Summary
Hier beschrijven we een eenvoudig protocol om DNA-vingerafdrukkenprofielen te genereren door de VNTR-locus D1S80 te versterken uit epitheelcel-DNA.
Abstract
In de biologische wetenschappen wordt DNA-fingerprinting veel gebruikt voor vaderschapstests, forensische toepassingen en fylogenetische studies. Hier beschrijven we een betrouwbare en robuuste methode voor genotypering van individuen door variabele aantal Tandem Repeat (VNTR) analyse in de context van niet-gegradueerde laboratoriumklassen. De menselijke D1S80 VNTR locus wordt in dit protocol gebruikt als een zeer polymorfe marker gebaseerd op variatie in het aantal repetitieve sequenties.
Dit eenvoudige protocol geeft nuttige informatie voor docenten en de implementatie van DNA-vingerafdrukken in praktische laboratoriumlessen. In de gepresenteerde laboratoriumoefening wordt DNA-extractie gevolgd door PCR-versterking gebruikt om genetische variatie bij de D1S80 VNTR-locus te bepalen. Verschillen in de fragmentgrootte van PCR-producten worden gevisualiseerd door agarosegelelektroforese. De fragmentgroottes en herhalingsgetallen worden berekend op basis van een lineaire regressie van de grootte en migratieafstand van een DNA-groottestandaard.
Volgens deze gids moeten studenten in staat zijn om:
• Dna oogsten en extraheren uit buccale slijmvliesepitheelcellen
• Voer een PCR-experiment uit en begrijp de functie van verschillende reactiecomponenten
• Analyseer de amplicons door agarose gel elektroforese en interpreteer de resultaten
• Begrijp het gebruik van VNDR's bij DNA-vingerafdrukken en de toepassing ervan in de biologische wetenschappen
Introduction
Moleculaire vingerafdrukken, ook wel DNA-vingerafdrukken genoemd, werden geïntroduceerd door Sir Alec Jeffreys toen hij in 1984 werkte op het department of Genetics van de Universiteit van Leicester1. Het is gebaseerd op de 0,1% van het menselijk genoom dat verschilt tussen individuen en bestaat uit ongeveer drie miljoen varianten. Deze unieke verschillen in het genotype maken de differentiatie tussen individuen mogelijk en kunnen daarom functioneren als een genetische vingerafdruk, behalve voor monozygote tweelingen. Bijgevolg wordt DNA-vingerafdrukken gebruikt voor de schatting van verwantschap van verschillende individuen die bijvoorbeeld wordt toegepast bij vaderschapstests of in populatiediversiteitsstudies. In onze laboratoriumlessen wilden we het concept van DNA-vingerafdrukken en allelfrequenties overbrengen. De hier beschreven methode toont een betrouwbare en robuuste methode voor genetische vingerafdrukken door het variabele aantal tandemherhalingen (VNTR) op de D1S80-locus te analyseren. De methode omvat de extractie van DNA uit buccale slijmvliesepitheelcellen en daaropvolgende Polymerase Chain Reaction (PCR) om de D1S80-locus te versterken, gevolgd door visualisatie van fragmentlengteverschillen op een agarosegel.
De D1S80 VNTR minisatelliet locus is zeer variabel en bevindt zich in het telomerische gebied van chromosoom 1 (1p36-p35). Het werd geïdentificeerd en beschreven door Karsai en collega's in 1990 als een locus met een kern herhaaleenheid van 16 bp, waardoor de scheiding van allelen met slechts één eenheid2mogelijk was. Bovendien vertoont D1S80 een hoge mate van variatie met een mutatiesnelheid van ongeveer 7,77 x 10-5 3. D1S80 heeft een hoge mate van heterozygositeit4,5 (bijv. 80,8% heterozygositeit voor Kaukasiërs6 en tot 87% heterozygositeit voor Afro-Amerikanen7). Bovendien is de D1S80-locus polymorf in de meeste populaties, met meestal meer dan 15 verschillende allelen die elk 14 tot 41 herhalingen dragen. De frequentie van D1S80 allelen varieert tussen populaties. Het allel met 24 herhalingseenheden (allel 24) komt het meest voor in Europese en Aziatische populaties , terwijl allel 21 het meest voorkomt bij Afrikaanse populaties4,7,8,9,10. Bijgevolg zijn de allelfrequentieverdelingen kenmerkend voor verschillende menselijke populaties en moeten ze in aanmerking worden genomen voor de schatting van verwantschap (bijvoorbeeld bij vaderschapstests).
