Summary
여기서 우리는 상피 세포 DNA에서 VNTR 궤적 D1S80을 증폭하여 DNA 지문 프로파일을 생성하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
생물 과학에서 DNA 지문은 친자 확인 검사, 법의학 응용 프로그램 및 물리 유전학 연구에 널리 사용되었습니다. 여기서는 학부 실험실 클래스의 맥락에서 Tandem Repeat(VNTR) 분석의 가변 수로 개인을 지색하는 신뢰할 수 있고 강력한 방법을 설명합니다. 인간 D1S80 VNTR 궤적들은 반복적인 서열 수의 변동에 기초하여 고도로 다형성 마커로서 이 프로토콜에서 사용된다.
이 간단한 프로토콜은 교사를위한 유용한 정보와 실제 실험실 수업에서 DNA 지문 의 구현을 전달합니다. 제시된 실험실 운동에서, PCR 증폭에 선행된 DNA 추출은 D1S80 VNTR 궤적에서 유전적 변이를 결정하는 데 사용된다. PCR 제품의 단편 크기의 차이는 아가로즈 젤 전기포에 의해 시각화된다. 단편 크기 및 반복 번호는 DNA 크기 표준의 크기 및 이동 거리의 선형 회귀를 기반으로 계산됩니다.
이 가이드에 따라 학생들은 다음을 수행할 수 있어야 합니다.
• 부칼 점막 상피 세포에서 DNA를 수확하고 추출
• PCR 실험을 수행하고 다양한 반응 구성 요소의 기능을 이해
• 아가로즈 젤 전기전도에 의해 앰플리통을 분석하고 결과를 해석
• DNA 지문에 VNTRs의 사용과 생물 과학의 응용 프로그램 이해
Introduction
DNA 지문이라고도 하는 분자 지문은 1984년 레스터 대학의 유전학학과에서 일하는 동안 알렉 제프리스 경이소개했다. 그것은 개인 사이 다르고 대략 3백만 개의 이체로 구성되는 인간 게놈의 0.1%를 기초합니다. 유전자형에 있는 이 독특한 다름은 개별 사이 분화를 허용하고 그러므로 단자고성 쌍둥이를 제외하고 유전 지문으로 작동할 수 있습니다. 따라서, DNA 지문은 친자 확인 시험 또는 인구 다양성 연구 결과에서 예를 들면 적용되는 다른 개별의 관련성의 추정을 위해 이용됩니다. 우리의 실험실 수업에서 우리는 DNA 지문 및 allele 주파수의 개념을 전달하는 것을 목표로했습니다. 여기서 설명된 방법은 D1S80 궤적에서 탠덤 반복(VNTR)의 가변 수를 분석하여 유전 지문에 대한 신뢰할 수 있고 견고한 방법을 보여줍니다. 상기 방법은 D1S80 궤적을 증폭시키는 부칼 점막 상피 세포및 후속 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로부터의 DNA 추출을 포함하고, 아가로즈 겔상에 대한 단편 길이 차이의 시각화를 포함한다.
D1S80 VNTR 미니위성 궤적은 매우 가변적이며 염색체 1(1p36-p35)의 텔로머 영역에 위치하고 있다. 1990년 Karsai와 동료들이 16bp의 코어 반복 유닛을 가진 궤적으로 확인및 기술되어, 단 하나의 유닛2로다른 알렐의 분리를 허용했다. 더욱이, D1S80은 약 7.77 x10-53의돌연변이율을 가진 높은 수준의 변이를나타낸다. D1S80은 백인에 대한 이종4,5의 높은 수준을 가지고4 (예를들어, 80.8% 백인에 대한 이종고시 6 최대 87% 아프리카 계 미국인7). 또한, D1S80 궤적은 대부분의 집단에서 다형성이며, 일반적으로 14~41개의 다른 진상체가 각각 14~41회 반복된다. D1S80 진알의 빈도는 인구마다 다릅니다. 24 반복 단위 (allele 24)를 가진 allele는 유럽과 아시아 인구에서 가장 빈번한 반면,allele 21은 아프리카 인구4,7,8,9,10에서일반적입니다. 따라서, 알렐 주파수 분포는 다른 인간 집단을 위한 진단이고 관련성의 추정을 고려할 필요가 있습니다 (예를 들면, 친자 확인 시험에서).
