyfta duodenaldelen något och hitta den stora duodenala papillipillan i Vater. Kläm fast den gemensamma gallgången vid duodenalpapillen med hjälp av en hemostat (figur 2B,C) för att förhindra läckage av agaros från kanalen till tolvfingertarmen.
      OBS: För att förhindra agarosläckage i tolvfingertarmen och längre upp och ner i mag-tarmkanalen, placera hemostaten på ett sådant sätt att den också klämmer fast tolvfingertarmen både proximalt och distalt från papillen. Det är bäst att använda en krökt hemostat för detta ändamål.
    5. Med små skarpa pincett, nå under den gemensamma gallgången och bryt membranet som fäster kanalen i bukspottkörtelvävnaden. För bättre visuell kontroll och enklare injektion, rensa så mycket fett och bindväv från kanalen som möjligt.
    6. Placera kanalen vinkelrätt på stora tångar (figur 2D) och injicera den beredda flytande agarosen i den proximala delen av den gemensamma gallgången (figur 2D). Var noga med att pressa sprutan hårt eftersom agarosen är viskös. Fortsätt fylla bukspottkörteln tills den blir vitaktig och något utspänd eller i minst 20-30 s.
      OBS: Detta är det mest kritiska steget i skivförberedelserna. Om det finns några kinks i bukspottkörtelns duktala träd, höj försiktigt eller dra bukspottkörteln bort från sprutan för att jämna ut dem. Bestäm inte när injektionen ska avbrytas baserat på volymen som injiceras från sprutan eftersom återflödet vid injektionspunkten och läckage framåt i tolvfingertarmen vanligtvis är mycket högre än volymen som injiceras i bukspottkörtelträdet. Det är viktigt att framgångsrika injektioner kan utföras med praktiskt taget omärkliga förändringar i sprutvolymen.
    7. Ta bort sprutan och häll långsamt 20 ml av det bubblande iskalla ECS vid 0-4 °C från flaskan på bukspottkörteln för att kyla vävnaden och härda agarosen.
    8. Extrahera försiktigt bukspottkörteln med pincett och fin hårdskuren sax. Placera den extraherade bukspottkörteln i en 100 mm petriskål som innehåller ~ 40 ml iskall ECS och flytta den försiktigt för att tvätta den. Överför bukspottkörteln till en ny 100 mm petriskål som innehåller ~40 ml iskall ECS.
    9. Från den välinsprutade delen av bukspottkörteln, som verkar vitaktig (figur 3A), skär upp till 6 block av vävnad, 0,1-0,2 cm3 i storlek, med pincett och hårdskuren sax. Rensa dem från alla bindväv och fettvävnader.
    10. Fyll en 35 mm icke-klibbig botten-petriskål med cirka 5 ml flytande agaros vid 40 °C, överför vävnadsblocken till den och lägg omedelbart petriskålen på is för att kyla ner den och härda agarosen.
      OBS: Hur blocken i bukspottkörteln fångas i agaros avgör hur de skärs under skivning. Erfarna experimentalister kan försöka finjustera blockens position under de få ögonblicken innan agarosen hårdnar när den placeras på is.
    11. När agarosen med vävnadsblocken har hårdnat, vänd petriskålen upp och ner på en plan slät yta, såsom locket på en 100 mm petriskål, och ta bort agarosen genom att försiktigt skära med ena halvan av ett rakblad i marginalen mellan petriskålens sidovägg och agarosen. Skär med ett rakblad enskilda agaroskuber, var och en innehållande ett vävnadsblock, och se till att varje vävnadsblock är omgivet av agaros. Limma agarosblocken på vibratomets provplatta med cyanoakrylatlim (figur 3B).

Figure 2
Figur 2: Injektion av agaros i den gemensamma gallgången. B) Den förstorade delen av det område som avgränsas av rektangeln på panel A. Den vita fläcken på tolvfingertarmen (indikerad med pilen) indikerar Vaters ampulla. Langerhanska öar betecknas med pilspetsar. (C) Kläm fast Vaters ampulla med en krökt hemostat och höj den något för att exponera och försiktigt sträcka den gemensamma gallgången (pilen). (D) Kannulering av den gemensamma gallgången och injektion av 1,9% agaroslösning med en 5 ml spruta och en 30 G nål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Skivning
    1. Fyll vibratomets skärkammare med ~0,15 L iskall ECS och bubbla konstant med karbogen. Omge skärkammaren med is och tillsätt 2 isbitar (~ 10 ml vardera) gjorda av ECS med 6 mM glukos i skärkammaren. Montera rakbladet för skärning på vibratomet och skruva fast provplattan med agarosblock på plats.
    2. Ställ in skivaren så att agarosblocken skärs vid 0,05 till 1 mm/s och 70 Hz i 140 μm tjocka skivor med en yta på 20-100 mm2. Följ tillverkarens instruktioner för utsnittsinställningar.
    3. Omedelbart efter varje skärsteg, pausa skivaren, samla försiktigt skivorna med en fin pensel och överför dem till en 100 mm petriskål fylld med 40 ml HEPES-buffert med 6 mM glukos vid rumstemperatur (figur 3C).
      OBS: Skivorna kan förvaras i HEPES-buffert vid rumstemperatur i minst 12 timmar, och bufferten bör bytas ut var 2: e timme.

Figure 3
Figur 3: Beredning och skivning av bukspottkörtelvävnad (A) Den extraherade mus bukspottkörteln efter agarosinjektion. Vit vävnad till vänster indikerar en välinsprutad del (duodenal del), medan den mer rödaktiga delen till höger visar den otillräckligt injicerade delen av bukspottkörteln (mjältdelen). (B) Vibratomskivning av två block av bukspottkörtelvävnad inbäddad i agaros. (C) Akut bukspottkörtelvävnadsskiva med langerhanska öar som indikeras av pilspetsar. Skalstång = 3000 μm. (D) Akut bukspottkörtelvävnadsskiva under ljusmikroskopet med Langerhans ö indikerad med en pilspets, asterisk indikerar en bukspottkörtelkanal. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Levande/död analys med LEVANDE/DÖD Livskrafts-/cytotoxicitetssats för däggdjursceller

OBS: För vissa experiment är det användbart att kontrollera livskraften hos celler i skivorna (figur 4) med levande / dödsanalys enligt följande.

  1. Följ tillverkarens instruktioner för att tina injektionsflaskor med reagenser av LIVE / DEAD Viability / Cytotoxicity Kit och förbered arbetslösningar av calcein AM strax före användning. Använd lösningarna inom en dag.
  2. Blanda 5 μl 4 mM calcein AM (komponent A), 20 μl 2 mM etidiumhomodimomer-1 (EthD-1, komponent B) och 10 ml dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS) i ett 15 ml etidiumhomodimomer-1 (EthD-1) och 10 ml Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS) för att bereda en arbetslösning innehållande cirka 2 μM kalcein AM och 4 μM EthD-1. Vortex grundligt.
  3. Använd en fin pensel och överför försiktigt vävnadsskivorna till en 3 ml petriskål med färsk HEPES-buffert för att späda serumesterasaktivitet. Ta bort HEPES-bufferten och täck skivorna med 100-200 μl (eller mer vid behov) av arbetslösningen från steg 2.2.
  4. Inkubera skivorna i 30-45 min vid rumstemperatur i en sluten petriskål. Avbilda vävnadsskivorna med excitations-/emissionsfilter enligt tillverkarens rekommendationer.