PCR gebaseerde versterking van de D1S80 VNTR locus is een zeer nuttige methode geweest in forensische wetenschap, vaderschapstests, ziekteanalyse en populatiediversiteitsstudies11,12,13,14. Terwijl in de forensische industrie vandaag het gebruik van VNTR's is vervangen door korte tandemherhalingen, wordt de D1S80 VNTR-locus veel gebruikt bij de bepaling van oorsprong en genetische relaties tussen en tussen populaties4,8,9,11. Bovendien wordt het vaak gebruikt om DNA-vingerafdrukken te leren in praktische laboratoriumklassen15,16. De hier beschreven methode vertegenwoordigt een robuuste, kosteneffectieve en gebruiksvriendelijke methode met een zeer hoog slagingspercentage in niet-gegradueerde laboratoriumklassen. Het doel van dit artikel is om een overzicht te geven van de workflow voor de moleculaire analyse van de menselijke D1S80 minisatelliet locus uit buccale slijmvlies epitheelcellen. Het omvat demonstratie van technieken, vereenvoudigde protocollen en praktische suggesties beschreven in eerder gepubliceerde werken2,17.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol mag alleen worden gebruikt als studenten of respectieve wettelijke voogden akkoord zijn gegaan met de geleiding van dit protocol, omdat genotypische profielen inzicht geven in genetische relaties. DNA-vingerafdrukken zijn een veelgebruikte moleculaire biologiemethode die voornamelijk wordt toegepast op bevolkingsonderzoek en forensische zaken. Daarom moet aandacht worden besteed aan het zo laag mogelijk houden van besmettingsrisico's. Om besmetting van het monster met DNA van een externe bron of DNases te voorkomen, moeten handschoenen worden gedragen, moeten instrumenten grondig worden gereinigd of gesteriliseerd en moeten oplossingen vóór gebruik worden gefilterd of geautoclaveerd.
1. Oogsten van buccale slijmvliesepitheelcellen
LET OP: Werken met speeksel en epitheelcellen kan leiden tot een overdracht van infectieziekten. Daarom moeten standaard- en transmissiegebaseerde voorzorgsmaatregelen worden toegepast (bijv. het gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen).
OPMERKING: Neem een positieve controle op, die wordt geleverd door de instructeur (bijv. DNA geëxtraheerd door de instructeur) en is opgenomen in de downstreamverwerkingsstappen.
- Wacht ten minste 1 uur na het eten of tandenpoetsen voordat u de monsters opeet.
- Etiket een lege en steriele microcentrifugebuis van 2,0 ml.
- Verwijder een steriel buccaal wattenstaafje uit de verpakking en wrijf krachtig op de binnenkant van de wang gedurende 30-40 keer of 30-40 seconden om buccale slijmvliesepitheelcellen te oogsten.
- Plaats de punt van het opvangdoekje in de eerder gelabelde steriele microcentrifugebuis en breek de lengte van het plastic af dat zich uitstrekt tot voorbij de rand, met de hand of met een steriele schaar.
- Plaats de dop stevig op de buis en sluit het opvangdoekje af.
2. Extractie van genomisch DNA uit menselijke cellen
- Stel vóór de extractie een thermische mixer of een verwarmingsblok in op 65 °C voor monsterlyse.
LET OP: Sommige gebruikte chemicaliën zijn geclassificeerd als gevaarlijk. Lees het veiligheidsinformatieblad zorgvuldig door en neem passende veiligheidsmaatregelen voordat u het behandelt.- Bereid en steriliseer door alle benodigde buffers en oplossingen te filteren of te autoclaafen (lysisoplossing, 8 M kaliumacetaat, 2-propanol, 70% ethanol en elutiebuffer).
OPMERKING: Alle centrifugeerstappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-30 °C), tenzij anders aangegeven.
- Bereid en steriliseer door alle benodigde buffers en oplossingen te filteren of te autoclaafen (lysisoplossing, 8 M kaliumacetaat, 2-propanol, 70% ethanol en elutiebuffer).
- Voeg 500 μL lysisoplossing (50 mM Tris/HCl, pH 8,0; 10 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA); 2% natriumdodecylsulfaat (SDS)) toe aan het buccale wattenstaafje en zorg ervoor dat het monster volledig in de lysisoplossing is ondergedompeld.