D1S80 VNTR 궤적의 PCR 기반 증폭은 법의학, 친자 확인 검사, 질병 분석 및 인구 다양성 연구11,12,13,14에서매우 유용한 방법이다. 오늘날 법의학에서 VNTRs의 사용은 짧은 탠덤 반복으로 대체되었지만, D1S80 VNTR 궤적은 인구4,8,9,11사이의 기원과 유전 적 관계의 결정에 널리 사용됩니다. 또한, 그것은 종종 실제 실험실 클래스에서 DNA 지문을 가르치는 데사용됩니다 15,16. 여기에 설명된 방법은 학부 실험실 클래스에서 매우 높은 성공률을 가진 강력하고 비용 효율적이며 사용하기 쉬운 방법을 나타냅니다. 본 문서의 목적은 부칼 점막 상피 세포로부터 인간 D1S80 미니위성 궤적의 분자 분석을 위한 워크플로우에 대한 개요를 제공하는 것이다. 여기에는 이전에 게시된 저작물2,17에기술, 단순화된 프로토콜 및 실용적인 제안이 포함되어 있습니다.
Protocol
참고: 이 프로토콜은 학생 또는 각 법적 보호자가 유전 적 프로필이 유전 적 관계에 대한 통찰력을 제공하기 때문에이 프로토콜의 전도성에 동의하는 경우에만 사용됩니다. DNA 지문은 주로 인구 연구 및 법의학 문제에 적용되는 일반적인 분자 생물학 방법입니다. 따라서 오염 위험을 가능한 한 낮게 유지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 외부 소스 또는 DNases에서 DNA와 샘플의 오염을 방지 하려면, 장갑을 착용 해야, 악기철 세척 또는 살균 해야 하 고 솔루션 필터 살균 또는 사용 전에 자동화 해야.
1. 부칼 점막 상피 세포의 수확
주의: 타액 및 상피 세포와 함께 작동하면 전염병의 전염으로 이어질 수 있습니다. 따라서 표준 및 전송 기반 예방 조치(예: 적절한 개인 보호 장비 사용)를 적용해야 합니다.
참고: 강사가 제공하는 양수 제어(예: 강사가 추출한 DNA)를 포함하고 다운스트림 처리 단계에 포함됩니다.
- 표본 수집 전에 치아를 먹거나 닦은 후 적어도 1 시간 동안 기다립니다.
- 빈 및 멸균 2.0 mL 마이크로 센심 분리기 튜브에 라벨.
- 포장에서 멸균 부칼 면봉 1개를 제거하고 뺨 안쪽에 30-40회 또는 30-40초 동안 힘차게 문지르며 부칼 점막 상피 세포를 수확합니다.
- 컬렉션의 끝을 이전에 표지된 멸균 미세 원심분리기 튜브에 넣고 손으로 또는 멸균 가위를 사용하여 가장자리를 넘어 확장되는 플라스틱의 길이를 분리합니다.
- 캡을 튜브에 단단히 고정하여 컬렉션 면봉을 내부에 밀봉합니다.
2. 인간 세포에서 게놈 DNA추출
- 추출하기 전에 시료 용해용열 믹서 또는 가열 블록을 65°C로 설정합니다.
주의: 사용되는 일부 화학 물질은 유해로 분류됩니다. 안전 데이터 시트를 주의 깊게 읽고 취급 하기 전에 적절한 안전 조치를 취하십시오.- 필요한 모든 완충제 및 용액(용액 8M 아세테이트, 2-프로판올, 70% 에탄올 및 용출 버퍼)을 필터링하거나 자동화하여 준비 및 소독합니다.
참고: 모든 원심분리 단계는 명시되지 않는 한 실온(20-30°C)에서 수행해야 합니다.
- 필요한 모든 완충제 및 용액(용액 8M 아세테이트, 2-프로판올, 70% 에탄올 및 용출 버퍼)을 필터링하거나 자동화하여 준비 및 소독합니다.
- 용액 500 μL(50mM Tris/HCl, pH 8.0; 10mM 에틸렌디아민 테트라 아세트산(EDTA); 2% 나트륨 도데실 황산염(SDS))을 부칼 스왑에 추가하여 시료가 용액에 완전히 침지되도록 합니다.
- 소용돌이는 적어도 5 초 동안 적극적으로.
- 10 분 동안 열 믹서에서 65 °C에서 샘플을 배양합니다.
- 배양 중에 펄스 소용돌이로 샘플을 3-4회 혼합합니다.