3. Kalciumfärgbelastning

OBS: Fluorescerande färgämnen bör skyddas från ljusexponering under hela processen med beredning och laddning av färgämnet, liksom under hantering av de färgade vävnadsskivorna. Tennfolie kan användas för att täcka rör eller petriskålar som innehåller kalciumfärgämnet.

  1. Färgämne beredning
    1. Lös upp innehållet i en injektionsflaska (50 μg) i det cellgenomsläppliga Ca2+- indikatorfärgämnet (excitation/emission 495/523 nm; se materialförteckningen), 7,5 μL dimetylsulfoxid (DMSO) och 2,5 μL polaxamer (20 % lösning i DMSO; Tabell över material) i 6.667 ml HBS innehållande 6 mM glukos i ett 15 ml skruvlocksrör.
      OBS: Denna slutliga lösning innehåller 6 μM av Ca2+ indikatorfärgämne, 0,11% DMSO och 0,037% polaxamer.
    2. Aspirera och utvisa lösningen i skruvlocksröret upprepade gånger med en pipett i 20 s; sänk ner röret i en ultraljudsbadkammare i 30 s och virvel i 30 s för att förbättra lösligheten. Alikvot 3,333 ml av den slutliga Ca2+ indikatorfärglösningen framställd i steg 3.1.1 till 5 ml petriskålar.
  2. Färgämnesbelastning
    1. Överför de beredda vävnadsskivorna från 60 ml petriskål med HBS till 5 ml petriskålar fyllda med färglösningen genom att försiktigt lyfta varje vävnadsskiva med en tunn, mjuk pensel och placera den i färglösningen. Inkubera upp till 10 vävnadsskivor per petriskål.
    2. Placera den skivade petriskålen på en orbitalskakare vid rumstemperatur inställd på omloppsrörelse vid 40 varv per minut i 50 minuter. Inkubera skivorna i färglösningen som utsätts för omgivande luft vid rumstemperatur, men skyddas från ljus genom att täcka petriskålen med tennfolie.
  3. Förvaring av skivor
    1. Överför de färgade vävnadsskivorna från 5 ml petriskål till en 60 ml petriskål fylld med färgfri HBS genom att försiktigt lyfta dem med en fin, mjuk pensel. Förvara upp till 20 skivor per petriskål.
      OBS: Använd vävnadsskivorna för avbildning vid denna tidpunkt. Vävnadsskivorna behåller Ca2+ indikatorfärgämnet i flera timmar. Överlevnaden av skivor och retention av färgämnet kan förbättras genom att placera petriskålen i en isolerad behållare, omgiven av is. Detta är särskilt viktigt om de färgbelastade skivorna ska transporteras. Byt dessutom HBS var 2: e timme.

4. Kalciumavbildning

  1. Inställning av konfokalmikroskopet
    1. Välj en lämplig objektiv förstoring beroende på studiens intresse. Välj 20x och 25x (numerisk bländare [NA] 0,77-1,00) för att visualisera en hel holme, flera acini samtidigt eller större kanaler. Välj högre förstoringar för att studera intracellulär dynamik.
    2. Välj förvärvsläge för time-lapse-avbildning (t.ex. time-lapse, xyt eller liknande läge). Ställ in pinhålet på 100-200 μm.
    3. Ställ in ljusvägen för gröna fluoroforer: excitation vid 488 nm och insamling av utsläpp vid 500-700 nm. Välj helst detektorer med hög kvanteffektivitet (t.ex. galliumarsenidfosfid) framför fotomultiplikatordetektorer.
  2. Inställning av inspelningskammaren och perifusionssystemet
    1. Montera inspelningskammaren på mikroskopets och perifusionssystemets temperaturstyrda steg (antingen tyngdkraftsmatad eller peristaltisk pumpbaserad installation, volym 1 ml). Placera inloppet och utloppet på inspelningskammarens bortre kanter för att undvika att perfusatet slingrar sig i kammaren och ställ in inflödet och utflödet på lika värden (1-2 ml/min). Undvik att driva den flytande meniskhöjden och droppar i perifusatet.
    2. Ställ in perifusionssystemets temperaturkontroll på 37 °C.Initiera perifusionen med den icke-stimulerande lösningen och förbered de stimulerande lösningarna. Byt lösningarna via motoriserade ventiler eller genom att manuellt byta lösningarna som matar perifusionssystemet.
  3. Spela in kalciumdynamik
    1. Överför en enda vävnadsskiva till inspelningskammaren. Immobilisera vävnadsskivan med en U-formad platinavikt med spänt nylonnät (t.ex. från nylonstrumpor). Undvik att placera nylontrådar över strukturen av intresse.
    2. Leta reda på en holme/acinus/kanal med alternativet brightfield. Kör levande avbildning för att placera de studerade strukturerna i synfältet och ställ in bildparametrarna. Optimera signal-brusförhållandet genom att justera lasereffekten, detektorförstärkningen och linjegenomsnittet / binning för att möjliggöra visualisering av cellerna samtidigt som lasereffekten hålls minimal.
    3. Justera inspelningens fokalplan till ~15 μm under snittytan (figur 5) för att undvika registrering från potentiellt skadade celler vid skärytan.
    4. Skaffa bilder. Ställ in samplingsfrekvensen på 1-2 Hz för att detektera enskilda svängningar initialt och använd en resonansskanner som kan snabba linjegenomsnitt (8-20) vid en högre förvärvshastighet (>10 Hz) för att registrera intracellulär Ca2+ ([Ca2+]IC) aktivitet. Tillåt ett intervall (t.ex. 30 % av den totala provtagningstiden) mellan på varandra följande punktbelysningar för att förhindra fototoxicitet. Spela in en högupplöst bild (t.ex. 1024 x 1024 pixlar, linjemedelvärde > 50) före tidsserieförvärvet (se avsnitt 5).
      OBS: Samplingsfrekvensen på 1-2 Hz ligger under Nyquist-kriteriet för förvärvsfrekvens för de flesta celler, och signalens form kommer att undersamplas som standard.
    5. Se ett onlinediagram, om tillgängligt i bildprogramvaran, för att få omedelbar feedback om förberedelsesvaret, överbelysning, fotoblekning och mekanisk drift. Vid en hög blekningshastighet under förvärvet, stoppa inspelningen och minska lasereffekten samtidigt som detektorförstärkningen ökar för att bibehålla signal-brusförhållandet. Vid mekanisk avdrift, kontrollera om det finns spänning mellan slangar/kablar och mikroskopsteget samt vätskeläckage eller volymförändringar i inspelningskammaren. Du kan också försöka korrigera avdriften under anskaffningen manuellt. Observera dock att detta i sig kommer att ge begränsade resultat.
      OBS: Endokrina celler är mycket heterogena vid koncentrationer nära tröskeln. En tillräcklig stimuleringslängd behövs för att detektera intervallet för aktiverings- / avaktiveringsfördröjningar i enskilda celler. Detta är särskilt viktigt för korrekt detektering av off-responses efter mycket stimulerande protokoll.
    6. Använd kalciumavbildning för att funktionellt skilja mellan endo- och exokrina celler (figur 6). För att spela in övergående aktivitet under aktivering och inaktivering, använd stimuli utan att stoppa inspelningen.
    7. Spara data efter experimentets slut (överväg att använda en automatisk sparfunktion). Tillåt en kylningsperiod innan du stänger av laserströmmen för att inte skada lasrarna under avstängningsproceduren.