- Vortex krachtig gedurende ten minste 5 s.
- Incubeer monsters bij 65 °C in een thermische mixer gedurende 10 minuten.
- Meng het monster 3-4 keer door pulskolken gedurende 5 s tijdens incubatie.
- Verwijder het wattenstaafje uit de lysisbuffer, druk het wattenstaafje tegen de binnenkant van de buis om een maximaal monstervolume te verkrijgen.
- Voeg 100 μL 8 M kaliumacetaat toe aan de cellen.
- Meng grondig door de buis om te keren tot er een wit neerslag is.
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 18.000 x g.
- Breng 450 μL van het supernatant over in een schone en steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 450 μL 2-propanol toe en meng grondig door de buis om te keren (neerslag van het DNA).
- Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer gedurende 5 min bij 18.000 x g.
- Gooi het supernatant weg en keer de buis om op een schone papieren handdoek om de pellet te drogen en kruisbesmetting te voorkomen.
- Incubeer het DNA gedurende 5 minuten bij 65 °C in een verwarmingsblok om de pellet volledig te drogen.
- Voeg 500 μL 70% ethanol toe om het DNA te wassen.
- Centrifugeer gedurende 1 min op 18.000 x g.
- Gooi het supernatant weg en keer de tube om op een schone papieren handdoek om de pellet te drogen.
- Voeg 30 μL resuspensiebuffer (10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) toe aan de pellet.
- Incubeer het DNA gedurende 10 minuten bij 65 °C in een verwarmingsblok om DNases te inactiveren.
3. Versterking van de D1S80 VNTR locus met behulp van PCR
OPMERKING: Noteer het aantal monsters dat zal worden gebruikt en bereid een werkblad voor met de vereiste reagentia en hun volumes voordat u de benodigde kunststoffen en andere materialen verzamelt. Etiketteer de steriele buizen/strips/platen die voor de PCR moeten worden gebruikt met monsternummers. Vergeet niet om een negatieve controle op te nemen met H2O in plaats van DNA en een positieve controle (bijvoorbeeld met behulp van het DNA dat door de instructeur wordt verstrekt) om de PCR te valideren.
- Bereid de 1x PCR mastermix voor die 10 μL 5x PCR-reactiebuffer bevat (met 15 mM MgCl2),1 μL deoxyribonucleotidetrifosfaat (dNTPs) (10 mM), 5 μL (10 pmol) van elke primer pMCT118-f en pMCT118-r (voorwaarts - 5'-GAAC reverse - 5'-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3') volgens Kasai et al.2, 23,8 μL ultrapure H2O en 0,2 μL Taq DNA-polymerase (5 U/μL).
OPMERKING: De primers pMCT118-f/pMCT118-r zijn ontworpen op de flankerende gebieden van de D1S80 VNTR-regio die de hele locus versterken. - Etiketteer de PCR-buizen/strips/plaat met de te gebruiken monsternummers.
- Aliquot 45 μL van de hoofdmix aan elke gelabelde PCR-monsterbuis of put.
- Voeg 5 μL van de DNA-sjabloon toe aan de mastermix in elke PCR-buis/-plaatput om een totaal volume van 50 μL te verkrijgen. Verander de pipettip voor elk DNA-monster om kruisbesmetting te voorkomen.
- Voeg een NTC (No Template Control) toe met ultrapure H2O in plaats van DNA.
- Sluit PCR buizen/strips of afdichtingsplaat en meng.
- Centrifugeer de PCR-buizen/strips/platen gedurende 20 s met behulp van een tafelcentrifuge.
OPMERKING: De PCR-omstandigheden in dit protocol zijn geoptimaliseerd met behulp van het GEBRUIKTE DNA-polymerase en de PCR-thermische cycler. Over het algemeen moeten pcr-omstandigheden worden aangepast aan het DNA-polymerase. De standaard verlengingstijd voor een Taq DNA polymerase is 1 min/kb. - Plaats de monsterbuizen/strips/plaat in de thermocycler en incubeer de reacties onder de volgende omstandigheden (verlengingstijd van DNA-polymerase): 1 cyclus van 95 °C gedurende 2 minuten; 25 cycli van 94 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 15 s, 72 °C voor 30 s; 1 cyclus van 72 °C gedurende 10 min.