- 리시스 버퍼에서 면봉을 제거하고 튜브 내부를 대고 면봉을 눌러 최대 샘플 볼륨을 얻습니다.
- 8M 칼륨 아세테이트100μL을 용액 세포에 추가합니다.
- 흰색 침전이 있을 때까지 튜브를 반전시켜 철저히 섞습니다.
- 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
- 원심 분리기 는 18,000 x g에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리합니다.
- 퍼블럼의 450 μL을 깨끗하고 멸균된 1.5mL 마이크로센트심리분리기 튜브로 옮기다.
- 2-프로판올 450 μL을 추가하고 튜브 (DNA의 강수량)를 반전시켜 철저히 섞습니다.
- 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
- 원심분리기 는 18,000 x g에서5 분 동안.
- 상체를 버리고 깨끗한 종이 타월에 튜브를 반전하여 펠릿을 건조시키고 교차 오염을 피하십시오.
- 펠릿을 완전히 건조시키기 위해 가열 블록에서 65 °C에서 5 분 동안 DNA를 배양합니다.
- DNA를 세척하려면 70% 에탄올의 500 μL을 추가합니다.
- 원심분리기 18,000 x g에서1분 동안.
- 상체를 버리고 깨끗한 종이 타월에 튜브를 반전하여 펠릿을 건조시합니다.
- 30 μL의 재서스펜션 버퍼(10m Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA)를 펠릿에 추가합니다.
- DNases를 비활성화하기 위해 가열 블록에서 65 °C에서 10 분 동안 DNA를 배양합니다.
3. PCR을 사용하여 D1S80 VNTR 궤적 증폭
참고: 필요한 플라스틱 및 기타 재료를 수집하기 전에 필요한 시약 및 볼륨으로 작업표를 사용하고 작업표를 준비합니다. 멸균 튜브/스트립/플레이트에 샘플 번호로 PCR에 사용할 라벨을 지정합니다. PCR을 검증하기 위해 DNA 대신H2O를 사용하는 음성 제어와 양성 제어(예: 강사가 제공한 DNA 사용)를 포함하는 것을 기억하십시오.
- 5x PCR 반응 버퍼(15m MgCl2포함), 데옥시리보뉴클레오티드 트리포산염 1μL(dNTP) (10mMMM), 5 μL(10pmol)을 포함하는 1x PCR 마스터 믹스를 각 프라이머 pMC의 준비 카사이 외에 따르면 T118-f 및 pMCT118-r (포워드 - 5'-GAAACTGGCCTCCAACCCAACGCGCCG-3', 역 - 5'-GTCTTGTTGGGTGTCCTGCCTGC-3') 초순수H2O의2,23.8 μL, 및 Taq DNA 폴리머라제의 0.2 μL (5 U/μL).
참고: 프라이머 pMCT118-f/pMCT118-r은 전체 궤적을 증폭시키는 D1S80 VNTR 영역의 측면 영역에 설계되었습니다. - PCR 튜브/스트립/플레이트에 사용할 샘플 번호로 레이블을 지정합니다.
- 각 표지된 PCR 샘플 튜브 또는 잘 마스터 믹스의 Aliquot 45 μL.
- 각 PCR 튜브/플레이트의 마스터 믹스에 DNA 템플릿의 5μL을 추가하여 총 50μL의 피펫 팁을 변경하여 교차 오염을 방지합니다.
- DNA 대신 초퓨어 H2O를 사용하여 템플릿 제어(NTC)를 포함하지 않습니다.
- PCR 튜브 / 스트립을 닫거나 씰 플레이트를 닫고 혼합하십시오.
- 테이블 탑 원심분리기를 사용하여 20초 동안 PCR 튜브/스트립/플레이트원심분리기를 제공합니다.
참고: 본 프로토콜에 주어진 PCR 조건은 사용된 DNA 폴리머라제 및 PCR 열 사이클러를 사용하여 최적화되었다. 일반적으로, PCR 조건은 DNA 중합체에 적응되어야 합니다. Taq DNA 폴리머라제의 표준 연장 시간은 1분/kb입니다. - 샘플 튜브/스트립/플레이트를 열사이클러에 놓고 다음 조건(DNA 폴리머라제 연장 시간)을 사용하여 반응을 배양하십시오: 2분 동안 95°C의 1사이클; 15s용 94°C의 25사이클, 15s용 60°C, 30s용 72°C; 10 분 동안 72 °C의 1 주기.