5. Analys av data

  1. Inspektera inspelningen visuellt kvalitativt genom att spela upp time-lapse-videon igen. Kontrollera om det finns celldrift från synfältet eller det optiska planet. Om en avdrift inom det optiska planet har inträffat, använd plugin-programmet för driftkorrigering i ImageJ.
  2. Välj intressanta regioner (ROI) med hjälp av mikroskopprogramvara eller programvara från tredje part. Använd den högupplösta bilden, den maximala projektionen eller bildrutegenomsnittet som referens för att välja avkastning på returnivå. Spela upp time-lapse-avbildning för att visualisera svarande celler som inte är synliga i referensbilder. Placera AVKASTNING: erna så att det valda området för en ROI inte överlappar med angränsande celler för att undvika signalöverhörning mellan ROI: er.
  3. Exportera tidsseriedata som ROI-medelvärde per bildruta. Exportera ROI-koordinater.
  4. Korrigera tidsseriedata för blekning (figur 7A) genom att använda en kombination av en exponentiell och linjär passform, enligt beskrivningen i
    Equation 1(1)
    där x(t) betecknar fluorescenssignalen vid en tidpunkt t; xcorr(t) den korrigerade signalen vid motsvarande tidpunkter, och a, b och c parametrarna för passningen beräknade som den minsta summan av kvadraterna mellan korr (t) och x (t).
  5. Analysera aktiverings- och avaktiveringsfasen för svaret (figur 7B). Beräkna det första derivatet av tidsseriedata och bestäm zenit och nadir för derivatet som motsvarar aktiveringen respektive deaktiveringen. Alternativt kan du manuellt välja början på den fasiska ökningen. Spara och exportera aktiverings-/avaktiveringstiderna och motsvarande cellkoordinater.
  6. Analysera platåfasen (figur 7C). Identifiera enskilda svängningar genom att tröskelvärde för rådata eller genom att tröskelvärdet för det första derivatet av tidsseriedata. Definiera början och slutet av en enskild svängning som den tid som motsvarar svängningens halva amplitud.
    1. Beräkna varaktigheten och frekvensen för enskilda svängningar för varje cell. Beräkna det inversa värdet på interspikeintervallet (lämpligt för vanliga aktivitetsmönster). Alternativt kan du dela antalet svängningar med postens tidsintervall (lämpligt för oregelbundna aktivitetsmönster).
    2. Beräkna den aktiva tiden. Uttryck den aktiva tiden som summan av varaktigheter och dela detta värde med tidsintervallet. Alternativt multiplicerar du frekvensen och varaktigheten som motsvarar en svängning.
      OBS: Att dividera summan av varaktigheter med tidsintervallet ger robusta resultat, men har låg statistisk diskriminering eftersom en enda datapunkt per cell erhålls. Att multiplicera frekvensen och varaktigheten av en svängning ger en tidsupplösning mellan svängning och svängning.

Representative Results

Injektionen av agaroslösningen i bukspottkörtelkanalen är det mest kritiska steget i beredning av bukspottkörtelvävnadsskivor. En framgångsrik injektion kan kännas igen genom en blekning av bukspottkörtelvävnaden, som ses på vänster sida av figur 3A, medan en ofullständigt injicerad del av bukspottkörteln presenteras på höger sida av figur 3A. Langerhanska öar kan kännas igen med blotta ögat eller under ett stereomikroskop, och detta hjälper till att skära lämpliga delar av bukspottkörteln för efterföljande inbäddning i agarosblock (figur 3B). I en nyskuren mus bukspottkörtelvävnadsskiva kan langerhanska öar lätt särskiljas från den omgivande exokrina vävnaden och mesenkymen som vita fläckar under stereomikroskopet (figur 3C) eller som brunaktiga strukturer under ljusmikroskopet (figur 3D). Bukspottkörtelvävnadsskivorna kan användas för olika typer av experiment i minst 12 timmar efter skivning. Förutom den grova morfologiska bedömningen under stereomikroskopet, ljusmikroskopet och cellernas funktionella svar under kalciumavbildning kan livskraften hos bukspottkörtelvävnadsskivorna bedömas (Figur 4).

Figure 4
Figur 4: Viabilitet av celler i vävnadsskivan. Cellernas livskraft bestämdes med live/dead-analysen. Levande celler färgas av Calcein AM (visas i grönt), medan döda celler färgas med etidiumhomodimomer-1 (visas i rött). Gula linjer anger positionen för X-Y-tvärsnittet av Z-stacken som visas längst ner och till höger. Z-stackens fulla djup är 88 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För kalciumavbildningsexperiment måste den fluorescerande kalciumindikatorn tränga igenom några lager av celler. Figur 5A visar framgångsrik laddning av det cellgenomsläppliga Ca2+ indikatorfärgämnet i bukspottkörtelvävnadsskivan där enskilda öar och acinarceller kan kännas igen. Däremot är skivor i figur 5B-D inte optimala på grund av misslyckad penetrering av färgämnet (figur 5B), brist på öceller (figur 5C) och mycket nekrotisk vävnad på ytan (figur 5D). Sådana skivor kan kasseras, kontrolleras för förekomst av ytterligare öar som skärs eller färgas bättre (se tabell 1 för felsökning) eller användas för att registrera svaren från exokrina celler.

Figure 5
Figur 5: Exempel på användbara och oanvändbara preparat. (B) Ett exempel på en dåligt färgad vävnadsskiva. (C) Exempel på en holme Langerhans med strukturella avbrott. (D) Ett exempel på en holme Langerhans som innehåller många döda celler och mycket skräp. Uppslagstabellen "glow-over, glow-under" till höger visar 0 intensitet i grönt och mättnad i blått. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Representativa resultat från kalciumavbildning med hjälp av det cellgenomsläppliga Ca2+ indikatorfärgämnet visas i figur 6. I figur 6A presenteras en högupplöst bild av en bukspottkörtelvävnadsskiva som innehåller en ö av Langerhans, acinär vävnad och en bukspottkörtelkanal. För bättre distinktion är den endokrina, exokrina och duktiga delen av bukspottkörtelvävnadsskivan som presenteras i figur 6A färgade i figur 6B. Att använda lämpliga stimuli kan funktionellt skilja mellan olika öceller, eller ö- och icke-öceller51. Betaceller svarar vanligtvis på en fyrkantig pulsstimulering av glukos med en övergående ökning av [Ca2+] IC följt av snabba kalciumoscillationer på en ihållande platå (figur 6C, övre panelen).

Eftersom alla betaceller är kopplade till ett enda, stort, funktionellt syncytium, är dessa svängningar också mycket väl synkroniserade mellan olika celler genom att sprida [Ca2+]IC-vågor 32,34,52,53,54 (Figur 7C). Långsammare [Ca2+]IC-svängningar med en period på 5-15 minuter kan ligga till grund för de snabba svängningarna eller till och med vara den dominerande typen av reponse55,56. Samma enkla protokoll kan avslöja andra typer av svar, särskilt i periferin av öar (figur 6C, nedre panelen). Eftersom dessa celler inte synkroniseras med betaceller och svarar med snabbare och mer oregelbundna svängningar som redan finns i låga glukosförhållanden eller med minskad aktivitet, tyder sådana svar starkt på icke-betaceller 21,32,57,58. Men deras definitiva funktionella karakterisering kräver mer komplexa protokoll med ytterligare stimuleringssteg eller alternativa tillvägagångssätt, som diskuteras nedan. Typiska svar från acinära och duktala celler presenteras i figur 6D respektive figur 6E. Se litteraturen för mer information om acinar och duktala celler 22,23,35.