- Wanneer het programma is voltooid, verwijdert u de producten uit de thermocycler en bewaart u ze 's nachts bij 4 °C of -20 °C tot elektroforese.
4. Agarose gel elektroforese van PCR producten
- Bereid een 1,5% agarose gel.
- Gebruik 1,5 g agarosepoeder en meng het met 100 ml 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) bufferoplossing in een kolf.
- Verwarm het mengsel ongeveer 1,5-2 min in een magnetron (600 W). Wervel de inhoud en verwarm opnieuw, indien nodig, om de agarose volledig op te lossen. Koel iets af en voeg 2 μL PeqGreen toe aan de agarose.
- Giet de gel in een vorm met behulp van een kam met voldoende putten voor alle monsters en voeg ten minste één moleculaire gewichtsmarker toe.
LET OP: Kookvertraging kan optreden. Schud de kolf voorzichtig bij het opnieuw insuspenden van de agarose die nog niet is opgelost.
OPMERKING: PeqGreen is een niet-toxische kleurstof voor de detectie van nucleïnezuren. Het is van toepassing op het kleuren van dubbelstrengs DNA (dsDNA) en enkelstrengs DNA (ssDNA) en RNA. De gevoeligheid is vergelijkbaar met ethidiumbromide.
- Verwijder de PCR-producten van 4 °C en centrifugeer gedurende ongeveer 10 s.
- Beleed de putten van de gel met een monster van 10 μL. Overbelast de gel niet.
OPMERKING: De DNA-polymerasebuffer bevat ook verbindingen die de monsterdichtheid verhogen, zodat monsters rechtstreeks op gels kunnen worden geladen zonder dat een ladingskleurstof nodig is. Hierdoor kan het monster in de put zinken en helpen kleurstoffen om bij te houden hoe ver het DNA-monster is gemigreerd.- Voeg een moleculaire gewichtsnorm toe aan de flankerende putten (bij voorkeur een 50 bp moleculaire gewichtsnorm).
OPMERKING: Bewaar de resterende PCR-monsters bij -20 °C voor het geval de elektroforese van de agarosegel moet worden herhaald.
- Voeg een moleculaire gewichtsnorm toe aan de flankerende putten (bij voorkeur een 50 bp moleculaire gewichtsnorm).
- Laat de gel in 1x TAE lopende buffer op 150 V (constant) gedurende ongeveer 40 minuten of totdat de onderste gele kleurstof voorkant die reist op ongeveer 50 bp bereikt het onderste uiteinde van de gel.
- Beeld de gel terwijl blauw licht of ultraviolet (UV) licht wordt toegepast en neem een afbeelding op voor fragmentlengteanalyse.
LET OP: UV-licht kan uw ogen en huid beschadigen. Draag altijd beschermende kleding en een UV-veiligheidsbril bij gebruik van een UV-lichtbak. - Gooi de gel weg in overeenstemming met het institutionele beleid inzake gevaarlijke stoffen.
5. Analyse van fragmentlengteresultaten
OPMERKING: Gebruik lineaire regressieanalyse om de lengtes van de fragmenten te schatten.
- Voor het dimensioneren van de D1S80 PCR-fragmenten plaatst u een liniaal op de gelfoto over de standaardbaan van 50 bp moleculair gewicht, zodat de bovenkant van de liniaal in lijn ligt met de onderkant van de put waarin het monster is geladen (figuur 1).
OPMERKING: Om de lineaire regressievergelijking voor de moleculaire gewichtsnorm (50 bp moleculaire gewichtsnorm) te berekenen, werd een spreadsheetprogramma gebruikt. - Noteer de afstand tot de put (bijv. in cm) voor elke band van de 50 bp moleculaire gewichtsnorm in een tabel met behulp van een spreadsheetprogramma (Figuur 2).
- Bepaal het logboek (bijv. basis 10) van elke fragmentgrootte van de 50 bp moleculaire gewichtsnorm en voer de logwaarden in de tabel in (figuur 2).
- Plot elk gegevenspunt naar een grafiek met het logboek van de bandgrootten op de verticale as (y-as) en de gemeten runafstand van de bovenkant van de gel tot elke band van de moleculaire gewichtsnorm op de horizontale as (x-as) met behulp van een scatterplot (Figuur 3).
- Plaats een trendlijn (lineaire regressielijn) en toon de regressievergelijking (y = ax + b) en de R2-waarde in de grafiek (figuur 4).