- 프로그램이 완료되면, 열순환기에서 제품을 제거하고 전기 전구가 될 때까지 하룻밤 동안 4 °C 또는 -20 °C에 저장합니다.
4. PCR 제품의 아가로즈 젤 전기 전광
- 1.5% 아가로즈 젤을 준비합니다.
- 아가로즈 파우더 1.5g을 사용하고 1x 트리아세테이트-EDTA(TAE) 버퍼 용액100mL과 플라스크에 섞는다.
- 전자 레인지 (600 W)에서 혼합물을 약 1.5-2 분 동안 가열합니다. 필요한 경우 내용물과 열을 다시 소용돌이어 아가로즈를 완전히 녹입니다. 약간 식히고 아가로즈에 PeqGreen 2 μL을 추가합니다.
- 모든 샘플에 충분한 우물이 있는 빗을 사용하여 형태로 젤을 붓고 적어도 하나의 분자량 마커를 추가합니다.
주의: 끓는 지체가 발생할 수 있습니다. 아직 용해되지 않은 아가로즈를 다시 일시 중단 할 때 플라스크를 조심스럽게 흔들어.
참고: PeqGreen은 핵산검출을 위한 비독성 염료입니다. 이중 좌초 DNA (dsDNA) 및 단일 좌초 DNA (ssDNA) 뿐만 아니라 RNA의 염색에 적용 할 수 있습니다. 감도는 에티듐 브로마이드와 비슷합니다.
- PCR 제품을 4°C에서 제거하고 원심분리기는 약 10초 동안 제거합니다.
- 젤의 우물을 10 μL 샘플로 적재합니다. 젤을 과부하시키지 마십시오.
참고: DNA 폴리머라제 버퍼에는 시료 밀도를 증가시키는 화합물이 포함되어 있어 시료를 적재하지 않고도 젤에 직접 적재할 수 있습니다. 이를 통해 샘플이 우물로 가라앉을 수 있으며 염료는 DNA 샘플이 얼마나 멀리 마이그레이션되었는지 추적하는 데 도움이 됩니다.- 측면 우물에 분자량 표준을 추가하십시오(바람직하게는 50bp 분자량 표준).
참고: 아가로즈 젤 전기포리가 반복되어야 하는 경우 -20°C에 잔류 PCR 샘플을 저장합니다.
- 측면 우물에 분자량 표준을 추가하십시오(바람직하게는 50bp 분자량 표준).
- 약 40분 동안 또는 약 50bp로 이동하는 하부 노란색 염료 전면이 젤의 하부 끝에 도달할 때까지 1x TAE 러닝 버퍼로 젤을 실행한다.
- 청색광 또는 자외선(UV) 빛이 가해지는 동안 젤을 이미지화하고 조각 길이 분석을 위한 이미지를 기록한다.
주의: 자외선은 눈과 피부를 손상시킬 수 있습니다. 자외선 차단제 사용 시 보호복과 자외선 안전 안경을 착용하십시오. - 기관 유해 물질 정책에 따라 젤을 폐기하십시오.
5. 조각 길이 결과 분석
참고: 선형 회귀 분석을 사용하여 조각의 길이를 추정합니다.
- D1S80 PCR 조각을 크기 조정하기 위해, 50 bp 분자중량 표준 레인 위에 겔 사진에 눈자를 배치하여 눈금자의 상단이 샘플이 로드된 우물의 바닥과 일렬로 세워집니다(도1).
참고: 분자량 표준(50bp 분자량 표준)에 대한 선형 회귀 방정식을 계산하기 위해 스프레드시트 프로그램이 사용되었다. - 스프레드시트프로그램(그림 2)을이용하여 표에서 50bp 분자량 표준의 각 대역에 대한 우물(예를 들어, cm)으로부터의 거리를 기록한다.
- 50bp 분자량 표준의 각 단편 크기의 로그(예를 들어, 베이스 10)를 결정하고 로그 값을테이블(도 2)에입력한다.
- 각 데이터 점을 세로축(y축)에 대역 크기의 로그를 가진 그래프로 플롯하고, 스캐터플롯(그림3)을사용하여 분자량 표준의 각 대역까지 겔의 상단에서 측정된 실행 거리를 플롯한다.
- 추세선(선형 회귀 선)에 맞추고 회귀 방정식(y = 도끼 + b) 및그래프(그림 4)에R2 값을 표시합니다.