Figure 6
Figur 6: Representativa resultat av kalciumdynamik i olika typer av bukspottkörtelceller. Skalstreck = 100 μm. (B) Avgränsning av distinkta delar av bukspottkörtelvävnad med acinär vävnad som visas i gult, en ö langerhans som visas i rött och ett segment av duktalträdet i blått. Skalstång = 100 μm. (C) Typiska spår av kalciumdynamik i beta- och förmodade icke-betaceller under stimulering med 12 mM glukos; 3 mM glukos användes för icke-stimulerande tillstånd. Protokoll som kan användas för mer specifik diskriminering av icke-betaceller beskrivs i diskussionsavsnittet. (D) Ett typiskt spår av kalciumdynamiken i acinarceller stimuleras av 25 nM acetylkolin. (E) Ett typiskt spår av kalciumdynamiken hos duktala celler stimulerad av 1 mM kenodeoxicholsyra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter framgångsrik kalciumavbildning exporteras och korrigeras data först för blekning genom en kombination av en exponentiell och linjär passform, som beskrivs i protokollavsnittet. En tidsserie före och efter blekningskorrigering presenteras i figur 7A. Därefter kan flera parametrar i aktiverings- och avaktiveringsfasen av svaret samt platåfasen analyseras. En fördröjning i början av [Ca2+]IC-ökning efter stimulering kan mätas som representerad av fördröjningA i figur 7B och heterogeniteten i fördröjningar mellan enskilda celler (fördröjningA1). Samma parametrar (fördröjningD och fördröjningD1) kan användas för att beskriva avaktiveringsfasen. Efter den initiala övergående [Ca2+]IC-ökningen kännetecknas platåfasen i de flesta betaceller i bukspottkörteln i en ö av relativt regelbundna högfrekventa [Ca2+]IC-svängningar . Platåfasen kan beskrivas genom att analysera de klassiska funktionella parametrarna. Den schematiska presentationen av [Ca2+]IC-svängningar varaktighet, frekvens och procentandel av aktiv tid presenteras i figur 7C. Vid kalciumavbildning med förvärvshastigheter högre än 10 Hz kan kalciumvågor som upprepade gånger sprider sig över holmen också kännas igen tydligt (figur 7C).

Figure 7
Figur 7: Analys av tidsseriedata. (B) Analys av fördröjningar av aktivering efter stimulering och avaktivering efter upphörande av stimulering med 12 mM glukos. Stimuleringens varaktighet betecknas med den ljusgrå, skuggade stapeln i bilden. (C) Analys av flera parametrar i platåfasen: I) Oscillationens varaktighet bestämd vid halvhöjd, II) oscillationsfrekvens bestämd av interoscillationsintervall. III) aktiv tid som en produkt av frekvens och varaktighet av svängningar. I-IV) Fördröjningar mellan svängningar i en given våg av svängningar som sprider sig över Langerhans ö bestämd av förseningarna (Δt) i tid då en enda cell når halvhöjden av oscillationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Pankreasvävnadsskivandemetoden är en snabb experimentell metod för att studera morfologin och fysiologin hos de endokrina och exokrina delarna av bukspottkörteln i en mer konserverad, in situ-beredning. Många av fördelarna har redan påpekats i inledningen. Det är värt att påpeka att i allmänhet (dvs. inte bara för kalciumavbildning) sparar skivmetoden för att studera bukspottkörtelfysiologi tid eftersom det inte innebär en återhämtningsperiod efter isolering. Det senare är inte absolut nödvändigt med alla typer av experiment och användning av isolerade öar från olika arter, men används vanligtvis för att öka renheten, återställa livskraften och funktionaliteten och ibland för att samla holmar från flera givare 59,60,61,62,63,64 . I samband med kalciumavbildning har dock betacellsvar visat sig bero på odlingens varaktighet och förhållanden, och detta är en viktig källa till variation som bör beaktas vid användning av isolerade öar15,65. Samma fråga bör övervägas för vävnadsskivor om deras långsiktiga odling blir ett allmänt använt alternativ i framtiden22,36. Vävnadsskivarmetoden har också ett högt utbyte och minskar därmed potentiellt djurens lidande och ökar statistisk kraft. Dessutom kan så många skivor framställas från ett enda djur och eftersom skivorna överlever under långa perioder blir det möjligt att inkludera samma djur eller till och med samma ö i både experiment- och kontrollgrupperna.

Eftersom den ursprungliga arkitekturen och cell-till-cell-kommunikationen bevaras, och eftersom den är kompatibel med ett antal strukturella analyser, elektrofysiologiska, avbildningsmetoder och hormonsekretionsanalyser, är denna metod särskilt användbar för att studera bukspottkörtelfunktioner som är beroende av ostörda interaktioner mellan enskilda celler, t.ex. känslighet för sekretagoger, parakrin och immuninteraktioner mellan olika celltyper, mönster av elektrisk aktivitet, egenskaper hos kalciumdynamik och utsöndring av olika hormoner. För kalciumavbildning specifikt är de främsta fördelarna med att använda skivor exponeringen av ökärnan och möjligheten att förvärva signaler från många olika celltyper med hög upplösning. Beroende på experimentets krav och djurens ålder kan tjockleken varieras, skivorna kan transfekteras eller erhållas från djur med genetiskt kodade reportrar. Som förklaras mer detaljerat nedan möjliggör de två senare metoderna också specifik funktionell identifiering och karakterisering av svar från icke-betaceller 31,66. Dessutom kan öar från väldefinierade delar av organet studeras för skillnader i lyhördhet eller mottaglighet för sjukdom. Även om de inte kräver en återhämtningsinkubationsperiod kan de lätt inkuberas med olika farmakologiska medel, fettsyror, hög glukos och cytokiner.

Viktigast av allt, eftersom hög upplösning kan uppnås i kombination med encellig eller till och med subcellulär upplösning, är konfokal kalciumavbildning i skivor en av de mest lämpliga metoderna för att analysera kalciumvågor, funktionell anslutning och de olika funktionella rollerna hos celler i distinkta delar av en holme54,67. Trots ett antal fördelar har vävnadsskivametoden viktiga begränsningar. För det första är det fortfarande åtminstone delvis störande för ö- och exokrin arkitektur, särskilt vid skärytan, och försiktighetsåtgärder, såsom låg temperatur, frekvent utbyte av lösningar och mild och snabb manipulation, behövs under beredningen för att förhindra ytterligare mekanisk och endogen enzymatisk skada. För det andra är mönstren för leverans av näringsämnen och sekretagog fortfarande sämre än in vivo-vägen, preparatet är fristående från systemisk innervation och återkoppling mellan organ, såsom mellan holmen och dess målvävnader, är omöjlig, i motsats till in vivo-tillvägagångssätt. För det tredje begränsas maximal skivtjocklek av syresättning, näringstillförsel och pH-reglering vid ~ 200 μm9. Vidare kräver både beredning av skivor och avbildning mycket träning, och djupgående analyser av kalciumdata från långa tidsserier och från många celler kräver specialkunskaper som ofta inte ingår i en klassisk fysiologs verktygslåda och kräver hjälp från fysiker eller datavetare. Fördelen att homo- och heterotypiska interaktioner bevaras kan också komplicera analysen av prover på grund av närvaron av signaler från andra celler i regioner av intresse. Beroende på protokoll kan aktivering av andra celler leda till indirekt ytterligare stimulering eller hämning av en observerad cell.