- Meet de gemigreerde afstand (bijv. in cm) voor elke D1S80-amplicon (figuur 5).
- Schat de grootte van elke D1S80 amplicon met behulp van de regressievergelijking: y = ax + b
waarbij y = het logboek van de fragmentgrootte
a = de helling van de lijn (berekend in punt 5)
x = de afstand tot de put (in cm)
b = het punt waar de regressielijn de y-as onderschept (berekend in punt 5)
OPMERKING: Aangezien de y-waarde het logboek van de fragmentgrootte vertegenwoordigt, moet de antilog (10y) worden berekend om de fragmentgrootte in bp van de D1S80-amplicons te verkrijgen.
6. Schatting van het aantal herhalingseenheden in de allelen van de geteste personen
OPMERKING: De D1S80 repeat unit is 16 bp lang. Het kleinste bekende allel voor D1S80 heeft 14 herhalingen. Het hier beschreven ampliconschema produceert amplicons met flankerende regio's die een extra 145 bp toevoegen aan de uiteindelijke grootte.
- Gebruik tabel 1 om te schatten hoeveel herhalingseenheden zich in elk PCR-fragment bevinden. De grootte die wordt geëxtrapoleerd met behulp van de lineaire regressie moet binnen 8 bp van een bepaald allel liggen.
- Registreer het genotype van elk getest individu als een combinatie van allele repeat size numbers.
Representative Results
Met behulp van het beschreven protocol werd D1S80 VNTR-markeranalyse uitgevoerd op menselijk genomisch DNA dat werd geëxtraheerd uit buccale slijmvliesepitheelcellen die werden geoogst door swabbemonstering (figuur 6). Na de versterking met PCR wordt een typische weergave van een agarosegel met de D1S80-amplicons weergegeven in figuur 1. Baan 1 toont de 50 bp moleculaire gewichtsnorm. Naast de moleculaire gewichtsnorm worden PCR-producten uit acht studentenmonsters gevisualiseerd. Lane 10 toont de NTC waarin water werd gebruikt in plaats van sjabloon-DNA. De meeste geanalyseerde monsters tonen duidelijk twee banden, die individuen heterozygoot vertegenwoordigen voor de D1S80-locus. Lane 2 en Lane 9 tonen een enkele band die individuen homozygoot vertegenwoordigt voor de D1S80 locus. Lane 5 toont een dubbelzinnige singleband die veel breder is in vergelijking met de andere bands. Dit kan het gevolg zijn van twee D1S80 allelen die verschillen in slechts één herhalingseenheid. Voor verdere analyse zal het monster in baan 5 worden beschouwd als een enkele band, die een homozygoot individu vertegenwoordigt.
Downstream gel elektroforese fragment analyse uitgevoerd op geverifieerde PCR producten werd gebruikt voor grootte bellen van de D1S80 VNTR locus van verschillende studenten monsters. De interpretatie van de amplicongrootten verkregen door PCR-analyse is gebaseerd op de gebruikte moleculaire gewichtsnorm. De afstand tot de put voor elke band van de moleculaire gewichtsnorm werd gemeten (figuur 1) en geregistreerd (figuur 2). Op basis van de grootte en migratieafstand kan de grootte van de afzonderlijke banden worden berekend met behulp van een lineaire regressieanalyse. Het logboek (basis 10) werd bepaald voor elke band in de studentenmonsters (figuur 5) en het respectieve antilog vertegenwoordigt het aantal bp voor elke amplicon. Het aantal herhalingseenheden kan worden berekend op basis van de verkregen amplicongrootte (tabel 2).
Voor elk studentenmonster werden de amplicongrootten berekend door lineaire regressie en kon elke band gemakkelijk aan een bepaald allel worden toegewezen, zoals weergegeven in tabel 2. De informatie over de D1S80 allelgroottes kan vervolgens worden gebruikt om allelfrequenties te bepalen onder de kleine populatie subset van niet-gegradueerde studenten. Het 28-herhaalde allel komt het meest voor onder de studenten vanwege twee homozygote individuen voor dit herhaal allel (individuen 1 en 4). Het tweede meest voorkomende allel is het 18-herhalings allel, dat wordt gedragen door het homozygote individu 8 en door het heterozygote individu 6. Laagfrequente allelen zijn de 21-, 26- en 30-herhaling allelen die slechts één keer worden aangetroffen bij individuen 6, 5 en 3, respectievelijk. De allelfrequentiepatronen van de D1S80 VNTR-locus van de kleine studentenpopulatie kunnen verder worden vergeleken met de allelfrequentie van grotere menselijke populaties, bijvoorbeeld populaties afkomstig uit verschillende continenten4,7,8,9,10.