- 각 D1S80 앰플리시온(그림5)에대해 마이그레이션된 거리(예를 들어 cm)를 측정합니다.
- 회귀 방정식을 사용하여 각 D1S80 앰플리턴의 크기를 추정합니다: y = 도끼 + b
여기서 y = 조각 크기의 로그
a = 선의 기울기(점 5로 계산)
x = 우물에서 거리 (cm)
b = 회귀 선이 y축을 가로채는 점(점 5에서 계산)
참고: y-값은 조각 크기의 로그를 나타내므로 D1S80 앰플리턴의 bp에서 조각 크기를 얻으려면 안티로그(10y)를계산해야 합니다.
6. 테스트 된 개인의 알레일에서 반복 단위의 수를 추정
참고: D1S80 반복 장치는 길이가 16bp입니다. D1S80의 가장 작은 알려진 적칭 에 는 14개의 반복이 있습니다. 여기에 설명된 앰플리통 방식은 최종 크기에 145 bp를 추가한 측면 영역을 가진 앰플리통을 생성합니다.
- 표 1을 사용하여 각 PCR 조각에 포함된 반복 단위 수를 추정합니다. 선형 회귀를 사용하여 추정된 크기는 특정 각선의 8bp 이내여야 합니다.
- 각 테스트 된 개별의 유전자형을 유전자 반복 크기 번호의 조합으로 기록합니다.
Representative Results
설명된 프로토콜을 사용하여, D1S80 VNTR 마커 분석은 면봉 샘플링에 의해 수확된 부칼 점막 상피 세포로부터 추출된 인간 게놈 DNA에 대해 수행되었다(도6). PCR을 이용한 증폭에 따라, D1S80 앰플리턴을 함유한 아가로즈 겔의 전형적인 표현이 도 1에도시된다. 레인 1은 50 bp 분자량 표준을 나타낸다. 분자량 표준 옆에는 8개의 학생 샘플의 PCR 제품이 시각화됩니다. 레인 10은 템플릿 DNA 대신 물이 사용된 NTC를 보여줍니다. 분석된 샘플의 대부분은 D1S80 궤적에 대한 개인 이종수구스를 나타내는 두 개의 밴드를 명확하게 표시합니다. 레인 2와 레인 9는 D1S80 궤적을 위해 개인 호마구우스를 나타내는 단일 밴드를 보여줍니다. 레인 5는 다른 밴드에 비해 훨씬 더 넓은 모호한 단일 밴드를 보여주고있다. 이는 하나의 반복 단위에서만 다른 두 개의 D1S80 alleles의 결과일 수 있습니다. 추가 분석을 위해, 레인 5의 샘플은 단일 대역으로 간주되며, 이는 동종구스 개인을 나타냅니다.
검증된 PCR 제품에 수행된 다운스트림 겔 전기전도 단편 분석은 다른 학생 샘플의 D1S80 VNTR 궤적의 크기 호출에 사용되었다. PCR 분석에 의해 얻어진 앰플리통 크기의 해석은 사용된 분자량 표준에 의존합니다. 분자량 표준의 각 대역에 대한 웰으로부터의 거리를 측정하였다(도1)및기록(도 2). 크기 및 마이그레이션 거리에 따라 개별 대역의 크기는 선형 회귀 해석을 사용하여 계산할 수 있습니다. 로그(base 10)는 학생샘플(도 5)의각 대역에 대해 결정되었고, 각각의 항로그는 각 앰플리코온에 대한 bp 수를 나타낸다. 반복 단위의 수는 얻은 앰플리시온 크기에 따라 계산될 수있다(표 2).
각 학생 샘플에 대해 앰플리시온 크기는 선형 회귀에 의해 계산되었고 각 대역은 표 2에도시된 바와 같이 특정 송계에 쉽게 할당될 수 있었다. 그런 다음 D1S80 본인 크기에 대한 정보를 사용하여 학부 생의 소규모 인구 하위 집합 중 의 알레일 주파수를 결정할 수 있습니다. 28 반복 적대는이 반복 적대자 (개인 1 및 4)에 대한 두 개의 동종 자구스 개인으로 인해 학생들 사이에서 가장 빈번합니다. 두 번째로 가장 빈번한 본인은 18반복 적인 18반복 적성으로, 이종구스 개인(8)과 이종구스 개인 6이 운반한다. 저주파 알레는 각각 개인 6, 5 및 3에서 한 번만 발견되는 21, 26 및 30 반복 적 악어입니다. 작은 학생 집단의 D1S80 VNTR 궤적의 골자 주파수 패턴은 더 큰 인간 인구의 골자 주파수에 비해 더 비교할 수있으며, 예를 들어 다른 대륙4,7,8,9,10에서유래하는 인구.