Detta kan endast lösas slutgiltigt genom dekonvolutionsmetoder, genom mer komplexa stimuleringsprotokoll inklusive ämnen som blockerar några av de indirekta effekterna, genom att använda specifika knock-out-djur och genom noggrann jämförelse av resultat med resultat från andra studier som använder mer reduktionistiska metoder. Dessutom, om sekretionsmätningar är nödvändiga, bör man komma ihåg att vissa skivor kan sakna öar, och den totala massan av endokrin vävnad i en enda skiva är vanligtvis låg. Förberedelsen av akuta bukspottkörtelvävnadsskivor för avbildning innefattar flera kritiska steg som diskuteras i följande avsnitt och sammanfattas i tabell 1, där läsaren också kan hitta korta men viktiga tips för felsökning. Först, vid beredning av agaroslösningen, måste agarospulvret lösas upp helt, annars kan de oupplösta partiklarna hindra injektionen. Håll den homogena agaroslösningen vid 37-45 °C för att förhindra härdning av agaros på grund av för låg temperatur å ena sidan och för att förhindra vävnadsskador på grund av för höga temperaturer å andra sidan. Efter användning kan den återstående agarosen förvaras vid 4 °C och värmas upp igen, även om upprepad uppvärmning kan leda till ökad densitet på grund av vattenavdunstning, vilket så småningom gör injektionen svår eller omöjlig.

Nästa kritiska steg i beredningen är att klämma fast den stora duodenala papillen korrekt. En vit fläck på tolvfingertarmen indikerar korsningen mellan den gemensamma gallgången och tolvfingertarmen. En klämma placerad för proximalt kommer att resultera i obstruktion av vissa laterala bukspottkörtelgrenar i den gemensamma kanalen, vilket inaktiverar injektionen av dessa delar, medan en klämma placerad för distalt kommer att resultera i att agaros läcker genom den nedre motståndsvägen direkt in i tolvfingertarmen. Före kannulering av den gemensamma gallgången kan den omgivande fettvävnaden försiktigt avlägsnas för bättre visualisering av kanalen och större kontroll under injektionen. Otillräcklig precision vid avlägsnande av den omgivande vävnaden kan leda till perforering av kanalen. Valet av nåldiametern som används för agarosinjektion är också viktigt. Hos möss används företrädesvis en 30 G nål; mindre (32 eller 33 G) nålar kräver mer ansträngning på grund av agaroslösningens höga viskositet och är mer benägna att obstruktion. Men om de används i kombination med en agaroslösning med lägre densitet kan de vara till stor hjälp i mindre musstammar och yngre djur. Under de första postnatala dagarna kan agaros alternativt injiceras subkapsulärt snarare än intraduktalt2. Att använda nålar med större diameter hos möss kommer troligen att leda till att den gemensamma gallgången skadas. Detta kan också hända med rätt nåldiameter, och en pincett kan hjälpa till att hålla nålen på plats under injektionen. Nålar med större diameter kan vara den enda lösningen vid större kanaler, som finns hos råttor. Om nålen är för smal för att säkerställa en tät tätning som förhindrar ryggläckage, kan en ligatur placeras runt den vid framgångsrikt inträde i kanalen.

Agarosinjektion tar lite ansträngning på grund av lösningens viskositet, och när injektionsprocessen har startat bör den inte avbrytas eftersom agaroslösningen med låg smältpunkt kan stelna i nålen eller de största delarna av duktalträdet innan injektionen är klar. Detta kommer att resultera i dålig vävnadspenetration och sämre stöd under skärning. Kanalen ska alltid kannuleras vid den punkt där den vänstra leverkanalen och den cystiska kanalen går samman för att bilda den gemensamma gallgången.. Om den gemensamma gallgången blir perforerad, försök upprepade gånger att kannulera närmare tolvfingertarmen. När bukspottkörteln är tillräckligt stabiliserad med agaroslösning och extraheras från bukhålan skärs små bitar av välinsprutad vävnad. Innan du bäddar in dem i agarosen är det viktigt att ta bort alla fett- och bindväv eftersom deras rester gör skivning mer utmanande. Detsamma gäller blodkärl och kanalrester, förutom när de är i fokus för experimentet. I det här fallet, se till att placera dem på ett sådant sätt att önskat tvärsnitt kommer att erhållas. När du bäddar in vävnaden i agaros, se till att temperaturen är lämplig (37 °C) och att vävnaden är helt omgiven av agaros, eftersom krafter under vibratomskärning kan slita ut bukspottkörtelvävnaden från agarosblocken.

Att snabbt torka vävnadsblocken innan du placerar dem i agaros genom att placera dem kort på en pappersvävnad kan hjälpa till att förhindra dålig kontakt mellan vävnad och agaros under detta steg. Under stelning av agarosblock, placera petriskålen horisontellt och förhindra kontakt mellan bukspottkörtelvävnaden och botten av petriskålen. Om bukspottkörteln inte är helt injicerad kommer skärprocessen att vara utmanande. Försök därför att minska skärhastigheten för att få vävnadsskivor. För att minimera cellskador under vibrationsskivning, byt ut ECS (och isbitarna gjorda av ECS) i skivkammaren regelbundet. Den senare kommer att minska aktiviteten hos pankreasenzymer som frigörs från acinär vävnad under skivning. Skivornas tjocklek är också av avgörande betydelse. För kalciumdynamik och elektrofysiologiska experiment skärs vanligtvis 140 μm skivor; Enligt syftet med studien kan dock skivtjockleken sträcka sig från 90 μm till 200 μm. Tänk på att i tjockare skivor kommer diffusionen av syre och näringsämnen att begränsas, men de kommer att innehålla mer vävnad. Dessutom kan andelen oklippta holmar förväntas öka med ökande skivtjocklek. Skivor kan förvaras i ett regelbundet utbytt ECS vid rumstemperatur i flera timmar eller till och med odlas i ett lämpligt cellmedium i flera dagar; detta kan dock så småningom påverka den normala öcellsfysiologin 3,22.

När du förbereder färglösningen, se till att alla komponenter blandas noggrant och undvik exponering för omgivande ljus. Bukspottkörtelskivan består av många cellskikt, och upptaget av kalciumfärgämne är begränsat till de första mest ytliga cellskikten, som beskrivits tidigare för isolerade öar58,68 och hypofysskivor69. Men i motsats till isolerade öar där den omgivande kapseln och de yttre cellskikten hindrar färgämnets penetration i djupare lager, tillåter vävnadsskivor tillgång till hela tvärsnittsytan på ön, vilket möjliggör samtidig mätning av kalciumdynamiken i hundratals celler från alla lager av en ö. Fluorescerande Ca2+ indikatorer är de mest använda för att mäta kalciumdynamik, och tillsammans med CLSM möjliggör de inspelningar med hög tidsupplösning och når flera hundra Hertz. När du väljer den lämpligaste fluorescerande Ca2+ -indikatorn, överväga olika faktorer, inklusive indikatorformen, som påverkar cellbelastningsmetoden, mätläget (kvalitativt eller kvantitativt) och dissociationskonstanten (Kd) som måste ligga i ca2+ koncentrationsintervallet av intresse och beror på pH, temperatur, närvaro av Mg2+ och andra joner, samt proteinbindning. Eftersom cellulära Ca2+ signaler vanligtvis är övergående bör Ca2+ bindningshastighetskonstanten också övervägas. För att mäta [Ca2+]IC-dynamik i bukspottkörtelceller använder denna grupp huvudsakligen det cellgenomsläppliga Ca2+ indikatorfärgämnet som beskrivs i detta protokoll (Materialtabell) eftersom det är en lång våglängdsindikator med emissionsvåglängderna i spektrumet där cellulär autofluorescens vanligtvis är mindre problematisk och energin i excitationsljus är låg, vilket minskar risken för cellulära fotoskador. Eftersom detta färgämne är fluorescerande vid låga Ca2+ koncentrationer, underlättar detta bestämningen av baslinjen [Ca2+] IC och ökar cellulär synlighet före stimulering. Efter bindning av Ca2+ ökar färgämnets fluorescensintensitet 14 gånger, vilket möjliggör detektering av även små förändringar i [Ca2+]IC.