Onder de studenten delen individuen 2 en 3 het 24-herhalings allel, individuen 2 en 7 delen het 20-herhaling allel en individuen 5 en 7 delen het 23-herhaling allel. Interessant is dat de twee D1S80 homozygote individuen (individu 1 en 4) het 28-herhalings allel delen. Het matchen van allelen tussen twee individuen kan wijzen op een potentiële verwantschap. Gedeelde allelen kunnen echter ook bij toeval voorkomen. Het is dus cruciaal om de waarschijnlijkheid van een allelmatch tussen twee individuen te bepalen. De waarschijnlijkheid hangt af van de allelfrequentie van individuele allelen in de algemene populatie en statistische benaderingen moeten worden gebruikt om een statistisch gewicht toe te voegen aan VNTR-markeranalyse zoals de Bayesiaanse benadering. Samengevat kan de gepresenteerde vingerafdrukmethode worden gebruikt in praktische practica om het gebruik van VNDR's in DNA-vingerafdrukken en de toepassing ervan in de biologische wetenschap te leren.
Figuur 1: Weergave van een agarose gel na elektroforese van D1S80 amplificatieproducten met een liniaal geplaatst naast de 50 bp moleculaire gewicht standaard lane. Lane 1 bevat de 50 bp moleculaire gewichtsnorm, terwijl lanes 2-9 PCR-reactieproducten bevatten. Rijstrook 10 bevat het besturingselement geen sjabloon (NTC). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Bepaling van de migratieafstand van DNA-fragmenten en logboek van elke fragmentgrootte van de 50 bp moleculaire gewichtsnorm. De afstand tot de put (in cm) voor elke band van de 50 bp moleculaire gewichtsnorm wordt geregistreerd en het logboek (basis 10) voor elk fragment wordt bepaald. Waarden worden in een tabel ingevoerd met behulp van een spreadsheetprogramma. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Spreidingsplot gegenereerd door het plotten van DNA-fragmentmigratieafstand van de moleculaire gewichtsnorm op de x-as tegen het logboek (basis 10) van de grootte van elk fragment op de y-as. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Exploitatie van de lineaire regressielijn en regressievergelijking evenals de R2-waarde voor de gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Bepaling van de grootte van de D1S80 amplicons. De afstand tot de put voor elk fragment wordt ingevoerd in de regressievergelijking. Het antilog van de y-waarde geeft de fragmentgrootte in bp weer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Voorgestelde tijdlijn en workflow voor D1S80 VNTR-analyse. De volledige D1S80 VNTR-analyseprocedure die hier wordt gepresenteerd, van het oogsten van buccale epitheelcellen tot de evaluatie van de fragmentlengte, kan binnen één werkdag worden voltooid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Allelgrootte (in bp) | Aantal herhalingen |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
Tabel 1: Amplicongrootte voor elke D1S80 VNTR-locus.
| individueel | allel | Afstand (in cm) | Grootte (in bp) | Aantal herhalingseenheden |
| 1 | homozygoot | 5 | 600 | 28 |
| 2 | heterozygoot | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | heterozygoot | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | homozygoot | 5 | 600 | 28 |
| 5 | heterozygoot | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | heterozygoot | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | heterozygoot | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | homozygoot | 5.6 | 435 | 18 |
Tabel 2: Allelsamenstelling van de verschillende geteste personen. Het aantal herhalingseenheden kan worden benaderd op basis van de amplicongrootte verkregen door lineaire regressieanalyse.
Discussion
Hier beschreven we een eenvoudige en kostenefficiënte methode voor het implementeren van moleculaire vingerafdrukken in niet-gegradueerde praktijklessen.