학생 들 중, 개인 2 및 3 공유 24 반복 allele, 개인 2 그리고 7 공유 20 반복 된 적 과 개인 5 과 7 공유 23 반복 적. 흥미롭게도, 두 D1S80 homozygous 개인 (개인 1 과 4) 공유 28 반복 적. 두 개인 사이의 일치 하는 진상계 잠재적인 관련을 나타낼 수 있습니다. 그러나 공유 된 alleles는 우연히 발생할 수 있습니다. 따라서 두 개인 간의 골라기 일치 가능성을 결정하는 것이 중요합니다. 가능성은 일반 인구와 통계 적 접근에 개별 적인 진열의 진열 주파수에 따라 달라 지며 Bayesian 접근과 같은 VNTR 마커 분석에 통계적 무게를 부착하기 위해 사용되어야합니다. 요약하자면, 제시된 지문 은 DNA 지문에 있는 VNTRs의 사용 및 생물학 과학에 있는 그것의 응용을 가르치기 위하여 실습 클래스 실용에 이용될 수 있습니다.
그림 1: 50 bp 분자량 표준 차선 옆에 놓인 통치자와 D1S80 증폭 제품의 전기전성 후 아가로즈 젤의 표현. 레인 1에는 50bp 분자량 표준이 포함되어 있으며, 레인 2-9에는 PCR 반응 제품이 포함되어 있습니다. 레인 10에는 템플릿 제어(NTC)가 포함되어 있지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: DNA 단편 이동 거리 및 50 bp 분자량 표준의 각 단편 크기의 로그 의 결정. 50bp 분자량 표준의 각 대역에 대한 웰(cm)으로부터의 거리가 기록되고 각 단편에 대한 로그(base 10)가 결정된다. 값은 스프레드시트 프로그램을 사용하여 테이블에 입력됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: y축상각 단편의 크기로 x축에 분자량 표준의 DNA 단편 이동 거리를 플로팅하여 생성된 분산 플롯(base 10). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 선형 회귀 선 및 회귀 방정식과 데이터에 대한 R2 값의 악용.
그림 5: D1S80 앰플리턴의 크기 결정. 각 조각의 우물에서 의 거리는 회귀 방정식에 입력됩니다. y-값의 안티로그는 bp의 조각 크기를 나타냅니다.
그림 6: D1S80 VNTR 분석을 위한 권장 타임라인 및 워크플로우입니다. 여기에 제시된 전체 D1S80 VNTR 분석 절차는, 부칼 상피 세포 수확에서 단편 길이 평가에 이르기까지, 단일 작업일 내에 완료될 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 알레일 사이즈(bp) | 반복 횟수 |
| 369 | 14 |
| 385 | 15 |
| 401 | 16 |
| 417 | 17 |
| 433 | 18 |
| 449 | 19 |
| 465 | 20 |
| 481 | 21 |
| 497 | 22 |
| 513 | 23 |
| 529 | 24 |
| 545 | 25 |
| 561 | 26 |
| 577 | 27 |
| 593 | 28 |
| 609 | 29 |
| 625 | 30 |
| 641 | 31 |
| 657 | 32 |
| 673 | 33 |
| 689 | 34 |
| 705 | 35 |
| 721 | 36 |
| 737 | 37 |
| 753 | 38 |
| 769 | 39 |
| 785 | 40 |
| 801 | 41 |
표 1: 각 D1S80 VNTR 궤적에 대한 앰플리턴 크기.
| 개인 | 대립 유전자 | 거리(cm) | 크기(bp) | 반복 단위 수 |
| 1 | 호모지구스 | 5 | 600 | 28 |
| 2 | 이테로지구스 | 5.2 ; 5.5 | 535, 458 | 24, 20 |
| 3 | 이테로지구스 | 4.9 ; 5.2 | 626, 535 | 30, 24 |
| 4 | 호모지구스 | 5 | 600 | 28 |
| 5 | 이테로지구스 | 5.1 ; 5.3 | 564, 508 | 26, 23 |
| 6 | 이테로지구스 | 5.4 ; 5.6 | 483, 435 | 21, 18 |
| 7 | 이테로지구스 | 5.3 ; 5.5 | 508, 458 | 23, 20 |
| 8 | 호모지구스 | 5.6 | 435 | 18 |
표 2: 테스트된 다른 개인의 알레오 조성. 반복 단위의 수는 선형 회귀 분석에 의해 얻어진 앰플리시온 크기에 따라 근사할 수 있다.