För framgångsrik kalciumavbildning av levande celler måste flera viktiga hårdvaruparametrar beaktas, som beskrivs i protokollavsnittet. För levande cellavbildning där signalamplituderna är låga och risken för fototoxicitet är hög, används mål med högre NA företrädesvis för att samla in mer ljus från provet. Om kalciumdynamik måste registreras med en hög tidsupplösning, använd resonansskannern istället för linjära galvanometrar. Förutom att välja rätt mål undviker användningen av mycket känsliga detektorer - som hybriddetektorer som kräver mindre laserkraft - fototoxicitet och fotoblekning. Detta är av särskild betydelse för långvarig kalciumavbildning. Andra viktiga steg i kalciumavbildning är parameterinställningar för bildkvalitet för tidsserieförvärv. De viktigaste är den tidsmässiga och den rumsliga upplösningen. Eftersom kalciumdynamiken i sig bestämmer den lägsta acceptabla tidsupplösningen måste samplingsfrekvensen vara minst två gånger högre än den förväntade signalfrekvensen för att detektera signalen eller till och med 10 gånger högre för att detektera signalens form på ett tillförlitligt sätt. Vid akuta bukspottkörtelvävnadsskivor kan kalciumdynamiken mätas i hundratals celler samtidigt och därför är den rumsliga upplösningen också viktig. Detta kan förbättras genom att öka antalet pixlar eller genom att öka linjens medelvärde under liveförvärv. Men på grund av det omvända förhållandet mellan den rumsliga och den tidsmässiga upplösningen behövs en avvägning mellan båda inställningarna.

Om kalciumavbildning måste utföras i en specifik cellpopulation i bukspottkörteln är en stimulans som funktionellt kan differentiera cellerna i skivan nödvändig. Hög glukos aktiverar pålitligt och snabbt betaceller till ett oscillerande mönster som läggs på en förhöjd kalciumnivå och är mycket synkroniserad mellan alla celler inom en ö 32,58,70. Betacellerna är den mest talrika celltypen inom en holme och ligger mestadels i ökärnan hos möss. Samma stimuleringsprotokoll minskar och förändrar ibland inte märkbart sprängningen i alfaceller 30,32,58,70,71,72. För att diskriminera alfaceller funktionellt kan låg (3 mM) glukos, glutamat eller adrenalin användas för att öka deras frekvens eller basala [Ca2+] IC 21,72,73,74,75. De representerar 10-20% av öcellerna och kommer att detekteras på öns periferi1. Deltaceller finns också i periferin. De utgör endast ~ 5% av det totala antalet endokrina celler i en ö och är vanligtvis aktiva i 6 mM glukos och svarar på glukosstimulering med en ökad oregelbunden sprängaktivitet från baslinjen eller en något förhöjd kalciumnivå 1,32,71,76. Ghrelin kan användas för specifik stimulering av deltaceller 21,77,78,79 i kalciumavbildningsexperiment. Protokoll för specifik funktionell identifiering av PP- och epsilonceller återstår dock att definiera. Vidare aktiverar 25 nM acetylkolin på ett tillförlitligt sätt acinarceller till sprängaktivitet 35,80,81. Dessutom kan ett antal andra sekretagoger, såsom cerulein, cholecystokinin och karbamylkolin, användas för att framkalla kalciumsvar i acinarceller 22,40,82,83.

Slutligen framkallar 1 mM kenodeoxicholsyra på ett tillförlitligt sätt kalciumsvar i duktala celler i vävnadsskivor; angiotensin II, ATP och några andra sekretagoger kan också användas 11,23,84,85. När en funktionell identifiering baserad på karakteristiska svar på specifika sekretagoger och hämmare inte är tillräcklig kan genetiskt märkta djur31, transfekterade celler73 eller immunocytokemi användas för identifiering av olika celltyper 9,22,71,86 . Under de senaste åren har vävnadsskiva-metoden framgångsrikt anpassats till mänsklig vävnad och öppnat många nya viktiga forskningsvägar inom både exokrin41 och endokrin fysiologi 9,36,37,39. Intressant nog har en detaljerad bedömning av kalciumdynamiken i mänskliga öar varit notoriskt svår och återstår att undersöka mer detaljerat87. I kombination med avancerad konfokalmikroskopi har bukspottkörtelvävnadsskiva-metoden möjliggjort många nya insikter om kalciumdynamiken hos möss och kommer förhoppningsvis att göra detsamma för mänsklig vävnad.

Disclosures

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiellt eller ekonomiskt intresse.

Acknowledgments

Det arbete som presenterades i denna studie stöddes ekonomiskt av den slovenska forskningsbyrån (forskningsmaterial. P3-0396 och I0-0029, samt forskningsprojekt nr. J3-9289, N3-0048 och N3-0133) och av den österrikiska vetenskapsfonden / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bilaterala bidrag I3562--B27 och I4319--B30). Vi tackar Maruša Rošer, Maša Čater och Rudi Mlakar för utmärkt tekniskt bistånd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Analytical balance KERN ALJ 120-4 KERN & SOHN GmbH ALJ 160-4A
Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup Leica 5100001578
Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup Leica
Cork pad 15 cm x 15 cm
Corning 15 mL centrifuge tubes Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430790
Corning Round Ice Bucket with Lid, 4 L Fischer Scientific, Leicestershire, UK 432124
Double edge razor blade Personna, USA
Dumont #5 - Fine Forceps FST, Germany 11254-20
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL Eppendorf 0030 121.023
Erlenmeyer flask 200 mL IsoLab, Germany 027.01.100
Fine Scissors - ToughCut FST, Germany 14058-11
Flat orbital shaker  IKA KS 260 basic IKA Ident. No.: 0002980200
Glass lab bottle 1000 mL IsoLab, Germany 091.01.901
Hartman Hemostat, curved FST, Germany 13003-10
HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0) Leica 15507701
Measuring cylinder 25 mL IsoLab, Germany 015.01.025
Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7 Luigs & Neumann  200-100 900 7311, 200-100 900 9050
Microwave owen Gorenje, Slovenia MO20MW
Osmometer Gonotec 010 Gonotec, Berlin, Germany OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20
Paint brush Faber-Castell, No.2 Any thin soft round paint brush No.2, preferably black
Paper towels
Perifusion pumps Ismatec ISM 827 Reglo Analog MS - 4/8
Petri dish 100/20 mm Sarstedt 83.3902
Petri dish 35/10 mm Greiner bio-one 627102
Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA 153066 NON-STICKY for agarose blocks
pH meter inoLab pH Level 1 WTW, Weilheim, Germany E163694
Pipette 1000 mL Eppendorf 3121 000.120
Pipette 50 mL Eppendorf 3121 000.066
Push pins 23 mm Deli, Ningbo, China E0021
Screw cap tube, 15 mL Sarstedt 62.554.502
Semken Forceps FST, Germany 11008-13
Stabilizing ring for Erlenmeyer flask IsoLab, Germany 027.11.048
Stereomicroscope Nikon SMZ 745 Nikon, Melville, NY USA
Syringe Injekt Solo 5 mL Braun, Melsungen, Germany 4606051V
Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2") Braun, Melsungen, Germany 4656300
Temperature controller Luigs & Neumann 200-100 500 0150, 200-150-500-145 Slice mini chamber, Temperature controller TC 07
Tubings for perifusion system Ismatec SC0310 Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)
Ultrasonic bath Studio GT-7810A Globaltronics
Vibrotome Leica VT 1000 S Leica, Nussloch, Germany 14047235613
Volumetric flask 1000 mL IsoLab, Germany 013.01.910
Vortex mixer Neolab 7-2020 Neolab  7-2020
Water bath Thermo Haake open-bath circulator Thermo Fisher Scientific Z527912
Material/Reagent
Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany C5080-500G
D-(+)-glucose Sigma Aldrich, Germany G8270-1KG
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D4540-100ML
DL-lactic acid Sigma Aldrich, Germany L1250-500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Merck KGaA, Darmstadt, Germany D8662-500ML
Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure
Glue Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020
HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G
L-(+)-ascorbic acid Sigma Aldrich, Germany A9,290-2
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA L3224
Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O Sigma Aldrich, Germany M2670-500G
Myo-inositol Sigma Aldrich, Germany I5125-100G
Oregon Green 488 BAPTA-1, AM Invitrogen (Thermo FisherScientific) O6807 cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) P3000MP polaxamer: nonionic triblock copolymer
Potassium chloride - KCl Sigma Aldrich, Germany 31248
SeaPlaque GTG agarose Lonza, Rockland, USA 50111
Sodium bicarbonate - NaHCO3 Honeywell, Germany 31437-500G
Sodium chloride - NaCl Honeywell, Germany 31434-1KG
Sodium hydroxide - NaOH Sigma Aldrich, Germany 30620
Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4 Sigma Aldrich, Germany S0751-500G
Sodium pyruvate Sigma Aldrich, Germany 15990-100G
Software
FIJI FIJI is an open source project
LASAF Leica microsystems, Inc.
Matlab Mathworks
Python Python Software Foundation Python is an open source project