Om te screenen op genetische variatie op de D1S80-locus, is het verzamelen van menselijke biologische monsters, samen met DNA-extractie en -analyse, vereist. Het is van essentieel belang dat het ethische gebruik van menselijke biologische specimens gedurende het hele proces wordt gewaarborgd. Het beheer van de monsters wordt gecontroleerd binnen een alomvattend regelgevingskader dat het juiste gebruik van monsters en bijbehorende gegevensgarandeert 18 (bv. toestemming voor het gebruik van menselijk biologisch materiaal). Deelnemers moeten naar behoren worden geïnformeerd over het gebruik van hun monsters, het risico van ontdekking van anomalieën in genetische relaties (bijvoorbeeld voor verwante personen), privacybescherming en intenties voor toekomstige opslag van de biologische specimens en gegevens. Alle donateurs (studenten of collega's) moeten vrijelijk toestemming geven en het recht om zich zonder opgaaf van reden terug te trekken begrijpen. Over het algemeen is het onmisbaar om vertrouwd te raken met de respectieve richtlijnen en voorschriften voor het beheer van menselijke monsters voordat u deze laboratoriumles uitvoert.
Voor het verzamelen van buccale slijmvliesepitheelcellen in niet-gegradueerde laboratoriumcursussen moet ervoor worden gezorgd dat verontreiniging van de DNA-monsters met DNA van de operator of met DNases wordt voorkomen. Het wordt aanbevolen om altijd laboratoriumjassen, handschoenen en beschermende glazen te gebruiken, evenals steriele wattenstaafjes en microcentrifugebuizen. Buccale swab-gebaseerde celoogst wordt beschouwd als een handige en kosteneffectieve methode voor het verzamelen van genetisch materiaal dat geschikt is voor PCR-gebaseerde VNTR-analyse, omdat het relatief goedkoop en niet-invasief is. Naast buccale swabs is speeksel de meest voorkomende orale bemonsteringsmethode voor medisch onderzoek. Het is aangetoond dat buccale swabs een hoger percentage epitheelcellen bevatten dan speeksel , waardoor ze betrouwbaarder zijn in het leveren van voldoende hoeveelheid en kwaliteit DNA voor PCR-gebaseerde D1S80 VNTR-analyse19,20. Bovendien kunnen buccale swabs worden verzonden na zelfverzameling die geografische belemmeringen overwint wanneer ze bijvoorbeeld worden gebruikt in populatiediversiteitsstudies21.
DNA-extractie is relatief eenvoudig geworden door de ontwikkeling van extractiekits van verschillende bedrijven. Het gebruik van deze kits is echter mogelijk niet geschikt in laboratoriumklassen vanwege de beperkte financiële middelen. Hier presenteerden we een eenvoudige, snelle en kostenefficiënte methode voor DNA-extractie uit menselijke monsters zonder de noodzaak van een commercieel verkrijgde DNA-extractiekit. De beschreven DNA-extractiemethode maakt geen gebruik van organische oplosmiddelen, maar cellulaire eiwitten worden verwijderd door de zoutconcentratie te verhogen met behulp van een 8 M kaliumacetaatoplossing. Deze methode maakt het ook mogelijk om meerdere monsters tegelijk te behandelen en levert voldoende DNA op voor verschillende genotype-analyses voor elk monster.
PCR is een veel voorkomende techniek in veel moleculaire laboratoria. Hoewel over het algemeen probleemloos, zijn er valkuilen die de reactie kunnen bemoeilijken die valse resultaten oplevert, die elders zijn besproken22. PCR-omstandigheden die hier worden gepresenteerd, zijn zeer robuust gebleken in het licht van slechte dna-kwaliteit van sjablonen, maar het gebrek aan PCR-versterking werd niettemin af en toe waargenomen bij het gebruik van sjablonen met extreem lage DNA-concentraties als gevolg van slechte buccale epitheelceloogst. De DNA-primers die in dit onderzoek worden gebruikt, kunnen bij verschillende bedrijven worden besteld, zoals die welke aan het einde van dit artikel in de tabel met materialen worden genoemd. Speciale zorg moet worden genomen bij het werken met DNA-primers om besmetting met DNases of DNA van de operator te voorkomen. PCR-producten moeten ook koud worden gehouden wanneer ze niet in gebruik zijn.
Een andere kritische stap is de agarose gel elektroforese. Fragmenten die verschillen door slechts één herhalingseenheid van 16 bp mogen niet worden gescheiden in de gelelektroforese en verschijnen dus als een enkele band. In dit geval kan een juiste bepaling van het aantal herhalingseenheden van de geteste D1S80-allelen niet worden gegarandeerd. Daarom moet de looptijd van de gel worden verhoogd terwijl de spanning moet worden verminderd en de gelconcentratie kan worden verhoogd om een betere resolutie en scheiding van de enkele banden te bieden.