Discussion
여기에서 우리는 학부 실습 수업에서 분자 지문을 구현하기위한 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명했습니다.
D1S80 궤적에서 유전적 변이를 검사하기 위해서는 DNA 추출 및 분석과 함께 인간의 생물학적 샘플 수집이 필요합니다. 인간 생물학적 표본의 윤리적 사용은 전체 과정을 통해 보장되는 것이 필수적입니다. 샘플 관리는 샘플 및 관련데이터(18)의 올바른 사용을 보장하는 포괄적인 규제 프레임워크 내에서 제어됩니다(예: 인간 생물학적 물질의 사용에 대한 동의). 참가자는 그들의 견본의 사용, 유전 관계에 있는 이상 발견의 리스크 (예를 들면, 관련 개별을 위한), 개인 정보 보호 및 생물학 견본 및 데이터의 미래 저장을 위한 의도에 관하여 제대로 통보되어야 합니다. 모든 기부자(학생 또는 동료)는 자유롭게 동의를 제공하고 이유를 제시하지 않고 철회할 권리를 이해해야 합니다. 일반적으로 이 실험실 클래스를 수행하기 전에 인간 샘플 관리를 위한 각 지침 및 규정에 익숙해지는 것이 필수적입니다.
학부 실험실 과정에서 부칼 점막 상피 세포의 수집을 위해, 운영자 또는 DNases와 DNA와 DNA 샘플의 오염을 피하기 위해주의해야 한다. 실험실 코트, 장갑 및 보호 안경은 멸균 면봉및 미세 원심 분리 튜브뿐만 아니라 항상 사용하는 것이 좋습니다. Buccal 면봉 계 세포 수확은 상대적으로 저렴하고 비침습적이기 때문에 PCR 기반 VNTR 분석에 적합한 유전 물질의 수집을 위한 편리하고 비용 효율적인 방법으로 간주됩니다. buccal 면봉 옆에, 타액은 의학 연구를 위한 일반적인 경구 샘플링 방법입니다. 부칼 면봉은 타액보다 상피 세포의 높은 비율을 함유하고 있어 PCR 기반 D1S80 VNTR 분석19,20에대한 충분한 수량과 DNA 품질을 제공하는 데 더 안정적으로 만드는 것으로 나타났다. 또한, 부칼 면봉은 인구 다양성 연구21에서사용될 때 지리적 장애를 극복한 자가 수집 후 우편으로 발송될 수 있다.
DNA 추출은 다른 회사에서 추출 키트의 발달로 인해 상대적으로 쉬워졌습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 키트의 사용은 제한된 재정 자원으로 인해 실험실 수업에 적합하지 않을 수 있습니다. 여기에서, 우리는 상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트의 필요 없이 인간 견본에서 DNA 추출을 위한 쉽고 빠르고 비용 효율적인 방법을 제시했습니다. 설명된 DNA 추출 방법은 유기 용매를 사용하지 않으며, 대신 세포 단백질은 8M 칼륨 아세테이트 용액을 사용하여 염 농도를 증가시킴으로써 제거된다. 이 방법은 또한 한 번에 여러 샘플을 처리하고 각 샘플에 대한 여러 유전자형 분석을위한 충분한 DNA에서 수반합니다.
PCR은 많은 분자 실험실에서 일반적인 기술입니다. 일반적으로 문제없는 동안, 다른 곳에서 논의 된 가짜 결과를 생성 반응을 복잡하게 할 수있는 함정이있다22. 여기에 제시 된 PCR 조건은 가난한 템플릿 DNA 품질의 얼굴에 매우 강력한 등장, 하지만 PCR 증폭의 부족은 그럼에도 불구하고 때때로 가난한 buccal 상피 세포 수확으로 인해 매우 낮은 DNA 농도와 템플릿을 사용할 때 관찰되었다. 이 연구에서 사용되는 DNA 프라이머는 이 논문 의 끝에 있는 재료 표에 인용되는 것과 같은 다른 회사에서 주문할 수 있습니다. DNases 또는 운영자의 DNA로 오염을 피하기 위해 DNA 프라이머로 작업 할 때 특별한주의를 기울여야합니다. PCR 제품은 사용하지 않을 때는 차갑게 유지되어야 합니다.