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e1024405 (2015).
  2. Meneghel-Rozzo, T., Rozzo, A., Poppi, L., Rupnik, M. In vivo and in vitro development of mouse pancreatic ß-cells in organotypic slices. Cell and Tissue Research. 316 (3), 295-303 (2004).
  3. Rozzo, A., Meneghel-Rozzo, T., Delakorda, S. L., Yang, S. B., Rupnik, M. Exocytosis of insulin: in vivo maturation of mouse endocrine pancreas. Annals of the New York Academy of the Sciences. 1152, 53-62 (2009).
  4. Dolenšek, J., Pohorec, V., Rupnik, M. S., Stožer, A. Pancreas physiology, challenges in pancreatic pathology. IntechOpen. Seicean, A. , (2017).
  5. Williams, J. A. The nobel pancreas: a historical perspective. Gastroenterology. 144 (6), 1166-1169 (2013).
  6. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  7. Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. American Journal of Physiology. 235 (5), 517-524 (1978).
  8. Peikin, S. R., Rottman, A. J., Batzri, S., Gardner, J. D. Kinetics of amylase release by dispersed acini prepared from guinea pig pancreas. American Journal of Physiology. 235 (6), E743-E749 (1978).
  9. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  10. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. Altex-Alternatives to Animal Experimentation. 27 (2), 105-113 (2010).
  11. Molnar, R., et al. Mouse pancreatic ductal organoid culture as a relevant model to study exocrine pancreatic ion secretion. Laboratory Investigation. 100 (1), 84-97 (2020).
  12. Rupnik, M. The physiology of rodent beta-cells in pancreas slices. Acta Physiologica (Oxford, England). 195 (1), 123-138 (2009).
  13. Blinman, T. A., et al. Activation of pancreatic acinar cells on isolation from tissue: cytokine upregulation via p38 MAP kinase. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 279 (6), C1993-C2003 (2000).
  14. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic ß-cells. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 446 (5), 553-558 (2003).
  15. Gilon, P., Jonas, J., Henquin, J. Culture duration and conditions affect the oscillations of cytoplasmic calcium concentration induced by glucose in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 37 (10), 1007-1014 (1994).
  16. Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), e55160 (2017).
  17. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (7), e255 (2007).
  18. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1125 (2009).
  19. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1343 (2009).
  20. Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4137 (2012).
  21. Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging calcium dynamics in subpopulations of mouse pancreatic islet cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (153), (2019).
  22. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS ONE. 8 (11), e78706 (2013).
  23. Gal, E., et al. A Novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
  24. Speier, S., Yang, S. B., Sroka, K., Rose, T., Rupnik, M. KATP-channels in beta-cells in tissue slices are directly modulated by millimolar ATP. Molecular and Cellular Endocrinology. 230 (1-2), 51-58 (2005).
  25. Speier, S., Gjinovci, A., Charollais, A., Meda, P., Rupnik, M. Cx36-mediated coupling reduces β-cell heterogeneity, confines the stimulating glucose concentration range, and affects insulin release kinetics. Diabetes. 56 (4), 1078-1086 (2007).
  26. Rose, T., Efendic, S., Rupnik, M. Ca2+-secretion coupling is impaired in diabetic Goto Kakizaki rats. The Journal of General Physiology. 129 (6), 493-508 (2007).
  27. Paulmann, N., et al. Intracellular serotonin modulates insulin secretion from pancreatic β-cells by protein serotonylation. PLoS Biology. 7 (10), e1000229 (2009).
  28. Mandic, S. A., et al. Munc18-1 and Munc18-2 proteins modulate β-cell Ca2+ sensitivity and kinetics of insulin exocytosis differently. Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 28026-28040 (2011).
  29. Dolensek, J., Skelin, M., Rupnik, M. S. Calcium dependencies of regulated exocytosis in different endocrine cells. Physiological Research. 60, S29-S38 (2011).
  30. Huang, Y. C., Rupnik, M., Gaisano, H. Y. Unperturbed islet α-cell function examined in mouse pancreas tissue slices. Journal of Physiology. 589 (2), 395-408 (2011).
  31. Huang, Y. C., et al. In situ electrophysiological examination of pancreatic α cells in the streptozotocin-induced diabetes model, revealing the cellular basis of glucagon hypersecretion. Diabetes. 62 (2), 519-530 (2013).
  32. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (1), e54638 (2013).
  33. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), e1002923 (2013).
  34. Dolenšek, J., Stožer, A., Skelin Klemen, M., Miller, E. W., Slak Rupnik, M. The relationship between membrane potential and calcium dynamics in glucose-stimulated beta cell syncytium in acute mouse pancreas tissue slices. PLoS ONE. 8 (12), e82374 (2013).
  35. Perc, M., Rupnik, M., Gosak, M., Marhl, M. Prevalence of stochasticity in experimentally observed responses of pancreatic acinar cells to acetylcholine. Chaos. 19 (3), 037113 (2009).
  36. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265-3265 (2020).
  37. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), e134525 (2020).
  38. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  39. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting beta cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
  40. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  41. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  42. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  43. Klemen, M., Dolenšek, J., Stožer, A., Rupnik, M. Exocytosis Methods. Thorn, P. 7, Humana Press. 127-146 (2014).
  44. Speier, S. Experimental approaches for high-resolution in vivo imaging of islet of Langerhans biology. Current Diabetes Reports. 11 (5), 420-425 (2011).
  45. Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Intraocular in vivo imaging of pancreatic islet cell physiology/pathology. Molecular Metabolism. 6 (9), 1002-1009 (2017).
  46. Reissaus, C. A., et al. A Versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 8449 (2019).
  47. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. FASEB Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  48. Fernandez, J., Valdeolmillos, M. Synchronous glucose-dependent [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans recorded in vivo. FEBS Letters. 477 (1-2), 33-36 (2000).
  49. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metabolism. 27 (3), 630-644 (2018).
  50. Weitz, J. R., et al. Mouse pancreatic islet macrophages use locally released ATP to monitor beta cell activity. Diabetologia. 61 (1), 182-192 (2018).
  51. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in α- and β-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60 (5), 1535-1543 (2011).