Het is vermeldenswaard dat niet alle allelen voor een VNTR-locus complete herhalingseenheden bevatten. Niet-consensus allelen (microvarianten) die onvolledige herhalingseenheden bevatten, komen hooguit voor vntr-loci en hun grootte valt tussen de maten van allelen met volledige herhalingseenheden. Deze microvarianten zijn nauwelijks waarneembaar door agarose gel elektroforese. Technieken zoals polyacrylamidegels of capillaire elektroforese kunnen daarentegen allelen oplossen die verschillen door één tot enkele herhalingseenheden of microvarianten12,23,24,25,26. Deze laatste technieken zijn echter minder geschikt voor niet-gegradueerde laboratoriumklassen, omdat ze veel nadelen hebben, waaronder het gebruik van gevaarlijke stoffen, complexe voorbereiding en gebrek aan apparatuur. Bij de bepaling van de fragmentgrootte moet speciale zorg worden beingenomen bij het meten van de afstand van de gemigreerde DNA-fragmenten. Als de banden te diffuus zijn om nauwkeurig te worden gemeten, kan de berekening van de grootte van het D1S80 allelfragment door lineaire regressie onjuist zijn, wat resulteert in een verkeerde schatting van de herhalingseenheidsgetallen. In dat geval is een herhaling van de agarosegelelektroforese na het optimaliseren van de gelcondities aan te raden zoals eerder beschreven door Lorenz en collega's22.
De volledige D1S80 VNTR-analyseprocedure die hier wordt gepresenteerd, van het oogsten van buccale epitheelcellen tot de evaluatie van de fragmentlengte, kan in één werkdag worden voltooid. Dit protocol is een robuuste, kostenefficiënte en gebruiksvriendelijke methode die geschikt is voor niet-gegradueerde praktijklaboratoriumklassen.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Kevin Graham bedanken voor zijn voice-over en alle deelnemers die samples hebben gedoneerd voor dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
References
- Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).
- Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).
- Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. T. Mutation at the human D1S80 minisatellite locus. The Scientific World Journal. 2012 (917235), (2012).
- Herrera, R. J., Adrien, L. R., Ruiz, L. M., Sanabria, N. Y., Duncan, G. D1S80 single-locus discrimination among African populations. Human Biology. 76 (1), 87-108 (2004).
- Lauritzen, S. L., Mazumder, A. Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).
- Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137 (1991).
- Budowle, B., et al. D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals. Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).
- Verbenko, D. A., et al. Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships. Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).
- Walsh, S. J., Eckhoff, C. Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus. Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).
- Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. A. Specificity of genetic diversity in D1S80 revealed by SNP-VNTR haplotyping. Annals of Human Biology. 38 (5), 564-569 (2011).
- Sajib, A. A., Yeasmin, S., Akter, M., Uddin, M. A., Akhteruzzaman, S. Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus. Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).
- Köseler, A., Atalay, A., Atalay, E. Ö Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey. Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).
- Mastana, S. S., Papiha, S. S. D1S80 distribution in world populations with new data from the UK and the Indian sub-continent. Annals of Human Biology. 28 (3), 308-318 (2001).
- Okuda, H., et al. A Japanese propositus with D-- phenotype characterized by the deletion of both the RHCE gene and D1S80 locus situated in chromosome 1p and the existence of a new CE-D-CE hybrid gene. Journal of Human Genetics. 45 (3), 142-153 (2000).
- Campbell, A. M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. Use PCR & a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.". The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).
- Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 83 (5), 774 (2006).
- Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. K. Use the Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in DNA fingerprinting and its application biological sciences. EurAsian Journal of BioSciences. 14 (2), 2835-2839 (2020).
- Beier, K., Schnorrer, S., Hoppe, N., Lenk, C. The ethical and legal regulation of human tissue and biobank research in Europe. Proceedings of the Tiss. EU Project. , Universitätsverlag Göttingen. (2011).
- Aida, J., et al. Telomere length variations in 6 mucosal cell types of gastric tissue observed using a novel quantitative fluorescence in situ hybridization method. Human Pathology. 38 (8), 1192-1200 (2007).
- Theda, C., et al. Quantitation of the cellular content of saliva and buccal swab samples. Scientific Reports. 8 (1), 1-8 (2018).
- McMichael, G. L., et al. DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis. Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232 (2009).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism. Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).
- Chen, B., et al. Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene. Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).
- Renges, H. -H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin. Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).
- Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine. Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).