또 다른 중요한 단계는 아가로즈 젤 전기전도입니다. 16 bp의 하나의 반복 단위에 의해 다른 단편은 겔 전기 포고에서 분리되지 않을 수 있으며 따라서 단일 밴드로 나타납니다. 이 경우 테스트된 D1S80 항진의 반복 단위 수에 대한 적절한 판정을 보장할 수 없습니다. 따라서, 겔의 런타임은 전압을 감소시켜야 하는 동안 증가되어야 하며, 겔 농도는 단일 밴드의 더 나은 분해능 및 분리를 제공하기 위해 증가할 수 있다.
VNTR 궤적에 대한 모든 알레임이 완전한 반복 단위를 포함하는 것은 아니라는 점을 언급 할 가치가 있습니다. 불완전한 반복 단위를 포함하는 비 합의 알레일 (microvariants)은 대부분의 VNTR loci에서 일반적이며 그 크기는 전체 반복 단위와 모두의 크기 사이에 빠진다. 이 미세 변이체는 아가로즈 젤 전기 포진에 의해 거의 검출될 수 없습니다. 대조적으로, 폴리아크릴아미드 젤 또는 모세관 전기포와 같은 기술은 1개에서 몇 개의 반복 단위 또는 마이크로변이체12,23,24,25,26으로다른 알레를 해결할 수 있다. 그러나, 후자의 기술은 유해 화합물의 사용, 복잡한 준비 및 장비의 부족을 포함하여 많은 단점이 있기 때문에 학부 실험실 클래스에 덜 적합합니다. 단편 크기 결정의 경우 마이그레이션된 DNA 단편의 거리를 측정할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 밴드가 정확하게 측정하기에 너무 분산되어 있는 경우 선형 회귀에 의한 D1S80 동선 조각 크기의 계산이 올바르지 않아 반복 단위 번호의 잘못된 추정이 발생할 수 있습니다. 이 경우 겔 조건을 최적화한 후 아가로즈 겔 전기포고의 재실행은 이전에 로렌츠와동료(22)에의해 설명된 바와 같이 바람직하다.
여기에 제시된 전체 D1S80 VNTR 분석 절차는, 부칼 상피 세포 수확에서 단편 길이 평가에 이르기까지, 단일 작업일에 완료될 수 있다. 이 프로토콜은 학부 실무 실험실 수업에 적합한 강력하고 비용 효율적이며 사용하기 쉬운 방법입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 케빈 그레이엄의 목소리와 이 작품을 위해 샘플을 기증한 모든 참가자들에게 감사를 표하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72,706 | autoclaved |
| 2 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 7,26,95,500 | autoclaved |
| 2-propanol | Fisher chemical | PI7508/17 | |
| 5x PCR buffer | Promega | M7845 | |
| Acetic acid | Sigma/Merck | A6283-500ML | |
| Agarose | BioBudget | 10-35-1020 | |
| Buccal swabs | BioBudget | 57-BS-05-600 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Combs | BioRad | ||
| dNTPs (10 mM) | Invitrogen | R0192 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.1 | |
| Ethanol | Honeywell | 32221-2.5L | |
| Gel caster | BioRad | ||
| Gel chamber | BioRad | SubCell GT | |
| Gel Doc XR+ | BioRad | ||
| Geltray | BioRad | SubCell GT | |
| GeneRuler 50 bp DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0371 | |
| Go-Taq Polymerase | Promega | M7845 | |
| Heating block | Eppendorf | Thermomixer | 1.5 mL and 2 mL |
| Microwave | Sharp | R-941STW | |
| peqGreen | VWR | 732-3196 | |
| Pipettes | Gilson | 1000 µL, 200 µL, 20 µL, 2 µL | |
| Potassium acetate | Arcos Organics | 217100010 | |
| PowerPac power supply | BioRad | 100-120/220-240V | |
| Primers | Sigma/Merck | ||
| Scale | Kern | PCB 2.5 kg | |
| SDS | Arcos Organics | 218591000 | |
| Shaker | IKA labortechnik | IKA RH basic | |
| Tabletop centrifuge | myFuge | ||
| Thermal Cycler | BioRad | C100 Touch | |
| Tris | VWR | 103156x | |
| Vortex mixer | LMS | VTX-3000L |
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