  52. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95 (11), 5048-5061 (2008).
  53. Santos, R. M., et al. Widespread synchronous Ca oscillations due to bursting electrical activity in single pancreatic islets. Pflügers Archive: European Journal of Physiology. 418 (4), 417-422 (1991).
  54. terk, M., et al. Assessing the origin and velocity of Ca2+ waves in three-dimensional tissue: Insights from a mathematical model and confocal imaging in mouse pancreas tissue slices. Communications in Nonlinear Science and Numerical Simulation. 93, 105495 (2021).
  55. Gosak, M., et al. Critical and supercritical spatiotemporal calcium dynamics in beta cells. Frontiers in Physiology. 8, 1106 (2017).
  56. Satin, L. S., Butler, P. C., Ha, J., Sherman, A. S. Pulsatile insulin secretion, impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Molecular Aspects in Medicine. 42, 61-77 (2015).
  57. Tengholm, A., Gylfe, E. Oscillatory control of insulin secretion. Molecular and Cellular Endocrinology. 297 (1-2), 58-72 (2009).
  58. Quesada, I., et al. Glucose induces opposite intracellular Ca2+ concentration oscillatory patterns in identified α- and β-cells within intact human islets of Langerhans. Diabetes. 55 (9), 2463-2469 (2006).
  59. Ferguson, J., Allsopp, R. H., Taylor, R. M., Johnston, I. D. Isolation and long term preservation of pancreatic islets from mouse, rat and guinea pig. Diabetologia. 12 (2), 115-121 (1976).
  60. Andersson, A. Isolated mouse pancreatic islets in culture: effects of serum and different culture media on the insulin production of the islets. Diabetologia. 14 (6), 397-404 (1978).
  61. Ramirez-Dominguez, M. Isolation of mouse pancreatic islets of Langerhans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 938, 25-34 (2016).
  62. Carter, J., Dula, S., Corbin, K., Wu, R., Nunemaker, C. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11 (1), 3-31 (2009).
  63. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplantation. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  64. Zawalich, W. S., Yamazaki, H., Zawalich, K. C. Biphasic insulin secretion from freshly isolated or cultured, perifused rodent islets: comparative studies with rats and mice. Metabolism. 57 (1), 30-39 (2008).
  65. Roe, M. W., et al. Absence of effect of culture duration on glucose-activated alterations in intracellular calcium concentration in mouse pancreatic islets. Diabetologia. 38, 876-877 (1995).
  66. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflügers Archive. European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  67. Dolenšek, J., et al. Glucose-dependent activation, activity, and deactivation of beta cell networks in acute mouse pancreas tissue slices. bioRxiv. , (2020).
  68. QZhang, Q., et al. Cell coupling in mouse pancreatic beta-cells measured in intact islets of Langerhans. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical, and Engineering Sciences. 366 (1880), 3503-3523 (2008).
  69. Sánchez-Cárdenas, C., Hernández-Cruz, A. GnRH-induced Ca2+-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  70. Asada, N., Shibuya, I., Iwanaga, T., Niwa, K., Kanno, T. Identification of alpha- and beta-cells in intact isolated islets of Langerhans by their characteristic cytoplasmic Ca2+ concentration dynamics and immunocytochemical staining. Diabetes. 47 (5), 751-757 (1998).
  71. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified α-, β- and δ-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (1), 85-93 (1999).
  72. Shuai, H., Xu, Y., Yu, Q., Gylfe, E., Tengholm, A. Fluorescent protein vectors for pancreatic islet cell identification in live-cell imaging. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 468 (10), 1765-1777 (2016).
  73. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7 (6), 545-554 (2008).
  74. Li, J., et al. Submembrane ATP and Ca2+ kinetics in α-cells: unexpected signaling for glucagon secretion. FASEB Journal. 29 (8), 3379-3388 (2015).
  75. Hamilton, A., et al. Adrenaline stimulates glucagon secretion by Tpc2-dependent Ca(2+) mobilization from acidic stores in pancreatic α-cells. Diabetes. 67 (6), 1128-1139 (2018).
  76. Arrojo, E. D. R., et al. Structural basis for delta cell paracrine regulation in pancreatic islets. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  77. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  78. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59 (10), 2156-2165 (2016).
  79. Rorsman, P., Huising, M. O. The somatostatin-secreting pancreatic δ-cell in health and disease. Nature reviews. Endocrinology. 14 (7), 404-414 (2018).
  80. Petersen, C. C., Toescu, E. C., Petersen, O. H. Different patterns of receptor-activated cytoplasmic Ca2+ oscillations in single pancreatic acinar cells: dependence on receptor type, agonist concentration and intracellular Ca2+ buffering. The EMBO journal. 10 (3), 527-533 (1991).
  81. Thorn, P., Lawrie, A. M., Smith, P. M., Gallacher, D. V., Petersen, O. H. Local and global cytosolic Ca2+ oscillations in exocrine cells evoked by agonists and inositol trisphosphate. Cell. 74 (4), 661-668 (1993).
  82. Behrendorff, N., Floetenmeyer, M., Schwiening, C., Thorn, P. Protons released during pancreatic acinar cell secretion acidify the lumen and contribute to pancreatitis in mice. Gastroenterology. 139 (5), e1711-e1715 (2010).
  83. Criddle, D. N., et al. Cholecystokinin-58 and cholecystokinin-8 exhibit similar actions on calcium signaling, zymogen secretion, and cell fate in murine pancreatic acinar cells. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (6), G1085-G1092 (2009).
  84. Venglovecz, V., et al. Effects of bile acids on pancreatic ductal bicarbonate secretion in guinea pig. Gut. 57 (8), 1468-3288 (2008).
  85. Maleth, J., Hegyi, P. Calcium signaling in pancreatic ductal epithelial cells: an old friend and a nasty enemy. Cell Calcium. 55 (6), 337-345 (2014).
  86. Nadal, A., Quesada, I., Soria, B. Homologous and heterologous asynchronicity between identified alpha-, beta- and delta-cells within intact islets of Langerhans in the mouse. Journal of Physiology. 517 (Pt 1), 85-93 (1999).
  87. Skelin Klemen, M., Dolenšek, J., Slak Rupnik, M., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).

Tags

Biologi Utgåva 170 Bukspottkörtel agaros vävnadsskiva in situ-beredning konfokal laserscanningsmikroskopi kalciumavbildning encellsupplösning 3R
Konfokal laserscanningsmikroskopi av kalciumdynamik i akuta mus pankreasvävnadsskivor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stožer, A., Dolenšek, J.,More

Stožer, A., Dolenšek, J., Križančić Bombek, L., Pohorec, V., Slak Rupnik, M., Klemen, M. S. Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62293, doi:10.3791/62293 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter